Optimalisation de procédures analytiques en vue d'analyses en ...

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TRAVAIL DE DIPLÔME Optimalisation de procédures analytiques en vue d’analyses en cytométrie de flux. Ecole Supérieure de la Santé, TAB 53ème

2013-

2014

Cindy Celeste & Réhane Delisle. Sous la supervision de M. Stéphane Quarroz CHUV | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois / Laboratoire Central

d’Hématologie – Laboratoire des moelles

Cindy Celeste & Réhane Delisle Travail de diplôme 2013-2014 CHUV – ESsanté (TAB 53ème

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SOMMAIRE

La cytométrie de flux est une méthode de pointe permettant l’immunophénotypisation (mise en évidence des

antigènes cellulaires grâce à des anticorps fluoromarqués) de cellules, la plupart du temps d’origine

sanguine ou médullaire (leucocytes). La cytométrie de flux est une technique utilisée dans de nombreux

domaines du laboratoire dont celui de l’hématologie où elle permet le diagnostic et le suivi de certaines

hémopathies malignes. Cette méthode nécessite une préparation de l’échantillon qui consiste en une étape de

lyse des érythrocytes et une étape de marquage des leucocytes. L’étape de lyse peut précéder ou suivre l’étape

de marquage. Actuellement, au laboratoire central d’hématologie (LCH), le protocole consiste à d’abord lyser

les cellules avec du NH4Cl (réactif de lyse fabriqué par le LCH), puis à les marquer. Parallèlement, le LCH

effectue des cytocentrifugations de ces suspensions cellulaires afin d’observer la morphologie des cellules

typisées.

Le premier but de notre travail de diplôme a été de comparer les résultats obtenus avec différents protocoles de

préparation cellulaire. Plus précisément, nous avons testé 3 réactifs de lyse commerciaux ainsi que le réactif de

lyse actuellement utilisé au LCH. Nous avons testé 2 méthodes, l’une d’elles commence par la lyse et se

termine par le marquage. A l’inverse, l’autre débute par le marquage et finit par l’étape de lyse. Nous en

sommes venues à la conclusion qu’il n’y avait aucun avantage à changer le protocole actuellement en place.

Le deuxième but de notre travail de diplôme a été de comparer 2 méthodes de préparation cellulaire, afin de

définir laquelle permet de mettre en évidence le plus de plasmocytes dans le cas du myélome multiple. Là, il

s’avère que la nouvelle méthode testée est plus efficace que le protocole actuellement en place.

ABSTRACT

Flow cytometry is a sophisticated method allowing the immunophenotypisation mostly of blood or

medullary cells (leukocytes). This immunophenotypisation is possible thanks to the use of fluorochrome-

labeled antibodies managed against cellular antigens. Flow cytometry is a method used in numerous

domains of the laboratory, especially in hematology where it allows the diagnosis and the follow-up of some

hematopoietic tumors. This method requires a preparation of the sample, which consists of a step of lysis of

the erythrocytes and a step of staining of the leukocytes. The step of lysis can precede or follow the step of

staining. Today, the protocol of the Central Hematology Laboratory (LCH) consists in a lysis of the cells with

NH4Cl (lysing solution made by the LCH), and then a staining of the cells. At the same time, the LCH makes

cytocentrifugations of these cellular suspension to observe the morphology of typised cells.

The first goal of our work was to compare the results obtained with various protocols of cellular preparation.

More precisely, we tested 3 commercial lysing solutions and the lysing solutions actually used in the LCH. We

tested 2 methods, one beginning with the lysing step and finishing by the staining. The other one we began

with the staining and finished with the stage of lysis. We came to the conclusion that there isn’t any advantage

in changing the protocol actually used.

The second goal of our work was to compare 2 methods of cells preparation, to determine which one would

allow to show most of plasma cells in the case of the plasma cell myeloma. It turns out that the new method

tested allows to show more plasma cells that the protocol at present used.


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TABLE DES MATIÈRES

1. INTRODUCTION 5

1.1. PRÉSENTATION DU LABORATOIRE 5 1.2. INTÉRÊT DE CE SUJET 5

1.2.1. Méthodes de préparation cellulaires utilisées au LCH 6 1.3. CYTOMÉTRIE DE FLUX 7

1.3.1. Historique 7 1.3.2. Applications en hématologie 7 1.3.3. Introduction sur les hémopathies malignes 8

1.3.3.1. Les leucémies aiguës (LA) 9 1.3.3.2. Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) 9 1.3.3.3. Les syndromes myélodysplasiques (SMD) 10 1.3.3.4. Les néoplasies à cellules B/T matures et à cellules NK 10 1.3.3.5. Le myélome multiple 10 1.3.3.6. Les lymphomes 12

2. BUTS 13

3. DÉVELOPPEMENT : MATÉRIEL, PRINCIPES ET MÉTHODES 14

3.1. MATÉRIEL 14 3.2. PRINCIPE DE L’APPAREIL DE CYTOMÉTRIE DE FLUX 17

3.2.1. Préparation de l’échantillon 17 3.2.1.1. La lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll 17 3.2.1.2. Le marquage 18

3.2.2. Focalisation hydrodynamique 21 3.2.3. Le système optique (banc optique) 23

3.2.3.1. La cellule de lecture 24 3.2.3.2. Les filtres et les miroirs 25 3.2.3.3. La détection du signal 26 3.2.3.4. Les réglages de l’appareil 27 3.2.3.5. L’interprétation des histogrammes 28

3.3. PRINCIPE D’ACTION DES RÉACTIFS DE LYSE TESTÉS 32 3.4. MÉTHODES 32

3.4.1. Protocole n°1 : préparation du matériel 33 3.4.2. Protocole n°2 : Lysis Staining Washing (LSW) 34 3.4.3. Protocole n°3 : Staining Lysis Washing (SLW) 35 3.4.4. Protocole n°4 : cytospin 36 3.4.5. Protocole n°5 : coloration “Romanowsky” pour cytospin 36

4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 37

4.1. RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES DIFFÉRENTES MÉTHODES 37 4.2. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES DIFFÉRENTES MÉTHODES 45 4.3. RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE 47 4.4. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE 48 4.5. RÉSULTATS STATISTIQUES 48 4.6. DISCUSSION DES RÉSULTATS STATISTIQUES 49 4.7. RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER 49 4.8. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER 50 4.9. RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE 50


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4.10. DISCUSSION DES RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE 51

5. CONCLUSIONS 51

5.1. CONCLUSIONS DE NOTRE TRAVAIL 51 5.2. SUITES POSSIBLES À NOTRE TRAVAIL 52 5.3. CONCLUSIONS PERSONNELLES 53

6. REMERCIEMENTS 54

7. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 55

8. ICONOGRAPHIE 57

9. LEXIQUE 60

10. ANNEXES 62

ANNEXE 1 : TRAÇABILITÉ 62 ANNEXE 2 : SOLUTIONS DE TRAVAIL 64 ANNEXE 3 : FACSLYSE 65 ANNEXE 4 : VERSALYSE 71 ANNEXE 5 : IOTEST 74 ANNEXE 6 : COLORATION ROMANOWSKY 76 ANNEXE 7 : GIEMSA 79 ANNEXE 8 : LA FABRICATION DES ANTICORPS 80 ANNEXE 9 : FLUOROCHROMES 81 ANNEXE 10 : PRÉPARATION POUR LA CMF 82 ANNEXE 11 : COMPTAGE 86 ANNEXE 12 : LISTE DES ÉCHANTILLONS TRAITÉS 87 ANNEXE 13 : DÉTAIL DES PANELS UTILISÉS 92 ANNEXE 14 : RÉSULTATS BRUTS 93 ANNEXE 15 : EXEMPLES KALUZA 99 ANNEXE 16 : DONNÉES DES GRAPHIQUES DE COMPARAISON DES MFI 109 ANNEXE 17 : DONNÉES UTILISÉES POUR LES CORRÉLATIONS 121


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1. INTRODUCTION

1.1. PRÉSENTATION DU LABORATOIRE

Notre stage s’est déroulé dans le laboratoire central d’hématologie (LCH) du CHUV. Outre la réalisation

d’analyses médicales, le LCH s’implique également dans les domaines de la formation, de l’enseignement

ainsi que dans la recherche.

Le LCH est divisé en 4 unités distinctes :

hématologie générale

hémostase (de routine et spécialisée)

hématologie spéciale

o moelle (cytologie et marqueurs)

o biologie moléculaire.

Les secteurs d’hématologie générale et d’hémostase assurent une prise en charge des échantillons en tout

temps, alors que les laboratoires d’hématologie spéciale ne fonctionnent que les jours ouvrables.

Les anémies, les cytopénies, les troubles de l’hémostase ainsi que les hémopathies malignes sont les 4

grands groupes de pathologies rencontrés au LCH. Les prélèvements proviennent principalement de la

cité hospitalière, mais peuvent aussi venir de demandeurs externes. Le LCH reçoit principalement deux

types de prélèvements : du sang et de la moelle osseuse.

Nous avons effectué notre travail de diplôme dans le laboratoire des moelles. Le personnel de ce

laboratoire assiste les médecins lors des ponctions et biopsies de moelle, prépare et colore les lames,

effectue une observation morphologique minutieuse des grumeaux et analyse les prélèvements à l’aide de

la cytométrie de flux (CMF). Plusieurs autres analyses moins fréquentes peuvent être effectuées dans ce

laboratoire (Pink test, test de falciformation). (cf. « 9. Lexique » page : 61). [1] et [2].

1.2. INTÉRÊT DE CE SUJET

Notre travail de diplôme (TD), proposé par Monsieur Stéphane Quarroz, s’inscrit dans le cadre d’une

remise en question permanente des techniques utilisées au laboratoire. Le but final d’une telle démarche

est l’optimalisation des techniques et ainsi l’obtention de meilleurs résultats.

Notre TD porte sur l’optimalisation de la préparation cellulaire précédant l’analyse sur l’appareil de CMF.

La CMF permet de détecter des antigènes présents à la surface cellulaire grâce à des anticorps

monoclonaux fluoromarqués (certaines méthodes permettent aussi la détection d’antigènes

cytoplasmiques ou nucléaires).

Dans la technique de la CMF, une suspension cellulaire (préalablement marquée avec des anticorps

fluoromarqués) passe dans un appareil de CMF (les cellules se présentant les unes derrière les autres).

Elles sont ensuite analysées par le biais d’un laser (cf. « 9. Lexique » page : 61) et d’un banc optique.

