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Université d’Oran Es-Sénia Faculté des Sciences – Département de Biologie

Laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique

MEMOIRE

Pour l’obtention du Diplôme de

MAGISTER

En Nutrition Clinique et Métabolique

Présenté par

DEHIBA Faiza

Soutenu le 2009, devant le jury

Président :

Pr. M. BOUCHENAK Université d’Oran Es-Sénia

Directeur de mémoire :

Pr. MY. LAMRI - SENHADJI Université d’Oran Es-Sénia

Examinateurs :

Pr. O. KHEROUA Université d’Oran Es-Sénia

Dr. K. MEKKI Université d’Oran Es-Sénia

Dr. H. HAMOU Université de Tiaret

Effets comparés des protéines de pois chiches et de la caséine combinées à un mélange d’huiles végétales ou une huile de

poisson sur le statut redox chez des rats consommant un régime enrichi en cholestérol

Sommaire

INTRODUCTION…………………………………………………………… 1

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE………………………………………….. 5

I. Stress oxydatif…………………………………………………………………… 5

I.1. Mécanisme prooxydant………………………………………………………. 5

I.1.1. Origine et régulation des espèces réactives de l’oxygène………………….. 5

I.2. Stress oxydant et conséquence cellulaire…………………………………….. 6

1.2.1. La peroxydation lipidique………………………………………………….. 6

1.2.2. Oxydation protéique……………………………………………………….. 7

II. Mécanisme antioxydant…………………………………………………………. 8

II.1. Les systèmes de défenses antioxydants……………………………………... 8

II.1.1. Les systèmes antioxydants enzymatiques………………………………….. 8

II.1.2. Les systèmes antioxydants non enzymatiques……………………………... 8

II.1.2.1. Les vitamines…………………………………………………………… 8

II.1.2.2. Les oligoéléments………………………………………………………. 10

III. Hypercholestérolémie, athérosclérose et stress oxydant……………………… 11

IV. Influence des protéines et des huiles alimentaire sur le risque

cardiovasculaire et le stress oxydant………………………………………….

12

IV.1. Effets des protéines de légumineuses sur la peroxydation lipidique……….. 15

IV.2. Effets des huiles végétales ou de poisson sur la peroxydation lipidique…… 16

V. Impact des régimes enrichis en le cholestérol sur le stress oxydant ………….. 17

MATERIEL & METHODES…………………….………………………. 19

I. Régimes et Animaux…………………………………………….………………. 19

I.1. Régimes…………………………………………………………….………… 19

I.1.1. Extraction et purification des protéines de pois chiches…………………… 19

I.1.2. Analyse de la composition chimique des protéines purifiées……………..... 19

I.1.2.1. Estimation de la teneur en azote………………………………………… 19

I.1.2.2. Détermination de la teneur en lipides …………………………………... 21

I.1.2.3. Estimation des cendres………………………………………………..….. 21

I.1.2.4. Estimation des fibres…………………………………………………..…. 21

I.1.2.5. Estimation de la teneur en eau……………………………………...…. 21

I.1.3. Extraction de l’huile de sardine……………………………………………. 22

II. Animaux…………………………………………………………………………. 24

III. Prélèvement des échantillons sanguins et des différents organes …………… 26

IV. Analyses biochimiques………………………………………………………….. 26

IV.1. Dosage sériques des teneurs en protéines totales et en albumine…………... 26

IV.2. Dosage sérique et urinaire de l’acide urique……………………………...... 26

IV.3. Dosage des teneurs en cholestérol total et en triglycérides………………... 27

IV.3.1. cholestérol total sérique………………………………………………. 27

IV.3.2. Triglycérides…………………………………………………………… 27

V. Séparation et purification des différentes fractions de lipoprotéines………….. 27

V.1. Séparation des lipoprotéines de faible densité………………………………. 27

V.2. Séparation des lipoprotéines de haute densité………………………………. 27

V.3. Purification de différentes lipoprotéines…………………………………...... 28

VI. Evaluation du statut redox………………………………………………………. 28

VI.1. Détermination de l’attaque radicalaire…………………………………… 28

VI.1.1. Mesure des substances réactives à l’acide thiobarbiturique du sérum,

urines, des différents tissus et des lipoprotéines…………………………………..

28

VI.1.1.1 .Au niveau sérique et urinaire……………………………………… 28

VI.1.1.2. TBARS des VLDL, LDL-HDL1, HDL2, HDL3………………………. 29

VI.1.1.3. Au niveau tissulaire………………………………………………...... 29

VI.1.2. Mesure de la peroxydation protéique…………………………………... 29

VI.1.2.1. Dosage des dérivés carbonylés sériques et tissulaires…………… 29

VI.2. Evaluation de la défense antioxydante…………………………………… 30

VI.2.1. Mesure de l’activité des enzymes antioxydante………………………... 30

VI.2.1.1. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase érythrocytaire et

tissulaire………………………………………………………..............................

30

VI.2.1.2. Dosage de l’activité de la catalase érythrocytaire et tissulaire…… 30

VI.2.2. Dosage du monoxyde d’azote sérique, urinaire et tissulaire……………... 30

VII. Analyse statistique…………………………………………………………….... 31

RESULTAS…………………………………………………………................ 32

I. Evolution du poids corporel, nourriture ingérée………………………………. 32

I.1. Evolution du poids corporel………………………………………………... 32

I.2. Nourriture ingérée………………………………………………………….. 33

II. Valeur absolue et relative du poids des organes……………………………….. 33

III. Teneurs sériques en protéines totales et en albumine………………………….. 34

IV. Teneurs sériques en cholestérol total et en triglycérides…..…………………… 35

V. Teneurs sériques et urinaires en acide urique………………………………….. 35

VI. Teneurs en substances réactives à l’acide thiobarbiturique……………………. 36

VI.1. Au niveau sérique et urinaire……………………………………………….. 36

VI.2. Au niveau des lipoprotéines………………………………………………………. 36

VI.3. Au niveau tissulaire…………………………………………………......... 38

VII. Teneurs sérique et tissulaires en carbonyles…………………………………..... 40

VII.1. Au niveau sérique………………………………………………………….. 40

VII.2. Au niveau tissulaire………………………………………………………... 40

VIII. Activités des enzymes antioxydantes…………………………………………… 41

VIII.1. Activité de la superoxyde dismutase……………………………………... 41

VIII.1.1. Au niveau des érythrocytes………………………………………...... 41

VIII.1.2. Au niveau des tissus…………..……………………………………... 42

VIII.2. Activité de la catalase…………………………………………………….. 44

VIII.2.1. Au niveau des érythrocytes………………………………………….. 44

VIII.2.2. Au niveau des tissus…………..……………………………………... 44

IX. Concentrations sériques, urinaires et tissulaires en monoxyde d’azote……….. 47

IX.1. Au niveau du sérum et des urines…………………………………………... 47

IX. 2. Au niveau tissulaire………………………………………………………… 47

DISCUSSION…………………………………………………………………… 50

CONCLUSION………………………………………………………………….. 61

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………… 63

ANNEXES……………………………………………………………………... 80

1

Selon les données de l’Organisation Mondial de la Santé (OMS) (2007), les maladies

cardiovasculaires (MCV) arrivent en tête de liste des causes de décès les plus fréquentes dans le

monde. En 2005, en Algérie le taux de mortalité dû aux MCV a atteint 46,2% et ce taux ne

cesse d’augmenter (Tahina, 2005). Les MCV arrivent en tête des maladies non transmissibles,

justifiées par des changements dans l’hygiène de vie (sédentarité, alimentation

déséquilibrée….). L’analyse des données biologiques recueillies auprès des individus de 35–70

ans dans l’Enquête Nationale Santé (Tahina, 2005) révèle que 76,02% d’entre eux ont une

cholestérolémie normale (cholestérol total (CT) inférieur à 2 g/L), 19,41% ont une

cholestérolémie limite (2 à 2,49 g/L) et 4,57% ont une cholestérolémie supérieure ou égale à

2,50 g/L. La fréquence de la cholestérolémie limite augmente avec l’âge passant de 14,51%

chez les 35–39 ans à 22,27% chez les 65–70 ans. La même tendance est observée pour

l’hypercholestérolémie (3,55% et 6,94% pour les deux classes d’âge extrêmes).

L'hypercholestérolémie est un important facteur de risque des MCV. Une réduction de

10% du taux de cholestérol sanguin réduirait de 20% ce risque. Une élévation de seulement 10

mg/dL (0,26 mmol.L-1) de cholestérol-HDL (lipoprotéine de haute densité) entraîne une

diminution de 30% du risque d’infarctus du myocarde (Spieker et al., 1999). Les mécanismes

sous-jacents aux effets protecteurs du C-HDL sont divers, mais en plus de son rôle dans le

transport des lipides, le C-HDL possède des propriétés anti-inflammatoires, pro-fibrinolytiques

et antioxydantes.

L’hypercholestérolémie joue un rôle important dans le déclenchement et la progression

de l'athérosclérose (Tang et al., 2006). Loin d’être anodine, l’hypercholestérolémie peut

engendrer des complications cardiovasculaires. Ainsi, en conjonction avec d’autres éléments

(tabagisme, diabète, hypertension artérielle, obésité, inactivité physique, stress),

l’hypercholestérolémie augmente le risque d’être atteint de troubles cardiovasculaires.

Le stress oxydatif est considéré comme l’un des facteurs majeur de risque des MCV

(Regöly-Mérei et al., 2007). Associé à l'hypercholestérolémie qui induit une augmentation de la

production de radicaux libres (Stocker & Keaney, 2004), impliqués dans les processus clés de

l’athérosclérose (Poredos & Kaja Ježovnik, 2007 ; Amom et al., 2008), et une augmentation de

la peroxydation des lipides (Harrison et al., 2003). Cette peroxydation augmente

l’athérogénicité des lipoprotéines de faible densité (LDL), l’une des classes de lipoprotéines les

plus athérogènes (Lähteenmäki et al., 2000) qui constitue le premier facteur de risque de MCV

(Myron, 2007).

2

Les facteurs spécifiques qui interviennent dans l’incrustation de l’hypercholestérolémie

et le développement de l’athérosclérose ont été activement recherchés et deux constituants

nutritionnels, cholestérol et acides gras saturés, ont été rendus responsables du développement

de cette pathologie (Vidon et al., 2001). En effet, ces deux constituants agissent en augmentant

les niveaux circulants de LDL (Beaumier-Gallon et al., 2001).

Le régime alimentaire et le mode de vie sont reconnus comme la première ligne

d'intervention pour la réduction du risque cardiovasculaire (Kendall & Jenkins, 2004).

L'association entre alimentation et stress oxydatif a été récemment confirmé (Parra et al., 2007 ;

Barbosa et al., 2008). Certains nutriments comme les protéines de légumineuses, l’huile de

poisson, les antioxydants, peuvent améliorer la fonction endothéliale et amener, du moins en

partie, à des effets cardioprotecteurs (Cuevas & Germain, 2004).

Les protéines alimentaires sont d’importants régulateurs du niveau de cholestérol

plasmatique (Bavelaar & Beynen, 2003). En effet, l’origine des protéines consommées

influence le taux de cholestérol (Hanczakowski et al., 2002). Lorsque les études portent sur des

protéines végétales, en général ce sont les protéines de soja qui sont choisies comme modèle, et

la caséine représente en général le modèle des protéines animales, c'est pourquoi les

comparaisons sont souvent établies entre ces deux types de protéines.

Plusieurs études ont confirmé l’effet hypocholestérolémiant des protéines végétales

comparées aux protéines animales (Reynolds et al., 2006 ; Reza, 2008). Les protéines végétales

inhibent l’athérothrombose en inhibant le processus d’athérosclérose (Sawashita, 2006). Les

protéines végétales comparées aux protéines d’origine animale, exercent un effet

hypocholestérolémiant significatif chez diverses espèces animales (Atwal et al., 1997) et chez

l’homme (Sugano et al., 1993), mais chez l’homme, cet effet n’est présent que lorsque le

régime apporte suffisamment de cholestérol ou que les patients sont hypercholestérolémiques

(Belleville, 2003).

La consommation de légumineuses contribue au moindre risque cardiovasculaire par leur

effet hypocholestérolémiant et antioxydant (Lecerf & Borgies, 2006). La protéine de pois

chiche comparée à la caséine réduit le taux de CT sanguin (Pittaway et al., 2008) et peut

corriger la dyslipidémie lorsque le régime est enrichi en cholestérol alimentaire en induisant une

diminution du C-LDL (Pittaway et al., 2008) et une augmentation du C-HDL (Ying Yang et al.,

2006). De plus, cette protéine modifie le profil des lipides tel que l’hyperlipoprotéinémie type II

par la normalisation des teneurs en triglycérides (TG) et en C-LDL (Zulet et al., 1999).

3

Les études réalisées au sein du laboratoire de Nutrition Clinique et Métabolique ont mis

en évidence l’effet antiathérogène des protéines de pois chiches. En effet, Boualga et al., (2009)

ont montré que les protéines purifiées de pois chiches ont un effet anti-athérogénique en

diminuant le contenu des VLDL et des LDL-HDL1, en augmentant l’activité et/ou le nombre de

récepteurs de remnants de VLDL et en stimulant la voie de retour inverse du cholestérol par

l’augmentation de l’activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT).

Chez le rat Wistar, la protéine hautement purifiée de légumineuse (soja) supplémentée

avec 0,1% de cholestérol alimentaire réduit la sensibilité des membranes érythrocytaires à

l’attaque radicalaire comparée à la caséine (Madani et al., 2004).

La nature de la matière grasse et sa composition en acides gras (AG) dans le régime

module différemment le métabolisme des lipides, en particulier dans le tissu adipeux et le foie

(Torre-availlalvazo, 2008). Les acides gras polyinsaturés (AGPI) de la série n-3 présents dans

les huiles de poisson et les huiles végétales (colza, noix), protègent contre les MCV (Aziz et al.,

2007) et pourrait moduler la réponse oxydatif (Romieu et al., 2008). Ils agissent indirectement

comme un anti plutôt qu’un pro-oxydant dans les cellules endothéliales vasculaires, d'où la

diminution du risque cardiovasculaire (Jung, 2008) par la réduction de l’accumulation des

lipides dans le foie et la diminution des lésions d’athérosclérose chez les souris (Gao et al.,

2007). Chez le rat normal, ces acides gras réduisent la peroxydation lipidique (Richard et al.,

2008).

Les études mentionnées précédemment ont traité principalement des effets individuels

des lipides et des protéines alimentaires. Ainsi, on connaît peu de choses sur les interactions

possibles entre les protéines et les lipides dans la modulation du métabolisme lipidique et du

stress oxydant.

Dans cette étude, nous nous sommes fixés deux objectifs :

Le premier objectif vise à déterminer les effets indépendants et interactifs des protéines

et des lipides alimentaires dans la régulation des lipides sanguins, chez des rats soumis pendant

28 jours à des régimes expérimentaux variant selon les sources protéiques (protéine de pois

chiche ou caséine) et lipidiques (mélange d’huiles végétales (olive– noix –tournesol) ou huile

de poisson (sardine).

4

Le deuxième objectif apporte un intérêt particulier à l’évaluation du statut redox,

puisque la relation entre le stress oxydant, l’hypercholestérolémie et la genèse de

l’athérosclérose et de ses complications est certaine.

Le choix du pois chiche (Ciser arietinum) comme source protéique est particulièrement

dû au fait que cette légumineuse est très consommée par la population algérienne et qu’elle a été

très peu étudié, comparativement aux autres protéines (soja, pois). Celui de la sardine (Sardina

pilchardus) est du au fait que ce poisson est largement consommé dans le bassin méditerranéen,

en particulier par la population oranaise et que son huile a été très peu étudiée par rapport à

d’autres poissons (merlu, maquereau, thon).

Avant de présenter les différents résultats, un rappel succinct est présenté sur le stress

oxydatif d’une part, et sur l’hypercholestérolémie, l’athérosclérose et ses conséquences sur le

statut antioxydant, d’une autre part. De plus, l’influence des protéines et des huiles alimentaires,

en particulier les protéines de légumineuses et les huiles de poisson supplémentées ou non en

cholestérol sur la dyslipidémie et le stress oxydant est abordée.

Revue bibliographique

5

I. Stress oxydatif

I.1. Mécanisme prooxydant

Le stress oxydatif est maintenant bien reconnu comme étant soit à l’origine de plusieurs

pathologies ou encore comme facteur aggravant de plusieurs pathologies (Dalle-Donne et al.,

2006). Son implication dans l’hypertension artérielle, le diabète, l’athérogénèse,

l’athérothrombose, l’hypercholestérolémie et la dysfonction endothéliale a été démontrée par

différentes études effectuées autant chez l’homme que chez l’animal (John & Schmieder, 2003 ;

Afonso et al., 2007). Le stress oxydant est un état caractérisé par un déséquilibre dans la

balance métabolique cellulaire entre la production des espèces réactives de l’oxygène (ERO) et

les capacités antioxydantes de l’organisme (enzymes antioxydantes et systèmes antioxydants

non enzymatiques) (Delattre et al., 2005).

I.1.1. Origine et régulation des espèces réactives de l’oxygène

L’oxygène (O2) est un élément indispensable à la vie des organismes aérobies. Ces

organismes utilisent l’O2 pour oxyder les substrats riches en carbone et en hydrogène.

