Place de la cytométrie en flux dans le diagnostic et le suivi des syndromes lymphoprolifératifs B

Hématologie : HémopatHies lympHoïdes b matures

Revue FRancophone des LaboRatoiRes - Mai 2013 - n°452 // 37

article reçu le 24 décembre 2012, accepté le 30 janvier 2013.© 2013 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés.

Summary

Flow cytometry in the diagnosis and the follow-up of chronic B-cell lymphoproliferative disordersThe considerable expansion of flow cytometry allows a rapid and reliable evaluation of cellular subsets in blood and bone marrow samples as well as in biological fluids (ascitic, pleural and cerebrospinal) even if they are in weak quantities. Thus, flow cytometry represents a major step in the diagnosis and the follow up of the majority of malignant hemopathies, in particular in B lympho-proliferative disorders. The detection of a monotypic population, a phenotypic gap, a lack of expression of a physiological marker or the expression of an aberrant marker, allow to suspect the abnormal feature of the sample. Based on immunopheno-type, it is possible to determine the cellular lineage which the lymphoma population originates from, the classification of the pathology, the evaluation of the prognosis and the detection of the minimal residual disease (MRD). Among the B lymphopro-liferative disorders, the most frequent and better characterized by flow cytometry is the chronic lymphocytic leukemia, the diagnosis of which is performed by the establishment of the Matutes/Moreau score based on the expression of 5 mar-kers. In atypical cases, the differential diagnosis with other types of lymphoproliferative syndromes may be difficult. The combination of some selected antigens allows to suspect or to diagnose other B-cell disorders such as mantle cell lymphoma, marginal zone lymphoma, follicular lymphoma, hairy cell leukemia, B prolymphocytic leukemia and lymphoplasmacytic lymphoma. In addition, the MRD quantification brings additional signifi-cant information in the evaluation of the treatment response and in the prediction of clinical outcome. The detection of MRD by flow cytometry, principally developed in CLL, should be currently restricted to clinical trials. However, after the standardization of the methods, we can hypothesize that the guide-lines for these lymphomas will be reconsidered in order to integrate the MRD quantification.

Flow cytometry – chronic B-cell lymphoproliferative disorders – monoclonal antibodies – immunophenotype –

minimal residual disease.

réSumé

L’essor considérable de la cytométrie en flux au cours de la dernière décennie rend possible une évaluation rapide et fiable des sous-popu-lations cellulaires dans des prélèvements sanguins et médullaires ou dans des liquides de ponction, même lorsqu’elles sont faiblement représentées. Elle constitue ainsi une étape essentielle dans le dia-gnostic et le suivi de la plupart des hémopathies malignes en par-ticulier des syndromes lymphoprolifératifs B. La confirmation d’une monotypie, l’existence d’un trou phénotypique, la perte d’expression d’un marqueur physiologique ou l’expression d’un marqueur aberrant permettent de faire suspecter le caractère pathologique de la prolifé-ration. L’immunophénotypage peut permettre ainsi l’identification de la lignée à partir de laquelle dérive la prolifération lymphomateuse, la classification de la pathologie, l’évaluation du pronostic et la détec-tion de la maladie résiduelle minimale (MRD). Parmi les hémopathies chroniques B, la plus fréquente et la mieux caractérisée phénoty-piquement est la leucémie lymphoïde chronique dont le diagnostic est porté par la détermination du score de Matutes/Moreau basé sur l’expression de 5 marqueurs. Dans certaines formes atypiques, se posent des problèmes de diagnostic différentiel avec d’autres syn-dromes lymphoprolifératifs chroniques. La combinaison de certains antigènes permet d’évoquer, avec une spécificité variable, d’autres lymphoproliférations B tels que le lymphome du manteau, le lym-phome folliculaire, la leucémie à tricholeucocytes, le lymphome de la zone marginale, la leucémie prolymphocytaire et les lymphomes lymphoplasmocytaires. De plus, la quantification de la MRD apporte de nouvelles informations significatives dans l’évaluation de la réponse thérapeutique et la prédiction de l’évolution clinique. Principalement développée pour la LLC, la détection de la MRD par CMF doit être restreinte, en l’état actuel de nos connaissances, aux protocoles cli-niques. Cependant, une fois obtenue la standardisation des méthodes, il est à parier que les différentes guidelines seront révisées afin d’y intégrer la surveillance régulière de la MRD.

Cytométrie en flux – syndromes lymphoprolifératifs chroniques B – anticorps monoclonaux – immunophénotypage – maladie résiduelle minimale.

Magali Le Garff-Taverniera,*, Myrto Costopoulosa, Hélène Merle-Bérala

Place de la cytométrie en flux dans le diagnostic et le suivi des syndromes lymphoprolifératifs B

a Service d’hématologie biologiqueGroupe hospitalier Pitié-Salpêtrière-Charles FoixBâtiment de la Pharmacie47-83, bd de l’Hôpital – 75013 Paris

* [email protected]