Plusieurs informations concernant la cellule sont alors obtenues : sa taille, sa complexité et, suivant le

marquage effectué, la présence ou l’absence de certains antigènes. Comme cette méthode nous fournit des


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informations phénotypiques (cf. « 9. Lexique » page : 61) sur chaque cellule, elle nous permet d’avoir une

vision globale de l’échantillon. Les antigènes mis en évidence permettent le plus souvent de rattacher les

cellules à une lignée cellulaire et parfois de définir leur stade de maturation. Cette technique permet donc

de préciser le diagnostic, d’effectuer le suivi de la maladie résiduelle et contribue à définir le pronostic.

[3] et [4] (pages : 1 à 2).

La CMF nécessite une étape de préparation des échantillons. Cette dernière a pour but, d’une part,

l’élimination des érythrocytes qui peuvent perturber l’analyse et, d’autre part, l’isolement des leucocytes

car ces derniers représentent la population d’intérêt. Pour cela, deux procédés existent : le Ficoll et la lyse

des érythrocytes (cf. « 3.2.1.1. La lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll » page : 17). Il existe

plusieurs réactifs de lyse sur le marché, avec chacun leurs avantages et leurs inconvénients. Une autre

étape de la préparation cellulaire est le marquage des cellules. C’est principalement sur cette préparation

de l’échantillon que nous avons travaillé. Plus précisément, nous avons comparé les différentes Mean

Fluorescence Intensity (MFI) (cf. « 3.2.3.5. Interprétation des histogrammes – Mean Fluorescence

Intensity (MFI) » page : 31) obtenues lors de l’analyse sur l’appareil de CMF après différentes techniques

de préparation.

Parallèlement à la préparation de l’échantillon, une cytospin (cf. « 9. Lexique » page : 60) est effectuée.

L’analyse microscopique de cet étalement cellulaire permet d’avoir une vue d’ensemble des cellules de

l’échantillon. Le choix des anticorps utilisés et la population leucocytaire à cibler pour l’analyse en CMF

peuvent, dans certains cas, être guidés par cette étude morphologique.

Un autre sujet qui nous a beaucoup intéressé dans le cadre de ce travail porte sur les myélomes multiples

(MM). En effet, le MM constitue un cas particulier. Au vu des images morphologiques régulièrement

obtenues par le laboratoire, ce dernier avait crainte que les plasmocytes soient détruits au cours de la

préparation cellulaire. Nous avons donc essayé d’éclaircir le sujet.

1.2.1. Méthodes de préparation cellulaires utilisées au LCH

Pendant longtemps, le LCH a utilisé la méthode Ficoll quel que soit le cas analysé. Il y a 5 ans environ,

pour les cas de maladies résiduelles et de myélome, un protocole différent a été introduit. Ce dernier

utilise la méthode de la lyse des érythrocytes. Dans un but de standardisation du traitement des analyses,

depuis 2013, la méthode de la lyse des érythrocytes a été adoptée pour tous les cas.

Actuellement, bien que les techniques employées semblent donner des résultats cohérents, plusieurs

questions, auxquelles nous avons essayé de répondre dans notre TD, se posent : y a-t-il un avantage à

faire le marquage avant la lyse ? Est-il préférable d’utiliser un autre agent de lyse ? Plusieurs articles

semblent favorables à ces idées. [5].

Cependant, la plupart des articles ne font pas mention d’une étude morphologique basée sur l’observation

de la cytospin. Selon le LCH, cette dernière semble peu intéresser les autres laboratoires pratiquant la

CMF.


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1.3. CYTOMÉTRIE DE FLUX

1.3.1. Historique

En 1934, la technique de la CMF est pour la première fois évoquée dans un article scientifique. Dans ce

papier, Moldavan décrit la méthode de comptage des cellules. Plus tard, en 1950, l’isothiocyanate de

fluorescéine (FITC) est lié à un anticorps. La découverte de ce couplage est loin d’être banale puisque le

FITC est un fluorochrome encore largement utilisé de nos jours. En 1970, on assiste à la naissance des

premiers appareils de CMF munis d’une source laser. Ces derniers permettent, en plus de la taille de la

cellule, de mesurer de la fluorescence verte et de la fluorescence rouge. Deux années plus tard, grâce au

travail d’Herzenberg, un nouvel appareil encore plus performant fait son apparition. Ce dernier, en plus

d’être muni d’un laser argon, est capable de trier les cellules. C’est en 1974 que le premier appareil de ce

type, produit par la firme Becton-Dickinson, fait son entrée sur le marché. En 1976, Shapiro imagine des

appareils de CMF pourvus de multiples sources lasers. Cette ingénieuse idée permettra, plus tard,

l’analyse simultanée de nombreuses fluorescences. En 1978, Schlossman débute la production d’anticorps

monoclonaux spécifiques d’antigènes de cellules lymphoïdes sanguines. En 1981, on pense à joindre un

système informatique à l’appareil de CMF. Cette étape est « révolutionnaire » puisqu’elle permet ainsi un

traitement des données. De nos jours, de multiples appareils de CMF sont commercialisés. Ces derniers

sont extrêmement performants. [4] (pages : 4 à 5).

1.3.2. Applications en hématologie

Aujourd’hui, en hématologie, la CMF est une technique de laboratoire largement utilisée, notamment

dans le cadre d’une immunophénotypisation des hémopathies malignes. Cette immunophénotypisation est

importante puisque, complétée par des données cliniques, morphologiques, cytogénétiques et

moléculaires, elle permet de définir précisément une hémopathie maligne (lignée, stade de maturation,

etc.). Ceci permet une prise en charge du patient plus aisée et plus adaptée. Le traitement et le suivi de

l’évolution de la maladie n’en seront que meilleurs.

On utilise aussi la CMF pour évaluer la maladie résiduelle. Celle-ci se définit par la persistance, dans la

moelle osseuse, de cellules hématopoïétiques malignes, ceci après un traitement à but éradicateur. En

CMF, on s’applique à rechercher/détecter un immunophénotype aberrant, spécifique à une pathologie

et/ou un immunophénotype précis, caractéristique au patient. La CMF permet d’estimer l’importance de

la persistance du clone. [6] (pages : 184 à 185).

Bien évidemment, il existe encore d’autres applications en hématologie, comme par exemple la

numération des cellules CD34 positives (cf. « 9. Lexique » page : 60) dans les cas de greffes de cellules

souches hématopoïétiques autologues ou encore pour le diagnostic de l’hémoglobinurie paroxystique

nocturne (HPN) (cf. « 9. Lexique » (page : 61) par exemple. [4].


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1.3.3. Introduction sur les hémopathies malignes

Les hémopathies malignes sont des maladies graves atteignant les cellules du système sanguin. Il en

existe une multitude. Chaque stade de maturation, à l’intérieur de chaque lignée, est susceptible d’être à

l’origine d’une telle maladie. Voici un tableau synthétique de l’hématopoïèse humaine.

Figure n°1 : hématopoïèse humaine

Les hémopathies malignes peuvent être classées dans différents groupes, selon de nombreux critères. A la

page suivante se trouve un tableau récapitulatif et non exhaustif de ces pathologies.


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Figure n°2 : classification OMS 2008 des hémopathies malignes (traduction personnelle)

1.3.3.1. Les leucémies aiguës (LA) On parle de leucémie lorsqu’on retrouve des cellules pathologiques simultanément dans la moelle osseuse

et dans le sang périphérique. La leucémie aigüe est définie par une population blastique présente à plus de

20% dans la moelle osseuse. [7] (diapositive : 4). Les cellules que l’on trouve dans le sang sont souvent

des cellules d’aspect jeune, présentant des altérations morphologiques.

Suivant la lignée cellulaire atteinte, on distingue deux grands groupes : les leucémies aigües lymphoïdes

et les leucémies aigües myéloïdes. [8] (page : 372).

1.3.3.2. Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) Ce groupe d’hémopathie maligne englobe plusieurs maladies, dont 4 principales : la leucémie myéloïde

chronique, la myélofibrose primaire, la thrombocytémie essentielle et la Polycythemia vera.

Ces anomalies hématologiques sont caractérisées par la prolifération démesurée d’une ou de plusieurs

lignées cellulaires à l’intérieur de la moelle osseuse. Naturellement, cette prolifération excessive peut

aboutir, dans le sang périphérique, soit à une polyglobulie, soit à une thrombocytose et/ou à une

augmentation significative des granulocytes. Les NMP sont des maladies présentant un risque d’évolution

vers une LA. [8] (page : 382).


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1.3.3.3. Les syndromes myélodysplasiques (SMD) Ce type de maladie est caractérisé par une hématopoïèse inefficace qui aboutit, dans le sang périphérique,

à des cytopénies. On observe des signes de dysplasie comme des anomalies de maturation. Les cellules

retrouvées dans le cadre d’un SMD ont une durée de vie inférieure aux cellules en bonne santé. Il existe

un risque important de transformation en leucémie aiguë. [8] (page : 387).

1.3.3.4. Les néoplasies à cellules B/T matures et à cellules NK Les néoplasies à cellules B/T matures et à cellules NK sont des hémopathies malignes touchant la lignée

lymphocytaire (B ou T) ou plasmocytaire (B). Ce type de maladie subit en général une évolution lente, de

type chronique. Les néoplasies de type plasmocytaire sont caractérisées par la sécrétion

d’immunoglobulines monoclonales, comme par exemple le myélome multiple, connu depuis la révision

de la classification OMS en 2008 sous le terme de myélome plasmocytaire, mais encore principalement

appelé myélome multiple. [8] (page : 391). Étant donné que cette pathologie fait l’objet d’un point

particulier de notre travail, nous en proposons un descriptif plus développé.

1.3.3.5. Le myélome multiple

Généralités Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne ayant pour origine un clone issu d’un

lymphocyte B devenu malin. Ce clone, ayant évolué vers le plasmocyte, prolifère de manière anormale et

incontrôlée, produisant de conséquentes quantités d’immunoglobulines (Ig) ou de fragments d’Ig. En leur

présence, on parle de gammapathie monoclonale. Lorsqu’on les retrouve dans les urines, on parle de

protéinurie de Bence Jones. [9] (page : 200) et [8] (page : 394).

Étiologie Le MM atteint généralement des personnes âgées de 60 à 70 ans et préférentiellement des hommes. [10]

(page : 295). Il semblerait que les personnes ayant été exposées aux radiations ou à certaines substances

toxiques présentent un risque plus élevé de développer un MM. [9] (page : 202).

