PROJET D’INTÉGRATIONen génie biotechnologique

2004-2005

LE PULLULAN

• Présentation des membres de l’équipe

• Caractéristiques du Pullulan

• Le Pullularia Pullulan

• Applications du Pullulan

• Le bioréacteur

• Le milieu réactionnel

• La séparation et la purification

• Tests à effectuer sur le Pullulan pendant et après la production

• Conclusion

• Surprise…

Présentation des membres de l’équipe

Guillaume Beaudet

David Beaudoin

Véronique Berberi

Alexandre Bourget

Amélie Caron-Laramée

Émilie Grenier

Yannick Labrecque

Nicolas Lauzière

Jean-François Lemay

Bona Men

Milos Skrga

LE PULLULAN

Structure moléculaire du Pullulan

http://www.hayashibara.co.jp/hbl/product-spec/pu101.html

CaractCaractééristiques du Pullulanristiques du PullulanLe Pullulan est un produit extracellulaire d’Aureobasidium Pullulan de plus en plus utilisé dans l’industrie pharmaceutique, alimentaire et pour diverses applications industrielles.

Propriétés physiques

Poudre blanche

Inodore

Sans saveur

Non toxique

Imperméable a l’oxygène

Solution collante et visqueuse

Possibilité de former un film

Soluble dans l’eau mais pas dans le méthanol, l’acétone et l’éthanol

IntIntéérêts de production et rêts de production et applications du Pullulanapplications du Pullulan

Aucune pollution produite pendant le processus de Aucune pollution produite pendant le processus de synthsynthèèsesePeutPeut--être plastifiêtre plastifiéée par este par estéérification ou rification ou ééththéérificationrification

Industrie pharmaceutiqueIndustrie pharmaceutique°° Fabrication de capsules solubles dans lFabrication de capsules solubles dans l’’eaueau°° Enrobage de mEnrobage de méédicamentsdicaments°° NanoparticulesNanoparticules liblibéératrices de molratrices de moléécules cules bioactivesbioactives

•Industrie alimentaire° Emballages

° Contenants

° Enrobages de produits alimentaires qui peuvent être lavés avant usage (pour dissoudre le film) ou consommés directement

° Fabrication d’aliment diététiques

° Épaississant pour confitures, sauces, etc

° Peut remplacer la gélatine et l’amidon pour augmenter la consistance d’aliments

• Applications industrielles◦ Colles et adhésifs

° Dans la construction pour recouvrir des surfaces

° Formation de fibres semblables à la soie et dont la résistance à l’élongation est comparable à celle des fibres de nylon

° Plastiques, comparable au polystyrène point de vue transparence et résistance. Il est plus élastique que le polystyrène.

Et bien sûr il ne faudrait pas oublier …

Les couches!!!

Grâce à ses propriétés biodégradables, la couche offre une protection et un confort que bébégreenpeace adore!

PULLULARIA PULLULAN

Pullularia Pullulan(Levure)

• Eaux naturelles• Égouts• Terre• Viande• Pulpe de bois• Fromage• Blé• Fruits et noyaux d’orge (là où il est le plus répandu)

Étapes d’élaboration du projet Pullulan 2004-2005

• Recherche d’articles (sur le Pullulan, la fermentation, les levures, etc.)

• Élaboration des étapes de production de Pullulan

• Division des sous-équipes

• Bioréacteur

• Milieu réactionnel

• Séparation et purification

• Tests à effectuer pour caractériser le Pullulan obtenu

• Précision de chacune des étapes de productions

• Élaboration du protocole final et budget

• Déroulement des étapes de production en laboratoire pour Hiver 2005

LE MILIEU RÉACTIONNEL

PrPrééparation de lparation de l’’inoculuminoculum

Levure: aureobasidium pullulans mutante (0,6g/L)

Milieu de cultureMilieu de culture5% de l’inoculum v/v (750mL)

DeuxiDeuxièème fermentationme fermentation

TempTempéérature: 30rature: 30°°CC

pH initial: 6,5pH initial: 6,5

AAéération: 10 L/minration: 10 L/min

Essais futurs:Essais futurs:Changement de sucre Changement de sucre

(sous(sous--produit alimentaire)produit alimentaire)

Optimisation:Optimisation:

Vitesse dVitesse d’’agitationagitationDDéébit dbit d’’aaéérationration

LE BIORLE BIORÉÉACTEURACTEUR

AFFICHEUR

FILTRE

MOTEUR

ROTAMÈTRE BONBONNED’AIR

SSÉÉPARATIONPARATION

Étape 1Dilution avec eau déionisée

500 ml milieu réactionnel1V milieu réactionnel / 1V eau déionisée

Étape 2Centrifugation

Surnageant(contient le Pullulan)

Levures, débris cellulaires et autres composantes du milieu réactionnel (gel)

Étape 3Dilution avec eau déionisée1V gel / 1V eau déionisée

Étape 4Centrifugation

Gel(rejet)