Dossier scientifique

38 // Revue FRancophone des LaboRatoiRes - Mai 2013 - n°452

1. Introduction

La cytométrie en flux (CMF) permet une évaluation précise des sous-populations cellulaires, même lorsque celles-ci sont faiblement représentées. Le principe repose sur la détection et la quantification de l’expression d’antigènes (Ag) à la surface et dans le cytoplasme des cellules héma-topoïétiques normales et pathologiques. Elle constitue ainsi une étape essentielle dans le diagnostic et le suivi de la majorité des hémopathies malignes : leucémies aiguës et syndromes lymphoprolifératifs chroniques (SLP). Elle permet de préciser la lignée cellulaire de la prolifération (myéloïde ou lymphoïde) ainsi que son degré de diffé-renciation (cellules immatures ou différenciées). Dans le cadre de protocoles, elle est également utilisée comme aide à la classification des gammapathies monoclo-nales ou à l’évaluation de la maladie résiduelle minimale (minimal residual disease ou MRD). En pratique quoti-dienne au laboratoire, la CMF permet ainsi de caractériser de façon rapide et fiable les cellules pathologiques sur toutes suspensions cellulaires : prélèvements sanguins, médullaires ou liquides de ponction (lombaire, ganglion-naire, pleurale, ascite…). Les laboratoires d’hématologie peuvent avoir accès à des cytomètres en flux marqués CE (conformités européennes) pouvant analyser simul-tanément de 5 à 10 « couleurs ». La description d’un grand nombre d’Ag cellulaires a nécessité la création d’un répertoire. Depuis 1982, date du premier Workshop on human leucocyte differentiation antigens ayant eu lieu à Paris, les CD ou clusters de différenciation, sont regroupés dans une classification internationale [1]. Celle-ci fait régulièrement l’objet de mise à jour dont la dernière a eu lieu à Barcelone en 2010 référençant 363 CD (www.hlda9.org). Le groupe European leukemia net (ELN) a également émis des recommandations en 2011, suggérant l’utilisation d’un panel minimal pour l’analyse des SLP, adaptable au sein de chaque laboratoire [2]. Plusieurs groupes nationaux et internationaux travaillent actuellement sur l’élabora-tion de recommandations françaises et européennes, concernant aussi bien le choix des Ag à rechercher que les méthodes de standardisation inter-laboratoires (Groupe d’étude immunologique des leucémies ou GEIL, ELN, Euroflow, etc.), de nombreux marqueurs pouvant être utilisés pour le diagnostic des SLP-B (tableau I) [3].

2. Diagnostic des syndromes lymphoprolifératifs chroniques B

Les cellules lymphomateuses B peuvent être étudiées par CMF sur des prélèvements sanguins dans les formes leucémisées, sur des prélèvements médullaires ou sur des suspensions de cytoponctions ganglionnaires. Après identification de l’appartenance des cellules/tissus patho-logiques à la lignée lymphoïde B, la nature tumorale de la prolifération doit être confirmée par la mise en évi-dence d’une monotypie qui se définit par une restric-tion isotypique (kappa ou lambda) et qui constitue un

critère majeur pour le diagnostic de SLP-B. L’utilisation de marqueurs particuliers permet ensuite l’orientation vers un sous-groupe précis de lymphome.

2.1. La leucémie lymphoïde chronique

2.1.1. DiagnosticLa leucémie lymphoïde chronique (LLC), la plus fré-quente des leucémies de l’adulte dans les pays indus-trialisés, correspond à une prolifération monoclonale de petits lymphocytes B matures dans le sang, la moelle osseuse et les ganglions. D’après les plus récentes recommandations de l’IWCLL (International workshop on CLL) [4], elle ne peut être affirmée que si le nombre de lymphocytes B clonaux sanguins est supérieur ou égal à 5 G/L. En deçà, il convient de parler de lympho-cytose B monoclonale (Monoclonal B-cell lymphocytosis ou MBL). La LLC fait partie des lymphoproliférations chroniques B les mieux définies phénotypiquement et dont les cellules sont facilement accessibles dans le sang périphérique. Suspecté sur l’hémogramme, le diagnostic de LLC est confirmé par l’étude des mar-queurs de membrane par CMF dans le sang. L’appar-tenance des lymphocytes à la lignée B est déterminée par l’expression du marqueur pan-B CD19. La détection d’une chaîne légère kappa ou lambda permet d’affirmer la monotypie et la diminution de son expression reflète la diminution de la densité antigénique du récepteur B à l’antigène (BCR) par rapport aux cellules B normales, qui est une caractéristique de cette maladie. La molécule CD5, habituellement observée à la surface des lympho-cytes T et sur une minorité de lymphocytes B à l’état normal, et le CD23, marqueur d’activation des cellules B, sont retrouvés de façon quasi constante à la surface des lymphocytes pathologiques. Ces caractéristiques immunophénotypiques de la LLC ont permis de définir un score décrit par Matutes en 1994 [5] puis réévalué par Moreau en 1997 [6] en donnant une valeur de 1 à chacun des éléments suivants : positivité du CD5 et du CD23, négativité ou faible expression du FMC7 (qui iden-tifie un épitope du complexe multimérique CD20), faible expression du CD79b (qui reconnaît la chaîne β associée au BCR) ou du CD22, et faible intensité d’expression de la chaîne légère kappa ou lambda (tableau II). La LLC est définie par un score de Matutes/Moreau à 4 ou 5.

Tableau II - Score de Matutes/Moreau [5, 6].

Marqueurs Points

0 1

Intensité des Ig de surface

Modérée/Forte Faible

CD5 - +

CD23 - +

FMC7 + Faible/-

CD22 ou CD79b + Faible/-

La somme des points obtenus donne le score de Matutes qui est ≥ 4 dans les LLC. Un score égal à 3 permet d’évoquer une LLC de phénotype atypique ou un autre SLP-B et un score < 3 exclut le diagnostic de LLC.+ : expression positive, - : absence d’expression



Tableau I – Antigènes d’intérêt dans le diagnostic et le suivi des syndromes lymphoprolifératifs chroniques B.

Marqueur Expression normale SLP-B

CD5 Lymphocytes T et minorité de lymphocytes B LLC, LCM

CD10Lymphocytes B et T immatures (centre germinatif), polynucléaires neutrophiles, minorité de lymphocytes B et T matures

LF

CD11c Quelques lymphocytes B et T HCL. Parfois faible expression dans LLC, LPL, LZM, SLVL

CD19 Lymphocytes B et plasmocytes Marqueur de la lignée B

CD20 Lymphocytes B Marqueur de la lignée B. Faible intensité d’expression dans LLC

Chaînes légères (kappa et lambda)

en surfaceLymphocytes B Indicateur de restriction isotypique

Chaînes légères (kappa et lambda)

en intracytoplasmiquePlasmocytes, lymphocytes B Indicateur de restriction isotypique

CD22 Lymphocytes B Marqueur de la lignée B. Faible intensité d’expression dans LLC

CD23Faiblement positif dans les lymphocytes B matures. Expression augmentée lors de l’activation.