Cependant, quand on oxyde les molécules avec l’oxygène, ce dernier est réduit et forme des

intermédiaires radicalaires, très réactifs connus sous le nom d’espèces réactives de l’oxygène

(ERO) ou radicaux libres (Bonjean et al., 2002). Les ERO sont des molécules contenant de

l’oxygène mais dont la réactivité est bien supérieure à celle de la molécule d’O2. Ces ERO

comprennent des radicaux tels l’anion superoxyde (O2°-) ou le radical hydroxyle (HO°) et les

espèces non radicalaires (le peroxyde d’hydrogène (H2O2), l’oxygène singulet (1O2)) (Garrel et

al,. 2007). L’O2 subit une réduction monoélectronique conduisant à la formation de l’anion

superoxyde (O2°-) qui constitue un des radicaux précurseurs pouvant être activés en d’autres

espèces plus réactives (le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le peroxynitrite (ONOO-)), substance

cytotoxique hautement réactif et qui cause l’oxydation des lipides et la nitrosylation des

protéines et par conséquence une lésion fonctionnelle des cellules résultant de la réaction de

l’O2°- avec le monoxyde d’azote (NO), sa faible réactivité permet son utilisation par

l’organisme comme médiateur régulant des fonctions biologiques (Barton, 2005). Le gain

d’énergie entraînant une modification de la configuration électronique de l’O2 ce qui conduit à

la formation d’un oxygène singulet (1O2), il a pour cible biologique les membranes, les acides

nucléiques et les protéines (Figure 1).


6

1O2 (oxygéne singulet) O2°- (anion superoxyde)

ONOO- (peroxynitrite)

H2O2 (peroxyde d’hydrogène)

OH° (radical hydroxyle)

Gain d’énergie Gain d’é

2H+ + 2 é +NO°

Agent stressant

Fig.1. Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de

l’oxygène impliqués dans certaines fonctions biologiques (Salem, 2007).

Les ERO vont aussi engendrer une situation de stress oxydant dans la cellule et donc des

dommages oxydatifs au niveau des macromolécules biologiques (peroxydation lipidique, lésions de

l’ADN, modifications oxydatives des protéines) (Hansen et al., 2006, Lopez et al., 2006).

I.2. Stress oxydant et conséquence cellulaire

L’équilibre entre les effets positifs et négatifs des radicaux libres est particulièrement

fragile (Pincemail, 2003). La production de ces radicaux peut être régulée par l’organisme (Sies,

1991). Les systèmes de régulation se composent d’enzymes, de protéines, de molécules

antioxydantes de petite taille et d’oligoéléments. Le stress oxydant va dénaturer les lipides, les

protéines, l’ADN et provoquer des pathologies (Curtin et al., 2002). Le mode d'action et les

produits terminaux d'oxydation formés seront différents (Therond, 2006).

I.2.1. La peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique est une réaction en chaîne initiée par la captation d’un atome

d’hydrogène par l’HO° ou l’O2°- à des esters d’acides gras insaturés ou constituants des

membranes lipidiques (Ercal et al., 2001 ; Tweeddale et al., 2007).

O2


7

Le radical carboné du constituant lipidique tend alors à se stabiliser par un

réarrangement conduisant au diène conjugué. Celui-ci réagit avec l’oxygène moléculaire et

forme un OH°, lui même susceptible d’arracher un atome d’hydrogène à un autre acide gras. Un

nouveau radical lipidique est ainsi généré et il se produit ainsi des hydroperoxydes de lipides

(Niki et al., 2005).

Un des principaux produits de dégradation lipidique est le malonedialdéhyde (MDA) qui

altère la fluidité et la fonction des membranes, dont la composition en acides gras insaturés

module l’oxydabilité (Del Rio et al., 2005). On attribue par ailleurs aux peroxydes lipidiques,

un rôle toxique et un rôle mutagène (Valenzuela, 1991). La peroxydation lipidique revêt une

importance toute particulière dans la physiopathologie de l’athérosclérose par l’attaque

oxydante des lipoprotéines (Watson, 2000 ; Rousselot et al., 2003). La peroxydation lipidique

est suivie d’un changement structural des membranes biologiques (Pacifici et al., 1994) ou

d’autres éléments contenant des lipides (Stark, 2005 ; Mutairi et al., 2007). Ces perturbations

fonctionnelles peuvent aboutir à la mort cellulaire (Pincemail, 2003).

I.2.2. L’oxydation protéique

Les protéines sont des constituants cellulaires structurales et fonctionnels essentiels

pouvant subir des modifications oxydatives provoquant ainsi l’introduction d’un groupe

carbonyl dans la protéine (Levine, 2002). L’oxydation des acides aminés, surtout des acides

aminés soufrés et aromatiques, entraîne des modifications structurales en particulier, celle des

protéines facilitant leur agrégation ou leur digestion par les protéases (Squier, 2001).

L’oxydation des acides aminés soufrés entraîne une perte des groupements thiols (SH)

(Davis et al., 2001). Ces altérations concernent particulièrement les enzymes antioxydantes qui

contiennent très souvent des groupements SH. L’intégrité des membranes cellulaires est

également menacée par l’oxydation des protéines du fait de la modification du caractère

antigénique et des propriétés fonctionnelles des protéines membranaires (récepteurs ou

enzymes) (Gruber et al., 2006, Jacob et al., 2006). En perdant leurs propriétés biologiques, ces

protéines deviennent non seulement beaucoup plus sensibles à l’action des protéases et

notamment du protéasome, mais aussi deviennent très hydrophobes.

Les carbonyles sont utilisés comme un marqueur de l’oxydation protéique et de façon

générale comme un marqueur du stress oxydant (Bonnefont-Rousselot, 2003).


8

II. Mécanismes antioxydants

II.1. Les systèmes de défenses antioxydants

Les antioxydants représentent l’ensemble des molécules susceptibles d’inhiber

directement la production, de limiter la propagation ou de détruire les ERO (Wassmann &

Nickenig, 2004). Ces antioxydants peuvent agir en réduisant ou en dismutant ces espèces, en

les piégeant pour former un composé stable. Une fois les taux des ERO fortement abaissés, les

systèmes enzymatiques interviennent et permettent ainsi la réparation.

Les antioxydants cellulaires sont enzymatiques et non-enzymatiques (Schulz et al., 2004).

II.1.1. Les systèmes antioxydants enzymatiques (Tableau I)

Les enzymes existent à l’état endogène et permettent de protéger les cellules contre les

radicaux libres produits de manière physiologique au cours du métabolisme cellulaire normal

(Jacob et al., 2006; Menon & Goswami, 2007). Les principaux systèmes enzymatiques

comprennent les superoxydes dismutases (SOD), la catalase (CAT), la glutathion peroxydase

(GSH-Px) et la glutathion réductase (GSH-Red) (Garrel et al., 2007).

II.1.2. Les systèmes antioxydants non enzymatiques

II.1.2.1. Les vitamines

Trois vitamines se comportent comme de puissants antioxydants : la vit A (plus encore

son précurseur, le béta-carotène), la vit E et la vit C.

La vit A et les caroténoïdes sont de puissants neutralisateurs des dérivés actifs de

l’oxygène, la plupart d’entre eux interagissent avec l’oxygène singulet et peuvent ainsi

empêcher l’oxydation de plusieurs substrats biologiques dont les AGPI (Tapiero, 2004 ;

Badeau, 2006).

La vit E ou tocophérol est présente dans les compartiments lipidiques et agit de deux

façons différentes, soit en piégeant directement les ERO ou en régulant à la hausse les enzymes

antioxydantes, telles que la SOD, la glutathion peroxydase et réductase et la catalase (Clarke &

Armitage, 2002).

La vit C ou acide ascorbique, possède une activité antioxydante par sa capacité à piéger le

radical hydroxyl (OH-), le radical peroxyle (ROO-), ou à réagir avec l’1O2 par oxydation de


9

l’acide ascorbique en acide déhydroascorbique, ou enfin à réduire le radical tocophéryle,

et à régénérer la vit E (Tyssandier, 2004).

Tableau I. Les systèmes antioxydants enzymatiques

Enzyme

Localisation Action

La superoyde

dismutase

(SOD)

Cytoplasme (Cu/Zn-SOD, cuivre-zinc)

Mitochondries (Mn-SOD, manganèse)

Maintient la concentration d’anion O2°- à des niveaux faibles avec la glutathion peroxydase (GSH-Px). Constitue la première ligne de défense contre les oxydants (Behrend et al., 2003 ; Rahman et al., 2006) (Figure 2). Accélèrent la vitesse de dismutation de l’anion O2°- en H2O2 (Garrel et al., 2007).

La catalase

Intracellulaire de l’hème

Catalyse la réaction de détoxification du H2O2 (généralement produit par les SOD) en H2O et en O2 (Valko et al., 2006), H2O2 doit être rapidement métabolisé par la catalase et la GSH-Px pour que la protection apportée par les SODs soit effective (Rahman et al., 2006) (Figure 2).

La glutathion

peroxydase

(GSH-Px)

Cytosol

Mitochondries

Décompose les hydroperoxydes organiques et l’H2O2. Possède une grande spécificité pour la GSH-Red qui est utilisée comme donneur d’hydrogène au cours des réactions de décomposition ; il s’en suit la formation du glutathion oxydé (GSSG). La GSH-Px est en compétition avec la catalase pour le substrat H2O2 et est la source majeure de protection contre les faibles niveaux de stress oxydant (Valko et al., 2006, Valko et al., 2007) (Figure 2).

La glutathion

réductase

(GSH-Red)

Cytosol en majeur partie

Catalyse irréversiblement la réduction de GSSG en GSH (Jaspard, 2003). Le rapport GSH/GSSG est un indicateur dynamique du stress oxydant (Al-Mutairi et al., 2007).


10

Fig.2. Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants (Descamps, 2004).

II.1.2.2. Les oligoéléments

Les oligoéléments (sélénium, cuivre et zinc) interviennent aussi dans l’activité des

enzymes antioxydantes. L’effet antioxydant capital du sélénium est dans la détoxification des

radicaux libres produits par le métabolisme cellulaire (Wolters et al., 2005). Le zinc peut

inhiber partiellement les réactions de formation d’espèces oxygénées induites par le fer ou le

cuivre (Mezzetti et al., 1998). Le cuivre joue en tant que métal dit de transition, un rôle

important dans le déclenchement des réactions conduisant à la formation d’espèces oxygénées

activées. Les protéines préviennent la formation des radicaux libres par le contrôle des apports

en fer et en cuivre grâce à la ferritine et à la transferrine.


11

III. Hypercholestérolémie, athérosclérose et stress oxydant

De nombreuses études ont démontré une relation entre le stress oxydatif et les MCV

(Meisinger et al., 2005). Le stress oxydatif augmente avec les différents facteurs de risque

cardiovasculaire tels que l’obésité, l’hypertension, l’hyperlipidémie, le diabète,

l’hypercholestérolémie et les maladies cardiovasculaires (MCV) s’élève davantage (Bégaud et

al., 2005). Les radicaux libres et le stress oxydatif sont impliqués dans les mécanismes

pathogènes des MCV (Galán et al., 2006). L'hypercholestérolémie représente un facteur de

risque dans la progression de l'athérosclérose (Dimitrova-Sumkovska et al., 2006), engendrant

des complications cardiovasculaires, ainsi en conjonction avec le stress oxydatif joue un rôle

important dans le développement de l’athérosclérose (Yhirga, 2006).

Fig. 3. Modifications oxydatives des LDL impliquées dans l’athérosclérose (Stocker et al., 2004). Le LDL est piégé dans l’espace subendothélial où il subit des modifications oxydatives par les cellules vasculaires présentes (cellules musculaires lisses, cellules endothéliales, macrophages). Le LDL ainsi oxydé stimule l’attraction des monocytes(A) empêche la sortie des monocytes (B) et supporte la formation des cellules spumeuses (C). Une fois formé, le LDL oxydé amène également à une dysfonction endothéliale (D) et les cellules spumeuses deviennent nécrotiques à cause d’une accumulation de LDL oxydés (E).


12

Le cholestérol LDL et son oxydation jouent un rôle important dans la formation des

plaques d'athéromes par son accumulation pathologique sur la paroi interne des artères (Brack,

2008). En effet, la première étape dans le processus d’athérogenèse est la rétention des LDL au

niveau sous-endothélial de la paroi artérielle, l’intima où elles subissent des modifications en

particulier, une oxydation par les ERO (Madamanchi et al., 2005). Ces modifications

oxydatives des LDL (Meisinger et al., 2005) représentent une modification biologique analogue

aux modifications chimiques concernant les cellules spumeuses. Les LDL oxydées

contribueraient à l’athérogenèse en facilitant le recrutement des monocytes circulant dans les

espaces intimaux, en inhibant la capacité des macrophages à quitter l’espace intimal

(Parthasarathy et al., 2008) et en augmentant le taux de captation de lipoprotéines menant à la

formation de cellules spumeuses en étant cytotoxique par la perte de l’intégrité membranaire

(Calder, 2005). La figure 3 résume l’hypothèse selon laquelle des modifications oxydatives des

LDL seraient responsables du développement de l’athérosclérose.

Une biodisponibilité restreinte du monoxyde d’azote a été démontrée en présence de tous

les facteurs de risque cardiovasculaire connus, dont l’hypertension artérielle,

l’hypercholestérolémie, le diabète, l’obésité, le tabagisme, le vieillissement, mais aussi lors d’un

manque d’activité physique. La signification étiopathogénétique de la biodisponibilité restreinte

du NO n’est pas encore élucidée à l’heure actuelle. Cependant, elle peut être utilisée de façon

fiable comme un facteur prédictif d’accidents cardiovasculaires (Lerman et al., 2005). Sa

biodisponibilité est un facteur capital pour le maintien de fonctions protectrices

cardiovasculaires, telles que la vasodilatation et la prévention des thromboses. Dans les

maladies cardiovasculaires, la biodisponibilité du NO est réduite par un stress oxydatif plus

important. La molécule NO est inactivée par les radicaux libres avec formation de peroxynitrite.

IV. Influence des protéines et des huiles alimentaires sur le risque cardiovasculaire et le stress oxydant

Il est évident que l’alimentation influence le développement des MCV et les études

épidémiologiques révèlent que la prévalence de ces maladies varie beaucoup selon les habitudes

alimentaires (Lagard & Lafont, 2007).

Chez l’homme, la consommation de légumineuses diminue le risque des MCV de 5%

(Dauchet et al., 2005) et le risque d’accident coronaire de 4% (Hercberg et al., 2006). De plus,

la consommation régulière de légumineuses à divers effets bénéfiques tels qu’un meilleur


13

contrôle du diabète (Venn, 2004), une diminution du risque cardiovasculaire (Kabagambe et al.,

2005, Bazzano et al., 2001) et une meilleure protection contre l’attaque radicalaire (Michels &

Giovannucci, 2006).

Les protéines végétales comparées aux protéines d’origine animale, exercent un effet

hypocholestérolémiant significatif chez diverses espèces animales (Atwal et al., 1997) et chez

l’homme (Sugano et al., 1993), mais chez l’homme, cet effet n’est présent que lorsque le

régime est supplementé en cholestérol ou que les patients sont hypercholestérolémiques

(Belleville, 2003). Ainsi, des enfants hypercholestérolémiques qui reçoivent des protéines

végétales (protéines de soja) voient leur taux de cholestérol plasmatique diminuer nettement en

huit semaines (Gaddi, 1987).

Le mécanisme de cet effet est encore l'objet de controverse. La caséine au contraire, a un

effet hypercholestérolémiant en augmentant l'absorption du cholestérol et en diminuant son

temps de renouvellement (Kritchevsky, 1995). Plusieurs études suggèrent que l'effet

hypocholestérolémiant des protéines végétales, serait dû en grande partie à une plus forte

excrétion fécale des stérols, en raison d'une réduction de leur absorption intestinale. C'est un

effet qui ressemble à celui obtenu avec certaines fibres alimentaires.

Il est bien connu que les protéines de légumineuses abaisse le CT et les TG plasmatiques

et hépatique par rapport aux protéines animales (caséine) (Zulet & Martinez, 1995 ; Marlett,

2006 ; Spielmann et al., 2007 ; Pittaway et al., 2007). La protéine de pois chiche réduit la

cholestérolémie et le C-LDL comparée à la protéine de blé (Pittaway et al., 2007). Chez le rat

adulte, la consommation d’un régime contenant 200 g/kg de protéines de pois chiches et 1% de

cholestérol alimentaire diminue le cholestérol hépatique et le C-VLDL (Spielmann et al., 2008)

et les teneurs en TG, C-LDL et C-HDL (Marlett, 2006) et conduit à une réduction de la

synthèse hépatique des acides gras comparée à la caséine (Spielmann et al., 2007). De même,

chez des rats hypercholestérolémiques, la protéine de pois chiche module le profil lipidique en

diminuant les concentrations du CT et des TG, ainsi que celles du C-LDL par rapport à la

caséine (Zulet & Martinez, 1995). Chez des rats Sprague-Dawley, la protéine de légumineuse

(soja) hautement purifiée combinée 5% d’huile de sardine et supplémentée avec 1% de

cholestérol alimentaire n’entraîne pas d’effet hypocholestérolémiant comparée à la caséine

(Choi et al., 1989). Cependant, chez des rats normolipidémiques, la protéine de soja induit un

effet hypocholestérolémiant (Reza et al., 2008). La consommation quotidienne de protéines de

soja associées à un apport faible en lipides, réduit significativement le C- LDL chez les sujets


14

ayant une hypercholestérolémie modérée, sans effets sur les biomarqueurs du stress oxydatif

comparée à plusieurs protéines d’origine animale (Hansel et al., 2007).

