S. I. I.T.U. B.

Electrophorèse

Electrophorèse des protéines en gel d’acrylamide

Comme toutes molécules chargées, les protéines peuvent se mouvoir dans un champ électrique. Cette charge provient des groupements ionisables des chaines latérales de certains acides aminés composant la protéine. On peut donc se servir de l'électrophorèse pour les séparer. Les méthodes les plus performantes pour séparer les protéines sont faites en gel de polyacylamide (EGPA. "polyacrylamide tel electrophoresis", PAGE). L'électrophorèse en général est expliquée dans la section "électrophorèse" du SIITUB.

PRINCIPES DE BASE

Caractéristiques des protéines affectant la séparation

Charge

La charge nette d'une protéine est évidemment le principal facteur qui détermine la direction (d'après sa polarité vers l'anode ou la cathode) et la vitesse (donc la distance) de migration (proportionnelle à la densité de la charge) d'une protéine. La charge nette d'une protéine dépend du pI de la protéine et du pH du milieu ambiant. (Réviser au besoin ces concepts de pI vs pH vs charge nette d'une protéine ou d'un acide aminé)

Si on veut être rigoureux, il faudrait aussi tenir compte des contre-ions de petites tailles (K+, Na+, Cl-, etc.) qui s'associent aux groupements ionisables de charge opposée. Ces ions migrent en sens opposés aux protéines et, ce faisant, entraînent des molécules d'eau, c'est que qu'on appelle l'endo-osmose. Ce déplacement des molécules d'eau ralentit la migration des protéines. En pratique cependant, ces considérations complexes sont plutôt académiques et ont un impact faible en EGPA.

Souvent, on ajoute aux protéines un agent (généralement un détergent) qui se complexe à elles. Dans ce cas, la charge de cet agent peut déterminer la charge nette de la protéine, en fait du complexe protéine-détergent. Cela permet d'égaliser artificiellement la densité de charge de toutes les protéines de l'échantillon et de les séparer seulement sur la base de leur masse moléculaire.

Pour deux protéines ayant des charges nettes égales, il faut tenir compte de la densité de la charge (nombre de charge/unité de masse moléculaire). Ainsi, les autres facteurs étant égaux, une protéine ayant 80 charges négatives (nettes) ayant une masse relative 50 kDa migrera plus vite qu'une protéine de 100 kDa ayant aussi 80 charges négatives nettes.

TailleLa taille est un autre facteur qui détermine la vitesse de migration des protéines dans une EGPA. Plus la protéine est grosse plus elle sera retardée par les mailles du gel, donc plus elle migrera lentement. Il peut arriver qu'une protéine soit tellement grosse

qu'elle ne puisse même pas se mouvoir ni même entrer dans le gel. Inversement il peut arriver qu'elle soit tellement petite qu'elle ne soit pas retardée du tout par les pores du gel.

Comme la taille d'une protéine est dépendante de sa masse moléculaire, on a souvent tendance à dire que la masse moléculaire est, en soi, le facteur qui détermine la séparation des protéines sur EGPA. Mais en général il s'agit d'une approximation (quelquefois trompeuse) puisque c'est bel et bien la taille qui est le facteur fondamental, mais ce fateur est intimement lié à la masse moléculaire.

La forme d'une protéine est importante. À masse moléculaire égale, une protéine globulaire (qui est plus ou moins sphérique) aura tendance à se déplacer un peu plus rapidement qu'une protéine fibrillaire (plus ou moins en forme de bâtonnet) parce qu'elle "se faufile" mieux dans les mailles du gel, sans avoir besoin de se réorienter constamment.

On peut contrôler la forme et la densité de charge des protéines pour les uniformiser afin de pouvoir les séparer sur la base de la masse moléculaire. Pour cela, on utilise des détergents anioniques, comme le dodecylsulfate de sodium (SDS), ou cationiques, comme le bromure de cétyltriammonium (CTAB).

Hétéroprotéines

Beaucoup de protéines ne sont pas constituées uniquement d'acides aminés. Certaines d'entre elles contiennent divers types de groupements: polysaccharides (glycoprotéines), des acides gras (lipoprotéines), etc. D'autres peuvent avoir été modifées par phosphorylation (phosphoprotéines), méthylation, acétylation, etc. Ce sont des hétéroprotéines. Ces modifications covalentes peuvent affecter la migration. Ainsi l'addition de molécules chargées (e.g. le phosphate d'une phosphoprotéine) va augmenter ou diminuer la charge nette d'une protéine, avec les conséquences sur la vitesse de migration.

La présence d'oligosaccharides (glycoprotéine) aura aussi un effet. Évidemment cela va augmenter la masse moléculaire de la protéine. Mais comme ces groupements sont beaucoup moins compacts que les acides aminés et ont peu d'affinité pour les détergents, la géométrie (forme de la protéine) et la densité de charge sont affectées. Ce phénomène explique pourquoi la migration de protéines fortement glycosylées est anormalement lente par rapport à des protéines non glycosylées de masse moléculaire identique.

Facteurs physico-chimiques affectant la migration

Les conditions physico-chimiques dans lesquelles on fait l'électrophorèse vont influencer sur la migration. Par exemple, il peut arriver que certaines des protéines à séparer puissent avoir une affinité non covente (lien hydrogène, interaction van der Vall, hydrophobe, etc.) pour la matrice dans laquelle la migration se fait. Cette affinité va évidemment retarder la migration des molécules. C'est une des raisons pourquoi l'acrylamide est une matrice très utile: elle n'est pas chargée et n'a pas d'affinité

particulière pour les chaînes latérales des acides aminés apolaires.

Le pH peut évidemment avoir un role capital dans les élecrophorèses. C'est lui déterminera la charge des acides aminés des protéines, donc une composante importance du processus électrophorétique. De plus, il faut ternir compte que les protéines ne sont pas solubles ou stables dans toute la gamme des pH. Ainsi, des pH acides (< 5 pour la majorité des protéines) font précipiter les protéines en aggrégats plus ou moins massifs qui ne peuvent se déplacer dans le gel. D'un autre coté des conditions trop alcalines conduisent à l'hydrolyse de certains acides aminés ou du lien peptidique. En général, on maintient des conditions entre pH 6 et 10. Les histones, protéines très basiques, supportent bien des conditions acides et requierrent des conditions spéciales d'électrophorèse: milieu acide, urée concentrée.