Diagnostic différentiel LLC et autre syndrome lymphoprolifératif chronique CD5+

CD24 Expression intermédiaire sur précurseurs B et T. LZM

CD25 Lymphocytes B et T activés.HCL, associé à CD103, CD11c et CD123. Rares LPL, LZM, LCM, MW

CD27Marqueur d’activation des lymphocytes T. Lymphocytes B mémoires.

LLC, SLVL, MZL, LPL-MW

CD38Cellules centro-folliculaires, cellules T immatures, plasmocytes

Différenciation plasmocytaire Marqueur pronostique dans la LLC

CD43 Lymphocytes T et minorité de lymphocytes BExpression aberrante dans la LLC Rares LCM et LZM

CD45 Marqueur pan-leucocytaireIntérêt pour la distinction des hémopathies matures et immatures

CD49d Lymphocytes B, T, NK, monocytes, plasmocytes Marqueur pronostique dans la LLC

CD79bPrécurseurs B, plasmocytes. Expression variable sur lymphocytes B

Marqueur de la lignée B. Faible intensité d’expression dans LLC

CD81 Lymphocytes B et T Intérêt diagnostique dans le MM. MRD LLC

CD103 Minorité de lymphocytes B. HCL et rares MZL

CD160 Lymphocytes NK et T CD8 HCL (LLC ?)

CD200Macrophages, cellules dendritiques, mastocytes, polynucléaires, lymphocytes B, lymphocytes T activés

Diagnostic différentiel LLC/LCM

FMC7 Lymphocytes B maturesDiagnostic différentiel LLC/LCM et autre syndrome lymphoprolifératif CD5+

Bcl-2 Lymphocytes T, minorité de lymphocytes B FL

ZAP-70 Lymphocytes T, NK, précurseurs B Marqueur pronostique dans la LLC

MRD : maladie résiduelle minimale, LLC : leucémie lymphoïde chronique, LF : lymphome folliculaire, LCM : lymphome du manteau, LZM : lymphome de la zone marginale, LPL-B : leucémie à prolymphocytes B, MM : myélome multiple, LPL-MW : lymphome lymphoplasmocytaire/maladie de Waldenström, SLP-B : syndrome lymphoprolifératif chronique B, SLVL : lymphome splénique à lymphocytes villeux, HCL : hairy cell leukemia (leucémie à tricholeucocytes). Adapté d’après Craig et al. (3)



La figure 1 illustre le profil phénotypique d’une LLC avec un score de Matutes à 5. Un score strictement inférieur à 3 exclut une LLC. Des cas de lymphoproliférations avec un score ambigu à 3 font évoquer une LLC de phénotype atypique ou un autre SLP-B. L’antigène pan-B mature CD20, dont l’expression à la surface des cellules de LLC est plus faible que sur les cellules B normales, apporte un argument complémentaire pour le diagnostic de LLC (tableau III). D’autres marqueurs sont fréquemment associés tels que le CD43 et le CD200 [7]. Le CD160 a été récemment retrouvé présent sur les cellules de LLC, bien que ce résultat soit controversé ([8] et données personnelles).

2.1.2. Facteurs pronostiquesLe pronostic de la LLC est longtemps resté basé sur la classification clinico-biologique de Binet (stades A, B ou C), principalement utilisée en Europe, et celle de Rai (stades I à IV) principalement aux Etats-Unis. Cependant ces classifications ne permettent pas de prédire, parmi le groupe hétérogène des patients en stades précoces, ceux qui vont évoluer vers un stade avancé. Depuis une quin-zaine d’années, de nouveaux facteurs pronostiques ont été identifiés, permettant de prédire le risque de progression et pour certains, de résistance au traitement. Seuls ceux évalués par CMF seront présentés ici.Le CD38 est une glycoprotéine membranaire traduisant la prolifération et la maturation cellulaire et qui est impliquée dans la signalisation. D’abord proposé comme marqueur de substitution à l’étude du statut mutationnel des gènes codant pour la partie variable des chaines lourdes des immunoglobulines (gènes IGHV), le CD38 a été finale-ment retenu comme facteur prédictif indépendant [9], son expression étant associée à un mauvais pronostic et à une évolution rapide de la maladie. Le seuil de positivité n’est pas encore clairement établi bien qu’il soit généralement fixé à 30 %. L’attitude de plus en plus souvent adoptée consiste à noter le pourcentage de cellules CD38+, qui correspondrait à une part proliférative de la population tumorale. Des études italiennes récentes ont rapporté une bonne corrélation entre l’expression du CD38 et du marqueur d’adhésion CD49d [10] dont l’expression aurait une valeur prédictive sur la survie globale et le délai avant traitement, mais ce marqueur reste peu utilisé en pratique.La détection de l’expression de ZAP-70 (Zeta associated protein 70 kDa) par marquage intracytoplasmique peut être réalisée par CMF. ZAP-70 est une tyrosine kinase retrouvée à l’état normal dans les lymphocytes T et les cellules NK. Son expression aberrante dans les cellules B de LLC est associée à un pronostic défavorable. La mesure de ZAP-70 a été initialement proposée comme facteur substitutif de l’état mutationnel des gènes IGHV [11], mais il est apparu secondairement que ces deux facteurs n’étaient pas strictement corrélés. Si la valeur pronostique de la pro-téine ZAP-70 dans la LLC a été confirmée, la méthode de détection optimale et une standardisation de la technique de dosage restent à déterminer. Plusieurs équipes dont la nôtre ont participé à des travaux d’harmonisation, au niveau national dans le cadre d’un protocole de soutien aux innovations thérapeutiques coûteuses (STIC) [12] et au niveau international au sein du groupe de l’European research initiative on CLL ou ERIC [13].