Signes cliniques

asthénie, anorexie et amaigrissement

douleurs osseuses et fractures spontanées ou dues à un effort ou à un traumatisme insignifiant

insuffisance rénale chronique et protéinurie

complications neurologiques, cardiaques et hémorragiques (rarement)

complications infectieuses

manifestations respiratoires (rarement) [8] (page : 395) et [10] (page : 296).

Ces signes cliniques sont résumés par l’acronyme CRAB (hypercalcemia – renal insufficiency – anaemia

– bone lesions). [9] (page : 201).


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Sang et moelle osseuse Voici les caractéristiques du sang et de la moelle osseuse d’un patient atteint d’un myélome multiple.

San

g

anémie (50% des cas), généralement normocytaire normochrome non régénérative

érythrocytes en rouleaux

leucocytes habituellement normaux (neutropénie et leucocytose possibles – éosinophilie

et lymphocytose relative rare)

rarement plasmocytes circulants (forme leucémique ou stade terminal)

thrombocytes habituellement normaux ou faiblement abaissés

vitesse de sédimentation fortement augmentée

Mo

elle

oss

euse

infiltration plasmocytaire, de degré variable

hypoplasie myéloïde

[8] (page : 395) et [10] (page : 297).

Analyses de laboratoire

électrophorèse des protéines (cf. « 9. Lexique » page : 60) : cette dernière montre un pic étroit

caractéristique de la fraction gamma. Ce pic correspond à l’Ig monoclonale. Les autres

immunoglobulines sont diminuées.

immunofixation (cf. « 9. Lexique » page : 61) : Cette dernière permet de caractériser l’Ig

monoclonale.

dosage quantitatif des immunoglobulines

recherche d’une cryoglubuline (cf. « 9. Lexique » page : 60)

dosage de la protéinurie dans les urines de 24 heures

cytogénétique (il existe des anomalies de nombre et de structure dans 50% des cas, cependant

aucune n’est spécifique).

cytométrie de flux. [8] (pages : 395 à 396) et [10] (page : 297). Plusieurs marqueurs sont étudiés

dans le cadre d’un MM. Au LCH, on étudie les marqueurs suivants : CD45, CD38, CD138, CD56

et CD19. Le CD38 est positif pour une grande majorité de cellules, cependant, les plasmocytes

ont la particularité de l’exprimer très fortement. Ils expriment également le CD138 (ce sont les

seules cellules qui co-expriment les CD38 et CD138). Ces informations sont nécessaires pour la

compréhension des futurs résultats. [11].

Figure n°3 : pic monoclonal à l’électrophorèse des protéines et IgG monoclonale de type kappa à l’immunofixation.


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Traitement et évolution Le MM est toujours d’évolution fatale. Le traitement est essentiellement symptomatique. Une

chimiothérapie est également administrée. Chez les patients de moins de 55 ans, une greffe allogénique

(cf. « 9. Lexique » page : 60) est envisageable. [8] (page : 396).

1.3.3.6. Les lymphomes Les lymphomes représentent un groupe d’hémopathies malignes particulier qui se définit par une atteinte

localisée principalement au niveau des organes lymphoïdes. On observe généralement une hypertrophie

ganglionnaire assez évocatrice.

Bien souvent, on ne retrouve pas de cellules malignes au niveau sanguin. Il existe deux grands groupes de

lymphomes : les lymphomes hodgkiniens et les lymphomes non hodgkiniens. [8] (page : 399).

Figure n°4 : hypertrophie ganglionnaire


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2. BUTS

Ce travail vise à une éventuelle amélioration du protocole de CMF utilisé au LCH. C’est sur l’étape de

préparation des échantillons, comprenant une étape de lyse des érythrocytes et une étape de marquage,

que nous avons particulièrement travaillé.

Pour ce faire, 8 protocoles différents de préparation des échantillons ont été comparés. Ces méthodes sont

précisément décrites au point « 3.4. Méthodes » (page : 32). Les 8 protocoles ont été effectués sur 13

échantillons provenant de la routine du laboratoire des moelles. Le marquage a été effectué avec

différents anticorps et fluorochromes.

Le but a ensuite été d’évaluer ces différentes méthodes en comparant les MFI obtenues pour chaque

anticorps, l’idéal étant d’obtenir des MFI les plus élevées possibles. Un autre objectif consistait à évaluer

la morphologie obtenue sur les cytospins après l’utilisation des différents réactifs de lyses. Un objectif

moins scientifique, mais tout de même important pour un laboratoire, visait à évaluer si l’une ou l’autre

des méthodes présentait un net intérêt financier.

Pour le cas des MM, la question était différente, puisque nous ne nous intéressions pas à la MFI mais au

pourcentage de plasmocytes détectés par l’appareil de CMF. La question était donc de savoir si une

méthode permettrait de récupérer significativement plus de plasmocytes.


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3. DÉVELOPPEMENT : MATÉRIEL, PRINCIPES ET MÉTHODES

3.1. MATÉRIEL

En « Annexe 1 : traçabilité » (page : 62), vous trouverez les numéros de lot ainsi que les dates de

péremption de tout le matériel utilisé.

Automates

appareil de cytométrie de flux

Nom de l’appareil : Navios

Fabricant : Beckman Coulter

Réf. : A80706

Laser : Argon à 488 nm

He/Ne (Hélium/Néon) à 633 nm

Diode à 405 nm

Liquide de gaine : Beckman Coulter

Iso Flow™ Sheath Fluid

Réf. : 8546859

pipeteur automatique

Nom de l’appareil : Biomek NXP

Fabriquant : Beckman Coulter

Réf. : A31839

(Cet appareil permet le pipetage automatique du mélange

d’anticorps nécessaire lors de chaque analyse.)

Anticorps et fluorochromes

Anticorps Fluoro-

chrome

Excitation

(nm)

Émission

(nm) Laser Filtres Fabricant Réf.

Ctrl IgG1 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter A07795

Ctrl IgG1 PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter A07796

Ctrl IgG1 ECD 480 767 Argon 770 Beckman Coulter A07797

Ctrl IgG1 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A62833

Ctrl IgG1 PC7 480 767 Argon 770 Beckman Coulter 6607099

Ctrl IgG1 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter IM245

Ctrl IgG1 A700 696 719 He/Ne 720 Beckman Coulter A79391

Ctrl IgG1 A750 650 780 He/Ne 780 Beckman Coulter A79393

Ctrl IgG1 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter A74764

α-CD2 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter A60794

α-CD3 A750 650 780 He/Ne 780 Beckman Coulter A66329

α-CD4 PE 480 575 Argon 575 Becton-Dickinson 345769

α-CD5 PC5.5 480 694 Argon 700 Beckman Coulter A70203

α-CD7 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter PNB06499

α-CD8 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter A82791

α-CD10 ECD 480 620 Argon 620 Beckman Coulter IM3608

α-CD11c PC7 480 767 Argon 770 Beckman Coulter A80249

α-CD13 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter IM0778U



α-CD20 PB 405 455 Diode 450 Beckman Coulter A74777

Figure n°5 : cytomètre de flux

Figure n°6 : pipeteur automatique


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α-CD23 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter A69964

α-CD33 PE 480 575 Argon 575 Becton-Dickinson 345799



α-CD38 FITC 495 520 Argon 525 Beckman Coulter A07778


α-CD45 KO 398 528 Diode 550 Beckman Coulter A96416



α-CD79b PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter IM1612

α-CD117 APC 650 660 He/Ne 675 Beckman Coulter IM3638

α-CD123 PC7 480 767 Argon 770 Biolegend 306010

α-CD138 PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter IM2759

α-HLADR ECD 480 620 Argon 620 Beckman Coulter IM3636

α-HLADR PC7 480 767 Argon 770 Becton-Dickinson 335830

α-KAPPA FITC 495 520 Argon 525 DakoCytomation F0434

α-

LAMBDA PE 480 575 Argon 575 DakoCytomation R0437

α-sIgM PE 480 575 Argon 575 Beckman Coulter R5111

[12] Les noms complets des fluorochromes se trouvent au point « 9. Lexique » pages : 60 à 61).

Réactifs de lyse

NH4Cl Solution de travail

Fabriquant : LCH (cf. « Annexe 2 : solutions de travail » page : 64).

BD FACS™ Lysing Solution (10x)

Fabriquant : Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences

Réf. : 349202 (cf. « Annexe 3 : FacsLyse » page : 65).

VersaLyse Lysing Solution (1x)


Réf. : A09777 (cf. « Annexe 4 : VersaLyse »

page : 71).

IOTest 3 Lysing Solution (10x)


Réf. : A07799 (cf. « Annexe 5 : IOTest » page :

74).

Solutions de travail

PBS – Albumine - Azide


RPMI – AZIDE - BSA (RAB)


Figure n°7 : Solutions de lyses testées


)

16

RPMI Medium 1640 (1x) 500ml

Fabriquant : gibco® by life technologies™

Réf. : 31870-025

Acqua ad injectabilia « Bichsel »

Fabriquant : Bichsel

Réf. : 100 0 006

Leucostase

Fabriquant : Sobioda

Réf. : 3101-002E

Colorants

MGG Tampon Weise pH6.8

Fabriquant : LCH (cf. « Annexe 6 : coloration Romanowsky »

page : 76).

Giemsa Stain, Modified Solution Fluka Analytical

Fabriquant : Sigma-Aldrich

Réf. : 48900 (cf. « Annexe 7 : Giemsa » page : 79).

Méthanol

Fabriquant : Merck

Réf. : 1.06009.2500

Petit matériel de laboratoire

tubes de différentes tailles

pipettes pasteur, automatiques et graduées

embouts à pipettes

pipet-boy

gants

vortex

centrifugeuse

portoirs

poubelles diverses

chambres de comptage

microscope

chronomètres

lames à bords rodés

colle de montage

lamelles

cytocentrifugeuse

Figure n°8 : solutions de travail

Figure n°9 : colorants

Figure n°10 : petit matériel de laboratoire


)

17

Échantillons biologiques

sang sur héparinate de lithium

moelle osseuse sur héparinate de lithium ou EDTA

Sang : Le sang doit être recueilli sur héparinate de lithium. Un délai de 24 heures est fixé pour effectuer

le prélèvement. Les échantillons se conservent à température ambiante.