Polymérisation de l'acrylamide

Il s'agit d'une réaction de polymérisation de monomères d'acrylamide. L'acrylamide (monomérique) a la formule chimique suivante:CH2=CH-CO-NH2.

Notez la présence du double lien C-C à l'extrémité de la molécule.

Quand un des carbones impliqués dans le double lien prend, sous l'influence d'un initiateur, une forme radicalaire (radical libre), il peut attaquer le double lien C=C d'une autre molécule. La réaction peut se résumer de la façon suivante où "M" est un monomère, "I" l'initiateur, le symbole "*" indique un radical et "- "indique un lien covalent.

La chaîne réactionnelle commence par la formation spontanée ou induite d'un radical au niveau l'initiateur:

I -> I*

La propagation de ce radical enclenche alors la polymérisation:M + I* -> M*

M* + M ->M-M*

M-M* + M -> M-M-M*

(répétition n autres fois de la réaction en chaîne)M-M-M* + n M -> M-M-M-(M)n-M*

Ainsi les monomères d'acrylamide entrent ainsi une réaction en chaîne ou de longs polymères linéaires sont formés par la propagation de ces radicaux libres. En plus de l'acrylamide en tant que tel, la réaction de polymérisation doit se faire en présence d'agents réticulants et de catalyseurs de la réaction.

Réticulation

Une solution de polyacrylamide polymérisé seulement avec de l'acrylamide est cependant liquide, quoique très visqueuse, donc impossible à manipuler. En effet, l'acrylamide ne possède qu'un seul site de formation de radical par molécule et ne peut donc donner que des chaînes linéaires plus ou moins longues sans lien entre elles.

Gel d’acrylamide non réticulé ( sans agent réticulant) Il y a formation de longues chaines linéaires sans liens entre elles

Au contraire, la présence d'agents réticulants permettra la formation de "ponts" entre les chaînes d'acrylamide. La solution formera donc un gel solide et manipulable, quoique flexible et plus ou moins fragile. Un agent réticulant ("cross-linker") peut s'incorporer dans les longues chaînes de polyacrylamide pour les relier entre elles et former un "filet" tridimensionnel qui sera solide et non pas liquide. Un agent réticulant est une molécule qui a deux doubles liens C-C, généralement un à chaque extrémité de la molécule. Chacun d'entre eux pourra dont s'intégrer dans le processus de polymérisation de deux chaînes voisines de polyacrylamide, les liant entre elles. Les gels obtenus sont solides, quoique plus ou moins fragiles selon les quantités d'acrylamide et d'agent réticulant.

Acrylamide (monomère)

Agent réticulant

Illustration schématique de l'acrylamide et d'un agent réticulant

Remarquez que cette représentation ne respecte pas les angles interatomiques et n'est faite que pour faciliter les explications en illustrant de façon schématique les structures impliquées.

Les agents réticulants ("cross-linkers") sont des molécules qui peuvent entrer dans le processus de polymérisation parce qu'elles possèdent, comme l'acrylamide, une structure chimique leur permettant de former et de propager des radicaux libres entre autres des doubles liens C=C. Mais ils possèdent cette structure en double, en général à chaque extrémité de la molécule.

Ils peuvent donc participer à la formation de deux chaînes linéaires d'acrylamide, ce

qui permet la formation de "ponts" entre chacune de ces chaînes. Il en résulte donc un réseau complexe faisant songer à un filet tridimensionnel dont les "mailles, plus ou moins grosses, laisseront passer les protéines plus ou moins facilement selon leur taille. Puisque le processus de polymérisation se produit de façon aléatoire, il y aura plusieurs grosseurs de maille dans un même gel.

Gel d'acrylamide polymérisé avec agent réticulant.

Il y a formation de longues chaines linéaires liées entre elles par l'agent réticulant

La proportion acrylamide/réticulant et la nature de ce dernier détermineront les capacités de séparation du gel en modifiant la porosité de ce "filet tridimentsionel". Ainsi, plus la proportion de réticulant est grande, plus les mailles seront petites. Cette grosseur aura une importance capitale dans la séparation des protéines. En effet, plus les mailles du gel sont petites plus il y aura un effet de "tamisage moléculaire" ralentissant les protéines qui auront à passer au travers.

Catalyseurs de la polymérisation

La polymérisation est donc initiée par la formation de quelques radicaux libres sur des doubles liens C-C de l'acrylamide ou de l'agent réticulant. Ces radicaux libres ne se forment pas spontanément sur l'acrylamide. Il faut mettre dans la solution des catalyseurs (ou initiateurs de la formation de radicaux libres).

Il faut donc ajouter à la solution un (ou des) catalyseurs capables, 1) d'initier la formation de radicaux libres qui pourront alors démarrer la réaction en chaîne de la polymérisation, ce sont des initiateurs, et 2) de stimuler la réaction de propagation des radicaux libres pour l'accélérer et l'empêcher de "s'étouffer", ce sont des accélérateurs. La formation de radicaux libres par ces composés peut être, soit, immédiate après leur mise en solution, soit, déclenchée par un phénomène physico-chimique. Généralement deux types de catalyseurs doivent être combinés: un initiateur de radicaux libres et un accélérateur.

Le TEMED (N,N,N',N'-tétraméthylènediamine) est presque toujours utilisé comme accélérateur. Le TEMED doit être sous forme basique pour avoir son action. Plus rarement on se sert du DMNAPN (3-diméthylaminopropionitrile).

Le persulfate d'ammonium (PSA) est souvent utilisé comme initiateur. Le persulfate forme spontanément des radicaux libres lorsque mis en solution. Un léger inconvénient de ce produit est qu'il introduit des ions (NH4+ et SO4-) dans la solution. On peut s'en débarrasser par une "pré-électrophorèse", en mettant le gel sous tension un certain temps avant le dépôt des échantillons. Les ions sortiront du gel sous l'influence du champ électrique. La pré-électrophorèse est cependant hors de question dans des système où des ions doivent être présents dans le gel. C'est particulièrement le cas des gels multiphasiques car la préélectrophorèse induirait le mélange des constituants ioniques des phases, ce qui empêcherait le phénomène de tassement. Cependant, les faibles quantités de PSA ont en général des effets négligeables, c'est pourquoi on essaie d'en minimiser la concentration quitte à ralentir le phénomène de polymérisation.