Le CD23, récepteur de basse affinité des IgE, est une glycoprotéine transmembranaire qui peut être clivée en fragments solubles. Sa forme soluble (sCD23) peut ain-si être détectée par CMF grâce à des techniques CBA (Cytometry binding array) (Grelier A. et al., article soumis). La valeur prédictive du taux de sCD23 sur la survie globale a été évaluée par plusieurs équipes : l’augmentation du taux de sCD23 est associée à des caractéristiques défavorables comme une infiltration diffuse de la moelle osseuse, une diminution du temps de doublement de la lymphocytose et une progression rapide de la maladie dans les formes précoces de LLC [14, 15].Dans la LLC, la présence d’une délétion du bras court du chromosome 17 (del17p) où est localisé le gène sup-presseur de tumeur TP53, s’accompagne d’une maladie à un stade avancé au diagnostic, d’un raccourcissement du délai entre diagnostic et début de traitement, d’un risque majeur de résistance aux chimiothérapies (agents alkylants et analogues des purines), et en conséquence aboutit à un net raccourcissement de la survie. Étant donné l’importance de la stratégie thérapeutique à établir pour ces patients, et la multiplicité des nouvelles thérapeutiques ciblées actuellement développées, l’identification précoce d’un dysfonctionnement de la protéine p53 est devenu un enjeu majeur. La protéine p53 joue un rôle important dans la réponse aux dommages de l’ADN, l’apoptose et la régu-lation du cycle cellulaire. Dans un grand nombre de cas, la del17p est associée à une ou plusieurs mutations sur l’autre allèle qui inactivent p53. Bien qu’il y ait des contro-verses, les mutations de TP53, en présence ou non d’une del17p, semblent corrélées à un pronostic défavorable. Cependant, toutes les mutations n’induisent probablement pas les mêmes conséquences sur la voie p53 et une dys-fonction de p53 peut être le résultat d’autres mécanismes [16]. C’est pourquoi plusieurs équipes, dont la nôtre, ont mis au point des tests mesurant la fonctionnalité de la p53 [17, 18]. Au sein d’un groupe européen rattaché à l’ERIC, nous évaluons les différentes méthodologies permettant la détection de ces anomalies fonctionnelles [19].

2.2. Lymphome lymphocytiqueLe lymphome lymphocytique à petites cellules (SLL pour small lymphocytic lymphoma) selon la classification de l’OMS [20] est un SLP chronique constitué de petits lymphocytes, à noyau arrondi ou discrètement irrégulier, observés dans la moelle, la rate et les ganglions, et dont l’infiltration sanguine, inconstante, est inférieure à 5 G/L. Les SLL se différencient des LLC par la lymphocytose périphérique, alors que les cellules pathologiques ont le même profil phénotypique : elles expriment le CD5 et le CD23, sont négatives pour le FMC7 et le CD79b, et l’Ig monotypique kappa ou lambda, retrouvée à la surface des cellules pathologiques est de faible intensité (score de Matutes/Moreau à 4 ou 5).

2.3. Leucémie prolymphocytaire BLa leucémie prolymphocytaire B (LPL-B) est une entité qui a été longtemps controversée car son profil immunologique est mal défini. Elle peut survenir d’emblée ou au décours d’une LLC. Elle se manifeste par la présence d’une franche hyperlympho-cytose constituée d’au moins 55 % de prolymphocytes [20].



Figure 1 – Diagnostic d’un cas de LLC.

Les lymphocytes (en violet), représentant 43 % des globules blancs, sont repérés par leur forte expression du CD45 et par leur structure « peu complexe ». Les lymphocytes B (en vert) sont isolés des lymphocytes totaux par leur expression du CD19. Les cellules de LLC (en rouge), représentant 88 % des lymphocytes B, présentent ici des caractéristiques typiques : monotypie lambda de faible intensité, CD5+, CD23+, CD79b de faible intensité, FMC7- (score de Matutes/Moreau à 5). Elles sont également CD20+ de faible intensité et CD43+. En comparaison, la population B résiduelle normale est visualisée en vert. Ce phénotype permet de porter le diagnostic de LLC.

Tableau III – Caractéristiques phénotypiques des syndromes lymphoprolifératifs chroniques B.

LLC LPL-B LCM LF LZM HCL SLVL LPL-MW

CD19 + + + + + + + +

CD5 + +/- + - - / + - - / + -

CD23 + - - - / + - - - / + -

sIg Faible ou - ++ ++ ++ ++ +++ +++ Faible à moyenne

FMC7 Faible ou - + + + ++ ++ +++ +/-

CD22 Faible ou - + + + + ++ ++ +

CD79b Faible ou - + + + + + ++ +

CD10 - - / + - +/- - - / + - -

CD103 - - - - - / + + - -

CD11c - / + - - - +/- + + -

CD25 - / + - - - +/- + - +

CD43 ++ - - / + - - - / + - -

CD20 Faiblement + + + + + ++ ++ +

+ : généralement positif ; - : généralement négatif ; +/- : habituellement positif mais peut être négatif ; -/+ : habituellement négatif mais peut être positif.sIg : immunoglobulines de surface (évaluées par l’expression des chaînes légères kappa ou lambda), LLC : leucémie lymphoïde chronique, LPL-B : leucémie à prolymphocytes B, LCM : lymphome du manteau, LF : lymphome folliculaire, LZM : lymphome de la zone marginale, HCL : hairy cell leukemia (leucémie à tricholeucocytes), LPL-MW : lymphome lymphoplasmocytaire/maladie de Waldenström



La distinction avec les variants blastoïdes de lymphome à cellules du manteau (LCM), les lymphomes de la zone marginale (LZM) et les LLC avec un petit contingent de prolymphocytes peut être délicate en utilisant uniquement des critères morphologiques. Le diagnostic différentiel avec les LZM est d’autant plus difficile que la LPL-B peut s’accompagner très souvent d’une splénomégalie. Les pro-lymphocytes sont des cellules lymphoïdes de taille moyenne, caractérisées par un nucléole central unique. Le phénotype est celui d’une cellule B mature, CD22/CD79b+, CD23/CD10- et exprimant fortement les chaînes légères des Ig. Le CD5 est retrouvé dans environ 1 cas sur 2, le CD11c et le CD25 plus rarement [21] (tableau III). Le prolymphocyte serait issu d’une cellule B mémoire après passage dans le centre germinatif, mais sa contrepartie normale n’est pas clairement identifiée.