Surnageant(contient le pullulan) Étape 5

Combinaison des deux surnageants

PURIFICATION

Étape 1Précipitation

Éthanol1V surnageant / 2V solvant

Étape 2Centrifugation

13 000 rpm25ºC

20 minutes

Étape 2Filtration

Filtre millipore type HA 0.45µm

Lavage avec le solvant

Répétition des étapes 1 et 2 jusqu’à

élimination totale du gel

Résidus de gel

Précipitéde Pullulan

Étape 3Lavage à

l’éther

ou

Étape 4Séchage du Pullulan

Récupération du précipité de Pullulan

sur le filtre

TESTS

Tests de caractTests de caractéérisationsrisations::-- Spectroscopie IRSpectroscopie IR-- RMN RMN 11H et RMN H et RMN 1313CC

Test de mesure du poids molTest de mesure du poids molééculaire:culaire:-- Mesure de la viscositMesure de la viscositéé en solutionen solution

Tests de toxicitTests de toxicitéé::-- CytotoxicitCytotoxicitéé

Spectroscopie IRSpectroscopie IRObjectifObjectif: D: Dééterminer les types de liaisons et les fonctions terminer les types de liaisons et les fonctions

chimiques que contient la substance analyschimiques que contient la substance analyséée.e.Exemple de spectre:Exemple de spectre:

RMN RMN 11H et RMN H et RMN 1313CCObjectif: Objectif: DDééterminer la structure molterminer la structure molééculaire de la culaire de la

substance analyssubstance analyséée. On e. On éétudie les atomes dtudie les atomes d’’hydroghydrogèène ne (RMN (RMN 11H) ou de carbones (RMN H) ou de carbones (RMN 1313C).C).

Exemple de spectre:Exemple de spectre:

ViscositViscositééObjectif: Objectif: DDéétermination du poids moltermination du poids molééculaire moyen en culaire moyen en

viscositviscositéé par la mesure exppar la mesure expéérimentale de la viscositrimentale de la viscositéé. Le . Le poids molpoids molééculaire ne sert pas culaire ne sert pas àà savoir si le produit savoir si le produit obtenu est bel et bien du pullulan, puisquobtenu est bel et bien du pullulan, puisqu’’il varie au il varie au cours de la fermentation. On cherchera plutôt cours de la fermentation. On cherchera plutôt àà faire un faire un suivi de son suivi de son éévolution dans le temps afin de la comparer volution dans le temps afin de la comparer àà celles dcelles dééjjàà obtenues par dobtenues par d’’autres expautres expéérimentateurs.rimentateurs.

Relations:Relations:B tηρ

= 0

0sp

η ηηη−

= [ ]0

lim sp

c cη

η→

=

η sp /c en fonction de c

c (g/100mL)

η sp/c

(ce

ntip

oise

s*10

0ml*g

-1)

[ ]0

lim sp

c cη

η→

=

[η]

ViscositViscositéé (suite)(suite)Relation entre la viscositRelation entre la viscositéé intrinsintrinsèèque et le poids que et le poids

molmolééculaire moyen en viscositculaire moyen en viscositéé: (: (relation de relation de MarkMark--HouwinkHouwink))

[ ] vKMαη =

CytotoxicitCytotoxicitéé

Objectif: dObjectif: dééterminer la rterminer la rééponse de cellules ponse de cellules vivantes face au matvivantes face au matéériau testriau testéé..

Dans le cas du pullulan pur, nous Dans le cas du pullulan pur, nous analyserons seulement sanalyserons seulement s’’il est mortel.il est mortel.

Test MTTTest MTT

MTT est un sel MTT est un sel tetrazoliumtetrazolium jaune jaune mméétabolistaboliséé dans les mitochondries de dans les mitochondries de cellules vivantes.cellules vivantes.

Une fois mUne fois méétabolistaboliséé, le MTT est converti , le MTT est converti en en formazanformazan bleu. bleu.

RRééaction du MTTaction du MTT

Culture cellulaire(L929)

Ajout de MTT (jaune)

Réaction métabolique mitochondriale

Cellules mortes MTT Cellules vivantes Formazan

Analyse du test MTTAnalyse du test MTT

On dOn déétermine ltermine l’’absorbance de chaque absorbance de chaque puit.puit.

On la met en relation avec la On la met en relation avec la concentration de cellules vivantes.concentration de cellules vivantes.

absorbance absorbance éélevlevéée = bonne viabilite = bonne viabilitéé!!!!

CONCLUSION

ET

REMERCIEMENTS

QUESTIONS

FIN DE LA PRÉSENTATION

…

CHANSON PULLULAN 2004-2005(Air de « Vive le vent »)

Refrain :Pullulan, Pullulan, vive le Pullulan !Premier projet d’intégration à l’Université….Hé !Pullulan, Pullulan, vive le Pullulan !Nous verrons en Janvier, ce que ça va donnerUn polysaccharideChaîne de maltotrioseSynthétisé par le pullularia pullulanOn peut en faire des filmsDes capsules de pilulesDes couches de bébésOu en mettre dans la confiture…Ho !RefrainTrouver un protocoleUn bioréacteurChoisir notre levure et le milieu réactionnel Comprendre la réactionSans trop poser d’questionsEt faut pas oublierDe séparer et purifier…Ho !RefrainOn a tous travailléLu plus de 100 articlesDes heures de réunionsEt plus de cent mille déceptionsLa théorie terminéeC’est l’temps d’expérimenterIl reste juste à souhaiterQu’on f’ra pas sauter le labo…Ho !RefrainNous verrons en Janvier, ce que ça va donner

FIN