On peut utiliser aussi la riboflavine ou la riboflavine-phosphate qui est plus soluble. La riboflavine ne forme des radicaux libres que lorsque la solution est exposée à une lumière UV rapprochée (généralement de la lumière fluorescente suffit) qui provoque la photoactivation de ce produit et la formation de radicaux libres. Cette propriété est intéressante dans le cas où on veut contrôler précisément le début de la réaction de polymérisation. Elle est particulièrement utile pour faire des gels en gradients.

Il faut se rappeler qu'il est préférable de combiner un initiateur et un accélérateur pour que la polymérisation de l'acrylamide se fasse de façon rapide et fiable. Ainsi il faut toujours qu'il y ait du TEMED en présence de PSA tandis que la riboflavine fonctionne beaucoup mieux en présence de TEMED.

Ces produits initiateurs de polymérisation ot tendance à se dégrader avec le temps. C'est pourquoi un même lot de produit semble devenir inefficace après quelques mois de rangement. il est préférable de les garder au réfrigérateur. Malgré cela, ils finiront par perdre peu à peu leurs capacités, on peut alors augmenter les quantités utilisées.

Effets des conditions physiques et chimiques sur la polymérisation

Quelques produits peuvent inhiber la réaction de polymérisation de l'acrylamide. En particulier, ceux qui réagissent avec les radicaux libres sans s'intégrer dans la chaîne, ont un effet très nuisible. En effet de tels produits vont "étouffer" la réaction en bloquant la propagation de la réaction d'une molécule d'acrylamide à l'autre.

L'oxygène moléculaire (O2) inhibe la polymérisation de l'acrylamide de cette façon. Lors de la préparation il faut donc minimiser le brassage excessif du mélange pour réduire la présence d'air dans le mélange. On peut aussi dégazer la solution d'acrylamide avant de la couler et d'induire la polymérisation.

D'autres produits peuvent interférer au niveau des réactifs eux-mêmes. Par exemple le TEMED doit être sous sa forme basique pour accélérer la réaction de polymérisation.

Donc un produit abaissant le pH (donc un acide plus ou moins fort) ralentira ou bloquera la formation de gel d'acrylamide.

Les conditions physiques peuvent affecter la polymérisation de l'acrylamide. La température est un exemple. Plus la température est forte, plus les réactions chimiques en général sont accélérées. La polymérisation de l'acrylamide n'est pas différente des autres réactions et est donc plus rapide à haute qu'à basse température.

MÉTHODOLOGIE ET TECHNIQUESMontage du gel

On fabrique un gel de polyacrylamide en mélangeant les composantes de base: acrylamide, agent réticulant, tampons, détergents (s'il y a lieu), etc. Quelques secondes avant de "couler" le gel, on ajoute le catalyseur et l'accélérateur puis on verse immédiatement dans le moule formé par deux plaques de verre. On coule la solution d'acrylamide avant qu'elle n'ait eu le temps de gélifier. On laisse polymériser le gel qui devient alors solide. Le moule contenant le gel solide est alors prêt à être introduit dans la cellule à électrophorèse. On ajoute les échantillons et on met le gel sous tension dans les conditions de voltage et de courant pour que les protéines migrent à la vitesse voulue. On démoule ensuite celui-ci pour colorer les protéines dans le gel ou soumettre à d'autres analyses (immunodétection, etc.)

Les échantillons sont dissouts dans un tampon contenant divers produits facilitant les procédures. Ce tampon comprend donc un agent destiné à augmenter la densité de l`échantillon. Généralement on emploi du saccharose ("sucrose") ou du glycérol. Un échantillon dense est plus stable, prévient le mélange de l'échantillon dans le tampon d'électrode. Pour faciliter la visualisation de la migration, on ajoute dans l'échantillon un traceur de migration ("tracking dye"). Ce produit est coloré et migre juste derrière le front d'ions, ce qui permet de visualiser facilement la migration. Le bleu de bromophénol est couramment employé. On arrête l'électrophorèse quand le traceur a atteint le bas du gel.

De nos jours les gels d'acrylamide sont essentiellement sous forme de gels plats où on peut creuser plusieurs puits permettant de séparer côte à côte plusieurs échantillons. Ceci est très utile pour comparer le contenu en protéines de plusieurs sources différentes. Ces gels plats sont faits en faisant un "sandwich" en joignant deux plaques de verre pour ne laisser qu'un espace de 0.5 à 1.5 mm d'épais dans lequel on introduit la solution liquide d'acrylamide.

Très peu utilisés de nos jours, sauf pour les séparations 2D, sont les gels cylindriques (en carotte) où la polymérisation se fait dans des tubes de verre de moins de 5 mm de diamètre interne. Chaque échantillon est mis dans un tube individuel. Certains prétendent que les cylindres donnent une meilleure séparation et sont plus fiables.

L'acrylamide commercial tend à se dégrader pour produire des dérivés généralement chargés. Ces dérivés interfèrent souvent avec la polymérisation ou la migration des protéines. Une façon de se débarasser de ces produits interférents est d'exposer l'acrylamide à une résine échangeuse d'ion mixte durant la préparation (e.g. Mallinckrod MB-1 ou BioRad AG 501-X8)/L ou un mélange de Dowex 1-X8 et

Dowex 50W-X8). Une autre solution est de se procurer de l'acrylamide de haute qualité en petites quantités à la fois; cela est cependant assez couteux. Une autre approche consiste, lorsque c'est possible, de faire une prélectrophorèse.

Fixation et coloration

La façon la plus simple de visualiser le patron de migration des protéines est de les colorer. Avant de procéder à cette coloration, il faut "fixer" les protéines. En effet, lorsqu'on enlève la tension électrique, les protéines vont se mettre à diffuser dans le gel. Ceci va évidemment diminuer la résolution de la séparation. Pour éviter cette diffusion, on les fixe dans le gel, autrement dit, on précipite les protéines dans le gel. Ces aggrégats de protéines intimement entremêlées dans les mailles du gel ne peuvent plus diffuser. Cette fixation se fait normalement en mettant le gel dans une acide dilué comme l'acide acétique ou l'acide trichloroacétique 1 à 10%. On peut omettre cette fixation si le colorant lui-même contient de l'acide dilué, cela permet de fixer les protéines en même temps qu'on les colore.