2.4. Lymphome du manteauLe LCM, peu fréquent (7 % des lymphomes), se présente le plus souvent sous une forme généralisée avec une atteinte médullaire (retrouvée dans 80 % des cas) et une dissémination sanguine fréquente (50 à 80 %), avec ou sans hyperlymphocytose. Les cellules du LCM, dont l’aspect cytologique est hétérogène et parfois difficile à distinguer des autres SLP [20], expriment les marqueurs pan-B, CD19 et CD20, une Ig de surface de type IgM souvent associée à une IgD. Le LCM est caractérisé, comme la LLC, par l’expression quasi constante du CD5 mais s’en différencie par la négativité du CD23 [22] et

un score de Matutes inférieur à 3 avec une expression forte du CD20 et du CD79b (tableau III et figure 2). Le LCM est fréquemment associé à la translocation t(11 ;14) impliquant les gènes de la cycline D1 (Bcl-1) et des IgH. La recherche de la cycline D1, activateur du cycle cellulaire, met en évidence son hyperexpression dans le LCM et en constitue un bon marqueur (bien que non totalement spécifique). Il est également possible de quantifier l’index de prolifération à l’aide de l’anticorps anti-Ki-67, variable au sein du tissu tumoral d’un patient à l’autre. Le pourcentage de cellules Ki-67+ a donc une valeur pronostique. Le CD200 prend une place de plus en plus prépondérante dans le diagnostic différentiel entre le LCM (CD200-) et la LLC de phénotype atypique (CD200+, score de Matutes à 3) [7]. L’équivalent normal serait la cellule B naïve de la zone du manteau, princi-palement de type pré-centre germinatif.

2.5. Lymphome folliculaireBeaucoup plus fréquent (20 à 35 % des lymphomes), le lymphome folliculaire (LF), dont le diagnostic est ana-tomopathologique, se présente souvent d’emblée sous forme disséminée. L’infiltration médullaire est fréquente mais l’envahissement sanguin ne dépasse pas 10 % des cas. L’immunophénotype se caractérise par la présence du CD10, physiologiquement exprimé sur les cellules du centre germinatif et dans la majorité des cas par l’absence de CD5 et de CD23, qui permettent le diagnos-tic différentiel avec la LLC (tableau III et figure 3) [23].

Figure 2 – Diagnostic d’un cas de lymphome du manteau.

Les cellules lymphomateuses B apparaissant en rouge sont monotypiques lambda de forte intensité, CD5+, CD79+, FMC7+, CD23-. Ce phénotype est compatible avec le diagnostic de lymphome du manteau.

Figure 3 – Diagnostic d’un cas de lymphome folliculaire.

La population pathologique monotypique lambda (en rouge) exprime le CD10 en grande majorité (65 %).



L’Ig de surface monoclonale est en général une IgM, parfois une IgG, rarement une IgA. L’analyse cytogé-nétique met en évidence une translocation t(14 ;18) qui juxtapose l’activateur du gène des IgH et le pro-to-oncongène Bcl2. Bcl2 confère alors des propriétés anti-apoptotiques et peut être détecté par CMF par des méthodes de marquage intracytoplasmique [24]. L’équivalent physiologique serait le centrocyte du centre germinatif des ganglions.

2.6. Leucémie à tricholeucocytesLes tricholeucocytes ont un profil phénotypique spéci-fique qui permet leur caractérisation aisée par CMF. Leurs paramètres taille/structure les rapprochent des mono-cytes. Classiquement, ce sont des cellules B matures identifiables grâce à l’expression simultanée et quasi constante de 3 marqueurs : i) le CD103, une intégrine presque spécifique de ce type de lymphome ; ii) le CD11c autre intégrine retrouvée sur des sous-populations de lymphocytes B et T ; iii) le CD25 qui correspond à la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (figure 4). Plus récem-ment ont été décrites à la surface du tricholeucocyte les fortes expressions du CD305 (LAIR-1) et du CD123 qui correspond à la chaîne α du récepteur à l’IL-3. Le score de Matutes est presque toujours < 2. L’équivalent normal serait une cellule B mémoire activée à un stade tardif de maturation (cf. chapitre consacré à la leucémie à tricholeucocytes – Pr Xavier Troussard).

2.7. Lymphomes de la zone marginaleLe terme de lymphome de la zone marginale (LZM) regroupe 3 catégories : le lymphome du MALT (muco-sae associated lymphoid tissue) le plus souvent de localisation digestive, le LZM splénique caractérisé par la présence de lymphocytes villeux circulants (splenic lymphoma with villous lymphocytes ou SLVL) et le LZM ganglionnaire. Ces entités ont des caractéristiques phénotypiques communes mais n’ont pas de mar-queur spécifique et correspondent, du point de vue de l’immunomarquage, à un diagnostic d’élimination. Les cellules lymphomateuses sont généralement for-tement positives pour les marqueurs pan-B et peuvent exprimer le CD11c et le CD103 (tableau III). Elles sont le plus souvent CD5/CD23- [25]. Cependant, il existe des formes CD5+ ce qui peut rendre le diagnostic particulièrement difficile. La présence de cellules avec co-expression du CD38 et de CD138 traduisant une différenciation plasmocytaire est observée dans une proportion significative de LZM. Le CD27 et le CD24 peuvent être d’une aide précieuse pour distinguer les LZM (généralement positifs) et les lymphomes splé-niques diffus de la pulpe rouge de la rate (générale-ment négatifs) [26]. La sous-classe des SLVL diffère des LZM non villeux par l’expression fréquente du CD103 et du CD11c mais d’intensité plus faible que les tricholeucocytes [25]. L’équivalent physiologique serait la cellule B de la zone marginale du ganglion à un stade post-centre germinatif.

