Production de métabolites secondaires par biologie synthétique€¦ ·
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Sylvie Lautru
Transcript of Production de métabolites secondaires par biologie synthétique€¦ ·
Sylvie Lautru
• Petites molécules produites par les plantes et les microorganismes
– plantes
– micro-organismes
• Non indispensables à la survie dans les conditions de laboratoire
• Des fonctions biologiques encore peu connues mais très variées
• Diversité des structures chimiques et des activités biologiques
Les métabolites secondaires
Papaver somniferum Codéine Morphine
Penicillium notatum Pénicilline
Me
O O
O
NH
OHN
O
NH
O
NHMe
Cl
O
HN
H
OH
NH
OCl
OH
NH
O
OHHO
H
HO2C
HO
H
O
HOHO
O
OH
OH2N
HOMe
NH2
O
MeN
MeN
NMe
O
MeN
O
O
NH
HN
NMe
O
O
OHN
OHO
HO
HN
O
NMe
O
NMe
O
Cyclosporine
HOO
HNOH
OH
NH
NH
NH2
NHH2N
O
OHC OH
OOH
OHOH
NHMe
Streptomycine
O
HN
N
SH
COOHO
Benzylpenicilline
Vancomycine
O
N
O
O
H
OH
MeO
H
MeO
H
OMe
OHH
O
OH
O
O
Tacrolimus (FK 506)
O
ONH
OH
OOH
O
OH OH
OAc
O
OAcO
Taxol
OMe O
O OH
OH O
OHO
O
OHNH2
Daunorubicine
Antibactériens
Immunosuppresseurs Anticancéreux
Quelques exemples
Desferrioxamine
Structures rouges: peptides; bleues: polycétides; violettes: aminoglycosides; noires: terpènes; vert: autres
Sidérophore (chélateur de fer)
Quelques exemples
Structures rouges: peptides; bleues: polycétides; violettes: aminoglycosides; noires: terpènes; vert: autres
Lovastatine Ivermectine
Bialaphos
Acarbose
Anticholestérol Antiparasitique
Antidiabétique Herbicide
Méthodes classiques de production
Microorganismes
Produits naturels
Analogues de produits
naturels
Fermentation Hémi
synthèse
Extraction/purification
Pénicilline G Amoxicilline
Difficultés potentielles: rendement, disponibilité de la matière première…
La biologie synthétique
Biologie synthétique: design et ingénierie de systèmes biologiques ainsi que le
re-design de systèmes biologiques existants (naturels).
La biologie synthétique
Biologie synthétique: design et ingénierie de systèmes biologiques ainsi que le
re-design de systèmes biologiques existants (naturels).
Pour la synthèse de métabolites secondaires: design et ingénierie de
voies de biosynthèses ainsi que le re-design de voies de biosynthèses
existantes (naturelles).
Re-design de voies existantes
Produits naturels
Extraction/purification
Artémisinine
Photochimie
Acide artémisinique
Armoise annuelle (Artemisia annua)
Levure (Saccharomyces cerevisiae)
Reconstitution d’une voie de biosynthèse de l’acide artémisinique
Re-design de voies existantes
Paddon and Keasling (2014) Nature Reviews Microbiology 12:355
Re-design de voies existantes
Refactoring the Silent Spectinabilin Gene Cluster Using a Plug-and-Play Scaffold
Re-design de voies existantes
Utilisation d’hôtes hétérologues: nécessité d’optimiser l’usage des
codons
Certaines enzymes auxiliaires ou précurseurs présents chez l’hôte
naturel peuvent être absents chez l’hôte hétérologue
Optimisation de la production: recours à la biologie des systèmes
pour faire des modèles de réseaux métaboliques et optimiser les
flux de métabolites
Reprogrammation et manipulation de voies de biosynthèse
Groupe de gènes de biosynthèse
Microorganismes
Biosynthèse combinatoire
Ensemble de gènes ou de groupes de gènes de biosynthèse
Délétion de gènes
Produits naturels
Analogues de produits
naturels
Fermentation Hémi
synthèse Mutasynthèse
Précurseurs non naturels
Synthèse chimique
Les synthétases de peptides non ribosomiques
module 1 module 2 module 3 module 4 module 5
synthétase 1 synthétase 2
C A A PCP E PCP C A PCP C A PCP C A PCP TE
NRPS: méga-complexes enzymatiques organisés en modules (un
module par acide aminé incorporé) eux-mêmes divisés en domaines
COOH3N
R1
COOH3N
R2
COOH3N
R3
COOH3N
R4
COOH3N
R5
La gramicidine S synthétase, une NRPS modèle
synthétase 1 synthétase 2
module 1 module 2 module 3 module 4 module 5
C Pro Phe PCP E PCP C Val PCP C Orn PCP C Leu PCP TE
SH SH SH SH O
NH
O
HN
NH
O
O
N
O
O
H2N
NH2
O
HN
HN
HNO
NH
NH
NH
O
O
O
O
O
O
NH2
H2N
N
O
HN
N
O
NH
D
La diversité au sein des NRPS
Module d’élongation
Module d’initiation
C A PCP A PCP
E Me Cy
C A PCP TE
Module de terminaison
C PCP
Red
F
Ox
Cy: domaine d’hétérocyclisation Me: domaine de méthylation E: domaine d’épimérisation Red: domaine réductase
F: formylation Ox: oxydation
Comment fabriquer de nouvelles molécules à partir des NRPS?