Le colorant le plus couramment utilisé est le bleu de Coomassie. Ce produit, en milieu acide et en présence de méthanol, a une grande affinité pour les protéines. Sa petite taille lui permet de pénétrer rapidement dans le gel pour atteindre les protéines. Sa solubilité dans l'acide permet de combiner la coloration des protéines et leur fixation. Après un certain, on peut transférer le gel dans une solution méthanolique acide pour enlever l'excès de colorant qui a diffusé dans le gel et empêche de voir les protéines. A la fin de cette décoloration, on obtient un gel transparent avec les bandes de protéines colorées en bleu. Le bleu de Coomassie est asez sensible. Il existe deux variétés de bleu de Coomassie. Le R250 est employé pour colorer les protéines, le G250 est plus indiqué pour les petites protéines et les polypeptides séparés dans des gels de fort %T. En effet, le G250 est une suspension colloïdale. ce colorant est assez sensible (limite de détection 0.5 ug et convient à la plupart des électrophorèse]

Une méthode extrèmement sensible est la coloration à l'argent (limite de détection 10 ng) (Merril et al, 1981). Elle est beaucoup plus sensible quoique plus complexe, nécessitant des produits et des solvants de haute qualité, et difficile à réussir.

Détergents et agents dénaturants

On utilise souvent des détergents dans la préparation des échantillons avant l'électrophorèse. Les détergents servent à dissocier les protéines pour éviter qu'elles ne forment des agrégats impossibles à séparer. La partie hydrophobe du détergent peut en effet interagir avec les chaînes latérales non chargées tandis que la partie hydrophile interagit avec les molécules d'eau. Cela permet la solubilisation maximale des protéines et le déploiement de ses parties hydrophobes. Certains détergents comme le dodécylsulfate de sodium (SDS) servent aussi à détruire la structure quaternaire des protéines pour séparer les protéines multimériques en leurs polypeptides individuels. La plupart des protéines peuvent complexer de grandes quantités de SDS, environ 1.4 g de dodécylsulfate/g de protéines (Reynolds et Tanford, 1970). Cela représente une moyenne de deux molécules de dodécylsulfate par résidu d'acide aminé. Cette quantité de molécules de dodécylsulfate complexées

aux protéines est tellement grande que les protéines prennent une charge négative nette. Les charges endogènes sont tellement peu nombreuses par rapport à celles apportées par le dodécylsulfate, que les toutes protéines ont à toute fin pratique une densité de charge uniforme. Par exemple l'ovalbumine, une protéine de 43 kDa, possède une charge nette de -10 à pH 7.0 et de -200 après dénaturation au SDS.

Dans certains cas, on veut dénaturer les protéines sans changer leur charge. On utilise alors comme dénaturants des agents chaotropiques non ioniques comme l'urée.

Principaux agents réticulants

Il existe divers types d'agents réticulants qui auront des propriétés différentes, donc permettant de préparer des gels appropriés pour divers usages.

L'agent réticulant le plus utilisé est le N,N'-méthylène bisacrylamide, plus communément appelé "bis" ou "bisacrylamide". Structuralement, il peut être décrit comme deux molécules d'acrylamide jointes par un méthyle entre les deux atomes d'azote. Les liens chimiques du gel obtenu sont très stables et le gel obtenu est suffisamment solide pour être facilement manipulé.

Le diacrylamide de piperazine est un autre réticulant. Il permet d'obtenir des gels un peu plus solide et avec une résolution améliorée. Son principal avantage est de donner un bruit de fond moins grand que le bis dans une coloration à l'argent. Il est cependant passablement plus cher.

D'autres agents réticulants peuvent être utilisés si on veut des gels "resolubilisables" après séparation des protéines, de façon à pouvoir récupérer ces dernières pour analyse, utilisation, etc. Cependant, ces produits donnent souvent des gels plus fragiles ou plus cassants. De plus, la quantité optimale pour séparer des protéines de masse moléculaires donnés reste à être déterminée.

Le BAC (N,N'-bisacrylylcystamine) a des liens disulfures qui peuvent être détruits par un réducteur de liens disulfures.

Le DATD (N,N'-diallyltartradiamide) a des liens diole, donnant un gel solubilisable à l'acide périodique, ce qui est pratique pour les comptages de radio-activité. Il donne aussi des mailles de gel plus grandes, ce qui est avantageux pour certaines protéines, mais désavantageux dans la plupart des cas à cause de la perte de résolution qui s'ensuit.

Le DHEBA (N,N'-dihydroxyéthylène bisacrylamide) a des liens diole et amido-méthylole qui peuvent être détruits par l'acide périodique ou une base.

Contrôle de la porosité et pouvoir de séparation

La principale caractéristique d'un gel d'acrylamide est la taille des mailles du gel. Plus les mailles seront petites, plus les grosses molécules auront de la difficulté à avancer dans le gel, donc plus elles seront retardées. Inversement les molécules très petites

pourront s'infiltrer et avancer dans le gel sans obstacles. On utilisera donc diverses grosseurs de mailles (ou porosité) selon que les protéines qu'on veut séparer sont petites ou grosses.

On se sert donc souvent de deux valeurs pour caractériser la porosité d'un gel de polyacrylamide:

%A (A pour acrylamide) qui est la concentration totale exprimée (en g/100 mL) d'acrylamide

%T (T pour concentration totale) qui est la concentration totale exprimée (en g/100 mL) d'acrylamide et de l'agent réticulant combiné; cependant beaucoup ne distinguent pas entre %A et %T, ce qui n’est pas très grave car la concentration de réticulant est généralement très faible et %A est normalement très près de %T.

%C (C pour "cross-linking") qui est le rapport (en %) entre les poids de l'agent réticulant sur celui de l'acrylamide et du réticulant combiné. Remarque: certains ne tiennent pas compte du poids du réticulant parce qu'il le considère négligeable.

Une autre façon d'exprimer la quantité de réticulant en terme de rapport entre les poids d'acrylamide et celui de réticulant. Ce rapport s'exprime généralement sous la forme acrylamide:réticulant, par exemple 25:1.

Exemple de calcul

Pour une solution de 50 mL contenant 5 g d'acrylamide et 100 mg de bisacrylamide on a: %A = (5 g/ 50 mL ) * 100 = 10% %T = [(5 + 0.10 g) /50 mL] * 100 = 10.2 % ≈10% %C = (0.1 g / (5 g + 0.1 g) ) * 100 = .1.96% = 2% Rapport acrylamide:bis = 50:1

Une porosité de gel donnée n'est optimale que pour une gamme de taille relativement réduite car, et les protéines trop grosses, et les trop petites seront moins bien séparées. Les protéines trop grosses seront toutes ralenties et se démarqueront mal une de l'autre; quelque fois elles ne pourront même pas entrer dans le gel! D'autre part les protéines trop petites ne seront presque pas ralenties car l'effet de tamisage est négligeable. Elles migreront toutes pratiquement à la même vitesse. Il faut donc choisir la concentration d'acrylamide et d'agent réticulant pour optimiser la migration des protéines qui nous intéressent. On essaie de prendre une porosité qui fera migrer les protéines qui nous intéressent le plus vers le milieu du gel de séparation.