2.8. Lymphomes lymphoplasmocytaires – Maladie de WaldenströmLes lymphomes lymphoplasmocytaires (LPL) se caracté-risent par une prolifération polymorphe de petits lympho-cytes, lymphoplasmocytes et plasmocytes, envahissant habituellement la moelle, et qui ne possède aucun des critères des autres SLP chroniques B avec différencia-tion plasmocytaire. La maladie de Waldenström (MW) définie par une infiltration médullaire par des lympho-plasmocytes et l’existence d’une protéine monoclonale de type IgM, fait partie de cette entité. Les cellules tumorales peuvent disséminer dans le sang, le plus souvent en faible quantité. Dans les cas de MW avec un clone B circulant, le phénotypage met en évidence une expression modérée des Ig de surface ainsi que des marqueurs pan-B (tableau III). Le score de Matutes est, dans la majorité des cas, inférieur à 3. Le CD5 est d’expression variable, le CD23 et le CD10 sont rarement exprimés, contrairement aux CD25, CD22 et CD38 [27]. Ce dernier est faiblement exprimé dans un tiers à deux tiers des cas reflétant probablement la nature lympho-plasmocytaire du clone. Cependant, aucun marquage spécifique n’a été formellement identifié. Une hétérogé-néité intraclonale immunophénotypique a été rapportée (cf. chapitre consacré à la maladie de Waldenström – Pr Véronique Leblond).

La CMF joue donc un rôle diagnostique essentiel dans les différents SLP-B. Elle peut également permettre d’évoquer une hémopathie biclonale, comme cela peut

Figure 4 – Diagnostic d’un cas de leucémie à tricholeucocytes.

Les tricholeucocytes (en rouge) représentent ici 91 % des lymphocytes B et ont une « structure complexe ». Monotypiques lambda, ils présentent un profil phénotypique caractéristique : CD103+, CD11c+, CD25+. Ce phénotype permet de porter le diagnostic de leucémie à tricholeucocytes.



être le cas dans la LLC (figure 5). Ceci représente un piège potentiel puisque la restriction isotypique (kappa ou lambda) peut devenir difficilement détectable ! De la même façon, la CMF permet de poser des diagnostics de double hémopathie (figure 6).

3. Suivi des syndromes lymphoprolifératifs chroniques B

Dans les différents SLP-B que nous venons de décrire, le phénotypage peut être répété pendant le suivi de la maladie. Il permet de quantifier la variation des cellules patholo-giques au cours de l’évolution, de mesurer l’efficacité d’un traitement, de détecter pré-cocement une rechute et potentiellement l’apparition d’un nouveau clone. Dans ces différentes indications, l’évaluation de la réponse au traitement (recherche de cel-lules pathologiques au cours ou au décours immédiat du traitement) et surtout l’évalua-tion de la MRD (recherche de cellules patho-logiques à distance de l’arrêt du traitement) sont actuellement en plein essor. En effet, l’introduction dans l’arsenal thérapeutique, il y a une quinzaine d’années, de l’anti-corps monoclonal anti-CD20 rituximab, a transformé la prise en charge des patients atteints de SLP-B, améliorant profondé-ment la qualité et la durée de la réponse au traitement et permettant d’obtenir des taux de rémission complète élevés. De plus récents développements thérapeutiques sont également très prometteurs et pour-raient permettre d’entrevoir une possibi-lité de guérison chez ces patients toujours actuellement incurables.

3.1. Considérations techniquesPour évaluer la MRD, deux grands types d’approches ont été développés : la CMF et la biologie moléculaire. Le choix de la méthode à utiliser dépend en grande partie de l’hémopathie, du type de traitement suivi mais également du moment de l’évalua-tion post thérapeutique. La CMF est rapi-dement apparue comme une technologie solide pour la surveillance de la MRD. Pour cela, il est indispensable que les cellules tumorales présentent des caractéristiques phénotypiques particulières, permettant une distinction avec les cellules normales environnantes. Bien que cette discrimi-nation soit le plus souvent aisée dans le sang périphérique, elle peut être plus déli-cate dans les échantillons médullaires, en raison de la présence de précurseurs B

Figure 5 – Diagnostic d’un cas de LLC biclonale.

Les lymphocytes B CD19+ sont majoritairement représentés (91 % des lymphocytes totaux) et ont des caractéristiques phénotypiques de LLC : CD5+, CD23+, CD79b et CD20 faiblement exprimés, FMC7-, et CD43+. Cependant, deux populations de lymphocytes B sont observées : l’une monotypique kappa (en bleu) et l’autre monotypique lambda (en rouge). Ce phénotype permet d’évoquer le diagnostic de LLC biclonale qui sera à conforter par une étude de la clonalité B par biologie moléculaire.

Figure 6 – Diagnostic d’un cas de double hémopathie : LLC et leucémie à tricholeucocytes.

La population B de LLC apparaît en rouge et est monotypique kappa de faible intensité, CD5/CD23+, CD79/CD20+ de faible intensité, FMC7-. Une seconde population de lymphocytes B (en bleu) est monotypique lambda, CD103/CD25+, CD5/CD23- et correspond à des tricholeucocytes. Ce phénotype est compatible avec le diagnostic de double hémopathie lymphoïde B associant une LLC et une leucémie à tricholeucocytes.