Les composants de l’alimentation, notamment les apports lipidiques, influencent le profil

lipidique et le risque cardiovasculaire (Fumeron et al., 2008). Un régime alimentaire riche en

graisses mène à une augmentation des acides gras libre (AGL) circulants. Il est bien établi que

des taux élevés de lipides sanguins accélère la formation de plaques athéromateuses et ainsi

contribue à l’augmentation de la rigidité des artères susceptibles à l’attaque radicalaire (Yki-

Jarvinen & Westerbacka, 2004).

Un excès d'acides gras (notamment saturés et insaturés trans) pourrait avoir des

conséquences sur la santé en augmentant de façon très significative le risque cardiovasculaire, en

particulier la cholestérolémie et le C-LDL (Kummerow, 2009 ; Cooper et al., 2009 ;

Subramanian & Chait, 2009). Généralement, les acides gras saturés (AGS) augmentent les taux

de cholestérol dans le sang, tandis que les acides gras polyinsaturés (AGPI), les réduisent. Chez

le lapin, un apport élevé en acides gras dans le régime induit une surproduction d’ERO (Birkner

et al., 2005) au niveau des entérocytes isolés du rat.

Une alimentation riche en acides gras monoinsaturés (AGMI) comme l’huile d’olive, est

liée à une diminution du risque des MCV (Salvini & Sera, 2006). Ces acides gras possèdent le

potentiel d’abaisser les taux de CT et de C-LDL dans le sang comparés aux AGS et

protégeraient contre l’oxydation des LDL par leurs effet protecteur contre les radicaux libres,

permettant ainsi de prévenir l’athérosclérose (Van Horn et al., 2008).

Chez les souris, la consommation d’un régime contenant de l’huile d'olive pendant 8

semaines provoque une augmentation significative des TG au niveau du foie comparée à l’huile

de maïs (Ferramosca , 2008).

L’huile de sardine source d’oméga 3 (acide eicosapentaénoïque (EPA) et acide

docosahexaénoïque (DHA)) a un effet hypolipémiant par une diminution des lipides associés

aux VLDL et LDL (Anil et al., 2008). L’apport optimal d’EPA et de DHA est associé à une

baisse du risque de mort subite (Connoly & Healey, 2005). Ils ont un effet anti-inflammatoire

(Mehra et al., 2006), protègent l’endothélium vasculaire (Boak & Chin, 2004 ; Morgan et al.,

2006). De plus, ces acides gras jouent un rôle majeur dans le traitement de l’insulinorésistance

(Barre, 2007) et dans le traitement des pathologies oculaires (Canzemy, 2007).

Sawashita et al., (2007) ont montré une réduction de l’accumulation des lipides dans le

foie et une diminution des lésions athéromateuses chez la souris consommant un régime


15

contenant 5% d’huile de sardine. Chez le rat, Toyoshima et al., (2004) notent que l’huile de

sardine a un effet hypotriglycéridémiant comparée à l’huile de soja. De même, Chang et al.,

(2009) constate que l’huile de sardine augmente le taux de CT et réduit les concentrations

plasmatiques en TG chez des souris consommant un régime contenant 5% d’huile de sardine

pendant 12 semaines.

IV.1. Effet des protéines de légumineuses sur la peroxydation lipidique

Peu d'études ont porté sur les effets de différentes protéines alimentaires sur la

peroxydation lipidique. Les protéines alimentaires paraissent jouer un rôle dans les mécanismes

de défense antioxydatifs. En effet, la nature et le niveau d'apport en protéines, spécialement leur

contenu en acides aminés soufrés, influencent la concentration cellulaire en glutathion (Hum et

al., 1992; Moundras et al., (1995) qui joue un rôle capital dans la détoxication des

intermédiaires réactifs fournis par le métabolisme oxydatif (Kaplowitz et al.,1985). Quand le

glutathion hépatique est diminué, les animaux et l'homme sont plus sensibles aux dommages

tissulaires entraînés par les radicaux libres (Deneke et al., 1983).

Chez le rat, les protéines de légumineuses (protéines de soja), comparées à la caséine,

diminuent la peroxydation lipidique (Sugano et al., 1982). Kanazawa et al,. (1995) mettent en

évidence un effet protecteur des protéines de soja vis à vis de la peroxydation des lipoprotéines

chez des patients souffrant d'une atteinte cérébrovasculaire. Cette action peut provenir des

isoflavones associées aux protéines de soja qui ont des actions antioxydantes (Esaki et al.,

1998).

Les protéines de soja et la caséine entraînent la même résistance des hématies à l'attaque

radicalaire, mais les protéines de soja diminuent les TBARS sériques (substances réagissant

avec l'acide thiobarbiturique, qui sont des produits d'oxydation), donc la peroxydation lipidique

(Madani et al., 2000), sans modifier ces substances au niveau du foie (Minehira et al., 2000).

Cela peut provenir de la diminution des TG plasmatiques avec le régime contenant les protéines

de soja. En effet, il a été trouvé une corrélation positive entre l'importance de la peroxydation

des lipides plasmatiques et les teneurs en TG du plasma chez l'homme (Ledwozyw et al., 1986).


16

IV.2. Effets des huiles végétales ou de poisson sur la peroxydation lipidique

Certaines huiles végétales possèdent des propriétés hypolipémiantes et sont considérées

comme un puissant antioxydant, leur consommation entraîne une réduction des lésions

athéromateuses de l'aorte chez des rats mâles de souche Wistar (Seweidy et al., 2005).

Salvayre (2003) a rapporté que l’huile d’olive possède une propriété antioxydante en

protégeant l’ADN de lésions causées par le stress oxydatif. Chez l’homme, l’huile d’olive réduit

efficacement les lésions oxydatif de l’ADN et protège les cellules mononucléaires contre le

peroxyde d’hydrogène (H2O2) induit par les dommages de l'ADN (Fabiani et al., 2008). L’huile

de maïs comparée à l’huile de poisson n’entraîne aucune différence dans le profil de distribution

des pro et antioxydants contre la peroxydation lipidique, alors qu’il accroît les facteurs de risque

des MCV chez les individus hypercholestérolémiques comparativement à l’huile de soja (Vega-

López et al., 2009). Chez des souris âgées de 4 semaines consommant des régimes semi-

purifiés contenant 5% d'huile de maïs ou d'huile de menhaden et supplémentés avec 0,15% de

cholestérol alimentaire, le niveau du stress oxydatif plasmatique et aortique est plus faible chez

les souris consommant l'huile de menhaden et la superficie des lésions athéromateuses au

niveau de l'aorte comparée à l’huile de maïs est réduite (Casós et al., 2008).

Les AGPI pourraient inhiber l’apoptose induite par les agents prooxydants ou par les

LDL oxydées (Abraham & Kappas, 2005), et donc participer à la stabilisation de la plaque

d’athérosclérose (Lecerf, 2008). Les AGPI stimulent le système antioxydant, comme l’acide

oléique qui stimule l’activation de la GSH-Px et inhibe la génération d’ERO (Duval et al.,

2002) et protège l’ADN des lésions induites par le stress oxydatif (Violi & Cangemi, 2005).

Les AGPI à longue chaîne (AGPILC), présents dans les poissons et dans les huiles marines,

EPA (C 20:5 n-3) et DHA (C22:6 n-3) sont des protecteurs très efficaces de la fonction

cardiaque (Ismail, 2005) et jouent un rôle dans la prévention cardiovasculaire (Guiness et al.,

2006 ; Jacobson, 2007) et dans le traitement du risque cardiovasculaire (Stanley et al., 2005) par

leur effet hypotriglycéridémiant quelle que soit le niveau des TG (Holub, 2007, Jacobson et al.,

2007).


17

V. Impact des régimes enrichis en cholestérol sur le stress oxydant

La présence ou l’absence du cholestérol dans le régime est l’un des facteurs majeurs qui

peut perturber le métabolisme des lipides. Cependant, la contribution du cholestérol alimentaire

dans le développement de l’hypercholestérolémie est controversée car, il est difficile de prévoir

précisément son effet sur les concentrations du CT et des lipoprotéines plasmatiques (Herron et

al., 2003). Le cholestérol alimentaire semble agir de façon modérée sur le taux de cholestérol

sérique autant chez les sujets normolipémiques que chez les sujets hypercholestérolémiques

(Hennekens et al., 2009). Tout régime alimentaire trop riche en lipides induit une augmentation

anormale du taux de CT et des triglycérides (TG) sanguins et du C-LDL, une diminution des

concentrations du C-HDL, un ralentissement du catabolisme des lipoprotéines de très faible

densité (VLDL), entraînant la formation de LDL petites et denses. Ces LDL fortement

athérogènes (Jean, 2005) favorise l`apparition des MCV (Naughton et al., 2009), en induisant

une augmentation anormale de la peroxydation des lipides et une baisse dans le système de

défense antioxydant (Yang et al., 2006).

L’hypercholestérolémie provoquée expérimentalement chez des rats Wistar par un

apport alimentaire élevé en cholestérol (1%) pendant 10 semaines, entraîne une augmentation

significative du CT, C-LDL, C-VLDL et de la peroxydation lipidique au niveau sérique, ainsi

qu’une réduction du C-HDL (Tauseef et al., 2007).

L'apport de 0,1% de cholestérol alimentaire dans le régime n'a pas d'effet

hypercholestérolémiant mais augmente les teneurs en triglycérides (TG) et en esters de

cholestérol (EC) dans le foie. Il augmente la sensibilité des membranes érythrocytaires à

l'attaque radicalaire (Madani & Belleville, 2000). Minehira et al., (2000) ont montré chez le rat

Wistar que le régime à base de caséine enrichi en cholestérol augmente le

malondialdehyde (MDA) au niveau du sang et du foie. Les activités des enzymes antioxydantes

(superoxyde dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathion peroxydase (GSH-Px)), ont été

évaluées chez le lapin consommant un régime supplémenté avec 1% de cholestérol. L’étude a

montré une diminution de l’activité de la SOD et de la GSH-Px et une augmentation de

l’activité de la CAT au niveau du plasma, alors que ces enzymes sont augmentées au niveau de

l’aorte (Cesare et al., 2004). De même, chez le lapin, la supplémention du régime en cholestérol

alimentaire (>1%) produit une hypercholestérolémie sévère et augmente la peroxydation

lipidique tout en diminuant l’activité de la glutathion peroxydase (GSH-Px) (Mahfous &

Kummerow , 2000). Chez des rats nourris avec un régime enrichi en cholestérol (0,5% ou 1%),


18

avec ou sans supplémentation en acide cholique ont été étudiés pendant 4 semaines. Les

résultats obtenus démontrent une baisse de la peroxydation lipidique chez les rats nourris avec

le régime contenant 0,5% de cholestérol comparés aux rats consommant le régime contenant

1% de cholestérol. L’ingestion d’un régime supplémenté avec 4% de cholestérol alimentaire et

1% d’acide cholique chez des rats wistar pendant 3 mois a entraîné une augmentation des

radicaux libres au niveau des érythrocytes provoquant une très grande sensibilité des

membranes érythrocytaires au stress oxydant (Devrim et al., 2008).

Matériel & Méthodes

19

I. Régimes et Animaux

I.1. Régimes

I.1.1. Extraction et purification des protéines de pois chiches

Les protéines de pois chiches (Ciser arietinum) préparées dans notre laboratoire, sont

extraites selon un procédé par voie humide (Sawnson, 1990), basée sur la solubilisation de la

farine de pois chiches à 10% dans une solution alcaline (NaOH, 0,1N) à pH 10 et contenant du

sulfite de sodium (Na2SO3 à 1%). Après une nuit, le culot obtenu renferme les polysaccharides

insolubles et les fibres, le surnageant est titré à pH 4,5 avec de l’acide sulfurique (H2SO4) à 98%

(Figure 4).

Après centrifugation, le coagulum protéique est lavé avec de l’eau acide ce qui élimine

les glucides solubles et les sels. Les protéines obtenues sont lavées, séchées et moulues puis

analysées.

I.1.2. Analyse de la composition chimique des protéines purifiées

I.1.2.1. Estimation de la teneur en azote

Le contenu en azote ammoniacal des échantillons protéiques est déterminé par la

méthode colorimétrique de NESSLER. Il s’agit d’un dosage après minéralisation de 50 mg

d’échantillon. Une gamme de référence est réalisée à partir du sulfate d’ammonium (Merck,

Germany) à 100 µg d’azote.mL-1. Le contenu en azote est multiplié par 6,25 pour déterminer la

teneur en protéines. Les isolats protéiques extraits sont purifiés à plus de 92%.

Tableau II. Composition en acides aminés des protéines utilisées (mg/g de protéines)

Acides aminés (%) Pois chiche1 Caséine2

Arginine 8,3 3,7 Histidine 3 3,2 Isoleucine 4,8 5,4 Leucine 8,7 9,5 Lysine 7,2 9,4 Méthionine + cystéine 1,1 3,5 Phénylealanine + tyrosine 5,5 11,1 Thréonine 3,1 4,2 Tryptophane 0,9 1,4 Valine 4,6 6,3

1Iqbal et al., (2006), selon la méthode American Oil Chemists’ Society (AOAC) 2Staron (1982)


20

Fig.4. Extraction et purification des protéines de pois chiches (Swanson, 1990).

Graines de pois chiches

Farine

Culot protéique

Broyage

1 nuit à 4C°

Solubilisation ( NaOH, pH 9-10) + 10 mmol de sulfite de soduim

Centrifugation 1200 x g, pendant 20 min

Précipitation des protéines solubilisées avec H2SO4, pH 4,5

Centrifugation (1200 x g, 15 min)

Lavage (H2O acide, pH 4,5)

Surnageant (Protéines solubilisées)

Séchage

Broyage

Dosage d’azote Isolat protéique


21

I.1.2.2. Détermination de la teneur en lipides

Les lipides totaux sont déterminés par la méthode de Delsal, (1944). Les lipides sont

extraits par un mélange chloroforme/méthanol (4/1 ; V/V). Les solvants sont évaporés sous vide

au Rotavapor (Büchi, Germany) à 48°C. Après séchage du ballon, la quantité de lipides totaux

de l’échantillon exprimée en % est déterminée par la différence entre le poids final du ballon et

le poids initial.

I.1.2.3. Estimation des cendres

Les échantillons sont incinérés dans un four à moufle à une température de 550°C

jusqu’à obtention de cendres blanches. Les résidus sont alors placés dans un dessiccateur et

pesés immédiatement.

I.1.2.4. Estimation des fibres

Le dosage des fibres totales est basé sur le principe de solubilisation des constituants non

cellulosiques par de l’acide sulfurique (3,12%) et de la potasse (3,12%) à chaud. Le précipité

ainsi obtenu après traitement des échantillons est filtré sur un filtre préalablement pesé et il est

ensuite incinéré. La teneur en fibres est déterminée selon la formule :

Poids des fibres = ((filtre + résidus + creuset)-(cendres + creuset))-filtre après séchage) 105°C.

I.1.2.5. Estimation de la teneur en eau

La détermination de la teneur en eau se fait par dessiccation. 5 g d’échantillon sont

déposés dans un récipient métallique et placés dans une étuve à 105°C pendant 4 heures. La

teneur en eau est déterminée par la formule :

% humidité = (poids humide – poids sec) x 100 / poids humide.


22

Tableau III. Composition chimique (exprimée en % de matière séche) de la protéine

purifiée de pois chiche

% Protéine de pois chiche1

MAT2 92

Lipides 0,86

Fibres 0,012

Cendres 0,9

Glucides+vitamines 5,82

Humidité 0,4

1 Extraites au laboratoire. 2 MAT matière azotée totale (protéines brutes, N x 6,25). Le pourcentage de glucides et de vitamines est déterminé par différence.

I.1.3. Extraction de l’huile de sardine

L’huile de sardine (Sardina pilchardus) utilisée dans notre étude a été réalisée selon la

méthode de Guillaume et al., (1999) (Figure 5). Les sardines sont débarrassées de leurs

viscères, tête et arêtes puis lavées. Elles sont ensuite malaxées manuellement et placées dans

une étuve (Tan STERIL, Italy) pendant 20 minutes entre 80-85°C. A ce niveau, une séparation

à lieu entre une phase solide (protéines coagulées) et une phase liquide (eau et huile). Le gâteau

obtenu est pressé. L’eau du presse obtenue est laissée décanter puis centrifugée (Eppendorf,

centrifuge 5702, Germany) afin de séparer l’huile. Le soluble est ensuite incorporé au gâteau.

Le gâteau qui représente les protéines non délipidées est conservé à 70°C.


23

Fig.5. Procédé d’extraction de l’huile de sardine (Guillaume et al., 1999).

Sardines

Hachage (manuel)

Cuisson (80-85 °C, 20 min)

Eau de presse

Pressage

Décantation

Boue + gâteau

Centrifugations successives (1200 x g, 20 min)

Huile de sardine

Gâteau Phase liquide

Eviscération et lavage

Broyage

Protéines non délipidées


24

II. Animaux

Des rats mâles de souche Wistar (Iffa Credo l’Arbesle, Lyon, France), (n=24) pesant 200

± 10 g et âgés de 7 semaines sont répartis en 4 groupes homogènes (n=6) consommant chacun

pendant 28 jours soit :

- Un régime à 20% de protéines de pois chiches combinées à 5% d’un mélange d’huiles

végétales (olive (3,9%), noix (1%), tournesol (0,1%)) contenant 13% d’AGS, 58% d’AGMI et

29% d’AGPI et un rapport n-6/n-3 = 7 (Pv).