Ce choix repose sur deux facteurs principaux qui influenceront la taille des pores du gel: la quantité d'acrylamide et le rapport bisacrylamide/acrylamide (ou agent réticulant/acrylamide). D'une part, plus il y a d'acrylamide en solution au moment de la polymérisation, plus les mailles seront petites. D'autre part, plus le rapport bis/acrylamide est élevé plus les mailles seront petites. En effet, plus il y a de bis, plus les chaînes d'acrylamide seront réticulées, donc plus les pores seront petits. Mais cet

effet se remarque le plus souvent jusqu’à concurrence de %C de %5. Pour des valeurs plus grandes ou plus petites, les pores sont plus grands.

Pour obtenir la meilleure résolution possible, le %C optimal devrait varier selon le %T, normalement autour de 5%. C'est pourquoi il est préférable de faire des solutions stock distinctes d'acrylamide et de bisacrylamide. Cela permettra de préparer des gels au %C optimal par rapport au %T. Au contraire on prépare une solution stock combinée d'acrylamide et de bis, on ne peut obtenir que le même %C pour toutes les %T. Il faut aussi se rendre compte que le %C des deux agents réticulants ne s'équivalent pas et qu'une porosité similaire sera obtenue avec deux %C similaires,

Des explications complémentaires sont disponibles sur le web (National Diagnostics, Electrophoresis) Gels homogènes et en gradient

Habituellement on fait des gels ou la concentration d'acrylamide est homogène, c'est-à-dire constante dans toute la plaque de gel. Les gels homogènes permettent une séparation fine sur une plage réduite de masses moléculaires. Si on désire séparer deux protéines une de l'autre, il est donc plus efficace d'utiliser un gel homogène

Il est cependant possible de faire des gels ou la concentration d'acrylamide sera variable. Dans ce cas la concentration à la base du gel sera plus grande que celle au sommet. Ainsi dans un gradient 3 à 25%, les protéines rentrent d'abord dans le gel ou la concentration est de 3%, plus les protéines avancent dans le gel plus elles sont mises graduellement en présence de grandes concentrations d'acrylamide jusqu'à 25%.

Ce système permet une meilleure séparation générale des protéines sur une vaste gamme de masses moléculaires. En effet la taille des mailles du gel sera de plus en plus petite à mesure que les protéines avanceront dans le gel. Donc, au fur et à mesure de leur progrès dans le gel, les protéines finiront par être exposées à la concentration d'acrylamide optimale pour leur séparation.

La principale difficulté des gels en gradients est qu'il faut éviter que la polymérisation ne se produise durant le coulage du gel qui est un processus un peu lent. Pour cela, on utilise soit un initiateur de polymérisation activable à volonté, comme la riboflavine, ou de très faibles concentrations d'un iniateur spontané comme le PSA.

Systèmes discontinus

Pour obtenir la meilleure résolution possible, le %C optimal devrait varier selon le %T. C'est pourquoi il est préférable de faire des solutions stock distinctes d'acrylamide et de bisacrylamide. Cela permettra de préparer des gels au %C optimal par rapport au %T. Au contraire on prépare une solution stock combinée d'acrylamide et de bis, on ne peut obtenir que le même %C pour toutes les %T. Il faut aussi se rendre compte que le %C des deux agents réticulants ne s'équivalent pas et qu'une porosité similaire sera obtenue avec deux %C similaire

Gels homogènes et en gradient

Habituellement on fait des gels ou la concentration d'acrylamide est homogène, c'est-à-dire constante dans toute la plaque de gel. Les gels homogènes permettent une séparation fine sur une plage réduite de masses moléculaires. Si on désire séparer deux protéines une de l'autre, il est donc plus efficace d'utiliser un gel homogène

Il est cependant possible de faire des gels ou la concentration d'acrylamide sera variable. Dans ce cas la concentration à la base du gel sera plus grande que celle au sommet. Ainsi dans un gradient 3 à 25%, les protéines rentrent d'abord dans le gel ou la concentration est de 3%, plus les protéines avancent dans le gel plus elles sont mises graduellement en présence de grandes concentrations d'acrylamide jusqu'à 25%.

Ce système permet une meilleure séparation générale des protéines sur une vaste gamme de masses moléculaires. En effet la taille des mailles du gel sera de plus en plus petite à mesure que les protéines avanceront dans le gel. Donc, au fur et à mesure de leur progrès dans le gel, les protéines finiront par être exposées à la concentration d'acrylamide optimale pour leur séparation.

La principale difficulté des gels en gradients est qu'il faut éviter que la polymérisation ne se produise durant le coulage du gel qui est un processus un peu lent. Pour cela, on utilise soit un initiateur de polymérisation activable à volonté, comme la riboflavine, ou de très faibles concentrations d'un iniateur spontané comme le PSA.

Souvent les tampons d'électrode et le tampon dans lequel l'acrylamide a été solubilisé (i.e. tampon du gel en tant que tel) sont les mêmes, il s'agit de systèmes qu'on qualifie de continus. Il existe cependant des modes d'électrophorèse où plusieurs tampons sont utilisés. On qualifie ces systèmes de discontinus ou multiphasiques.

Système continu Système discontinu

Résolution plus ou moins bonnedépendante de la taille de l'échantillon

bonneindépendante de la taille de l'échantillon

Facilité d'emploi facileétapes peu nombreuses

plus complexeétapes nombreuses

Acrylamide 1 seule concentration 2 concentrationsSystèmes tampons 1 seul 3 (tampon d`électrode, gel de tassement, gel

de séparation)

Mécanisme de séparation

séparation immédiate selon la mobilité déterminée par la masse, la conformation, la charge, etc.

étape de tassement de l'échantillon précédent la séparation qui est basée uniquement sur la masse (en principe)

Les systèmes discontinus sont des systèmes triphasiques, c'est-à-dire contenant trois compartiments différents de pH et de composition ionique. Ces trois compartiments constituent respectivement trois parties du montage de l'électrophorèse: tampon d'électrode, échantillon et gel de tassement, ainsi que gel de séparation.