à différents stades de la maturation nor-male (hématogones) qui peuvent parta-ger des caractéristiques phénotypiques avec certaines cellules pathologiques. Ces dernières années, la détection de la MRD par multifluorescence (au moins 5 « cou-leurs » mesurées simultanément) a permis d’en améliorer la sensibilité (en augmen-tant le nombre d’événements traités) et la spécificité (en augmentant le nombre de marqueurs analysés simultanément par cellule). Ces nouvelles techniques néces-sitent l’enregistrement d’un grand nombre de cellules, ce qui induit des conséquences sur les étapes préanalytiques : (i) prise en charge rapide du prélèvement, idéalement en moins de 24 h, (ii) lyse des globules rouges par des techniques dites « macro-volume » permettant de travailler sur de plus grandes quantités de prélèvement. La stratégie d’analyse utilisée est égale-ment particulièrement importante, pou-vant conditionner les performances de la CMF. Des algorithmes spéciaux per-mettant une séparation automatisée des populations sont maintenant disponibles dans de nouveaux logiciels d’analyse (par exemple Infinicyt®, Cytognos ou Kaluza®, Beckman Coulter). Commercialisés récemment pour faciliter l’interprétation des nombreuses données cytométriques générées par la multifluorescence, ils permettent de transformer des informa-tions multidimensionnelles en une seule représentation graphique (figures 7 et 8). Il sera intéressant d’évaluer leur apport potentiel dans les techniques de recherche de MRD par CMF.Enfin, la variabilité des performances en fonction des techniques introduit la notion de terminologie à utiliser. En effet, la notion de MRD indétectable (à un seuil donné) devrait être préférée à l’appellation MRD négative, puisque cette dernière n’a pas la même signification selon le type de tech-nique utilisée. Un patient avec une MRD positive à 10-4 avec une technique aurait une MRD indétectable avec une autre tech-nique dont la limite de détection serait plus faible, par exemple à 10-2.

3.2. évaluation de la MRD dans la LLCL’évaluation de la MRD par CMF est particulièrement adaptée à la LLC, car ces cellules tumorales présentent des caractéristiques phénotypiques particulières et com-munes à l’ensemble des patients et elles sont systéma-tiquement présentes dans le sang et la moelle osseuse. Cette étude par CMF est ainsi virtuellement applicable à tous les patients, même en l’absence d’évaluation phéno-typique pré-thérapeutique, et a l’avantage d’être réalisable

Figure 7 – Mise en évidence des différentes populations lymphocytaires B pouvant être retrouvées dans une moelle de patient LLC après traitement.

A. Cet exemple, correspondant au mélange d’une moelle régénérative et d’un sang de patient LLC, montre que le choix des marqueurs appropriés, comme le CD5, CD43, CD22, CD81 et CD20, permet d’isoler les cellules de LLC (en rouge) malgré la présence de lymphocytes B normaux (en vert) et d’hématogones (en marron).

B. Certaines fonctions des nouveaux logiciels d’analyse (ici la fonction « radar » du logiciel Kaluza®) permettent, à l’aide d’algorithmes spéciaux, une séparation automatisée des populations avec une visualisation de l’ensemble des marqueurs sur une seule représentation graphique

Figure 8 – Evaluation de la MRD sanguine chez un patient atteint de LLC après immuno-chimiothérapie.

A. Les cellules de LLC (en rouge) restent détectables et peuvent être isolées des lymphocytes B normaux (en vert) grâce à la même combinaison d’Ac que celle présentée dans la figure 7. Cette population de LLC est présente en très faible quantité et a été évaluée à 4x10-4 (par rapport aux leucocytes totaux).

B. La séparation automatisée des populations a également permis de visualiser les lymphocytes de LLC. Cependant, l’utilisation de ces logiciels n’est pas validée à ce jour pour les techniques de recherche de MRD par CMF.

sur du sang périphérique. Cependant, bien que l’analyse y soit plus délicate, il a été suggéré une meilleure sensibilité de la CMF dans les prélèvements médullaires, ce qui per-mettrait une détection plus précoce d’une MRD positive.Initialement basées sur la co-expression CD5/CD19+, les premières approches cytométriques dites de basse réso-lution présentaient des sensibilités limitées par la présence potentielle de cellules B polyclonales CD5+ de régénération,



À l’heure actuelle, ces dernières techniques sont ainsi privilégiées par rapport aux techniques de CMF.

3.4. Corrélations MRD et évolution cliniqueDans les lymphomes B, une rémission complète clinique (CR) selon les critères de réponse standard conduit à une plus longue survie sans maladie. La positivité du TEP scan-ner (tomographie par émission de positons) mais non la détection de la MRD exclut une CR dans les lymphomes. Cependant, il y a maintenant de plus en plus de preuves, à partir de données aussi bien rétrospectives que prospec-tives, que l’obtention d’une rémission biologique complète, c’est-à-dire l’absence de cellules tumorales détectables par des méthodes standards (PCR ou CMF), conduise à une survie sans maladie plus longue que celle observée chez les patients en CR avec une MRD persistante [32, 33]. Le LF a été le premier SLP-B dans lequel la détection de la MRD a été pratiquée. Ces travaux pionniers ont démontré la pertinence pronostique de cette détection, que ce soit en post autogreffe [34], ou pendant et après une chimiothéra-pie intensive conventionnelle [35]. Depuis, d’autres études ont confirmé la valeur prédictive majeure de la détection MRD dans le LF pour identifier le risque de rechute après immuno-chimiothérapies et son évaluation est effectuée très majoritairement par PCR quantitative en temps réel. Dans le LCM, les données de la littérature montrent que la détection de la MRD après traitement est un facteur prédictif de rechute et, comme pour le LF, la PCR clonospécifique est actuellement le gold standard pour la détection et la quantification des cellules tumorales résiduelles, laissant peu de place pour la CMF.C’est ainsi à nouveau dans la LLC que les données publiées sur les corrélations entre l’évolution clinique et la quan-tification de la MRD par CMF sont les plus nombreuses. Elles ont montré qu’un niveau de MRD indétectable était associé à un temps de survie sans progression (PFS) plus long que celui observé chez les patients avec une MRD positive (revue dans [36]). Il est à noter que la proportion de patients LLC atteignant une MRD indétectable après immunochimiothérapie est variable en fonction des études, en raison des différentes méthodes utilisées (sensibilités de 10-2 à 10-5) et des différents points d’évaluation. Récem-ment, la signification pronostique de la quantification de la MRD par CMF de haute sensibilité a été démontrée dans l’essai randomisé CLL8 du groupe allemand d’étude de la LLC (GCLLSG) [33]. Ainsi, quels que soient les types de traitements et les facteurs biologiques pronostiques, les patients de cette cohorte stratifiés sur des niveaux de MRD < 10-4, compris entre 10-4 et 10-2 et > 10-2, présentent des différences significatives de la PFS et de la survie glo-bale (OS). Cette signification pronostique des niveaux de MRD évalués par CMF a pu être retrouvée dans un essai indépendant appliquant des traitements différents [37] ainsi que par d’autres groupes.Ainsi, bien qu’une MRD indétectable ne soit actuellement pas incluse dans la définition de la rémission complète de l’IWCLL [4], elle est de plus en plus utilisée comme critère d’évaluation secondaire ou même principal dans les essais cliniques. La question de l’importance de l’éradication de la MRD chez les patients atteints de LLC nécessite encore des études plus approfondies dans de grands essais contrôlés,