- Un régime à 20% de protéines de pois chiches combinées à 5% d’huile de sardine (38% AGS,

31% AGMI et 31% AGPI) (Ps).

- Un régime à 20% de caséine combinée à 5% du mélange d’huiles végétales (CASv).

- Un régime à 20% de caséine combinée à 5% d’huile de sardine (CASs).

Les 4 régimes sont isoénergétiques et supplémentés avec 1% de cholestérol alimentaire

(Sigma-Aldrich Chémie, Germany) et 0,5 % d’acide cholique (Sigma-Aldrich Chémie,

Germany) (Tableau IV).

Les animaux sont traités conformément aux conseils pour la protection et l’utilisation

des animaux de laboratoire (Council of European Communities, 1986). Ils sont placés dans une

animalerie à la température de 25°C, une hygrométrie de 60°C et un rythme circadien (12h

jour/12 nuit), et mis individuellement dans des cages à métabolisme

L’eau et la nourriture en poudre sont données ad-libitum durant toute l’expérimentation.

Le poids corporel (PC) des animaux et la nourriture ingérée sont pesés quotidiennement. Durant

la dernière semaine du 21 au 28 ème jour de l’étude, les urines sont collectées quotidiennement,

elles sont recueillies sur un antiseptique (Thymol-isopropanol à 10%) puis filtrées et conservées

à 4°C.


25

Tableau IV. Composition des régimes en g/kg de régime1

Ingrédients Pv Ps CASv CASs

Caséine2 - - 200 200

Protéines de pois chiche3 200 200 - -

Amidon de mais4 585 585 585 585

Saccharose5 40 40 40 40

Huile végétale6 50 - 50 -

Huile de Sardine7 - 50 - 50

Cellulose8 50 50 50 50

Mélange minéral9 40 40 40 40

Mélange vitaminique10 20 20 20 20

Cholestérol11 10 10 10 10

Acide cholique12 5 5 5 5

1Les quatres régimes sont isoénergétiques et donnés ad libitum sous forme de poudre. 2Prolabo-Paris, France. 3Extraites et purifiées au laboratoire. 4ONAB, Sidi Bel Abbes, Algérie. 5Sucre cristallisé, ENASUCRE, Sfisef, Algérie. 6Produit du commerce : Huile d’olive (15% AGS, 75% AGMI, 10% AGPI avec 9% oméga 6 et 1% oméga 3)

Ifri olive, Bejaia, Algérie. Huile de noix (11% AGS, 18% AGMI, 71% AGPI avec 58%oméga 6 et 13%

Oméga 3) Lesieur, France. Huile de tournesol (13% AGS, 22% AGMI, 65% AGPI avec 65% oméga 6)

Cevital, SPA, Bejaia, Algérie. 7Extraites au laboratoire. 8 Prolabo-Paris, France. 9UAR 205 B (Villemoisson, 91360, Epinay/S/Orge, France), Mélange minéral (mg/kg de régime) CaHPO4,

17200 ; KCL, 4000 ; NaCl, 4000 ; MgO2, 420 ; MgSO4 , 2000 ;Fe2O3, 120 ; FeSO4, 7H 2O, 200 ; MnSO4,

H2SO4, H2O, 98 ; CuSO4, 5H2O, 20 ; ZnSO4, 80 ; CuSO4, 7H2O ; Kl ,0,32. 10(Villemoisson, 91360, Epinay/S/Orge, France), Mélange minéral (mg/kg de régime) CaHPO4, 17200 ; KCl,

4000 ; NaCl, 4000 ; MgO2, 420 ; MgSO4, 2000 ; Fe2O3, 120 ; FeSO4, 7H2O, 200 ; MnSO4, H2SO4, H2O, 98 ;

CuSO4, 5H2O, 20 ; ZnSO4, 7H2O 80 ; CuSO4 7H2O ; KI, 0,32. 11,12Sigma-Aldrich Chemie, Germany.


26

III. Prélèvement des échantillons sanguins et des différents organes

Au 28ème jour de l’étude, après 12 heures de jeûne, 6 rats de chaque groupe sont

anesthésiés par injection intrapéritonéale d’une solution de chloral (10%) à raison de 0,3

mL/100g de poids corporel. Le sang est prélevé par ponction au niveau de l’aorte abdominale et

le sérum est centrifugé à 1000 x g pendant 20 min à 4°C (Sigma, 4K10 Bioblock Scientific,

Germany). Le sérum est conservé dans du Na2EDTA (0,1%, 10 µl.mL-1 de sérum). Les

érythrocytes sont lavées avec du NaCl à 0,9% puis à 1 volume d’érythrocytes, 4 volumes d’eau

distillée sont rajoutés. La solution est maintenue 10 min à froid puis centrifugée à 1000 x g

pendant 10 min à 4°C.

Les différents organes (foie, cœur, cerveau, tissu adipeux epididymaire, muscle

gastrocnémien, rein et aorte) sont prélevés, rincés avec une solution de NaCl à 0,9% à froid,

séchés puis pesés et conservés à -70°C.

Le sérum, les érythrocytes et les organes sont conservés à -70°C jusqu’aux analyses.

IV. Analyses biochimiques

IV.1. Dosage sériques des teneurs en protéines totales et en albumine

Les teneurs en protéines totales du sérum sont déterminées par une méthode

colorimétrique enzymatique (Kit spinreact, Spain). En milieu alcalin, le complexe formé par les

protéine-Cu2+ et les groupements tyrosine et tryptophane des protéines est réduit par le réactif

(Spinreact, Spain). Il se développe une coloration bleue dont l’intensité est proportionnelle à la

quantité de protéines contenue dans l’échantillon. La lecture se fait à l’aide d’un

spectrophotomètre (Jasco V-530, Japan) à une longueur d’onde λ=546 nm.

L’albumine sérique est déterminée par une méthode colorimétrique (KIT Spinreact,

Spain). L’albumine présente dans l’échantillon donne après sa liaison avec le vert de

bromocrésol, un complexe coloré quantifiable par spectrophotométrie. L’intensité de la

coloration est proportionnelle à la concentration d’albumine dans l’échantillon. La lecture se

fait à une longueur d’onde λ=630 nm.

IV.2. Dosage sérique et urinaire de l’acide urique

L’acide urique est déterminé par une méthode colorimétrique enzymatique (Kit biocon,

Germany). L’acide urique présent dans l’échantillon donne, en présence d’uricase, un

indophénol coloré quantifiable par spectrophotométrie. La lecture se fait à une longueur d’onde

λ=546 nm.


27

IV.3. Dosage des teneurs en cholestérol total et en triglycérides

IV.3.1. Cholestérol total sérique

Le cholestérol total (CT) est mesuré par une technique colorimétrique enzymatique (Kit

biocon, Germany). Le CT présent dans l’échantillon donne, après hydrolyse enzymatique et

oxydation, un complexe coloré. L’indicateur, la quinonéimine, est formé à partir du H2O2 et du

4-amino-antipyrine en présence du phénol et de la peroxydase. La densité optique de

l’échantillon est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à la longueur d’onde λ=500 nm.

IV.3.2. Triglycérides

Les teneurs en triglycérides (TG) sont déterminées par une technique colorimétrique

enzymatique (Kit biocon, Germany). Les TG contenus dans l’échantillon donnent, après

hydrolyse enzymatique et oxydation, un complexe coloré. L’indicateur, la quinonéimine, est

formé à partir du H2O2 et du 4-amino-antipyrine en présence du chlorophénol sous l’action de la

peroxydase.

La densité optique de l’échantillon est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre à la

longueur d’onde λ=546 nm.

V. Séparation et purification des différentes fractions de lipoprotéines La séparation des différentes fractions de lipoprotéines est réalisée par une méthode de

précipitation. Les agents précipitants diffèrent selon la densité de chaque classe de

lipoprotéines.

V.1. Séparation des lipoprotéines de faible densité

Les lipoprotéines de faible densité VLDL (d<1,006) et LDL-HDL1 (1,006<d<1,075) sont

précipitées par du phosphotungstate (Sigma-Aldrich Chemie, Germany) et du MgCl2 (Merck)

selon la technique de Burstein et al., (1970).

V.2. Séparation des lipoprotéines de haute densité

Les lipoprotéines de haute densité HDL2 (1,085<d<1,121) et HDL3 (1,12<d<1,210) sont

précipitées par du sulfate de dextran (poids moléculaire moyen 500 000, Sigma Chemical

Company, St Louis) et du MgCl2 selon la méthode de Burstein et al., (1989). Toutes les

centrifugations sont effectuées à 1000 x g durant 30 min à 20°C, après 30 min d’incubation.


28

V.3. Purification de différentes lipoprotéines

Les différentes fractions de lipoprotéines sont solubilisées dans une solution contenant

du citrate trisodique et du NaCl à 0,01M. Afin de minimiser la contamination par les protéines

sériques, les différentes fractions sont ensuite purifiées par des lavages successifs. Les VLDL

et les LDL-HDL1 sont purifiées par du sulfate de dextran 0,05M et du MgCl2 à 0,05M, et les

HDL2 et HDL3 avec de l’oxalate de potassium à 0,5M et 1M, respectivement.

VI. Evaluation du statut redox VI.1. Détermination de l’attaque radicalaire VI.1.1. Mesure des substances réactives à l’acide thiobarbiturique du sérum, urines, des

différents tissus et des lipoprotéines

Le dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) est une méthode

de référence caractérisée par sa simplicité et sa sensibilité, elle permet la mise en évidence d’un

éventuel stress oxydant. Le malondialdéhyde (MDA) (Sigma-Aldrich Chemie, Germany) est le

principal marqueur de la détermination des radicaux libres.

VI.1.1.1. Au niveau sérique et urinaire

Les teneurs des TBARS du sérum et des urines sont déterminées par la méthode de

Quitanilha et al., (1982). 100 µL d’échantillon sont dilués dans 0,9 mL de NaCl puis à cette

solution, 20 µL de Buthyl-hydroxy toluéne (BHT) (BHT 2% dans de l’éthanol) (Sigma-aldrich

Chemie, Germany) et 1 mL d’acide thiobarbiturique (TBA) (Sigma-aldrich Chemie, Germany)

(TBA 0,375% dans du HCl à 0,5N en concentration finale d’acide trichloroacétique (TCA à

15%) sont rajoutés. Après incubation à 85°C pendant 30 min et refroidissement dans de la

glace, les échantillons sont centrifugés à 2000 x g pendant 10 min, à 4°C (Sigma, 4K10

Bioblock Scientific, Germany). La lecture se fait par spectrophotométrie à une longueur d’onde

λ=535 nm. Le MDA est utilisé pour établir une courbe d’étalonnage. Le contenu en TBARS est

exprimé en µmol.mL-1.


29

VI.1.1.2. Au niveau des VLDL, LDL-HDL1, HDL2 et HDL3

La mesure de la peroxydation lipidique au niveau des différentes fractions de

lipoprotéines est déterminée par le dosage des TBARS selon la technique de Quitanilha et al.,

(1982) citée précédemment. Les teneurs en TBARS sont exprimées en µmol.mL-1 de sérum.

VI.1.1.3. Au niveau tissulaire

La peroxydation lipidique au niveau des différents tissus (foie, cœur, tissu adipeux, rein,

aorte, cerveau et muscle) est déterminée par la mesure des TBARS selon la technique

d’Ohkawa et al., (1979). 100 mg de tissu sont broyés dans 0,9 mL de KCL à 1,15%. Le milieu

réactionnel contient 0,2 mL d’homogénat tissulaire. 0,2 mL d’une solution contenant du SDS à

8,1% et 1,5 mL d’acide acétique à 20% (pH 3,5) et 1,5 mL de TBA à 0,8% sont rajoutés, le

volume final est ajusté avec 4 mL d’eau distillée. Le mélange est ensuite vortexé pendant 30 sec

et chauffé à 95°C pendant 1 h dans un bain marie. 1 mL d’eau distillée et 5 mL de butanol sont

ensuite additionnés. Les tubes sont agités vigoureusement et centrifugés à 1000 x g pendant 10

min. Les TBARS tissulaires sont estimés par spectrophotométrie (λ=532 nm ) et les résultats

sont exprimés en mmol de MDA.g-1 de protéines tissulaires.

VI.1.2. Mesure de la peroxydation protéique

VI.1.2.1. Dosage des dérivés carbonylés sériques et tissulaires

La mesure de la peroxydation protéique est réalisée par le dosage des dérivés carbonylés

selon la méthode de Levine et al., (1990). 0,1 mL de sérum ou d’homogénat tissulaire (125 mg

de tissu dans 3 mL de tampon phosphate) sont déposés dans 2 tubes, 0,5 mL HCL 2,5 M (blanc

échantillon) et 0,5 mL de 2,4- dinitrophénylhydrazine (DNPH) 10mM (échantillon) sont

rajoutés. Les tubes sont ensuite placés à l’obscurité pendant 1h à la température de 25°C, une

agitation est effectuée toutes les 10-15 min. 500 µL de TCA à 20% sont additionnés, le mélange

est vortexé puis centrifugé à 11000 x g, pendant 3 min à 20 C°. Le surnageant est éliminé et le

culot (contenant le DNPH seulement) est lavé 3 fois avec 1 mL d’un mélange éthanol / acétate

d’éthyle (1/1, V/V). Le surnageant est éliminé à chaque lavage. Les protéines précipitées sont

redissoutes dans 0,6 mL d’une solution de guanidine puis incubée pendant 15 min à 37°C. Une

centrifugation à 11000 x g durant 15 min permet d’éliminer les débris insolubles. Un spectre

d’absorption est réalisé entre 250 et 300 nm pour obtenir les dérivés aldéhydes et les cétones.

La concentration de ces derniers est calculée par la différence d’absorbance entre le

blanc et l’échantillon selon la formule : C = absorption / ε (ε = 22000/106 nmol.mL-1 pour 380


30

nm). ε : coefficient d’extinction molaire spécifique à la longueur d’onde choisie). Les résultats

sont exprimés en nmol.mg-1 pour les tissus et en nmol.mg-1de protéines au niveau sérique.

VI.2. Evaluation de la défense antioxydante

VI.2.1. Mesure de l’activité des enzymes antioxydantes

VI.2.1.1. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase sérique, érythrocytaire et

tissulaire

Le dosage de la superoxyde dismutase (SOD) au niveau des érythrocytes et des

différents tissus est réalisé par une méthode colorimétrique (SOD Assay Kit-WST) qui utilise

un sel de tétrazolium pour la détection des radicaux superoxydes générés par la xanthine

oxydase et l’hypoxanthine. Une unité de SOD est définie comme la quantité d’enzyme

nécessaire pour la dismutation de 50% du radical superoxyde. Les tissus sont rincés avec du

tampon phosphate salin (PBS) (pH 7,4 contenant 0,16 mg.mL-1 d’héparine).

VI.2.1.2. Dosage de l’activité de la catalase érythrocytaire et tissulaire

L’activité de la catalase est réalisée selon la méthode décrite par Bergmeyer (1974) par

la mesure du taux de décomposition du H2O2. Le dosage s’effectue sur 250 µL de surnageant

pour les érythrocytes et 250 µL d’homogénat tissulaire (100 mg de tissu broyé dans 0,9 mL de

KCL). 250 µL d’H2O2 (30 mmoL dans du tampon phosphate à 50 mmol/L) et 250 µL de

tampon phosphate sont rajoutés, la solution est ensuite agitée et incubée pendant 5 min. La

lecture est réalisée par spectrophotométrie à une longueur d’onde λ = 420 nm, rapidement après

addition du titanium sulfate (TiOSO4). L’activité de l’enzyme est exprimée en mmol.mL-1 au

niveau des érythrocytes et en mmol.g-1 au niveau des tissus.

VI.2.2. Dosage du monoxyde d’azote sérique, urinaire et tissulaire

Les teneurs en monoxyde d’azote (NO) sont estimées selon la méthode de Cortas &

Wakid (1990). Le NO donne des nitrates+nitrites. Le dosage du NO se fait avec le réactif de

Griess (sulfanilamide et n-naphtyléthylène diamine) qui réagit avec les nitrites ; les nitrates

quant à eux sont réduits par le cadmium (Fluka Chemie Sigma-Aldrich, Poland) en nitrites. La

détermination de la concentration en NO du sérum, des urines et des tissus s’effectue après

déprotéinisation des différents échantillons. La déprotéinisation se fait avec de l’EDTA pour le

sérum et les urines, et avec du sulfate de Zn pour les homogénats tissulaires. Une gamme étalon


31

est réalisée avec du sodium nitrite NaNO2 (Sigma-Aldrich Chemie, Germany). La lecture

est réalisée à l’aide d’un compteur Elisa à λ = 540 nm. Les résultats sont exprimés en µmol.mL-

1 pour le sérum et les urines et en µmol.mg-1 pour les tissus.

VII. Analyse statistique

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne ± erreur standard (M ± ES) de 6 rats

par groupe. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de

rang multiple de Duncan (1955) (Logiciel Statistica, Version 5,1, Statsoft 97) entre les quatres

groupes. Les moyennes portants des lettres (a, b, c, d) sont significativement différentes

(P<0,05).