Les gels d'électrophorèse nécessitent souvent l'application de "grosses" quantités de protéines (pour une électrophorèse, grosses quantités veut dire plus de 75 µg !!!) pour

pouvoir détecter les protéines peu abondantes du mélange. Cependant cela veut dire qu'il faut mettre de "gros" volumes (pour une électrophorèse gros volume veut dire plus de 50 µL !!!). Malheureusement, l'application de gros volumes donne une faible résolution des protéines. En effet les bandes de protéines individuelles seront toujours un peu plus épaisses que la bande originale de l'échantillon de protéines à cause de la diffusion des molécules durant la migration et la coloration. Pour résoudre ce problème, les systèmes discontinus triphasiques permettent d'appliquer de gros volumes d'échantillon qui vont se compacter en une zone mince dans un gel de tassement (ou gel de concentration) avant d'être séparés en bandes bien résolues dans le gel de séparation.

Ce système comprend les compartiments suivants:Le tampon d'électrode, dans lequel baignent la cathode et l'anode, et fait contact avec le gel en tant que tel. Il contient le tampon d'électrode (TEL) caractérisé par une abondance de l'ion de traîne ("trailing ion"), l'absence d'ion frontal et la présence du tampon/contre-ion. Au pH du tampon d'électrode, l'ion de traîne est très chargé. Il n'y a évidemment pas d'acrylamide dans ce tampon.

L'échantillon de protéines qui contient les protéines dissoutes dans un tampon d'échantillon (TEC). Le TEC contient un marqueur de migration, un détergent, un agent réducteur de liens disulfure, etc., en plus du tampon de gel de tassement (TGT). Le TEC, comme le TGT, se caractérise par une abondance de l'ion frontal ("front ion"), mais ne contient pas d'ion de traîne, et contient évidemment le tampon/contre-ion. Au pH du TGT, l'ion de traîne sera peu chargé et l'ion frontal est très chargé. Il n'y a évidemment pas d'acrylamide dans le TEC.

Le gel de tassement ("stacking gel") est la phase dans laquelle les protéines entrent dans l'acrylamide. Il sert à entasser les diverses espèces protéines en bandes très minces pour augmenter la résolution de la séparation. Dans cette section du gel les protéines ne se séparent pas, elles migrent ensemble en s'entassant dans un volume plus petit que le dépôt. Il contient le tampon du gel de tassement (TGT) caractérisé par une abondance de l'ion frontal ("front ion") et l'absence d'ion de traîne. Tel que mentionné précédemment, au pH du TGT, l'ion de traîne (quand il y entrera) deviendra peu chargé et l'ion frontal est très chargé. L'acrylamide y est très peu concentré de sorte que toutes les protéines migrent ensemble à la même vitesse.

Le gel de séparation ("separating gel") est la phase dans laquelle les protéines entassées dans le gel de tassement se séparent les unes des autres. Il contient le tampon du gel de séparation (TGS) qui contient l'ion frontal (peu concentré). Au pH du TGS, l'ion de traîne et l'ion frontal sont très chargés, ils migrent donc tous deux très vite parce qu'ils ne sont pas ralentis par les mailles du gel. L'acrylamide y est plus concentré de sorte que les protéines se séparent puisqu'elles migrent à des vitesses différentes, étant retardées selon leure masse moléculaire.

L'ion frontal doit toujours conserver sa charge et être de très petite taille. Un ion inorganique (Cl, Na,

etc.) est généralement employé à cette fin. Le contre-ion des ions de traîne et frontaux est normalement le produit tampon qui assure la stabilité du pH dans chaque compartiment. Donc, l'ion frontal est généralement aussi utilisé sous forme d'acide ou de base fortes servant à ajuster le pH du produit tampon. L'ion de traine doit être un produit pouvant changer de charge (très chargé à très peu chargé) en fonction du pH des divers compartiments. Un acide aminé ayant un pI entre les entre les deux pH, mais très près du pH du gel de tassement est souvent employé. On pourait aussi utiliser un produit ayant un pK adéquat pour que le produit adopte les charges requises par le processus. Il est le même dans chaque compartiment car il doit migrer, évidemment à contre-courant des ions frontaux et de traîne ainsi que des protéines, mais sans affecter le pH des compartiments qu'il traverse. De plus les pH choisis doivent être compatibles avec la stabilité et la solubilité des protéines.

Diagramme de la structure d'un gel triphasiqueNoter que seulement une rangée d'ions frontaux et de traine est illustrée pour simplifier l'illustration. Pour la même raison, les proportions respectives de chaque compariment et des molécules ne sont pas à l'échelle. Il est à remarquer qu'au début de l'électrophorèse il n'y a pas d'ion de traine présents dans le gel de tassement, ni dans l'échantillon de protéines, ni dans le gel de séparation. Au pH du tampon d'électrode, les ions de traine (T) sont complètement chargés de sorte qu'il entrent et peuvent se mouvoir vite. Il est à remarquer qu'au début de l'électrophorèse il n'y a pas d'ions frontaux présents dans le tampon d'électrode.

Lorsqu'on applique un voltage dans ce système, les ions frontaux vont se déplacer rapidement puisqu'ils ont une forte densité de charge. Les ions de traîne, en entrant dans l'échantillon qui a une composition de pH identique au gel de tassement, prennent une charge très faible et vont donc se déplacer très lentement. Ces deux ions vont se déplacer à des vitesses différentes. Ils vont donc créer un "vide" électrique entre les deux: l'espace ou l'ion frontal, très mobile, est déjà parti mais où l'ion de traîne, peu mobile, n'est pas encore entré. Dans des conditions électriques constantes, ce "vide" aura toujours la même distance (1-2 mm). Ce "vide" électrique aura tendance à "aspirer" les molécules ayant une densité de charge et une mobilité intermédiaire. Dans notre cas, les protéines sont plus mobiles que l'ion de traîne, mais moins que l'ion frontal. Au fur et à mesure que ce système passe à travers l'échantillon de protéines, celles-ci s'entasseront donc dans cet espace séparant les deux ions. Le gel de tassement a une faible concentration d'acrylamide, de 3 à 5%, insuffisante pour séparer les protéines du mélange. Les ions ne sont évidemment pas retardés non plus par cette concentration d'acrylamide.