Moelle : La moelle peut être prélevée sur EDTA ou sur héparinate de Lithium. Le prélèvement de la

moelle osseuse se fait dans la crête iliaque postéro-supérieure. Une ponction (aspiration) et généralement

une biopsie sont effectuées. Pour la CMF, on travaille avec du matériel provenant de la ponction. Tout

comme le sang, l’analyse doit être effectuée dans les 24 heures qui suivent le prélèvement et les

échantillons se conservent à température ambiante. [13] et [14].

Programme informatique (Kaluza) Kaluza est un programme informatique utilisé pour traiter les données générées par les analyses faites sur

l’appareil de CMF. Il permet de modifier certains paramètres post-analyse ainsi que de connaître, entre

autre, les pourcentages et la fluorescence moyenne de populations cellulaires ciblées. Ce programme est

produit par la firme Beckman Coulter.

3.2. PRINCIPE DE L’APPAREIL DE CYTOMÉTRIE DE FLUX

3.2.1. Préparation de l’échantillon

Comme nous l’avons déjà brièvement dit dans le chapitre « 1.2. Intérêt de ce sujet » (page : 5), une

préparation de l’échantillon est nécessaire avant son passage dans l’appareil de CMF. La préparation d’un

échantillon comprend 2 étapes principales, la lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll et le marquage.

L’étape de marquage peut précéder ou suivre l’étape de lyse. Au LCH, la lyse est effectuée avant le

marquage.

3.2.1.1. La lyse des érythrocytes ou la méthode Ficoll La méthode Ficoll permet, par gradient de densité, de récupérer uniquement les cellules mononuclées

(lymphocytes, monocytes, blastes, etc.).

La méthode de la lyse des érythrocytes permet, elle, de récupérer tous les leucocytes. Par ce fait, elle offre

une meilleure représentation quantitative de la population leucocytaire. Plusieurs agents de lyse sont

Figure n°11 : échantillons


)

18

disponibles. Les 4 que nous avons testés seront décrits précisément au chapitre « 3.3. Principe d’action

des réactifs de lyse testés» (page : 32). [3] (diapositives : 5 à 9).

3.2.1.2. Le marquage Le marquage fait intervenir 3 notions

principales : les antigènes, les anticorps, et les

fluorochromes. La réaction de base du marquage

est une réaction immunologique entre un

antigène et son anticorps spécifique lié à un

fluorochrome. Il existe une méthode de

marquage direct et une méthode indirecte. (Nous

avons utilisé uniquement la méthode directe,

c’est pourquoi nous avons développé seulement

celle-ci).

Les antigènes Antigen (en anglais) = ANTIbody GENerate

Comme son nom l’indique, l’antigène est une molécule qui est reconnue spécifiquement par le système

immunitaire (capacité immunogène) et qui a la capacité d’induire une production d’anticorps (capacité

antigénique). Cet anticorps est alors spécifique à l’antigène et peut interagir avec ce dernier. [15] (pages :

13 à 14).

Les cellules sont recouvertes d’antigènes. Ceux-ci peuvent se trouver à leur surface, être

transmembranaires, intracytoplasmiques ou encore intranucléaires. Ces antigènes confèrent leur identité

aux cellules. [15] (pages : 13 à 14).

Certains antigènes sont présents sur tous les leucocytes, d’autres peuvent être spécifiques d’une lignée

cellulaire, d’autres encore d’un stade de maturation. Plusieurs de ces antigènes ont été répertoriés et

numérotés en utilisant la dénomination « CD » qui signifie Cluster of Differenciation. (Ex : CD4, CD8,

CD19). Il en existe plus de 350. C’est majoritairement ce type d’antigènes que nous marquons en CMF

[15] (pages : 13 à 14).

Le pouvoir antigénique est la capacité d’un antigène à induire une production d’anticorps. Il varie selon la

nature chimique de l’antigène : protéique, glucidique, acides nucléiques ou lipidiques. [15]

(pages : 13 à 14).

L’épitope est le site antigénique de l’antigène, ce dernier en possède

plusieurs. C’est sur ce site que viendra se lier de façon spécifique

l’anticorps. La valence de l’antigène est déterminée selon son

nombre d’épitopes. [15] (pages : 13 à 14).

Figure n°12 : marquage direct

Figure n°13 : épitope


)

19

Les anticorps Les anticorps sont des protéines synthétisées par les cellules dérivées du lymphocyte suite à une

stimulation antigénique : les plasmocytes. [15] (pages : 14 à 16).

Plus précisément, les anticorps sont des glycoprotéines formées par 4 chaînes : 2 chaînes légères

identiques et 2 chaînes lourdes identiques. Ce sont des ponts disulfures qui relient les chaînes entre-elles.

Il y a 2 sortes de chaînes légères : kappa (κ) et lambda (λ). Deux tiers des lymphocytes produisent des

anticorps dont les chaînes légères sont de type kappa.

Pour les chaînes lourdes, il en existe 5 types, qui déterminent les classes d’anticorps :

les IgG γ (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)

les IgM µ (pentamère)

les IgA α (monomérique dans le sang, dimère sous forme sécrétoire) (IgA1, IgA2)

les IgE ε

les IgD δ

En CMF, on utilise surtout des IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM et des Fragments d’Ig – F(ab’)2. Il est

important, lorsqu’on utilise un anticorps en CMF, de connaître son isotype afin d’effectuer le contrôle

isotypique adéquat. [16] (diapositive : 10).

La structure d’un anticorps forme la lettre « Y », il est constitué de deux parties, une partie constante (Fc,

fragment cristallisable) et une partie variable (Fab, fragment antigen binding). C’est cette deuxième partie

qui est spécifique à un antigène et c’est avec cette partie

que l’anticorps se lie à l’épitope (déterminant

antigénique) de l’antigène. [15] (pages : 14 à 16).

Tout comme les antigènes, les anticorps peuvent être

classés selon plusieurs critères. Il existe par exemple des

anticorps monoclonaux (produits par un seul clone

lymphocytaire) et des anticorps polyclonaux (produits par

plusieurs clones lymphocytaires) [15] (pages : 14 à 16).

Aujourd’hui, en CMF, on utilise essentiellement des

anticorps monoclonaux. L’explication de la fabrication de

ces derniers n’est pas essentielle pour la compréhension

de notre TD, néanmoins nous trouvons ce processus

intéressant, c’est pourquoi il est expliqué à l’ « Annexe 8 :

la fabrication des anticorps » (page : 80).

Figure n°14 : schéma d’un anticorps


)

20

Technique de marquage direct Voici un exemple de marquage direct. Selon les laboratoires, quelques détails peuvent différer, mais le

principe reste le même.

Figure n°15 : technique de marquage

Lors de la première étape, les cellules à marquer sont mises en contact avec les anticorps fluoromarqués.

Si l’anticorps trouve l’antigène correspondant, il s’y fixe. Lors de l’étape 2 et 3, les cellules sont lavées

afin d’éliminer les anticorps non liés. [16] (diapositive : 13).

Figure n°16 et 17 : technique de marquage direct

Lors de l’étape 4, les cellules sont à nouveau suspendues dans un milieu approprié, elles sont prêtes à être

analysées sur l’appareil de CMF. [16] (diapositive : 13).

Les fluorochromes L’appareil de CMF détecte la fluorescence des cellules. Ce sont les fluorochromes (liés aux anticorps) qui

confèrent de la fluorescence aux cellules. Nous pouvons définir les molécules fluorescentes comme des

molécules absorbant la lumière à une certaine longueur d’onde et la réémettant à une longueur d’onde

supérieure.


)

21

Ce phénomène a une explication physique : lorsqu’une molécule absorbe plus d’énergie lumineuse

qu’elle n’en retransmet, la molécule passe

d’un état stable à excité puis à nouveau à une

situation stable. Cela s’explique par le

déplacement des électrons sur une couche

électronique supérieure sous l’influence des

photons (cf. « 9. Lexique » page : 61). La

molécule est alors instable. C’est lors du

retour à l’état stable qu’il y a une perte

d’énergie sous forme d’émission de lumière.

Ce principe est résumé sur le Diagramme de

Jablonski.[4] (pages : 48 à 49).

C’est lors de ce passage de l’état excité à l’état stable qu’a lieu la diminution d’énergie lumineuse

retransmise par rapport à l’énergie lumineuse absorbée. Une faible longueur d’onde contenant plus

d’énergie qu’une longueur d’onde plus élevée, cela explique pourquoi la longueur d’onde retransmise est

plus grande que celle absorbée.

Ce décalage est appelé « Décalage de Stokes »,

il montre l’écart entre les spectres d’absorptions

et d’émissions. [4] (pages : 48 à 49). Chaque

fluorochrome a un spectre d’excitation et

d’émission qui lui est propre.

En « Annexe 9 : fluorochromes » (page : 81),

vous trouverez des exemples de quelques

fluorochromes avec leur longueur d’onde

d’excitation et d’émission ainsi que le laser

utilisé pour les exciter.

3.2.2. Focalisation hydrodynamique

Le but de la focalisation hydrodynamique est de faire passer des cellules en suspension, les unes derrières

les autres, à très grande vitesse, devant une source laser afin de les analyser séparément. [4] (page : 5) et

[6] (pages : 4 à 5).

Ceci est réalisable grâce aux propriétés des fluides. Il y a 2 composants liquides principaux, le liquide de

gaine (qui forme le manteau à l’intérieur duquel les cellules circulent) et l’échantillon contenant des

cellules en suspension. Trois paramètres permettent d’expliquer la focalisation hydrodynamique : la

pression, la vitesse et la densité. [4] (pages : 5 à 6) et [6] (pages : 4 à 5).

Figure n°18 : diagramme de Jablonski

Figure n°19 : spectres d’excitation et d’émission, définition du rayon de

Stokes


)

22

Figure n°20 : focalisation hydrodynamique

L’échantillon est injecté avec une certaine pression au milieu d’une buse, à l’intérieur de laquelle le

liquide de gaine est lui aussi amené avec une certaine pression. C’est la pression du liquide de gaine qui

définit la vitesse du flux cellulaire, et donc la vitesse

d’analyse des cellules. La sortie de la buse étant un

petit orifice, le liquide de gaine sera accéléré à la

sortie de la buse. Ce dernier sort de la buse sous

forme de jet dont le diamètre correspond à celui de

l’orifice. La structure de la buse et de l’orifice

permettent d’obtenir un flux laminaire à l’intérieur

duquel les cellules sont attirées et sont forcées de

circuler les unes derrière les autres, permettant ainsi

une analyse individuelle. [4] (page : 6) et [6] (pages :

4 à 5).