Résultats

32

b b b

a

ba

aa

a

190

200

210

220

230

240

250

260

0 7 14 21 28

g

Jours

Pv

Ps

CASv

CASs

I. Evolution du poids corporel et nourriture ingérée

I.1. Evolution du poids corporel (Fig.6)

Après 28 jours de consommation des régimes supplémentés en cholestérol et quelle que

soit l’huile incorporée, le poids corporel des rats reste similaire chez les 2 groupes consommant

la protéine de pois chiche (Pv vs Ps) et la caséine (CASv vs CASs). Cependant, la protéine de

pois chiche comparée à la caséine, induit une croissance pondérale plus faible tout le long de

l’étude. En effet, à la fin de l’expérimentation nutritionnelle, le poids des animaux est réduit de

-12% chez le groupe Pv par apport à CASv et -10% chez le groupe Ps comparé à CASs.

Fig. 6. Croissance pondérale des animaux

Fig. 7. Nourriture ingérée

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b) sont significativement différentes (P<0,05).

ba a a

0

15

30

J28

PvPsCASvCASs

g.j‐1.rat

‐1

Résultats

33

I.2. Nourriture ingérée (Fig. 7)

La nourriture ingérée quotidienne (exprimée en g.j-1.rat-1) est 1,2-fois plus faible chez le

groupe Pv comparé aux groupes Ps et CASv. Par contre, elle est identique chez les groupes

CASv, CASs et Ps et représente en moyenne 23 g.j-1.rat-1

II. Valeur absolue et relative du poids des organes (Tableau V)

Les poids du foie, rein, cerveau et aorte ne sont pas influencés par l’origine de la

protéine (pois chiche ou caséine) ou de l’huile (végétale ou sardine) chez les 4 groupes

d’animaux. De plus, aucune différence significative n’est notée dans le poids du tissu adipeux

chez les groupes Ps vs Pv et CASv vs CASs. Cependant, ce dernier est 2,3-fois plus faible chez

le groupe Pv comparé à CASv.

Le poids du muscle est similaire chez les groupes consommant la protéine de pois

chiche, alors qu’il est 2,7- fois plus élevé chez le groupe CASs vs CASv.

L’origine des protéines à un effet significatif sur le poids du cœur. En effet, les valeurs

sont 1,6-fois plus faibles chez les rats nourris avec la protéine de pois chiche comparée à la

caséine.

Le poids relatif des organes (poids de l’organe/poids corporel de l’animal x100)

renseigne sur la croissance pondérale de l’organe par rapport à celle de l’organisme entier.

Les poids relatif des organes (foie, tissu adipeux, muscle, rein, cœur, cerveau et aorte) ne

sont influencés ni par l’origine de la protéine (pois chiche ou caséine), ni par l’origine des

huiles (végétales ou poissons (sardine)).

Résultats

34

Tableau V. Valeur absolue et relative du poids des organes


III. Teneurs sériques en protéines totales et en albumine (Tableau VI) Les teneurs en protéines sériques sont 1,5- et 1,7-fois plus faibles chez les groupes Pv vs

Ps et Pv vs CASv, respectivement. En revanche, elles sont identiques chez les groupes CASv et

CASs.

La teneur sérique en albumine est 2- et 1,4-fois plus faible chez le groupe Ps et CASv

comparé au groupe CASs, alors qu’elle est identique chez les groupes Pv, Ps et CASv.

Tableau VI. Teneurs sériques en protéines totales et en albumine

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b, c) sont significativement différentes (P<0,05).

Pv Ps CASv CASs Poids des organes (g) Foie 8,82 ± 1,37 10,35 ± 0,74 8,43 ± 0,73 10,69 ± 2,35Tissu adipeux 1,28 ± 0,49b 2,38 ± 0,74ab 3,06 ± 0,77a 3,00 ± 1,06a

Muscle 0,96 ±0,21ab 0,86 ± 0,12a 0,58 ± 0,18b 1,57 ± 0,69a

Cœur 0,48 ± 0,06b 0,46 ± 0,06b 0,72 ± 0,05a 0,74 ± 0,11a

Rein 1,39 ± 0,16 1,62 ± 0,2 1,78 ± 0,15 1,65 ± 0,31Cerveau 1,54 ± 0,07 1,76 ± 0,13 1,75 ± 0,26 1,72 ± 0,15Aorte 0,07 ± 0,06 0,16 ± 0,07 0,11 ± 0,06 0,16 ± 0,06Poids relatif des organes (g.100 g PC)

Foie 4,13 ± 0,87 4,55 ± 0,31 3,43 ± 0,29 4,27 ± 1,00Tissu adipeux 0,65 ± 0,27 1,04 ± 0,32 1,25 ± 0,33 1,2 ± 0,44Muscle 0,45 ± 0,13 0,38 ± 0,05 0,67 ± 0,07 0,63 ± 0,27Cœur 0,23 ± 0,04 0,28 ± 0,04 0,29 ± 0,02 0,29 ± 0,05Rein 0,65 ± 0,11 0,71 ± 0,09 0,72 ± 0,07 0,66 ± 0,14Cerveau 0,72 ± 0,07 0,78 ± 0,06 0,71 ± 0,11 0,68 ± 0,07Aorte 0,03 ± 0,02 0,07 ± 0,03 0,05 ± 0,03 0,07 ± 0,03

Pv Ps CASv CASs Protéines totales (g.L-1) 40,98 ± 7,79c 59,24 ± 8,62b 71,91 ± 3,95a 78,59 ± 6,94a

Albumine (g.L-1) 26,18 ± 1,88b 21,33 ± 2,70b 28,81 ± 3,37b 42,34±10,90a

Résultats

35

IV. Teneurs sériques en cholestérol total et en triglycérides (Tableau VII) Les interactions entre les protéines et les lipides ont montré que les plus faibles valeurs

de la cholestérolémie (1,78± 0,44 et 1,99 ±1,04 mmol.L-1) sont observées chez les rats

consommant le melange d’huiles végétales (olive-noix-tournesol). En revanche, l’huile de

sardine combinée à la protéine de pois chiche ou à la caséine induit une augmentation

significative des teneurs en CT (4,69±0,31 et 4,89±1,32 mmol.L-1).

L’huile végétale combinée à la protéine de pois chiche ou à la caséine ne modifie pas les

valeurs des TG sériques. A l’inverse, l’huile de sardine combinée à la caséine entraîne une

réduction de -29% des teneurs en TG sériques comparativement au régime contenant le

mélange d’huiles végétales associé à la caséine.

Tableau VII. Teneurs sériques en cholestérol total (CT) et en triglycérides (TG)


V. Teneurs sérique et urinaire en acide urique (Tableau VIII) Aucune différence significative n’est notée dans les teneurs sériques en acide urique

chez les groupes de rats ingérant la protéine de pois chiche, alors qu’elles sont 2-fois plus

faibles chez le groupe CASv vs CASs. Par ailleurs, les valeurs sériques en acide urique sont

3- et 1,7-fois plus élevées chez les groupes Pv vs CASv et Ps vs CASs, respectivement.

Au niveau urinaire, aucune variation de l’acide urique n’est observée chez les quatres

groupes d’animaux.

Tableau VIII. Teneurs sérique et urinaire en acide urique

Acide urique (g.L-1) Pv Ps CASv CASs Sérum 7,53 ± 0,54a 8,30±0,1a 2,51±0,86c 5,04±0,18b

Urines 0,60 ± 0,11 0,65 ±0,18 0,45±0,02 0,43 ±0,18Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b, c) sont significativement différentes (P<0,05).

Pv Ps CASv CASs CT (mmol.L-1) 1,78 ± 0,44b 4,69 ± 0,31a 1,99 ± 1,04b 4,89 ± 1,32a

TG (mmol.L-1) 0,53 ± 0,17a 0,36 ± 0,03a 0,68 ± 0,05a 0,48 ± 0,10b

Résultats

36

a

c

b

c0

75

150Urine

VI. Concentration en substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS)

VI.1. Au niveau sérique et urinaire (Fig. 8)

Au niveau sérique, les teneurs en TBARS sont 1,2-fois plus élevées chez les groupes Pv

comparé au groupe Ps et 1,2-fois plus faibles chez le groupe Ps comparé à CASs.

Au niveau urinaire, les teneurs en TBARS sont significativement plus élevées chez le

groupe Pv vs Ps (20-fois) et CASv vs CASs (14-fois). L’origine des protéines n’a aucune

influence sur les TBARS urinaires lorsque celles-ci sont combinées à l’huile de sardine. En

revanche, lorsque les protéines sont associées aux huiles végétales, les valeurs des TBARS sont

plus élevées (1,2-fois) chez le groupe Pv par rapport à CASv .

Fig. 8. Teneurs sériques et urinaires en TBARS


VI.2. Au niveau des lipoprotéines (Fig. 9)

Les teneurs en TBARS au niveau de la fraction VLDL sont 10- et 7-fois plus faibles

chez le groupe Ps par rapport à Pv et CASs comparé à CASv, respectivement. De plus, une

réduction des concentrations en TBARS dans la fraction VLDL est trouvée chez le groupe Pv vs

CASv (1,5-fois) et Ps vs CASs (2-fois). En revanche, dans la fraction LDL-HDL1 les valeurs

des TBARS sont 2- et 2,2-fois plus importantes chez le groupe Ps vs Pv et CASs vs CASv,

respectivement.

a

b

aa

0

25

50Sérum

µmol

.mL

-1

µmol

.mL

-1

Résultats

37

L’effet protéine montre que la protéine de pois chiche atténue l’oxydation des LDL-HDL1 (1,4-

fois) chez le groupe Pv vs CASv et Ps vs CASs. Aucune différence significative n’est notée au

niveau de la fraction HDL2 chez les 2 groupes consommant la caséine et chez le groupe Ps vs

CASs, alors qu’elles sont 1,4-fois plus élevées chez le groupe Pv comparé à CASv.

Dans la fraction HDL3, les teneurs en TBARS ne sont pas influencées par l’origine de

l’huile. En effet, les valeurs son identiques chez les 2 groupes consommant la protéine de pois

chiche ou ceux ingérant la caséine. En revanche, la protéine de pois chiche comparée à la

caséine, réduit la peroxydation des lipides de la fraction HDL3 de 2,7-fois lorsqu’elle est

combinée aux huiles végétales (Pv vs CASv) et de 1,3-fois lorsqu’elle est associée à l’huile de

sardine (Ps vs CASs).

Fig. 9. Teneurs des lipoprotéines en TBARS

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b, c, d) sont significativement différentes (P<0,05).

µmol

.mL

-1

µmol

.mL

-1

µmol

.mL

-1

µmol

.mL

-1

aab

b b

0

5

10

15HDL2

b

d

a

c

0

5

10

15VLDL

d

bc

a

0

5

10

15LDL-HDL1

bb

a

a

0

5

10

15HDL3

Résultats

38

VI.3. Au niveau tissulaire (Fig. 10)

Au niveau tissulaire, les TBARS hépatiques sont similaires chez les 2 groupes

consommant la protéine de pois chiche, alors qu’elles sont 3,6- et 2-fois plus élevées chez le

groupe CASv vs CASs et Ps vs CASs.

Dans le tissu adipeux, la protéine de pois chiche associée aux huiles végétales ou l’huile

de sardine ne modifie pas les teneurs en TBARS comparativement à la caséine. En effet, les

teneurs en TBARS sont 3,6-fois plus élevées chez le groupe CASv vs CASs et 3,7-fois plus

faibles chez le groupe Pv comparé à CASv.

Au niveau musculaire, les teneurs en TBARS sont réduites chez le groupe Ps vs Pv (1,6-

fois) et chez CASs vs CASv (2,8-fois). En revanche, la protéine de pois chiche comparée à la

caséine induit une augmentation des TBARS de 4,6-fois lorsqu’elle est combinée à l’huile

végétale et de 8,5-fois lorsqu’elle est associée à l’huile de sardine.

Dans le cœur et le rein, le mélange d’huiles végétales n’induit aucune variation dans les

teneurs en TBARS lorsqu’il est combiné à la protéine de pois chiche ou à la caséine.

Néanmoins, comparée à l’huile de sardine, les huiles végétales entrainent une diminution des

teneurs en TBARS (2-fois au niveau du cœur et 3,8-fois au niveau du rein) chez le groupe Pv vs

Ps et une réduction de 2,7-fois en moyenne dans le cœur et le rein, chez le groupe CASv vs

CASs.

Aucune différence significative n’est notée au niveau du cerveau chez les groupes Pv vs

Ps comparativement à la caséine. Tandis que, les valeurs des TBARS sont plus élevées (2,6-

fois) chez le groupe CASv comparé à CASs.

Au niveau de l’aorte, l’huile de sardine entraîne une baisse significative des TBARS

(6,7-fois) chez le groupe Ps vs Pv et 9-fois chez le groupe CASs vs CASv. De plus, les valeurs

des TBARS sont 1,2-fois plus faibles chez les groupes Pv vs CASv.

Résultats

39

b b

a

b

0

15

30

Cerveau

Fig. 10. Teneurs tissulaires en TBARS


abb

a

c

0

5 Foie

b b

a

c

0

15

30Tissu adipeux

mm

ol.g

-1

b a ba

0

15

30Coeur

ab

c d0

15

30Muscle

ba

ba

0

15

30

Rein

b

c

a

c0

15

30

Aorte

mm

ol.g

-1

mm

ol.g

-1

mm

ol.g

-1

mm

ol.g

-1

mm

ol.g

-1

mm

ol.g

-1

Résultats

40

VII. Teneurs sériques et tissulaires en carbonyles (Tableau IX) VII.1. Au niveau sérique Les teneurs en carbonyles sont 1,5-fois plus élevées chez le groupe Pv comparées à

celles du groupe Ps, mais elles sont similaires chez les groupes CASv vs CASs. Cependant, les

valeurs en carbonyles sont 1,7-fois plus élevées chez Pv vs CASv et semblables chez le groupe

Ps et CASs.

VII.2. Au niveau tissulaire

Au niveau du foie, les teneurs en carbonyles sont augmentées de 2,8-fois chez le groupe

Pv vs Ps mais réduites (1,5- fois) chez le groupe CASv vs CASs. La protéine de pois chiche

combinée aux huiles végétales entraîne une augmentation des carbonyles comparée à la caséine

combinée à la même huile. Par contre, lorsqu’elle est combinée à l’huile de sardine, elle

entraîne une diminution de 3,7-fois des carbonyles comparée à la caséine associée à la même

huile.

Au niveau du tissu adipeux, les teneurs en carbonyles sont plus faibles (1,6-fois) chez le

groupe Pv vs Ps, mais similaires chez les 2 groupes consommant la caséine. La protéine de pois

chiche combinée aux huiles végétales ou l’huile sardine, abaisse les teneurs en carbonyles de

2,3- et 1,4-fois comparée à la caséine combinée aux mêmes huiles.

Tableau IX. Teneurs en carbonyles au niveau sérique et tissulaire


Pv Ps CASv CASs Sérum (nmol.mg-1 de protéines) 1 ± 0,01a 0,68 ± 0,16b 0,58 ± 0,03b 0,68 ± 0,1b

Tissus (nmol.mg-1 de tissu) Foie 6,47 ± 0,97b 2,32 ± 0,50d 5,51 ± 0,02c 8,52 ± 0,21a

Tissu adipeux 4,28 ± 0,75c 7,09 ± 0,2b 9,76 ± 0,68a 10,34 ± 0,07a

Muscle 1,82 ± 0,27b 1,19 ± 0,26c 10,05 ± 0,43a 8,75 ± 1,83a

Cœur 2,88 ± 0,04d 4,78 ± 0,51c 8,51 ± 0,25b 10,62 ± 0,21a

Rein 7,25 ± 2,17b 6,63 ± 1,90b 10,14 ± 0,27a 10,81 ± 0,51a

Cerveau Aorte

6,05 ± 0,6c

5,05±0,17c 0,37 ± 0,01d

0,17± 0,01d10,91 ± 0,14a

7,65 ± 0,13a 6,14 ± 0,04b

0,6 ± 0,05b

Résultats

41

Au niveau du muscle, les teneurs en carbonyles sont 1,5-fois plus élevées chez le groupe

Pv vs Ps mais identiques chez les 2 groupes consommant la caséine. Chez le groupe Pv, les

carbonyles sont 5-fois plus réduits comparés à ceux notés chez le groupe CASv. En revanche,

une diminution significative (7,3-fois) est constatée dans les teneurs en carbonyles, chez le

groupe Ps comparé au groupe CASs. L’effet huile montre qu’au niveau du cœur, le mélange

d’huiles végétales comparé à l’huile de sardine réduit les carbonyles de 1,6-fois chez le groupe

consommant la protéine de pois chiche et de 1,2-fois chez le groupe caséine. De plus, l’effet

protéine montre que la consommation de la protéine de pois chiche diminue les teneurs en

carbonyles (3-fois) chez le groupe Pv vs CASv et 2-fois chez le groupe Ps vs CASs.

Au niveau du rein, aucune différence significative n’est trouvée chez le groupe Pv vs Ps et

CASv vs CASs. Cependant, la protéine de pois chiche comparée à la caséine entraîne une

diminution des carbonyles de 1,4-fois lorsqu’elle est combinée au mélange d’huiles végétales et

de 1,6 fois quand elle est combinée à l’huile de sardine.

Au niveau du cerveau et de l’aorte, le mélange d’huiles végétales entraîne

respectivement, une élévation des teneurs en carbonyles de 16-fois et de 30-fois chez le groupe

Pv vs Ps. En revanche, les valeurs des carbonyles sont réduites de 1,8- et 16-fois chez le groupe

Pv vs CASv et de 3,5 et 1,5-fois chez le groupe Ps vs CASs.