Le gel de séparation a une concentration en acrylamide plus forte que celle du gel de tassement, suffisamment pour séparer les protéines. Les ions frontaux ou de traine ne sont cependant pas retardés par cette concentration d'acrylamide. Le pH du gel de séparation est compatible avec la charge que l'on veut donner aux protéines d'intérêt. Au pH du gel de séparation, l'ion de traîne reprend une charge qui lui permet de

migrer aussi presque aussi rapidement que l'ion frontal. Donc, le "vide" électrique entre ces deux ions disparaît et l'effet d'entassement des protéines ne se fait plus sentir. Au pH du gel de séparation, les protéines deviennent généralement plus chargées. Mais comme l'acrylamide est substantiellement plus concentré, elles rencontrent une résistance qui les ralentit plus ou moins selon leur taille. La séparation des protéines s'effectue alors comme dans une électrophorèse normale.

Etat du système au avant l'application de la tension.

La tension vient d'être appliquée. Les ions frontaux ont avancé rapidement tandis que les ions de traîne, en entrant dans l'échantillon, sont devenus peu chargés et avancent plus lentement. Un "vide" électrique s'est formé entre les ions frontaux et de traîne. Les protéines avancent plus rapidement que les ions de traine mais plus lentement que les ions frontaux. Les ions frontaux ont commencé à "rattraper" les protéines.

Les ions frontaux et les ions de traîne et les protéines continuent d'avancer à leur vitesse. Le processus de tassement, amorcé dans l'échantillon, se poursuit dans le gel de tassement proprement dit. La distance entre les ions frontaux et de traîne se stabilise et les protéines commencent à s'y entasser.

Le processus se poursuit. La distance entre les ions frontaux et de traîne se maintient toujours et les protéines s'y accumulent de plus en plus.

Le processus se poursuit. La distance entre les ions frontaux et de traîne se maintient toujours et les protéines s'y accumulent de plus en plus.

Le processus de tassement est pratiquement terminé. Les protéines sont presque arrivées au gel de séparation. Elles se sont toutes entassées dans le "vide" électrique. Elles occupent un volume (en hauteur) beaucoup plus compact qu'au début. En entrant dans le gel de séparation, elles se sépareront selon leur masse.

Electrophorèse avec détergentsDiverses conditions affectent la migration et la séparation des protéine, parmi les plus importantes sont la géométrie et la charge des protéines. Si on veut les séparer selon leur masse moléculaire, il faut abolir les différences entre ces deux types de caractéristiques. Pour cela, on emploie des détergents cationiques (chargés positivement comme le bromure de cétyltriméthylammonium CTAB) ou

anioniques (chargés négativement comme le dodécylsulfate de Na (SDS), le déoxycholate de sodium (DOC). Ce détergent confère une charge uniforme (positive ou négative selon le cas) et une conformation dénaturée similaire à toutes les protéines du mélange. La composition ionique (type d'ions, pH, etc.) de chaque phase devra tenir compte de ce fait pour maintenir des ions frontaux et de traine ayant les caractéristiques requises.

APPLICATION À LA BIOCHIMIE

Préparation des échantillons et conditions de migration

Les échantillons de protéines qu'on dépose dans un puit de gel doivent être le plus possibles exempts de produits contaminants. Les ions sont particulièrement à éviter puiqu'ils peuvent nuire au déroulement correct des phénomènes électriques permettant la concentration des protéines dans le gel de tassement. Si on veut séparer des protéines métaboliquement marquées, par exemple avec un acide aminé, du phosphate, des précurseurs d'oligosaccharides, etc., il faut aussi enlever les molécules qui ne se seraient pas incorporées dans les protéines. En effet elles peuvent souvent créer un bruit de fond réduidant la sensibilité d'une autoradiographie ou d'une fluorographie.

Plusieurs approches sont couramment utilisées pour éliminer ces contaminants. La plus simple est la précipitation acide des protéines avec de l'acide trichloroacétique. Les protéines précipitent dans ces conditions et peuvent ètre récupérées sous forme de sédiment après centrifugation, tandis que les petites molécules contaminantes restent dans le surnageant. Cette méthode a cependant plusieurs défauts. Elle ne permet pas une récupération de toutes les protéines et le précipité de protéines est souvent difficile à redissoudre. Une approche plus efficace quoique plus longue est la précipitation au phénol (Sauvé et al, 1995). Cette méthode vient du fait que les protéines en solution aqueusse mises en présence de phénol se dénaturent et, soit deviennent soluble dans le phénol, soit forment un film à l'interface eau-phénol; les petites molécules contaminantes demeurent dans la phase aqueuse. On peut donc récupérer les protéines et les soumettre à une électrophorèse. D'autres précipitation avec des solvants organiques (éthanol, acétone) sont aussi faisable mais ont aussi des inconvénients (SIITUB: Précipitation des protéines). Une façon très efficace, mais un peu plus couteuse, est l'emploi de tubes à centrifuger munis d'une membrane à dyalise (Salodof MacNeil (2003). En centrifugeant, on force les petites molécules et la gande majorité du solvant aqueux à travers la membrane et on peut recueillir à la surface de la membrane des protéines concentrées et débarassées des contaminants ayant une masse inférieure à la limite d'exclusion ("cut-off"), de l'ordre de 5 à 10 kDa. De nombreux fabricants fournissent ces dispositifs.

Il faut aussi que les conditions ioniques et de pH soient compatibles avec la stabilité des protéines analysées. On évite généralement les milieux trop acides ou trop alcalins. Pour la plupart des protéines, les pH acceptables sont de l'ordre de 6 à 10.

La chaleur perturbe aussi la migration électrophorétique. Il faut particulièrement éviter les situations où le gel est soumis à des températures différentes. Les gels en plaque sont particulièrement sensible et il était fréquent que le centre des gels surchauffait. Cela causait une migration plus lente des échantillons des puits périphériques caractérisé par des bandes protéiques ayant migré plus rapidement au centre du gel, créant un patron ayant la forme d'un sourire.... De nos jours cependant, les dispositifs à électrophorèse sont conçus pour assurer un refroidissement uniforme de tout le gel.Si on laisse des puits inoccupés par un échantillon, les protéines des puits adjacents peuvent mal migrer, c''est ce qu'on appelle 'l'effet de bordure". Ce problème est facilement réglé en mettant simplement du tampon d'échantillon (1 X) dans ces puits inutilisés.

Le tampon dans lequel est dissout l'échantillon de protéine contient aussi un marqueur de migration ("tracking dye"), une petite molécule colorée, qui migre devant toutes les protéines permettant de suivre le progrès de la migration.