Deux conditions sont nécessaires pour permettre la création d’un flux :

une pression doit être appliquée sur le liquide de gaine et sur l’échantillon.

la pression doit être plus grande sur le liquide de gaine que sur la suspension cellulaire

(différentiel positif). [4] (pages : 6 à 7).

Si le différentiel de pression était négatif, le liquide de gaine serait refoulé vers l’injecteur et donc vers

l’échantillon également. En cas de pression identique sur le liquide de gaine et sur l’échantillon, ce

dernier n’aurait pas la possibilité de s’insérer dans le flux.

Comme dit précédemment, la pression du liquide de gaine influence la vitesse de défilement cellulaire,

mais il y a aussi la pression de l’échantillon qui influence le flux. L’utilisateur a la possibilité de changer

la pression différentielle appliquée sur l’échantillon et donc de modifier la vitesse de défilement des

cellules. Cependant, en augmentant le différentiel de pression, la vitesse est accélérée mais le diamètre du

jet cellulaire est lui aussi agrandi. Cette dernière modification entraîne une influence négative sur la

précision de l’analyse. En effet, le diamètre étant élargi, la vitesse de défilement augmente mais le

centrage des cellules dans le flux diminue et péjore la qualité de l’analyse. Lorsque les cellules ne passent

Figure n°21 : focalisation hydrodynamique


)

23

pas toutes au même endroit devant le laser, il se crée alors des variations entre les cellules. La

fluorescence des cellules n’est alors pas le reflet exact de leur charge en fluorescence, et les résultats sont

moins précis. Pour intensifier la vitesse d’analyse, il est donc préférable d’appliquer une pression qui

permet de garder cette précision de centrage des cellules, et

plutôt d’augmenter la concentration cellulaire de

l’échantillon. [4] (pages : 6 à 7) et [6] (pages : 4 à 5).

En ce qui concerne la densité, c’est aussi un élément

important de la focalisation hydrodynamique. Il est

préférable de choisir les liquides de gaine ayant une densité

inférieure ou identique à celle de l’échantillon, afin de

prévenir les effets de réflexion qui peuvent entraîner une

perte du signal. [4] (page : 7) et [6] (pages : 4 à 5).

Évidemment, chaque appareil est différent. Les réglages faits

sur un appareil ne seront pas les mêmes sur un autre appareil

de CMF. Chaque paramètre doit être adapté. Par exemple,

certains appareils de CMF analysent 1’000 à 2’000

cellules/seconde alors que d’autres sont capables de lire

30'000 cellules/seconde. Dans ce cas, la concentration idéale

de l’échantillon à analyser n’est pas la même. [4] (page : 7) et

[6] (pages : 4 à 5).

3.2.3. Le système optique (banc optique)

Le système optique d’un appareil de CMF se compose de plusieurs éléments :

une ou plusieurs sources lumineuses : le(s) laser(s)

une cellule de lecture

une succession de filtres et miroirs

des détecteurs. [17] (diapositive : 5).

Figure n°23 : schéma d’un cytomètre de flux

Figure n°22 : influence de la concentration et de la pression sur la précision de la mesure


)

24

A ce jour, on utilise 3 types de lasers en CMF ; un laser Argon à 488 nm, un laser He/Ne (Hélium/Néon)

à 633 nm et un laser diode à 405 nm [18].

Les appareils de CMF peuvent être équipés uniquement d’un laser argon, ou alors posséder un deuxième

et/ou un troisième laser. Évidemment, le nombre de fluorochromes potentiellement exploitables est

proportionnel au nombre de lasers que possède l’appareil. [17] (diapositive : 8).

3.2.3.1. La cellule de lecture Le point de rencontre entre le laser et les cellules

constitue la cellule de lecture. [17] (diapositive : 9).

Au moment où le laser frappe les cellules qui se

présentent devant lui, plusieurs informations sont

obtenues :

la taille de la cellule (forward scatter à 0

degré)

la complexité de la cellule (side scatter à

90 degrés)

les différentes intensités de fluorescence

émises par la cellule (90 degrés). [19] [20]

Forward scatter (diffusion aux petits angles) Le forward scatter donne une indication sur la

taille de la cellule. Ce signal correspond à la

lumière diffractée. Cette dernière est recueillie

à 0 degré par rapport à l’axe du laser. Plusieurs

paramètres sont susceptibles d’influencer le

forward scatter : la composition du milieu et la

structure des cellules. [4] (pages : 9 à 13).

Side scatter (diffusion aux grands angles) Le side scatter donne une indication sur la

complexité de la cellule (granularité et

noyau). Ce signal correspond à un mélange de

lumière diffusée, réfléchie et réfractée,

recueillie à 90 degrés par rapport à l’axe du

laser. [4] (pages : 9 à 13).

Figure n°24 : cellule de lecture

Figure n°25 : forward scatter

Figure n°26 : side scatter


)

25

Fluorescence émise par les cellules A 90 degrés, on recueille également la fluorescence émise par les cellules. Une cellule émet de la

fluorescence pour autant qu’elle ait été préalablement marquée par un anticorps lié à un fluorochrome. La

fluorescence doit finalement être acheminée vers des détecteurs. [4] (pages : 9 à 13).

3.2.3.2. Les filtres et les miroirs Le rôle des filtres et des miroirs est de conduire la fluorescence vers un détecteur et également de définir

la « partie » de la fluorescence à transmettre afin que chaque détecteur ne reçoive finalement que les

longueurs d’ondes qui lui sont appropriées. [4] (pages : 9 à 13).

Les miroirs dichroïques Il existe 2 types de miroirs dichroïques, les miroirs dichroïques passe-bas et les miroirs dichroïques passe-

haut. Ceux-ci permettent de transmettre la lumière jusqu’à, ou à partir, d’une certaine longueur d’onde. A

titre d’exemple, un miroir dichroïque passe-bas de 630 nm réfléchit les longueurs d’ondes supérieures à

630 nm. Les longueurs d’ondes inférieures sont transmises. A l’inverse, un miroir dichroïque passe-haut

de 630 nm transmet les longueurs d’ondes au-delà de 630 nm et réfléchit les longueurs d’ondes

inférieures à 630 nm. [4] (pages : 9 à 13).

Figure n°27 : fluorescence

Figure n°28 : miroirs dichroïques


)

26

Les filtres Il existe 3 types de filtres :

Figure n°29 : les filtres

Les filtres passe-haut stoppent la lumière inférieure à une certaine longueur d’onde, à l’inverse, les filtres

passe-bas arrêtent la lumière supérieure à une certaine longueur d’onde. Quant aux filtres passe-bande, ils

laissent passer la lumière se trouvant entre deux longueurs d’ondes. Ce type de filtres est le plus

largement utilisé. Placés juste devant un détecteur, les filtres passe-bande permettent d’assurer que le

détecteur reçoive uniquement les longueurs d’ondes qui lui sont appropriées.

Bien qu’ils fassent partie intégrante de la partie optique d’un appareil de CMF, les détecteurs font l’objet

d’un chapitre particulier dans ce travail car la compréhension de la détection du signal en CMF est un

point capital. [4] (pages : 9 à 13).

3.2.3.3. La détection du signal La détection du signal en CMF s’effectue grâce à des photodétecteurs. Le rôle d’un photodétecteur est de

convertir les photons en photon-électrons, ce qui a la particularité de créer un courant électrique. Il existe

2 types de photodétecteurs dans un appareil de CMF : les photodiodes (PD) et les photomultiplicateurs

(PMT). [4] (pages : 13 à 16).

Les photodiodes Les PD, particulièrement efficaces pour transformer les photons en photons-électrons, sont généralement

utilisés pour détecter des signaux d’intensité élevée. On les utilise notamment pour la détection du signal

du forward scatter.


)

27

Les photomultiplicateurs Les PMT sont habituellement utilisés pour détecter des signaux de plus faible intensité (comme le side

scatter). On les utilise également pour la détection de la fluorescence des éléments marqués. Les PMT

possèdent un enchaînement d’électrodes (les dynodes) dont le rôle est d’augmenter le signal électrique

Cette possibilité d’amplification du signal fait que les PMT sont des photodétecteurs particulièrement

sensibles. La sensibilité est encore accrue en augmentant le voltage appliqué aux PMT.

Après la photodétection, on obtient ce que l’on appelle une impulsion. Grâce à cette valeur, l’étape de

conversion d’un voltage en une valeur numérique est réalisable. Cette étape s’appelle la digitalisation du

signal. Pour sa réalisation, des convertisseurs analogiques-numériques (ADC) sont nécessaires.

Aujourd’hui, chaque firme possède un système de traitement du signal un peu différent. [4] (pages : 13 à

16).

3.2.3.4. Les réglages de l’appareil Avant de pouvoir utiliser l’appareil de CMF et afin d’être certain que les résultats obtenus sont fiables, il

est important de faire plusieurs réglages sur l’appareil :

la détermination des volts appliqués à chaque PMT

le calcul de la compensation de fluorescence entre les différents

fluorochromes.

Détermination des volts Les volts sont réglés en analysant une population cellulaire. Ils sont

ajustés de façon à ce que le pic de fluorescence des cellules négatives se

retrouve dans la première décade de l’échelle logarithmique du

fluorochrome concerné.

Compensation Il arrive que les spectres d’émission de deux fluorochromes se chevauchent, par exemple, FITC et PE.

Cela crée alors des interférences lors de la

lecture. Comme nous pouvons le voir sur

le graphique, une partie de la fluorescence

de FITC est lue par le PTM destiné à la

lecture de PE (et inversement). Cela

signifie, que sans compensation, une

cellule uniquement marquée avec du FITC

peut se retrouver positive aussi pour PE (et

inversement). Il y a une contamination du

canal de lecture PE par la fluorescence

émise par le fluorochrome FITC (et

inversement). Cet effet peut ainsi induire

de faux résultats. [21] (diapositives : 22 à

29).

Figure n°30 : ajustement du voltage

Figure n°31 : compensation

525 nm 575 nm

canal delectureFITC

canal delecture

PE

[Longueur d'onde en nm]

[I]

FITC PE


)

28

La correction de ce phénomène s’appelle la compensation de fluorescence. Afin de régler ces

compensations, une série de marquages est effectuée avec de l’α-CD45 (cf. « 3.2.3.5. Interprétation des

histogrammes ».page : 28) dans les

différents fluorochromes utilisés

habituellement. Les tubes, contenant

chacun un seul fluorochrome, sont

analysés sur l’appareil de CMF. Cela

permet de déterminer le pourcentage

de contamination de chaque

fluorochrome sur les autres canaux

de lecture. Le logiciel de l’appareil

de CMF calcule automatiquement

les pourcentages de contamination.