dont le phénotype peut se superposer, au moins partiel-lement, avec les cellules pathologiques. Actuellement, les techniques dites de haute résolution sont privilégiées dans la majorité des études cliniques. En 2007, le groupe européen ERIC a proposé une approche internationale standardisée après comparaison de diverses combinaisons d’Ac monoclonaux à la PCR spécifique d’allèle (ASO-PCR), gold standard permettant d’atteindre des sensibilités très élevées [28]. Les marqueurs CD5/CD19, associés aux CD20/CD38, CD81/CD22 ou CD79b/CD43 étaient les meilleurs pour détecter la MRD avec de faibles variations inter-laboratoires, de faibles taux de faux positifs et une précision de plus de 95 % et sont ainsi retenus pour les évaluations actuelles. Une nouvelle méthode standardisée en 6 « couleurs » vient d’être publiée par le groupe ERIC, nécessitant moins de réactifs, moins de temps technique et une approche analytique plus simple [29]. Les résultats de cette étude montrent que lorsque de grands nombres de cellules sont analysés, les techniques de CMF en 4 et 6 « couleurs » peuvent détecter des cellules de LLC à des taux de 10-5 à 10-4, plaçant la limite de détection de la MRD par CMF au même niveau que les techniques de biolo-gie moléculaire à haute sensibilité (RQ-PCR-ASO IGH et séquençage à haut débit) [30]. Actuellement, en France, des combinaisons associant de 6 [31] à 10 « couleurs » sont en cours d’évaluation dans différents essais cliniques français de l’intergroupe GCFLLC/MW-GOELAMS. Deux exemples de détection de MRD sont représentés sur les figures 7 et 8. Bien que controversée, la recherche de la monotypie de la chaine légère kappa ou lambda dans ces combinaisons multiparamétriques est d’une aide précieuse pour confirmer le caractère clonal.

3.3. évaluation de la MRD dans les autres SLP-BLes tricholeucocytes sont également caractérisés par un phénotype très particulier en raison de la co-expression des marqueurs CD103, CD25 et CD11c, ce qui fait de la leucémie à tricholeucocytes une autre hémopathie de choix pour l’évaluation de la MRD. Dans certains cas difficiles avec perte d’expression du CD103, il est possible d’étudier le CD123 et le LAIR-1, positifs sur les tricholeucocytes. Cependant, étant donné la rareté de cette hémopathie et son faible passage sanguin, l’évaluation de la MRD par CMF est beaucoup moins bien documentée que dans la LLC.Le LF et le LCM sont également de bons candidats pour les études de MRD en raison de leur fréquence relati-vement élevée (20 à 35 % pour les LF et 7 % pour les LCM), de leur tendance à une infiltration médullaire et une dissémination sanguine, ainsi que leur grande sen-sibilité aux immuno-chimiothérapies récentes. Le FL et le LCM présentent également certaines caractéristiques phénotypiques, respectivement la positivité du CD10 et l’association CD5+CD23- qui, associées à la monotypie de la chaîne légère, peuvent être exploitées pour recher-cher une MRD. Cependant, ces deux hémopathies pré-sentent des aberrations chromosomiques spécifiques et très bien caractérisées, t(14 ;18) ou t(11 ;14), pouvant servir de cible pour une détection de la MRD par PCR ayant des sensibilités très élevées (< 10-4 chez la majorité des patients) ainsi qu’un haut niveau de standardisation.



où les patients devraient être stratifiés non seulement en fonction des données cliniques, mais aussi des facteurs biologiques pronostiques tels que la cytogénétique, le statut mutationnel des IGVH, les mutations de nouveaux gènes récemment impliqués dans cette hémopathie ou l’expression du CD38 et ZAP -70 (cf. chapitre consacré à la leucémie lymphoïde chronique – Pr Florence Cymbalista).

4. Conclusion

En conclusion, malgré l’intérêt pratique de la plupart des approches de CMF utilisées pour la surveillance de la MRD dans les hémopathies, celle-ci n’est réellement dévelop-pée dans les SLP-B que pour la LLC. En effet, plusieurs obstacles existent encore pour que cette approche soit généralisable à tous les SLP-B : (i) la nécessité d’avoir une combinaison phénotypique spécifique des cellules tumorales, (ii) la présence possible de modifications phé-

notypiques après traitement, (iii) la nécessité de sensibili-tés très élevées, (iv) les niveaux limités de standardisation obtenus à ce jour. Les développements présents et futurs de l’évaluation de la MRD par CMF devront avoir pour objectif de résoudre ces limitations. Ceci est particulière-ment important puisque l’éradication de la MRD apparaît comme un objectif dans certains essais cliniques en cours que ce soit dans la LLC, le LF ou le LCM. À l’avenir, une fois obtenue la standardisation des méthodes, il est à parier que les différentes guidelines seront révisées afin d’y intégrer ce critère. D’ici là, certaines questions d’ordre pratique seront également à résoudre : (i) Sommes-nous prêts pour un traitement fondé sur la quantification de la MRD ? (ii) La MRD doit-elle être analysée sur des échan-tillons de sang et/ou de moelle osseuse ? (iii) A quelle fréquence et combien de temps doit-on suivre la MRD ?

Déclaration d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.

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