VIII. Activités des enzymes antioxydantes

VIII.1. Activité de la superoxyde dismutase

VIII.1. 1. Au niveau des érythrocytes (Fig. 11)

Fig. 11. Activité de la superoxyde dismutase érythrocytaire Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b, c) sont significativement différentes (P<0,05).

a ac

b

0

4

8Erythrocytes

mm

ol.m

L-1

Résultats

42

Au niveau des érythrocytes, l’activité de la SOD est augmentée de + 52% chez le

groupe Pv vs CASs et de +20% chez le groupe Ps vs CASs.

Aucune différence significative n’est trouvée entre les deux groupes ingérant la

protéine de pois chiche, alors que la SOD est plus élevée (+27%) chez le groupe CASv vs

CASs.

VIII.1.2. Au niveau des tissus (Fig. 12)

Au niveau du foie, l’huile de sardine induit une augmentation de la SOD (+42% et

+39%) chez le groupe Ps vs Pv et CASs vs CASv, respectivement. De plus, cette activité est

50% plus élevée chez le groupe Pv par rapport à CASv et Ps comparé à CASs.

Au niveau du tissu adipeux, une augmentation de l’activité de la SOD (+43% et 58%) est

trouvée chez le groupe Pv vs Ps et CASv vs CASs, respectivement. Par ailleurs, la SOD est plus

élevée (+15%) chez CASv vs Pv mais réduite de -57% chez CASs vs Ps .

Au niveau du muscle, l’activité de la SOD est respectivement plus élevée (+15% et

+23%) chez les groupes Pv vs Ps et CASv vs CASs. De même, une augmentation de +31% est

observée chez le groupe Pv vs CASv et +400% chez le groupe Ps vs CASs.

Au niveau du cœur, l’activité de la SOD est plus élevée chez le groupe Pv vs Ps (+68%)

mais reste similaire chez les 2 groupes consommant les régimes caséine. La protéine de pois

chiche comparée à la caséine augmente significativement l’activité de la SOD (+280%)

lorsqu’elle est combinée au mélange végétal et +73% lorsqu’elle est combinée à l’huile de

sardine.

Au niveau du cerveau, l’activité de la SOD est élevée de +35% chez le groupe Ps vs Pv

mais réduite de -25% chez le groupe CASs vs CASv. La SOD reste identique chez le groupe Pv

et CASv, alors qu’elle est augmentée de +77% chez le groupe Ps vs CASs.

Au niveau de l’aorte, la SOD est significativement plus élevée chez les groupes Pv par

rapport à Ps (+350%) et +50% chez le groupe CASv comparé à CASs. De plus, l’activité de la

SOD est +300% et +26% plus importante chez le groupe Pv vs CASv et CASv vs CASs,

respectivement.

Résultats

43

m.g

-1pr

otéi

nes

m.g

-1pr

otéi

nes

m.g

-1pr

otéi

nes

m.g

-1pr

otéi

nes

m.g

-1pr

otéi

nes

m.g

-1pr

otéi

nes

Fig. 12. Activité de la superoxyde dismutase tissulaire


a

b bc

0

6

12Aorte

b

a

b c

0

6

12 Cerveau

a

b

c c

0

6

12 Cœura

b

c

d

0

6

12 Muscle

b

c

a

d

0

6

12 Tissu adipeux

b

a

dc

0

1

2 Foie

Résultats

44

VIII.2. Activité de la catalase

VIII.2.1. Au niveau des érythrocytes (Fig. 13)

Les deux sources d’huiles combinées à la protéine de pois chiche ou à la caséine

n’influencent pas l’activité de la catalase au niveau des érythrocytes. Cependant, l’origine de la

protéine influence l’activité de cette enzyme. En effet, la protéine de pois chiche comparée à la

caséine réduit l’activité de la catalase de -38% chez les groupes Pv vs CASv et -30% chez Ps vs

CASs.

Fig. 13. Activité de la catalase au niveau érythrocytaire Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b) sont significativement différentes (P<0,05).

VIII.2.2. Au niveau des tissus (Fig. 14)

L’activité de la catalase est réduite au niveau du foie de -18% chez le groupe Ps vs Pv et

de -70% chez le groupe CASs comparé à CASv. Cependant, elle est augmentée de +52% chez

le groupe Pv vs CASv mais est similaire chez le groupe Ps vs CASs.

Au niveau du tissu adipeux, l’activité de la catalase est plus importante de +50% chez le

groupe Ps vs Pv et de +9% chez le groupe CASs vs CASv. Quelle que soit l’huile incorporée, la

protéine de pois chiche réduit l’activité de la catalase de -50% chez le groupe Pv vs CASv et de

-47% chez le groupe Ps vs CASs.

mm

ol.m

L-1

bb

a a

0

2,5

5

Erythrocytes PvPsCASvCASs

Résultats

45

Au niveau du muscle, les deux huiles combinées à la protéine de pois chiche ou à la

caséine n’influencent pas l’activité de la catalase. Cependant cette activité est réduite de -40%

chez le groupe Pv vs CASv et -25% chez le groupe Ps vs CASs.

Au niveau du cœur, l’activité de la catalase est augmentée de +67% chez le groupe Pv vs

Ps et de +55% chez le groupe CASv vs CASs, alors qu’elle est diminuée de -57% chez le

groupe Pv vs CASv et de - 70% chez le groupe Ps vs CASs.

Au niveau du rein, une diminution de la catalase de -12% est trouvée chez le groupe Pv

vs Ps et de -36% chez le groupe CASv vs CASs. Quelle que soit l’huile combinée, la protéine de

pois chiche comparée à la caséine entraîne une augmentation significative de l’activité de la

catalase (+40%) chez le groupe Pv vs CASv et de +16% chez le groupe Ps vs CASs .

Au niveau du cerveau, l’activité de la catalase est plus faible -18% chez le groupe Pv vs

Ps, alors qu’aucune différence significative n’est constatée entre les 2 groupes ingérant la

caséine. En revanche, une augmentation de + 35% et +48% est observée chez le groupe Pv vs

CASv et Ps vs CASs, respectivement.

Au niveau de l’aorte, l’activité de la catalase est réduite de -17% chez le groupe Pv vs Ps

et de -31% chez le groupe CASv vs CASs. Quelle que soit l’origine de l’huile, la protéine de

pois chiche induit une réduction de-14% chez le groupe Pv comparé au groupe CASv et

de -28% chez le groupe Ps vs CASs.

Résultats

46

ba

c

b

0

150

300 Rein

Fig. 14. Activité de la catalase au niveau tissulaire


bc

a

bc

0

150

300

b b

a a

0

150

300 Muscle

mm

ol.g

-1tis

su

mm

ol.g

-1tis

su

mm

ol.g

-1tis

su

mm

ol.g

-1tis

su

ba

c c

0

150

300 Cerveau

b

c

a

b

0

150

300 Cœur

mm

ol.g

-1tis

su

cb b

a

0

150

300 Aorte

mm

ol.g

-1tis

su

mm

ol.g

-1tis

su

d

c

b a

0

150

300 Tissu adipeux Foie

Résultats

47

IX. Concentrations sériques, urinaires et tissulaires en monoxyde d’azote (NO)

IX.1. Au niveau du sérum et des urines (Fig. 15)

Au niveau sérique, les concentrations du NO sont 1,6- et 1,2-fois plus faibles chez le

groupe Pv vs Ps et CASv vs CASs, respectivement. De plus, le NO est 1,3- et 1,8-fois plus élevé

chez les groupes Pv vs CASv et Ps vs CASs.

Au niveau urinaire, la valeur du NO est 1,8-fois plus importante chez le groupe Pv vs Ps,

alors qu’aucune différence significative n’est notée chez les 2 groupes caséine. Chez le groupe

Pv comparée au groupe CASv, la concentration du NO est 1,9-fois plus élevée, alors qu’elle est

similaire chez le groupe Ps vs CASs.

Fig. 15. Teneurs sériques et urinaires en monoxyde d’azote

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées à l’huile végétale ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinées à l’huile végétale ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b,c, d) sont significativement différentes(P<0,05).

XI. 2. Au niveau tissulaire (Fig. 16)

Au niveau hépatique, la concentration du NO est identique chez les groupes consommant

la protéine de pois chiche ou la caséine. Cependant, cette valeur est 2,7-fois plus faible chez le

groupe Pv comparé au groupe CASv mais semblable chez le groupe Ps vs CASs.

Dans le tissu adipeux, une augmentation du NO de 1,3-fois est notée chez le groupe Pv

vs Ps et de 2,6-fois chez le groupe CASv vs CASs. De plus, le NO est 2-fois plus élevé chez le

groupe Ps par rapport à CASs.

µmol

.mL

-1

a

bb

b

0

7

14Urine

b

a

c d

0

1

2

Sérum

µmol

.mL

-1

Résultats

48

µmol

.mg-1

µmol

.mg-1

µmol

.mg-1

µmol

.mg-1

µmol

.mg-1

µmol

.mg-1

Fig. 16. Teneurs tissulaires en monoxyde d’azote


b

b

a

ab

0

5

10 Foie

aa

b b

0

15

30 Cœur

a

ba

c

0

15

30 Tissu adipeux PvPsCASvCASs

b

a

d

c

0

5

10 Muscle

aa

b b

0

10

20 Cerveau

b

a

c

b

0

50

100 Rein

Résultats

49

Au niveau du muscle, les valeurs du NO sont en moyenne 2-fois plus faibles chez les

groupes Pv vs Ps et CASv vs CASs. Par ailleurs, le NO est en moyenne 1,4-fois plus important

chez les groupes Pv vs CASv et Ps vs CASs.

Au niveau du cœur et du cerveau, aucune différence significative n’est notée entre les 2

groupes consommant la protéine de pois chiche ou la caséine. Néanmoins, la protéine de pois

chiche comparée à la caséine entraîne respectivement chez le groupe Pv vs CASv et Ps vs

CASs, une augmentation significative du NO de 4-, 2,9-fois au niveau du cœur, et de 3,5- et

3,2-fois au niveau du cerveau.

Au niveau du rein, la concentration du NO est 4,7-fois plus faible chez le groupe Pv vs

Ps et 5,7-fois plus élevée chez le groupe CASv vs CASs. Par ailleurs, une diminution

significative est notée chez le groupe Pv vs CASv, alors qu’une augmentation de 8-fois est

trouvée chez le groupe Ps comparé au groupe CASs.

Discussion

50

Le but de cette étude est de mettre en évidence l’impact des protéines hautement purifiées

de pois chiches (P) comparées à la caséine (CAS), combinées à un mélange d’huiles végétales

(v) (olive-noix-tournesol) ou à une huile de sardine (s) sur la dyslipidémie d’une part, et sur les

biomarqueurs du stress oxydatif et de la défense antioxydante d’autre part, chez des rats Wistar

adultes consommant un régime enrichi en cholestérol.

Le premier objectif de cette étude visait à voir l’effet respectif et interactif des protéines et

des huiles alimentaires sur la dyslipidémie.

Les résultats montrent qu’après 28 jours d’expérimentation, la variation de l’huile dans

le régime contenant la protéine de pois chiche ou la caséine ne provoque aucun changement

dans le poids corporel. Cependant, les régimes contenant les protéines de pois chiches induisent

une croissance pondérale plus faible comparée à la caséine. Malgré une consommation

alimentaire similaire chez le groupe Ps comparé aux 2 groupes CAS, le poids corporel reste plus

faible.

Une excrétion plus importante de l’azote fécal (non estimé dans notre étude) (d’origine

alimentaire non absorbé mais aussi endogène) pourrait expliquer ce résultat. La faible teneur en

acides aminés soufrés (méthionine, cystéine) dans la protéine de pois chiche, ou la présence de

fractions indigestes pourrait être aussi la conséquence (Rubio & Seiquer, 2002). Chez le groupe

Pv, le déficit pondéral serait dû, probablement, à une diminution de la masse grasse, comme le

reflète le faible poids relatif du tissu adipeux épididymaire (Tableau V). Boualga et al., (2009)

ont montré que le régime à 20% de protéines hautement purifiées de pois chiches induit chez le

rat wistar, un poids corporel plus faible que celui des rats consommant un régime de référence à

20% de gluten:caséine.

De nombreuses études suggèrent que la consommation régulière de légumineuses

accélère la sensation de satiété et contribue à un meilleur contrôle du poids (Sparti, 2000 ; Agus,

2000 ; Dumesnil et al., 2001). Les légumineuses de part leurs protéines, sont susceptibles de

jouer un rôle non négligeable dans l’équilibre pondéral. En effet, certains travaux ont confirmé

les effets bénéfiques des protéines de pois chiches dans la perte de poids et le contrôle de la

masse pondérale (Eisenstein et al., 2002 ; Schoeller & Buchholz, 2005). Chez les patients ayant

un facteur de risque cardiovasculaire, et notamment dans le cas du diabète de type II, les

protéines de pois chiches peuvent contribuer à une meilleure maîtrise des problèmes de santé

liés au poids et ceci, par la diminution de l’indice de masse corporelle (Watts, 2009).

Discussion

51

De nombreux modèles animaux ont été utilisés pour étudier les effets des régimes sur le

métabolisme du cholestérol et des triglycérides. Quoique, la plupart de ces modèles diffèrent du

modèle humain dans la répartition du cholestérol et dans le profil des lipoprotéines

plasmatiques (Fernandez & Volek, 2006). Le rat est un modèle animal souvent utilisé dans les

études du métabolisme lipidique. Il se révèle être un bon modèle pour l’étude des effets des

régimes alimentaires sur le métabolisme des triglycérides. Il a d’ailleurs été utilisé très souvent

dans des protocoles expérimentaux visant à déterminer l’impact des AGPI n-3 sur la

triglycéridémie (Demonty et al., 1998; Demonty et al., 2003). Le rat a aussi été largement

utilisé pour l’étude du métabolisme du cholestérol en réponse aux modifications du régime

alimentaire notamment, l’influence des protéines alimentaires sur la cholestérolémie (Sanchez-

Muniz et al., 2003 ; Shukla et al., 2006). Ainsi, l’extrapolation des résultats à l’homme doit être

faite avec réserve, le métabolisme des lipoprotéines est différent chez le rat et l’Homme

(Bozoky et al., 2006).

Le type de lipides alimentaires, ainsi que la quantité de cholestérol dans le régime ont été

associés à plusieurs troubles métaboliques, aussi bien chez l’homme que l’animal.

Chez le rat Wistar, un apport élevé en cholestérol (1%) dans le régime augmente

significativement le cholestérol total sérique des rats hypercholestérolémiques par rapport au

contrôle (Barbosa et al., 2008).

Les effets respectifs et interactifs des protéines et des lipides ont montré que les plus

faibles valeurs de la cholestérolémie sont observées chez les rats consommant le mélange

d’huiles végétales (olive-noix-tournesol). En revanche, l’huile de sardine combinée à la protéine

de pois chiche ou à la caséine induit une augmentation significative des teneurs en cholestérol

total sérique (Tableau VII).

Une alimentation riche en acides gras monoinsaturés (AGMI) comme l’huile d’olive, est

liée à une diminution du risque des MCV (Salvini & Sera, 2006). Ces acides gras possèdent le

potentiel d’abaisser les taux de CT et de C-LDL dans le sang comparés aux acides gras saturés

et protégeraient contre l’oxydation des LDL par leurs effets protecteurs contre les radicaux

libres, permettant ainsi de prévenir l’athérosclérose (Van Horn et al., 2008). Chez les souris, la

consommation d’un régime contenant de l’huile d'olive pendant 8 semaines entraîne une

augmentation des TG d'environ 2,6 fois au niveau du foie comparée à l’huile de maïs

(Ferramosca, 2008). En plus de sa richesse en AGMI, l'huile d'olive contient des propriétés

antioxydantes chez l'homme (Covas, 2008). Toutefois, chez les rats, les AGMI de la série n-6

présents dans les huiles végétales telle que l’huile de tournesol augmentent les taux de TG

Discussion

52

(Mei-Huei et al., 2005), alors que les AGMI présents dans l’huile de noix, riche en omégas 3

entraînent un effet hypocholestérolémiant (Jacotot et al., 1995).

Outre l’effet de la structure des protéines, de même que les composés non protéiques

pouvant être apportés dans les régimes, leur composition ainsi que la teneur en acides aminés

libérés dans le compartiment plasmatique après digestion peuvent agir sur le métabolisme du

cholestérol.