[21] (diapositives : 22 à 29).

3.2.3.5. L’interprétation des histogrammes Lors d’une analyse par CMF, plusieurs histogrammes peuvent être construits :

l’histogramme FS/SS

l’histogramme SS/α-CD45

les histogrammes monoparamétriques

les histogrammes biparamétriques.

L’histogramme FS/SS Sur cet histogramme, les cellules sont réparties selon leur complexité en abscisse (SS) et selon leur taille

en ordonnée (FS). La fluorescence émise par les cellules n’est pas prise en compte. Cet histogramme

permet une visualisation de la répartition des différents types de leucocytes. Ces derniers se répartissent

comme sur le schéma ci-dessous.

Figure n°32 : compensation

Figure n°33 : répartition des différents types leucocytaires

LYMPHOCYTES

MONOCYTES GRANULOCYTES


)

29

L’histogramme SS/α-CD45 Cet histogramme s’établit selon 2 paramètres, la complexité de la cellule (SS) et l’intensité de la

fluorescence des cellules à l’α-CD45.

Pour pouvoir analyser correctement cet histogramme, une petite introduction sur le CD45 est nécessaire.

Le CD45 est un antigène composé d’une glycoprotéine de 240 kD. Cette protéine est codée par un gène

localisé sur le chromosome 1. Cet antigène possède la caractéristique d’être exprimé sur tous les

leucocytes. Sur les leucocytes immatures, il peut être plus faiblement exprimé, voire absent sur les

cellules très immatures. [22] (page : 71).

Voici une représentation de la répartition des différentes cellules sur un histogramme SS/α-CD45. L’axe

des abscisses correspond au SS avec une échelle linaire, celui des ordonnées à la fluorescence de l’α-

CD45 marqué au Krome orange (KO).

Par rapport au FS/SS, cet histogramme permet une

meilleure discrimination entre les lymphocytes et les

blastes. Ce type d’histogramme est essentiel lorsque la

technique de la lyse des globules rouges est utilisée. Sur

l’histogramme FS/SS, des érythrocytes mal lysés se

mélangent à la population lymphocytaire. [21]

(diapositive : 8).

Le « gating » Sur la base des histogrammes FS/SS et SS/α-CD45,

l’utilisateur peut décider d’effectuer un « gating ». Ce

dernier cible la population à analyser. Après un « gating »,

il est possible de conditionner les graphiques afin que les

résultats obtenus ne portent que sur la population

sélectionnée. Des « gating » successifs peuvent être

réalisés. [23] (diapositive : 39). Voici un exemple de

gating, tiré de l’une des analyses que nous avons effectuée

pour ce TD.

Figure n°34 : répartition des différents types leucocytaires sur un

histogramme biparamétrique SS / CD45

Figure n°35 : le gating

GATING


)

30

Les histogrammes monoparamétriques Les histogrammes monoparamétriques donnent une information sur un seul paramètre. Sur l’axe des

abscisses se trouve l’intensité de la florescence (échelle logarithmique) et sur l’axe des ordonnées se

trouve le compte cellulaire. Chaque cellule analysée est ensuite répartie dans différents canaux. Les

histogrammes monoparamétriques donnent une

représentation de la population (est-elle fortement

positive, négative ?). [21] (diapositive : 29) et [23]

(diapositives : 42 à 44). L’image ci-contre est un

exemple d’histogramme monoparamétrique. Sur ce

dernier, on s’intéresse au CD43. Pour cela, on a utilisé

un α-CD43 couplé au fluorochrome FITC, 100% de la

population cellulaire testée est positive au CD43. Sur

l’image, le trait horizontal AW définit, la « zone

positive ». Cette dernière commence à l’endroit où

s’arrête la « zone négative », qui, comme expliqué au

point suivant, est fixée au début de l’analyse grâce au

contrôle isotypique.

Contrôle isotypique – contrôle négatif Le contrôle négatif, appelé contrôle isotypique, consiste à faire passer des cellules marquées uniquement

avec de l’α-CD45 dans l’appareil de CMF. Le tube de contrôle isotypique contient des anticorps de même

isotype que le tube analytique (ex : IgG1, IgG2a.), fluoromarqués, mais qui ne sont pas dirigés contre des

antigènes humains. Ils ne se fixent donc pas, mais une fluorescence est tout de même captée dans chaque

canal. On peut alors fixer le seuil de négativité pour chaque fluorochrome, correspondant au bruit de fond.

Lors des passages suivants, les cellules ne présentant pas une fluorescence supérieure au contrôle seront

considérées comme négatives. A l’inverse, si une cellule émet une fluorescence plus élevée, elle sera

considérée comme positive. [21] (diapositives : 11 à 12).

Figures n°37 et 38 : contrôle isotypique

Co

mp

te c

ellu

lair

e

Intensité de fluorescenceéchelle logarithmique

1 10 100 1000

Négatif Positif

Tube contrôle isotypique

Figure n°36 : exemple d’un histogramme monoparamétrique


)

31

Figure n°39 : échantillon positif I Figure n°40 : échantillon positif II

Les histogrammes biparamétriques Les histogrammes biparamétriques renseignent sur 2 paramètres. Sur l’axe des abscisses se trouve

l’intensité de fluorescence de l’un des 2 paramètres étudiés et sur l’axe des ordonnées, l’intensité de

fluorescence du second paramètre étudié. Ces histogrammes biparamétriques sont très utiles car ils

permettent d’analyser la co-expression de deux marqueurs. Un histogramme biparamétrique n’est en fait

que la « combinaison » de deux histogrammes monoparamétriques.

L’interprétation d’un histogramme biparamétrique se fait de la manière suivante : Les éléments se

trouvant dans le carré en bas à gauche sont négatifs pour les 2 paramètres testés. A l’inverse, les éléments

se trouvant dans le carré en haut à droite sont doublement positifs. Dans les carrés en haut à gauche et en

bas à droite, les éléments sont positifs pour l’un des deux paramètres uniquement. Par exemple, si l’on se

réfère à la « Figure n°41 : histogramme biparamétrique I » 94.8% des cellules testées sont positives

uniquement pour le CD19. [21] (diapositive : 15) et [23] (diapositives : 45 à 47).

Figure n°41 : histogramme biparamétrique I Figure n°42 : histogramme biparamétrique II

Mean Fluorescence Intensity (MFI) La MFI correspond à l’intensité moyenne de la fluorescence émise par un fluorochrome pour un anticorps

donné. L’idéal est d’obtenir une MFI élevée. Ces notions sont importantes pour la compréhension des

résultats.

Com

pte

cellu

laire

Intensité de fluorescenceéchelle logarithmique

1 10 100 1000

Négatif Positif

Tube analyse


)

32

3.3. PRINCIPE D’ACTION DES RÉACTIFS DE LYSE TESTÉS

NH4Cl Le NH4Cl (ou chlorure d’ammonium) est fréquemment utilisé pour obtenir une lyse des érythrocytes. Ces

derniers ont une membrane perméable au NH4Cl. Lorsque du NH4Cl entre à l’intérieur d’un globule

rouge, cela provoque un déséquilibre de la pression osmotique. C’est précisément ce déséquilibre qui est à

l’origine de la lyse de l’érythrocyte. [24].

Facslyse Pour la Facslyse, le fabricant donne peu d’indication quant au principe de la méthode utilisée. Il est juste

notifié que la lyse des érythrocytes intervient dans des conditions hypotoniques douces et que les

leucocytes sont préservés. [25] (cf. « Annexe 3 : FacsLyse » page : 65).

VersaLyse Le fabricant ne donne pas beaucoup d’indication. Il nous explique que le réactif VersaLyse contient une

amine cyclique (cf. « 9. Lexique » page : 60) qui, au contact avec une anhydrase carbonique (cf. « 9.

Lexique » page : 60) présente dans les érythrocytes, devient hautement lytique pour ce type de cellules.

[26] (cf. « Annexe 4 : VersaLyse » page : 71).

IOTest Le principe actif du réactif IOTest est le chlorure d’ammonium. IOTest agit donc de la même manière que

NH4Cl. [27] (cf. « Annexe 5 : IOTest » page : 74).

3.4. MÉTHODES

La première étape de notre TD a été de nous sensibiliser à la CMF. Durant la première semaine, M.

Quarroz nous a introduit les notions théoriques nécessaires à la réalisation et à la compréhension d’une

analyse en CMF. Une TAB nous a ensuite enseigné la pratique. Puis, nous avons pu réaliser nos analyses

de façon indépendante.

Vous trouverez les protocoles que nous avons « recréés » et adaptés à notre travail de diplôme à partir de

ceux du laboratoire (cf. « Annexe 6 : coloration Romanowsky » page : 76 et « Annexe 10 : préparation

pour la CMF » page : 82) et avec lesquels nous avons travaillé. En ce qui concerne la préparation

cellulaire, nous en avons établi 2 :

un premier avec la lyse des érythrocytes puis le marquage (LSW), qui correspond plus ou moins à

ce que fait le LCH.

un deuxième avec le marquage puis la lyse des érythrocytes (SLW).

Chaque échantillon a été traité selon les 2 méthodes. Nous avions 4 lyses à disposition, ce qui nous donne

finalement 8 manières différentes de traiter un échantillon. Voici un tableau explicatif :

Lyses NH4Cl Facslyse VersaLyse IOTest

Méthode LSW LSW/NH4Cl LSW/Facslyse LSW/VersaLyse LSW/IOTest

SLW SLW/NH4Cl SLW/Facslyse SLW/VersaLyse SLW/IOTest


)

33

Pour les 2 premiers essais, nous n’avions pas compté les cellules, puis, afin de standardiser nos méthodes

nous avons introduit ce comptage. En effet, selon les pratiques du LCH et selon les recommandations du

fabricant, il est important d’avoir une certaine concentration de leucocytes à marquer. Cette concentration

se situe entre 1 et 5 millions de cellules par ml. Cela correspond à la concentration idéale pour que le

marquage se fasse de façon optimale.