Électrophorèse des protéines en gel de polyacrylamide-SDS (EPGP-SDS) et estimation de la masse moléculaire

De nos jours, l'électrophorèse le plus utilisé est sûrement l'EGPA-SDS. Le système triphasique tris-glycine-Cl- est de loin le plus utilisé. Il a été développé par Laemmli (1970), d'où le nom électrophorèse de Laemmli qu'on lui donne quelquefois.

Il s'agit d'un système ou les protéines ont été traitées avec le détergent anionique, le SDS, tel que préconisé par Weber et Osborne (1969). Ce détergent s'adsorbe avec les protéines. Le traitement des protéines comprend aussi du b-mercaptoéthanol (bME) qui réduit les ponts disulfure et accentue encore l'uniformisation de la charge et de la géométrie des protéines. Un court traitement à la chaleur, généralement à 90-100°C, accélère les réactions de dénaturation des protéines du SDS et du bME. Le SDS détruit les structures secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines; on dit souovent qu'il les "linéarise". De plus, il s'adsorbe sur les protéines pour leur conférer une charge négative. On obtient donc des protéines de géométrie et de densité de charge uniformes. La seule différence entre les protéines de l'échantillon devient leur masse, donc à toute fin pratique, leur taille.

La grande innovation de Laemmli a été de séparer les protéines traitées au SDS (un détergent anionique) avec le système triphasique très performant, au niveau de la résolution, à base de Cl- , glycine et tris développé par Davis et Ornstein (1969). L'ion frontal est le Cl-, dont la charge ne varie pas en fontion du pH. L'ion de traîne est la glycine. Cette dernière, dont le pI est de 6.0 (pK 2.34 et 9.78), est peu chargée à pH 6.8 (TGT) mais très chargée négativement à pH 8.8 (TGS et TEL). Le contre-ion et produit tampon est le tris (pK 8.08).

Une des utilités de l'EPGP-SDS est d'estimer la masse moléculaire des protéines qu'on sépare. Pour ce faire, il suffit de faire migrer dans le gel des étalons de masse moléculaire connue. On obtient une résolution enocre meilleure en employant un gradient de concentration d'acrylamide. On peut alors construire une courbe de distance de migration (ou Rf linéaire entre le) vs log (masse moléculaire). La masse approximative des protéines des échantillons pourra donc être facilement déterminée. Pour obtenir une mesure valable de la masse moléculaire, on doit faire migrer dans le même gel des étalons cote-à cote avec la protéine dont on veut connaitre la masse. Il est important de choisir des conditions de migrations, essentiellement la porosité du gel (%A et %C) où les étalons auront une relation Rf vs log MM linéaire et que la protéine de masse inconnue migre à l'intérieur de cette zone de linéarité. Plus il y a d'étalons dans la zone de linéarité, meilleure est la détermination de la masse. Le Rf est le rapport entre la distance de migration de la protéine (échantillon ou étalon) et le front d'ion déterminé par la position d'un indicateur coloré (bleu de bromophénol). La compagnie BioRad a produit un dépliant (en format pdf) sur le sujet.

Cette méthode a une précision satisfaisante mais n'est pas infaillible. En effet, la mobilité de la majorité des protéines varie entre 5-20% par rapport la moyenne (Weber et Osborne, 1969) . De plus, quelques protéines ont un comportement carrément anormal. En effet, même si la grande majorité des protéines adsorbent entre 1.1 et 1.7 g de dodécylsulfate par g, certaines ont une faible affinité pour ce détergent (Nelson, 1971; Rizzolo et al, 1976). Par exemple la papaïne et la glucose oxydase ne lient que 0.2 g de dodécylsulfate/g, ce qui leur donne une densité de charge réduite par rapport à la moyenne des protéines. Une autre exception est celle des protéines fortement glycosylées. En effet les résidus glycosyles de ces protéines ne se lient pratiquement pas au SDS, impliquant encore une fois une densité de charge réduite. Certaines protéines, comme les histones et des protéines ribosomiques, sont très basiques et ont un grand nombre de charges positives proportionnellement aux molécules de dodécylsulfate qu'elles peuvent complexer. C'est pourquoi on doit considérer que l'EPGP-SDS ne permet de mesurer qu'une masse moléculaire apparente.

Une variante de l'EPGP-SDS est le système tris-tricine. Il vise à solutionner la limite majeure du système de Laemmli, le manque de résolution des polypeptides de petite masse moléculaire (< 15 kDa). En effet ceux-ci sont emprisonnés dans les micelles de SDS qui migrent derrière le front d'ions et ne sont pas séparées. En remplaçant la glycine par la tricine (un tripeptide de glycine) on peut dissocier les petits polypeptides, aussi petits que 1 kDa, des micelles de SDS, ce qui leur permet de migrer selon leur masse. Autres systèmes de séparation électrophorétique des protéines

Un système triphasique basé sur un autre détergent a été mis au point, mais il est beaucoup moins employé. Ce système utilise comme agent dénaturant le détergent cationique bromure de

cétyltriméthylammonium (CTAB). Le principal avantage du CTAB est qu'il engendre une dénaturation généralement réversible des protéines, contrairement à celle du SDS qui est généralement irréversible.

Si on veut dénaturer les protéines sans affecter leur charge intrinsèque, on peut utiliser l'urée, un agent chaotropique non ionique. Des concentrations de l'ordre de 6 M d'urée sont requises et la migration se fait en milieu acide.

Électrophorèse préparative

On peut utiliser l'électrophorèse comme étape de purification de protéines. Généralement on utilise des conditions de migration non dénaturantes pour préserver les protéines.

Il existe un montage spécialisé à cette fin, il ressemble à une colonne à chromatographie munie d'électrodes. Il s'agit d'un gros tube cylindrique dans lequel on peut couler de l'acrylamide. On dépose l'échantillon pour le soumettre à l'électrophorèse. On continue la migration sans l'arrêter et on recueille les fractions protéiques au fur et à mesure qu'elles sortent du gel.

Une approche plus simple, quoique plus "artisanale", est de faire l'électrophorèse dans un gel plat conventionnel sauf que les puits sont très grands et peuvent contenir un grand volume d'échantillon. Après le temps voulu, on récupère le gel, on le coupe et on récupère la bande dans laquelle est la protéine qu'on veut isoler. On broie cette bande pour en libérer les protéines. Pour ce faire, on peut utiliser un broyeur de type "Potter-Evelhjem", un sonicateur, etc. Pour faciliter cette extraction, on peut polymériser l'acrylamide avec un agent réticulant solubilisable (e.g. BAC avec b-mercapto-éthanol).

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