Il a été aussi suggéré que l'effet hypocholestérolémiant des protéines de légumineuses

pouvait être dû à leurs teneurs en composants non protéiques, donc pouvait varier selon le degré

de pureté des protéines. Il est a rapellé que dans notre étude, les protéines de pois chiche ont un

degré de pureté de 92%. Des composés non-protéiques (fibres, acide phytique, minéraux,

isoflavones …), associés aux protéines de légumineuses, peuvent en effet aussi modifier le

métabolisme du cholestérol et avoir un effet hypocholestérolémiant (Nagata et al., 1982 ; Potter

et al., 1995 ; Balmir et al., 1996). Les isoflavones des protéines de soja, mais pas les protéines

de soja débarrassées de leurs isoflavones, diminuent le cholestérol plasmatique chez le singe

rhésus (Anthony et al., 1996). Bien que la protéine de pois chiche soit plus riche en arginine (84

mg.g-1) et en alanine (49 mg.g-1) que la caséine (36 mg.g-1 et 30 mg.g-1), respectivement, la

protéine de pois chiche comparée à la caséine induit un effet similaire sur la cholestérolémie. En

effet, la protéine de pois chiche est hypocholestérolémiante lorsqu’elle est associée au mélange

d’huiles végétales, et hypercholestérolémiante lorsqu’elle est associée à l’huile de sardine. La

faible teneur en méthionine (11 mg.g-1) dans la protéine de pois chiche par rapport à celle de la

caséine (23 mg.g-1) n’a pas permis de réduire la cholestérolémie lorsque celle-ci est associée à

l’huile de sardine. Plusieurs études suggèrent que l'effet hypocholestérolémiant des protéines

végétales, serait dû en grande partie à une plus forte excrétion fécale des stérols, en raison d'une

réduction de leur absorption intestinale (Nagata et al., 1982). C'est un effet qui ressemble à

celui obtenu avec certaines fibres alimentaires. Afin de compenser les pertes fécales des stérols,

les protéines de légumineuses peuvent stimuler les activités hépatiques de l'hydroxy

méthylglutaryl CoA (HMG-CoA) réductase (Nagata et al., 1982), enzyme limitante dans la

biosynthèse du cholestérol, et de la cholestérol 7α-hydroxylase, enzyme clef qui permet la

transformation du cholestérol en acides biliaires (Vahouny et al., 1985; Beynen, 1990).

La caséine au contraire, a un effet hypercholestérolémiant en augmentant l'absorption du

cholestérol et en diminuant son temps de renouvellement (Kritchevsky, 1995). Cependant, dans

notre étude, il semblerait que l’huile de sardine a modulé l’effet hypercholestérolémiant de la

Discussion

53

caséine enrichie en cholestérol. Un certain nombre d’études ont affirmé que la consommation

élevée de poissons (≥ 2 fois / semaine) garantit un effet protecteur vis-à-vis du risque

cardiovasculaire (König et al., 2005 ; Iso et al., 2006). Cette relation inverse avec l’événement

cardiovasculaire est attribuée à l’effet hypotriglycéridémiant, anti-inflammatoire et

hypothrombogénique ainsi qu’à l’impact positif sur la fonction endothéliale des acides gras

polyinsaturés (AGPI) de la série (n-3): acides eicosapentaénoїque (EPA) et

docosapentaéinoїque (DHA) contenus dans l’huile de poisson (Harris, 1997; Balk et al., 2006;

Domingo, 2007).

Chez l’homme, le changement d’huile de poisson par des huiles végétales (olive + noix)

dans le régime provoque une diminution du taux de cholestérol plasmatique, ainsi que celui des

fractions VLDL, LDL et HDL circulantes (Dolecek, 1992 ; Mozaffarian, 2005). Sawashita et

al., (2007) ont montré une réduction de l’accumulation des lipides dans le foie et une

diminution des lésions athéromateuses chez la souris consommant un régime contenant 5%

d’huile de sardine. Chez le rat, Toyoshima et al., (2004) notent que l’huile de sardine a un effet

hypotriglycéridémiant comparée à l’huile de soja. De même, Chang et al., (2009) démontre que

l’huile de sardine augmente le taux de CT et réduit les concentrations plasmatiques en TG chez

des souris consommant un régime contenant 5% d’huile de sardine pendant 12 semaines.

L’étude de l’influence des combinaisons protéines-lipides sur la triglycéridémie révèle

que le mélange d’huiles végétales combiné à la protéine de pois chiche ou à la caséine ne

modifie pas les valeurs des TG sériques. En revanche, l’huile de sardine combinée à la caséine

entraîne une réduction significative des teneurs en TG sériques comparativement au régime

contenant les huiles végétales associées à la caséine. Les protéines alimentaires peuvent

moduler les effets de l'huile de sardine sur la triglycéridémie chez le rat consommant des

régimes supplémentés en cholestérol et qui peuvent s’expliquer par des modifications dans les

concentrations des lipides hépatiques (Demonty, 1998 ; Deshaies & Jacques, 1998).

Les régimes supplémentés avec 1% de cholestérol augmentent les concentrations de

cholestérol sérique des rats avec les deux types de protéines lorsqu’elles sont combinées à

l’huile de sardine. En revanche, le mélange d’huiles végétales entraîne des valeurs

significativement plus réduites. L'absorption du cholestérol (et des acides biliaires) dépendrait

donc des propriétés physicochimiques des protéines ou de leurs produits de digestion mais

surtout de la nature de l’huile avec laquelle elles sont associées.

Discussion

54

L’effet hypotriglycéridémiant obtenu avec l’huile de sardine, serait en partie dû

principalement à sa richesse en oméga 3.

L’hypercholestérolémie induit des altérations microvasculaires caractéristiques d’un

stress oxydant et d’une réponse inflammatoire, chez les animaux consommant des régimes

enrichis en cholestérol (Deepa & Varalakshmi, 2006).

De nouveaux facteurs dits «facteurs de risque émergents » ont été identifiés, comme les

agents de l'inflammation impliqués dans la genèse de l’athérosclérose (Novo & Corrado, 2006).

En effet, des études épidémiologiques et observationnelles suggèrent le rôle prédictif potentiel

du fibrinogène, de la Protéine C Réactive (PCR) (Novo & Corrado, 2006) et de l’albumine

(Schalk et al., 2006) dans les maladies coronaires.

La plupart des protéines possèdent des groupements thiols (-SH) qui réagissent très

facilement avec les EOA. Vu sa grande quantité, l’albumine qui possède des groupements thiols

peut être considérée comme étant un des antioxydants majeurs du plasma (Jones et al., 2002).

Les effets délétères induits par le stress carbonyl pourraient être aussi la conséquence de la perte

de la capacité antioxydante de l'albumine suite à l'attaque par des composés dicarbonylés

(Lecomte et al., 2005). Le taux d’albumine sérique est augmenté chez le groupe CASs. L’huile

de sardine combinée à une protéine animale (caséine) pourrait probablement contribuer à une

meilleure protection.

Le deuxième objectif de ce travail est de voir si la protéine de pois chiche comparée à la

caséine, combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine peut améliorer le statut

redox chez le rat ingérant un régime enrichi en cholestérol.

Dans l’hypercholestérolémie, le stress oxydant résulte d’un déséquilibre de la balance

redox, dû à l’altération du métabolisme des lipides, à la production excessive d’espèces

réactives de l’oxygène (ERO) et à la réduction des défenses antioxydantes (Huet & Duranteau,

2008).

L’acide urique possède des propriétés antioxydantes (Madero et al., 2009). Il est l’un des

plus importants antioxydants, capable d’éliminer jusqu’à 60% des radicaux libres produits

(Nakagawa, 2006). Il est actuellement l’antioxydant plasmatique le plus efficace en termes de

réactivité avec les EOA et tout particulièrement avec le HO° (Oliver, 2007). Il augmente lors

d’un stress oxydant, principalement lors de phénomènes d’ischémie. L’acide urique est un

facteur prédictif indépendant de toutes les causes de mortalité chez les patients à haut risque de

MCV. Ainsi, des taux sériques élevés en acide urique contribuent à l’augmentation de

Discussion

55

l’athérosclérose (Strazzullo & Puig, 2007 ; Ioachimescu et al., 2008). Bien que le mécanisme

par lequel l’acide urique contribue à la pathogénèse des MCV ne soit pas clair, l’hyperuricémie

est associée à des effets nuisibles sur la dysfonction endothéliale, le métabolisme oxydatif et

l’adhérence plaquettaire (Alderman & Redfern, 2004).

Les protéines de pois chiches comparées à la caséine induisent une augmentation des

teneurs sériques en acide urique qui peut être expliqué par l’augmentation du métabolisme de

l’adénosine due à l’ischémie ou au dommage tissulaire et/ou une perte de l’inhibition de la

xanthine oxydase dont le rôle est de bloquer l’action de l’enzyme qui forme l’acide urique par le

NO et/ou une baisse du métabolisme oxydatif (Bellomo, 2006). En revanche, l’effet interactif

de la caséine avec les 2 huiles utilisées montre des valeurs plus faibles de l’acide urique

suggérant la mise en place de mécanismes plus efficaces.

L’évaluation du stress oxydant est réalisée à différents niveaux (érythrocytaire, sérique,

urinaire, et tissulaire) par le dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique et des

protéines oxydées. Le potentiel antioxydant peut également être apprécié par la détermination

des activités enzymatiques de certaines enzymes antioxydantes comme la superoxyde dismutase

(SOD) et la catalase, ainsi que par le dosage du monoxyde d’azote (NO).

Il est bien établi que le stress oxydant, qui résulte du déséquilibre entre la production des

radicaux libres et leur élimination par les défenses antioxydantes (Barbosa, 2008) contribue à la

progression des MCV. Les radicaux libres sont très réactifs et peuvent attaquer, différentes

cibles telles que les protéines (Covas, 2008), l’ADN (Marnett, 2000 ; Cooke et al., 2003) et

surtout les acides gras polyinsaturés (peroxydation lipidique).

La surproduction des ERO induite par l’hypercholestérolémie, entraîne une

augmentation anormale de la peroxydation des lipides chez les patients et les animaux

hypercholestérolémiques ou consommant des régimes supplémentés en cholestérol (Hennekens

et al., 2009 ; Naughton et al., 2009), et une baisse dans le système de défense antioxydant

(Yang et al., 2006).

L’étude du statut antioxydant montre que l’huile de sardine induit une réduction de la

concentration en substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) qui sont les

marqueurs les plus utilisés pour évaluer in vivo la présence d’une peroxydation lipidique

(Meagher & FitzGerald, 2000). Au niveau sérique, lorsqu’elle est combinée à la protéine de

pois chiche, l’huile de sardine réduit les concentrations en TBARS. Cet effet est moins marqué

lorsqu’elle est combinée à la caséine.

Discussion

56

Au niveau des lipoprotéines, quelle que soit l’origine de la protéine, l’huile de sardine

comparée au mélange d’huiles (olive-tournesol-noix), réduit significativement la peroxydation

des lipides au niveau des VLDL, alors qu’elle l’augmente dans les LDL-HDL1. En effet, les

résultats montrent des teneurs élevées en TBARS dans la fraction athérogène. Le mélange

végétal semble par contre atténuer la peroxydation lipidique des LDL-HDL1.

Les LDL sont riches en cholestérol et en phopholipides (PL), ce qui les rend des cibles

privilégiées de la peroxydation lipidique (Koechlin-Ramonatxo, 2006). Le nombre élevé de

particules LDL circulantes favorise l’accumulation du cholestérol au niveau sanguin. Ces

particules athérogènes deviennent susceptibles à l’oxydation ce qui augmente le risque de

lésions athéromateuses, car l’hypercholestérolémie menant à une production accrue de radicaux

libres (Yokozawa et al., 2006). Nos résultats montrent que l’hypercholestérolémie notée avec

les régimes contenant l’huile de sardine est concomitante à l’élévation des TBARS dans la

fraction LDL-HDL1. De même, la peroxydation des lipides sériques est parallèle à celle de la

triglycéridémie. Une étude effectuée chez l’homme a montré une corrélation positive entre la

peroxydation des lipides plasmatiques et les TG plasmatiques (Ledwozyw et al., 1986). In vitro, sous l’action d’un stress oxydatif, les HDL s’oxydent et subissent les mêmes

modifications chimiques que les LDL. Toutefois, il n’existe aucune preuve de l’existence in

vivo de HDL oxydées. En revanche, les HDL ont un rôle protecteur à deux niveaux, lors du

transport inverse du cholestérol et lors de l’oxydation des LDL en les protégeant (Yokozawa et

al., 2006) quoique, les HDL ont des effets délétères (rôle athérogène quand elles sont oxydées).

Dans notre étude, les particules HDL2 ne sont pas affectées par la peroxydation lipidique

chez la plupart des animaux. En revanche, l’effet protéine-huile révèle que la protéine de pois

chiche comparée à la caséine et combinée à l’huile de sardine ou du mélange d’huiles végétales

réduit la concentration des TBARS dans la fraction HDL3.

Au niveau tissulaire, l’huile de sardine induit une diminution significative de la

peroxydation lipidique au niveau du foie, tissu adipeux, muscle, cerveau et aorte mais

l’augmente au niveau cœur et du rein. Ces résultats au niveau de certains tissus sont

probablement dus à une inhibition de la génération des radicaux libres oxygénés.

En revanche, le mélange d’huiles olive-tournesol-noix comparé à l’huile de sardine

réduit à moindre degré la peroxydation lipidique au niveau de certains tissus (cœur et rein) et

l’augmente dans d’autres tissus (muscle et aorte) particulièrement lorsque celui-ci est combiné à

la protéine de pois chiche. La diminution des TBARS au niveau du rein avec le mélange

d’huiles végétales est vraisemblablement due à leur forte élimination urinaire. En effet, la

Discussion

57

peroxydation lipidique est élevée au niveau des urines chez les groupes consommant la protéine

pois chiche ou la caséine combinée au mélange d’huiles végétales.

En présence d’EOA, les protéines peuvent se dénaturer, se fragmenter ou perdre leurs

structures primaire et secondaire. Les dommages oxydatifs au niveau des protéines (et des

acides aminés) peuvent se manifester de diverses manières (Pincemail et al., 2000), apparition

de groupements hydroperoxydes (-OOH), oxydation du squelette carboné de la chaîne

polypeptidique conduisant à une fragmentation des protéines et à l’apparition de groupements

carbonyles. La mise en évidence de groupements carbonyles dans les protéines oxydées est de

loin la technique qui est la plus utilisée (Pantke et al., 1999). Toutefois, l’apparition de ces

groupements reflète plutôt une modification globale dans la protéine et n’est sans doute pas

aussi spécifiquement représentative de la présence d’un stress oxydant. Certains acides gras

alimentaires peuvent modifier la composition de la membrane des monocytes, majorant ainsi la

production de radicaux libres et déclenchant des effets pro-oxydants (Hooper et al., 2008).

Au niveau sérique, aucune variation n’est constatée dans les teneurs en carbonyles entre

les groupes Ps, CASv et CASs. En revanche, Quelle que soit l’huile incorporée, la protéine de

pois chiche comparée à la caséine réduit significativement les teneurs en carbonyles au niveau

de la plupart des tissus (tissu adipeux, muscle, cœur, rein, cerveau et aorte). Certains acides

aminés pourraient être incriminés. Cecarini et al., (2007) ont montré que les acides aminés les

plus sensibles à l’oxydation protéique sont les acides aminés aromatiques, la méthionine et la

lysine qui peuvent être oxydés de façon irréversible, ce qui modifie la structure des protéines et

peut ainsi altérer leur activités. Les protéines modifiées deviennent généralement plus sensibles

à l’action des protéases et sont donc éliminées. Les faibles teneurs en carbonyles dans la

majorité des tissus étudiés sont vraisemblablement dus à la faible teneur en méthionine et lysine

de la protéine de pois chiche (Tableau II).

Le stress oxydatif induit par l’hypercholestérolémie est associé à une réduction du statut

antioxydant, d’où une élévation des effets délétères dus aux radicaux libres. En effet, les

systèmes de défense antioxydante enzymatiques tels que la superoxyde dismutase (SOD), la

glutathion peroxydase (GSH-Px) et la glutathion réductase (GSSH-Red), et non enzymatique

(glutathion) sont altérés au cours de l’hypercholestérolémie.

L’enrichissement du régime en cholestérol peut influencer l’activité des enzymes

impliquées dans la défense antioxydante. En effet, l’étude de Mantha et al., (1993) a montré

Discussion

58

chez le lapin consommant un régime enrichi en cholestérol, une diminution de l’activité de la

SOD au niveau sérique.

L’influence de la protéine de pois chiche et de la caséine combinée au mélange d’huiles

végétales ou l’huile de sardine sur les systèmes de défenses enzymatiques montre que le

mélange d’huiles végétales combiné à la protéine de pois chiche ou la caséine augmente

l’activité de la SOD au niveau de certains tissus (tissu adipeux, muscle et aorte) et la diminue au

niveau du foie comparativement à l’huile de sardine. En revanche, la protéine de pois chiche

comparée à la caséine stimule l’activité de la SOD dans les érythrocytes, foie, muscle, cœur et

aorte.

Il semble que la protéine de pois chiche pourrait protéger les érythrocytes et

spécifiquement certains tissus d’une attaque radicalaire élevée induite par l’enrichissement du

régime en cholestérol. En revanche, il est possible que l’activité réduite de la SOD dans certains

tissus soit insuffisante pour détoxifier les radicaux libres responsables de la peroxydation

lipidique.

Le séquençage des acides aminés au sein des peptides présente également une

importance dans l’expression de l’activité des enzymes antioxydantes. Les peptides

fonctionnels sont contenus initialement dans les séquences des protéines alimentaires. Pour

exercer leurs propriétés potentielles, ils doivent être libérés par la digestion intraluminale, mais

protégés d’une hydrolyse ultérieure qui détruirait leurs sites actifs, puis absorbés sans être

dégradés lors du passage entérocytaire, enfin toucher leur cible à une concentration qui soit

compatible avec la physiologie.

Chez le rat, les régimes supplémentés en cholestérol n’ont pas d’incidence sur la

peroxydation lipidique, mais entraînent une augmentation significative de la catalase et de la

glutathion peroxydase dans le foie (Mahfouz & Kummerow, 2000). De même que chez le lapin,

la supplémentation du cholestérol dans un régime standard induit une augmentation de la

peroxydation lipidique favorisant ainsi la formation des plaques d’athérome (Hsu et al., 2001).