Les premières semaines de la réalisation de ce travail, tous les réactifs de lyse n’étaient pas encore à

disposition. Nous avons donc effectué une série d’analyses (appelée : TD essai 0, 1, 2, etc.) uniquement

avec les réactifs de lyse disponibles (NH4Cl et Facslyse). Lorsque les 2 derniers réactifs de lyse nous sont

parvenus, nous avons enfin pu traiter chaque échantillon avec les 4 réactifs de lyse. Nous les avons alors

appelés TD éch 1, 2, etc.

En ce qui concerne les cytospins, elles n’ont pas été réalisées systématiquement. Nous avons choisi de les

effectuer lorsque notre emploi du temps s’y prêtait le mieux.

Plusieurs facteurs expliquent le fait que nous n’ayons obtenus que peu de valeurs pour certains anticorps.

Nous étions dépendantes des échantillons que le laboratoire pouvait nous transmettre. Lorsque nous

travaillions sur des prélèvements de moelle osseuse, il était nécessaire qu’il y ait une infiltration

médullaire. Un facteur limitant était également la quantité de matériel. De plus, selon les indications

cliniques, les échantillons ont été marqués par différents panels d’anticorps. Au total, nous avons donc

obtenu un nombre important de données mais pour certains anticorps, nous n’avons que peu de résultats.

3.4.1. Protocole n°1 : préparation du matériel

Prêt à

l’emploi Préparation

NH4Cl

Facslyse Diluer 10X avec de l’eau désionisée. Stable un jour.

VersaLyse

IOTest Diluer 10X avec de l’eau désionisée. Stable un jour.

PBS – Albumine – Azide

RPMI – Azide – BSA (RAB)

RPMI

Leucostase


)

34

3.4.2. Protocole n°2 : Lysis Staining Washing (LSW) L

ys

e / L

av

ag

e

1. Pipeter 300 µl de moelle ou 500 µl de sang, si possible, dans 4 tubes de 10 ml

2. Ajouter l’agent de lyse ad 10 ml (NH4Cl, Facslyse et IOTest). Attention : pour VersaLyse

ajouter 1ml de solution pour 100 µl de matériel. Mélanger

3. Incuber 30’ à 4°C à l’abri de la lumière (mélanger pendant l’incubation)

4. Centrifuger 3’ à 900 g

5. Vider le surnageant. Détacher le culot

6. Resuspendre dans 10 ml de RPMI. Mélanger



9. Resuspendre dans 1 ml de RPMI-AZIDE-BSA (RAB). Mélanger

Co

mp

tag

e

10. Mettre en chambre 10 – 15 μl

11. Laisser sédimenter 1’

12. Compter (la méthode de comptage est décrite à l’ « Annexe 11 : comptage » (page : 86)).

13. Si nécessaire, diluer avec du RPMI-AZIDE-BSA (RAB) ou concentrer (Objectif : 1 à 5

millions de cellules par ml)

Ma

rqu

ag

e

14. Préparer et identifier les tubes de marquage

15. Programmer le panel d’anticorps fluoromarqués choisi sur le Biomek

16. Ajouter 100 µl de suspension cellulaire dans les tubes de marquage (pipeter au fond du tube,

ne pas toucher les bords). Mélanger

17. Incuber 15’ à 4°C à l’abri de la lumière

Lavag

e

18. Ajouter 3 ml de PBS – Albumine – Azide. Vortexer



21. Resuspendre dans 1 ml de PBS – Albumine – Azide. Vortexer


)

35

3.4.3. Protocole n°3 : Staining Lysis Washing (SLW) P

ré-l

ava

ge

1. Pipeter 300 µl de moelle ou 500µl de sang, si possible, dans un tube de 10 ml

2. Ajouter du RPMI ad 10 ml



5. Resuspendre dans 1 ml de RPMI-AZIDE-BSA (RAB). Mélanger

Co

mp

tag

e

6. Pipeter 45 μl de Leucostase

7. Ajouter 5 μl de suspension cellulaire

8. Incuber 5’ à TA (lyse des érythrocytes)

9. Mettre en chambre 10 – 15 µl

10. Laisser sédimenter 1’

11. Compter (la méthode de comptage est décrite à l’ « Annexe 11 : comptage » (page : 86))

12. Si nécessaire, diluer avec du RPMI-AZIDE-BSA (RAB) ou concentrer (Objectif : 1 à 5 millions

de cellules par ml)

Ma

rqu

ag

e

13. Préparer et identifier les tubes de marquage

14. Programmer le panel d’anticorps fluoromarqués choisi sur le Biomek

15. Ajouter 100 µl de suspension cellulaire dans les tubes de marquage (pipeter au fond du tube, ne

pas toucher les bords)

16. Incuber 15’ à 4°C à l’abri de la lumière

Lyse

17. Ajouter environ 2.5 ml de solution de lyse (NH4Cl, Facslyse et IOTest). Attention : pour la

VersaLyse ajouter 1ml. Vortexer

18. Incuber 30’ à 4°C à l’abri de la lumière (vortexer pendant l’incubation)

Lavag

e








)

36

3.4.4. Protocole n°4 : cytospin

Une cytospin s’effectue toujours avant l’étape de marquage mais après l’étape de la lyse des érythrocytes,

car on ne s’intéresse qu’aux leucocytes. Elles ont donc été effectuées uniquement à partir de la méthode

LSW, et sur un nombre restreint d’échantillons. S’il fallait introduire ces cytospins dans un protocole de

type SLW, un tube parallèle ne contenant aucun anticorps devrait être ajouté et la cytospin se ferait à

partir de ce dernier.

1. Préparer la cytocentrifugeuse.

2. Préparer une dilution à partir des suspensions cellulaires obtenues au point 9 du protocole LSW

selon le tableau ci-dessous :

Concentration cellulaire

(millions/ml)

Volume (µl) de la suspension

cellulaire

Volume (µl) de

PBS-Albumine-Azide 1 200 1000

2 100 1000

3 70 1000

4 50 1000

5 40 1000

3. Déposer 200 µl de cette dilution dans les réservoirs de la cytospin.

Effectuer 2 lames par échantillon.

4. Centrifuger (5’ à 500 RPM).

3.4.5. Protocole n°5 : coloration “Romanowsky” pour cytospin

Bac 1 Bac 2 Bac 3

Préparation Méthanol absolu 150 ml

Préparation Giemsa Fluka filtré 70 ml

Méthanol absolu 80 ml

Préparation Giemsa Fluka filtré 25 ml

Tampon Weise 130 ml

Conservation 1 semaine à T° ambiante

Conservation 1 semaine à T° ambiante

Conservation 1 jour T° ambiante

Temps de coloration

3 minutes

Passer dans le bac 2 sans rincer

Temps de coloration

5 minutes

Rincer abondamment à l’eau

courante et passer dans le bac 3

Temps de coloration

20 minutes

Rincer abondamment à l’eau

courante – sécher – monter sous

Eukitt

[28]

Vous trouverez à l’« Annexe 12 : liste des échantillons traités » (page : 87), un tableau contenant tous les

échantillons que nous avons traités et de quelles façons ils ont été traités. A l’« Annexe 13 : détails des

panels utilisés » (page : 92), vous trouverez un détail de chaque panel d’anticorps utilisés.


)

37

4. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS

La première étape du traitement des résultats a été d’affiner nos « gatings », puis de reporter les données

fournies par le logiciel Kaluza dans un tableau (% de cellules ciblées (= « gated ») et MFI des différents

anticorps fluoromarqués). Vous trouverez à l’« Annexe 14 : résultats bruts » (page : 93) ce tableau et à

l’« Annexe 15 : exemples Kaluza » (page : 99) les documents Kaluza.

Nous avons décidé de prendre les données de nos échantillons nommés « TD éch… » car ces échantillons

ont tous été traités selon les 8 protocoles. Néanmoins, nous avons aussi pu utiliser les données des « TD

essai 0, 2, 4, 5, 6, 8, 11 et 12 » car ils provenaient de patient atteint de myélome et pour ce point, nous

n’avions besoin que des échantillons traités avec NH4Cl de la façon SLW et LSW.

Puis, vu le nombre assez élevé de données, il a ensuite fallu choisir lesquelles nous voulions exploiter et

de quelle façon nous allions les exploiter (type de graphique, quelles données dans quels graphiques, etc.).

Les analyser toutes n’aurait pas été possible et M. Quarroz a fait un choix arbitraire des anticorps à

analyser.

4.1. RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES DIFFÉRENTES MÉTHODES

Voici une représentation graphique des résultats obtenus. Nous avons effectués ces graphiques sur un

nombre limité d’anticorps. Sur l’axe des abscisses se trouve le numéro des échantillons et sur l’axe de

l’ordonnée, les MFI obtenues pour les différents anticorps fluoromarqués. Voici un exemple de

graphique :

Anticorps fluoromarqué

Pour des questions de lisibilité, les données utilisées pour la réalisation de ces graphiques se trouvent à

l’« Annexe 16 : données des graphiques de comparaison des MFI » (page : 109).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5

MFI

Echantillons

Réactif de lyse utilisé

LSW

SLW


)

38

α-CD2 APC α-CD3 A750

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5

NH4Cl

LSW

SLW

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

NH4Cl

LSW

SLW

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5

Facslyse

LSW

SLW

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

Facslyse

LSW

SLW

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5

VersaLyse

LSW

SLW

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

VersaLyse

LSW

SLW

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5

IOTest

LSW

SLW

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

IOTest

LSW

SLW


)

39

α-CD4 PE α-CD8 PB

55 65 75 85 95

105 115 125

0 1 2 3 4 5

NH4Cl

LSW

SLW

15 20 25 30 35 40 45 50 55

0 1 2 3

NH4Cl

LSW

SLW

55 65 75 85 95

105 115 125

0 1 2 3 4 5

Facslyse

LSW

SLW

15 20 25 30 35 40 45 50 55

0 1 2 3

Facslyse

LSW

SLW

55 65 75 85 95

105 115 125

0 1 2 3 4 5

VersaLyse

LSW

SLW

15 20 25 30 35 40 45 50 55

0 1 2 3

VersaLyse

LSW

SLW

55 65 75 85 95

105 115 125

0 1 2 3 4 5

IOTest

LSW

SLW

15 20 25 30 35 40 45 50 55

0 1 2 3

IOTest

LSW

SLW


)

40

α-CD13 FITC α-CD19 A700

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3

NH4Cl

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120

0 1 2 3

NH4Cl

LSW

SLW

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3

Facslyse

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120

0 1 2 3

Facslyse

LSW

SLW

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3

VersaLyse

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120

0 1 2 3

VersaLyse

LSW

SLW

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 1 2 3

IOTest

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120

0 1 2 3

IOTest

LSW

SLW


)