Changer la
spécificité d’un
domaine A
Changer un
domaine A
pour un autre
Changer un
module complet
Rajouter des
domaines
optionnels
Changer les domaines
COM (changer des
sous unités complètes)
module 1 module 2 module 3 module 4 module 5
C A A PCP PCP C A PCP C A PCP C A PCP Te
C’ A’ PCP’ A’ C’ A’ PCP’ Te’ Me
A B C D
Quelques exemples
- Ingénierie du site actif d'un domaine d'adénylation
Eppelmann et al. (2002), Biochemistry 41, 9718-9726
Quelques exemples
- Remplacement d'un domaine AT par un autre
Stassi et al. (1998), PNAS 95, 7305-7309 Erythromycine A
Vers des produits non naturels
Précurseurs non-naturels
(mutasynthèse)
Modification du squelette (échange de
domaines ou modules)
Modification de la
décoration du squelette
(glycosylation,
hydroxylation…)
Principe de la mutasynthèse
Adapté de Weissman, (2007) Trends in Biotechnology, 25:139
Quelques exemples
3-aminopropionamidine
Cgc4 Cgc5 Cgc6
N
CH3
HN
ON
CH3
NH
O
NH2
NHNHH
NHN
H2N
O
F
Fluorocongocidine
N
CH3
HN
ON
CH3
NH
O
NH2
NHNHH
NHN
H2N
O
Congocidine
Quelques exemples
Gregory et al. (2005), Angew. Chem. Int. Ed. 44, 4757
Les étapes de modifications post-NRPS ou post-PKS
Blanchard & Thorson (2006), Current Opinion in Chemical Biology 10: 236
Vers la biologie synthétique et la biosynthèse combinatoire
54 PKS trimodulaires non naturelles
96% produisent le polycétide escompté
Menzella H et al. (2007), Chemistry & Biology 14, 143-151
Résumé & Conclusion
• La biologie synthétique des produits naturels permet:
– de "re-créer" des voies de biosynthèse naturelle dans des hôtes hétérologues (production/rendement plus important que dans l’hôte naturel)
– de synthétiser de nouvelles molécules par biosynthèse combinatoire et mutasynthèse
• Discipline à l’interface de la biologie et de la chimie, et pouvant faire appel à des compétences en mathématiques (modélisation)
Résumé & Conclusion
• Limites actuelles:
– Absence de précurseurs sans l’hôte hétérologue
– Difficulté d’obtenir de bon rendements pour la synthèse de nouvelles molécules
rôles des spécificités de substrats des enzymes, des interactions protéines, du transport des mutasynthons…
Remerciements
Equipe MMA
Jean-Luc Pernodet
Emmanuelle Darbon
Alain Raynal
Corrine Saulnier
Florence Lorieux
Drago Haas
Jerzy Witwinowski
Soumaya Najah
Laura Giudici
Previous members
Audrey Vingadassalon
Priscillia Pierre-Elies
Pierre-Alexandre Mariel
Maud Juguet
François-Xavier Francou
Claude Gerbaud
CEA/Saclay
Muriel Gondry et son équipe
Robert Thai
University of Warwick
Greg Challis et son équipe Lijiang Song
Christophe Corre
ActinoGEN
Université Paris Descartes
Luc Demange
Thomas Lombès
Laurent Micouin
LC-MS
Analyses et synthèses chimiques
ICSN
Jamal Ouazzani et son équipe
Géraldine Le Goff