De plus, le régime supplémenté en cholestérol entraîne une diminution du taux de glutathion et

une réduction des activités de la glutathion réductase, la glutathion peroxydase et la catalase.

La catalase catalyse la réaction de détoxification du H2O2 (généralement produit par les

SOD) en H2O et O2 (Valko et al., 2006). Elle est surtout active lorsque le niveau de stress

oxydatif est élevé (Wassmann & Nickenig, 2004).

L’histidine aurait une capacité à donner des atomes d’hydrogène, à piéger les radicaux

peroxyles lipidiques et à chélater les ions métalliques du fait de la présence du groupement

Discussion

59

imidazole (Chan & Decker, 1994). La relation entre la structure et l’activité des peptides

contenant l’histidine n’est pas encore bien définie à ce jour. On ne peut de manière générale

établir de relation claire entre la structure de ces peptides actifs et l’activité antioxydante.

Cependant, en dépit d’une teneur similaire en histidine dans la protéine de pois chiche et la

caséine, il semblerait que l’origine des protéines stimule différemment l’activité de la catalase.

L’effet spécifique des protéines révèlent qu’au niveau des érythrocytes et de certains tissus

(tissu adipeux, muscle, cœur et aorte), l’activité de la catalase est plus élevée avec les régimes

contenant la caséine que ceux contenant la protéine de pois chiche, alors qu’au niveau du

cerveau et du rein, l’activité de la catalase est plus importante. Ce résultat ne concorde pas avec

celui de Madani & Belleville (2000) qui ont montré que les protéines de soja diminuent la

sensibilité des membranes érythrocytaire à l’attaque radicalaire probablement conséquente à

l’augmentation de la biodisponibilité en acides aminés nécessaires à la synthèse des enzymes

participant à la défense anti-radicalaire.

L’augmentation de l’activité de la SOD au niveau de certains tissus avec la protéine de

pois chiche vis-à-vis de la caséine laisse suggérer une atténuation du stress oxydatif.

L’effet spécifique des huiles montre que le mélange d’huiles végétales élève l’activité de

la catalase au niveau du foie et du cœur, alors que l’huile de sardine agit plus spécifiquement

au niveau du tissu adipeux, rein, cerveau et aorte.

Chez l’homme, l’huile d’olive réduit efficacement les lésions oxydatif de l’ADN et

protège les cellules mononucléaires contre le H2O2 induit par les dommages à l'ADN (Fabiani et

al., 2008) et aux lésions oxydatives, probablement du fait de la composition en acides gras des

membranes (Van Horn et al., 2008). Les omégas 3 de l’huile de noix peuvent réduire les effets

néfastes des radicaux libres en augmentant l’activité de certains enzymes telle que la catalase, le

remplacement des AGS par de l’huile de tournesol entraîne une baisse remarquable des ERO

par l’amélioration de l’activité des antioxydants (Hollman, 2005).

Dans le système cardiovasculaire, une des découvertes majeures de ces vingt dernières

années est celle du rôle exercé par le NO d’origine endothéliale pour maintenir l’homéostasie

vasculaire. De par ses divers effets sur les cellules circulantes et vasculaires, le NO endothélial

est reconnu comme un facteur protecteur (Morton et al., 2002).

Un stress oxydant peut toutefois conduire à un mauvais fonctionnement des cellules

endothéliales qui produiront alors un excès du NO. Ce dernier pourra réagir avec des ERO pour

Discussion

60

former des substances particulièrement toxiques pour l’organisme, les peroxynitriques

(HOONOH). Le NO pout également interagir avec les protéines au niveau de leur groupement

tyrosine (phénomène de nitration) (Jourd’heuil et al., 2000).

Le mélange d’huiles végétales comparé à l’huile de sardine augmente les NO au niveau

de certains tissus (tissu adipeux et cœur). Les omégas 3 des huiles de poissons réduisent la

vasoconstriction, augmentent la fibrinolyse et réduisant la formation de fibrine, et stimulent le

NO dans la régulation de la vasodilatation et la réponse immunitaire (Huet & Duranteau, 2008).

Toutes les protéines possédant les acides aminés : tryptophane, tyrosine, phénylalanine,

histidine, méthionine et cystéine peuvent subir des modifications suivant des réactions

d’oxydation ou de réduction. La modification de ponts disulfures ou des groupements

sulfydryles sur ces acides aminés peut priver la protéine de son fonctionnement biologique

normal ou au contraire, augmenter l’efficacité de la protéine.

La protéine de pois chiche combinée au mélange d’huiles végétales ou à l’huile de

sardine entraîne une augmentation du NO au niveau sérique, cœur et cerveau. La protéine de

pois chiche est riche en arginine (précurseur direct du monoxyde d’azote) et pourrait donc avoir

un rôle antioxydant important. En effet, le NO est une molécule très réactive, lui permettant

d’interagir avec beaucoup de protéines régulatrices et de modifier leur niveau d’activité

(Pherson et al., 2006).

II en ressort que l'effet des protéines alimentaires sur le statut antioxydant pourrait être

modulé par la nature des lipides présents dans le régime alimentaire. L'hypothèse quant à la ou

les voies métaboliques qui pourraient être impliquées dans cette modulation ne sont pas bien

élucidées et les études sont controversés. Les résultats dépendent probablement de l’espèce

utilisée, de la présence ou non de composés non-protéiques associés aux protéines, donc de leur

degré de pureté, de l’addition ou non de cholestérol et de sa quantité dans les régimes.

Conclusion

61

Le but du présent travail est de déterminer si un apport adéquat en protéines (20% de

caséine ou de protéines hautement purifiées de pois chiche), associé à deux huiles alimentaires

(végétale ou poisson) est capable de modifier la composition des lipides sanguins et d'influer

sur le statut redox. Les huiles utilisées, diffèrent par leur composition en acides gras (olive

(3,9%), noix (1%), tournesol (0,1%)) contenant 13% d’AGS, 58% d’AGMI et 29% d’AGPI et

un rapport n-6/n-3 = 7 et de sardine (AGS 38%, AGMI 31% et AGPI 31%). Les régimes sont

administrés à des rats mâles adultes, pendant une durée relativement courte (28 jours).

Cette étude révèle que la protéine de pois chiche peut jouer un rôle dans la réduction du

poids corporel chez le rat consommant un régime enrichi en cholestérol.

La protéine de pois chiche comparée à la caséine associée au mélange d’huiles végétales

ou de sardine entraîne un effet similaire sur la cholestérolémie. En effet, les régimes

supplémentés avec 1% de cholestérol augmentent la cholestérolémie des rats avec les deux

types de protéines lorsqu’elles sont combinées à l’huile de sardine. En revanche, le mélange

d’huiles végétales induit un effet hypocholestérolémiant.

Quant aux acides gras polyinsaturés (oméga-3) présents dans l’huile de sardine, leur

puissant potentiel hypotriglycéridémiant serait en partie dû principalement à sa richesse en

oméga 3.

En ce qui concerne le stress oxydatif, la protéine de pois chiche combinée au mélange

d’huiles végétales ou l’huile de sardine induit une augmentation de l’acide urique (puissant

antioxydant) au niveau sérique protégeant efficacement contre l’attaque radicalaire par

stimulation des systèmes antioxydants.

Le mélange d’huiles végétales diminue la peroxydation lipidique au niveau sérique,

urinaire et au niveau des LDL-HDL1 comparé à l’huile de sardine, ainsi qu’au niveau de

certains tissus (cœur et rein). En revanche, l’huile de sardine exerce un effet protecteur sur la

peroxydation lipidique au niveau des VLDL et dans certains tissus (muscle et aorte). Les

particules HDL2 (fraction anti-athérogène) ne sont pas affectées par la peroxydation lipidique.

De plus, la protéine de pois chiche comparée à la caséine réduit la peroxydation lipidique dans

la fraction HDL3 (Fraction athérogène).

Au niveau tissulaire, la protéine de pois chiche combinée au mélange d’huiles végétales

diminue la peroxydation lipidique dans le cœur et le rein et réduit l’oxydation protéique au

niveau de tous les tissus (foie, tissus adipeux, muscle, cœur, rein, cerveau et aorte) lui conférant

des propriétés antioxydantes.

Conclusion

62

Quelle que soit l’origine des protéines, l’huile de sardine comparée au mélange d’huiles

végétales diminue la dénaturation protéique causé par les ERO au niveau du foie, muscle,

cerveau et aorte.

La protéine de pois chiche comparée à la caséine module le stress oxydatif en

augmentant l’activité de la SOD dans les érythrocytes, foie, muscle, cœur et aorte. De plus, elle

augmente l’activité de la catalase au niveau du cerveau et du rein.

Le mélange d’huiles végétales comparé à l’huile de sardine stimule les activités de la

SOD spécifiquement au niveau de certains tissus (tissu adipeux, muscle et aorte) et la catalase

(foie et cœur), alors que l’huile de sardine agit au niveau du tissu adipeux, rein et aorte.

Il s’avère que l’huile de sardine pourrait diminuer la susceptibilité des animaux aux

lésions provoquées par la peroxydation lipidique lorsqu’ils sont soumis à un régime

supplémenté en cholestérol. Ce résultat pourrait probablement être expliqué en partie par le rôle

protecteur de certains lipides bioactifs contenus dans l’huile de sardine contre le risque

cardiovasculaire. En effet, l’huile de sardine riche en acides gras polyinsaturés de la série

oméga-3 semble diminuer le risque cardiovasculaire en entraînant une diminution des TG d’une

part, et en améliorant la fonction endothéliale par la réduction de l'agrégation plaquettaire, et en

augmentant spécifiquement la résistance de certains tissus aux attaques radicalaires, d’une autre

part.

La protéine de pois chiche, riche en arginine (précurseur direct du monoxyde d’azote)

combinée à l’huile végétale pourrait avoir un rôle antioxydant important par la réduction de la

production du monoxyde d’azote (marqueur du stress oxydatif) favorisant spécifiquement son

utilisation au niveau de certains tissus (muscle, cœur et cerveau).

II apparaît donc d'après cette étude que les protéines et les lipides alimentaires

interagissent dans la modulation du métabolisme lipidique et du statut redox chez le rat

consommant un régime enrichi en cholestérol. D'autres études sont cependant nécessaires pour

déterminer la nature de ces interactions, de même que les mécanismes par lesquels elles se

produisent.

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63

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Annexes

80

Tableau X. L’évolution du poids corporel

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b) sont significativement différentes (P<0,05). Tableau XI. Nourriture ingérée à J28

Chaque valeur représente la moyenne ± ES de six rats par groupe. Les groupes Pv et Ps consomment les régimes contenant 20% de protéines de pois chiches combinées au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Les groupes CASv et CASs consomment les régimes contenant 20% de caséine combinée au mélange d’huiles végétales ou l’huile de sardine. Après analyse de variance, la classification des moyennes est effectuée par le test de rang multiple de Duncan entre les différents groupes. Les moyennes portant des lettres différentes (a, b) sont significativement différentes (P<0,05). Tableau XII. Teneurs sériques et urinaires en TBARS


Groupes J0 J7 J14 J21 J28 Pv 194,13±14,99 200 ±28,48a 207,75 ± 23,35b 215,65 ±19,49b 216 ± 19,3b

Ps 195,83 ± 4,22 200,33 ± 4,03a 208,5 ± 7,07b 211,17 ± 4,71b 227,5 ± 3,27b

CASv 195,5 ± 6,72 212 ± 7,07a 224,83 ± 3,49a 235,5 ± 4,18a 245,83 ± 6,24a

CASs 194,67 ± 4,72 214,17 ± 7,39a 227,5 ± 6,77a 237,17 ± 3,31a 251,17 ± 4,58a

Pv Ps CASv CASs Nourriture ingérée (g. j-1 .rat-1) 19,83 ± 0,08b 22,80 ± 0,16a 23,23 ± 0,20a 23,72 ± 0,14a

Pv Ps CASv CASs

Sérum (µmol.mL-1) 14,66 ± 3,25a 11,59 ± 0,06b 17,61 ± 1,89a 14,63 ± 1,47a

Urines (µmol.mL-1) 95,95 ± 1,91a 4,73 ± 2,87c 83,78 ± 7,02b 6,08 ± 0,96c

Annexes

81

Tableau XIII. Teneurs en TBARS des différentes fractions de lipoprotéines

Lipoprotéines (µmol.mL-1) Pv Ps CASv CASs VLDL 7 ,44 ± 0 ,71b 0,73 ± 0,08 d 11,11 ±0,35a 1,57 ± 0,08c

LDL-HDL1 2,53 ± 0,54d 5,33 ± 0,12 b 3,52 ±0,04c 7,72 ± 1,03a HDL2 3 ,49 ± 0 ,24a 4,30 ± 1,30 ab 2,39 ± 0,8 b 5,72 ± 2,03a HDL3 2,07 ± 0,89 b 3,26 ± 0,49 b 3,25 ± 0,1b 4,43 ± 0,25a


Tableau XIV. Teneurs tissulaires en TBARS

Pv Ps CASv CASs Tissus (mmol.g-1de protéines) Foie 1,33 ± 0,5ab 1,06 ± 0,02b 1,81 ± 0,04a 0,5 ± 0,2c

Tissu adipeux 5,10 ± 0,49b 5,17 ± 0,56b 19,02 ±1,43a 5,31 ± 1,36c

Muscle 12,10 ± 0,4a 7,63 ± 0,53b 2,67 ± 0,38c 0,9 ± 0,04d

Cœur 1,30 ± 0,34b 2,67 ± 0,54a 1,16 ± 0,21b 3,19 ± 0,44a

Rein 1,35 ± 1,06b 5,11 ± 0,49a 1,66 ± 0,64b 4,38 ± 0,47a

Cerveau 3,31 ± 0,79c 5,1 ± 0,39b 13,76 ±3,02a 5,25 ± 0,22b

Aorte 8,64 ± 0,88b 1,28 ± 0,11c 10,63 ±0,07a 1,15 ± 0,39c


Annexes

82

Tableau XV. Activité de la superoxyde dismutase érythrocytaire et tissulaire


Tableau XVI. Activité de la catalase au niveau érythrocytaire et tissulaire


Pv Ps CASv CASs Erythrocytes (M.mL-1) 3,11 ± 0,1a 3,11 ± 0,10a 2,04 ± 0,18c 2,61 ± 0,28b

Tissus (M.g-1de protéines) Foie 0,8 ± 0,02b 1,4 ± 0,05a 0,4 ±0,05d 0,56 ± 0,09c

Tissu adipeux 5,66 ± 0,15b 3,94± 0,29c 6,5 ± 0,03a 2,51 ± 0,62d

Muscle 9,83 ± 0,58a 8,52 ± 0,14b 4,24 ± 0,48c 1,9 ± 0,5d

Cœur 10,03 ± 0,51a 6,1 ± 0,06b 3,68 ± 0,09c 3,51 ± 0,25c

Cerveau 5,54 ± 0,57b 7,5 ± 0,06a 5,3 ± 0,05b 4,22 ± 0,25c

Aorte 7,93 ± 0,06a 2,25 ± 0,09b 2,61 ± 0,4b 1,78 ± 0,02c

Pv Ps CASv CASs Erythrocytes (mmol.mL-1) 2,98 ± 0,44b 3,43 ± 0,40b 4,14 ± 0,46a 4,49 ± 0,02a

Tissus (mmol.g-1) Foie 151,59 ± 9,49b 127,92 ± 4,5c 230,39±14,12a 135,41±52,29bc

Tissu adipeux 123,44 ± 1,25d 186,12± 5,00c 251,94 ±9,99b 275,27 ± 4,01a

Muscle 133,04 ± 3,75b 140,46±11,24b 186,22 ± 1,00a 188,96 ± 1,88a

Cœur 179,15±10,99b 107,42 ± 1,50c 280,74 ± 5,25a 181,45 ± 16,24b

Rein 203,42 ± 6,02b 229,15±13,24a 144,99±10,93c 197,00 ± 17,43b

Cerveau 169,49 ± 3,36b 201,18 ± 3,94a 125,8 ± 6,19c 135,81 ± 3,05c

Aorte 175,27 ± 7,5c 205,48 ± 5,25b 200,71±8,23b 263,07 ± 5,75a

Annexes

83

Tableau XVII. Teneurs sériques et urinaires en monoxyde d’azote


Tableau XVIII. Teneurs tissulaires en monoxyde d’azote

Pv Ps CASv CASs

Tissus (µmol.mg-1 ) Foie 2,29 ± 0,06b 3,67 ± 1,14b 6,31 ± 3,06a 5,31 ± 0,89ab

Tissu adipeux 19,39 ± 1,13a 14,41 ± 1,87b 18,61 ±0,92a 7,02 ± 4,81c

Muscle 3,62 ± 0,26b 7,47 ± 0,62a 2,56 ± 0,05d 5,51 ± 0,30c

Cœur 18,05 ± 2,58a 13,49 ± 5,05a 4,4 ± 0,78b 4,71 ± 0,50b

Rein 10,69 ± 4,65b 50,06±34,71a 35,39 ±5,00c 6,18 ± 3,05b

Cerveau 13,69 ± 0,71a 10,76 ± 2,24a 3,88 ± 0,41b 3,35 ± 0,08b


Pv Ps CASv CASs Sérum (µmol.mL-1) 0,58 ± 0,03b 0,96 ± 0,22a 0,45 ± 0,01c 0,51 ± 0,02d

Urines (µmol.mL-1) 12,12 ± 0,46a 6,74 ± 0,46b 6,64 ± 2,26b 6,33 ± 1,03b

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