41

α-CD19 PC5.5 α-CD45 KO

0

20

40

60

80

100

0 1 2

NH4Cl

LSW

SLW

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

NH4Cl

lsw

slw

0

20

40

60

80

100

0 1 2

Facslyse

LSW

SLW

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Facslyse

lsw

slw

0

20

40

60

80

100

0 1 2

Versalyse

LSW

SLW

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

VersaLyse

lsw

slw

0

20

40

60

80

100

0 1 2

IOTest

LSW

SLW

0

10

20

30

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

IOTest

lsw

slw


)

42

α-CD56 PC5.5 α-HLADR ECD

6 8

10 12 14 16 18 20

0 1 2 3 4

NH4Cl

LSW

SLW

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1 2 3 4 5

NH4Cl

LSW

SLW

6 8

10 12 14 16 18 20

0 1 2 3 4

Facslyse

LSW

SLW

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1 2 3 4 5

Facslyse

LSW

SLW

6 8

10 12 14 16 18 20

0 1 2 3 4

VersaLyse

LSW

SLW

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1 2 3 4 5

VersaLyse

LSW

SLW

6 8

10 12 14 16 18 20

0 1 2 3 4

IOTest

LSW

SLW

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 1 2 3 4 5

IOTest

LSW

SLW


)

43

α-HLADR PC7

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

NH4Cl

LSW

SLW

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

Facslyse

LSW

SLW

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

VersaLyse

LSW

SLW

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3

IOTest

LSW

SLW


)

44

α-Kappa FITC α-Lambda PE

10 30 50 70 90

110 130 150 170 190 210

0 1 2 3

NH4Cl

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120 140 160 180

0 1 2 3

NH4Cl

LSW

SLW

10 30 50 70 90

110 130 150 170 190 210

0 1 2 3

Facslyse

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120 140 160 180

0 1 2 3

Facslyse

LSW

SLW

10 30 50 70 90

110 130 150 170 190 210

0 1 2 3

VersaLyse

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120 140 160 180

0 1 2 3

VersaLyse

LSW

SLW

10 30 50 70 90

110 130 150 170 190 210

0 1 2 3

IOTest

LSW

SLW

0 20 40 60 80

100 120 140 160 180

0 1 2 3

IOTest

LSW

SLW


)

45

4.2. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE LA COMPARAISON DES MFI DES

DIFFÉRENTES MÉTHODES

L’ensemble des résultats présentés montre une certaine cohérence. Les 11 anticorps étudiés permettent de

tirer des conclusions relativement similaires. On peut donc supposer que les résultats ne sont dépendants

ni du type d’anticorps, ni du type de fluorochrome utilisé.

On constate ensuite que la FacsLyse est la moins constante des 4 réactifs de lyses testés. Les résultats de

la Facslyse sont à plusieurs reprises très différents en fonction de la méthode (LSW ou SLW) utilisée. Il

serait intéressant de comprendre pourquoi la méthode utilisée a une telle influence sur les résultats

obtenus. Nous ne l’avons pas fait car cela n’était pas vraiment le but de notre TD mais il pourrait s’agir là

d’une suite à donner à notre travail. Quoiqu’il en soit, d’après ces résultats, il n’est pas possible

d’introduire la FacsLyse au laboratoire, nous avons donc décidé d’éliminer ce réactif de lyse de la suite de

nos résultats. A l’exception de l’étude morphologique, ce réactif de lyse ne figurera plus dans les analyses

suivantes.

En ce qui concerne les 3 autres réactifs de lyse, les résultats obtenus sont de qualité acceptable. A

quelques exceptions près, les valeurs de MFI obtenues diffèrent peu en fonction de la méthode utilisée

(LSW ou SLW). Là encore, il serait intéressant de déterminer pourquoi on observe des différences

largement supérieures à la moyenne dans quelques situations mais nous n’avons pas poussé nos

investigations aussi loin.

Sur la base des résultats obtenus, il est difficile de dégager une tendance et de déterminer quelle est la

meilleure méthode entre LSW et SLW. Pour ce point-là, les résultats sont assez hétérogènes et présentent

des différences entre patients même avec un anticorps et un fluorochrome identique. Comme la méthode

SLW ne semble pas présenter des MFI significativement meilleures, nous avons donc décidé de poursuive

l’étude de nos résultats uniquement avec la méthode LSW (méthode actuellement employée au LCH). Un

passage à la méthode SLW impliquerait non seulement une adaptation de la part du personnel du

laboratoire, mais c’est également une méthode nécessitant plus de temps. De plus, elle ne laisse pas la

possibilité de tester un nouveau marqueur sans avoir à recommencer la préparation cellulaire dès le début,

contrairement à la méthode LSW. Mis à part un léger avantage financier, car la méthode SLW nécessite

un plus petit volume de réactif de lyse, il n’y a pas d’argument pour que le laboratoire change sa méthode.

Les kappa/lambda font l’objet d’une analyse spécifique. Il était important de tester ces deux anticorps car

le cas des chaînes légères kappa et lambda est un peu particulier. En effet, ces dernières peuvent se

trouver à la fois à la surface cellulaire et être secrétées dans le plasma sous forme « libre ». C’est donc une

analyse pour laquelle les lavages jouent un rôle prépondérant. Si les lavages ne permettent pas d’éliminer

toutes les chaînes légères libres, il y a, lors de l’ajout des anticorps, un phénomène de compétition entre

les chaînes légères cellulaires et les chaînes légères libres. On risque alors d’obtenir un résultat

faussement abaissé voire négatif.

Si on s’intéresse maintenant à nos résultats, on constate de grandes différences entre la méthode LSW et

SLW. C’est particulièrement frappant pour les antigènes lambda où force est de constater que la méthode

SLW donne toujours des résultats inférieurs à la méthode LSW. La méthode LSW nécessitant plus de


)

46

lavages que la méthode SLW, nous avons donc supposé que les résultats obtenus avec la méthode SLW

n’étaient pas représentatifs de la réalité. Ce phénomène constitue un argument de choix pour nous

conforter dans l’idée de ne pas remplacer la méthode LSW par la méthode SLW. En effet, un résultat

faussement diminué pourrait avoir de lourdes conséquences pour le patient.


)

47

4.3. RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE

Voici des exemples de morphologie cellulaire obtenue avec les différents agents de lyse suite aux

cytospins effectuées.

NH

4C

l

Fac

sLyse

Ver

saL

yse

IOT

est


)

48

4.4. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE MORPHOLOGIQUE

L’analyse morphologique montre que la méthode FacsLyse altère considérablement les leucocytes. Cette

constatation nous conforte dans l’idée que la Facslyse n’est pas adaptée pour la routine du laboratoire des

moelles. Les trois autres réactifs de lyse montrent toutes des images interprétables et de qualité identique

permettant une étude morphologique.

4.5. RÉSULTATS STATISTIQUES

Afin d’affiner quelque peu notre étude, nous avons décidé d’analyser les résultats obtenus avec les

méthodes LSW NH4CL, VersaLyse et IOTest sur un plan plus statistique. Le but de ce TD étant d’évaluer

si un des réactifs de lyse testés pourrait potentiellement remplacer la méthode actuelle, nous avons

comparé la méthode actuelle versus les réactifs de lyse commerciaux et non les réactifs de lyse

commerciaux entre-eux. Ces résultats sont basés sur des petites séries de données, ils sont toutefois

suffisants pour établir une tendance mais ne constituent en aucun cas une étude statistique poussée. Tout

d’abord, voici les graphiques de corrélation obtenus pour l’α-CD45. Nous avons réalisés ces graphiques

uniquement avec l’α-CD45 KO car c’est le seul anticorps pour lequel nous avions une valeur de MFI pour

tous les échantillons. A l’« Annexe 17 : données utilisées pour les corrélations » (page : 121), vous

trouverez les tableaux des données utilisées pour faire ces graphiques.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15 20 25 30 35 40

MFI

α-C

D4

5 K

O V

ers

aLys

e

MFI α-CD45 KO NH4Cl

MFI α-CD45 KO NH4CL/VersaLyse

NH4CL/VersaLyse

Linéaire (NH4CL/VersaLyse)

r : 0.972

Droite idéale


)

49

Voici ensuite un tableau récapitulatif des coefficients de corrélation obtenus.

α- CD2

APC

CD3

A750

CD4

PE

CD8

PB

CD13

FITC

CD19

A700

CD56

PC5.5

HLADR

ECD

HLADR

PC 7

NH4Cl / VersaLyse 0.973 0.850 0.983 0.987 0.931 0.997 0.999 0.957 0.949

NH4Cl / IOTest 0.987 0.943 0.939 0.986 0.999 0.999 0.898 0.989 0.933

A noter que nous avons calculé les coefficients de corrélation uniquement pour les anticorps pour lesquels

nous avions au minimum 3 valeurs.

4.6. DISCUSSION DES RÉSULTATS STATISTIQUES

Les 2 graphiques présentés ci-dessus montrent une bonne corrélation entre VersaLyse, IOTest et NH4Cl.

VersaLyse semble montrer des résultats légèrement meilleurs, mais au vu du faible nombre de données à

disposition, il est difficile de l’affirmer. Quant aux coefficients de corrélation, ils ne permettent pas non

plus de dégager une tendance claire. VersaLyse et IOTest montrent, chacune à leur tour, de meilleurs

résultats. Ces résultats ne présentent donc pas d’arguments incitant à remplacer NH4Cl par VersaLyse ou

IOTest.

4.7. RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER

Les coûts ont été calculés pour le protocole LSW. Bien qu’il soit clair que la FacsLyse ne puisse pas

remplacer la lyse actuellement utilisée, elle y figure tout de même à titre informatif.

Lyse utilisée Prix de vente

(Fr.-) Contenu (ml)

Quantité (ml)

nécessaire pour

une analyse

Prix approximatif

de la lyse par

analyse (Fr.-)

NH4Cl 15 1000 10 0.15

VersaLyse 304 100 ~ 3 à 5 ~ 9 à 15

IOTest 183 20 1 9

Facslyse 303 100 1 3

r : 0.969

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15 20 25 30 35 40

MFI

α-C

D4

5 K

O I

OTe

st

MFI α-CD45 KO NH4Cl

MFI α-CD45 KO NH4CL/IOTest

NH4Cl/IOTest

Linéaire (NH4Cl/IOTest)

Droite idéale


)

50

4.8. DISCUSSION DES RÉSULTATS DE L’ANALYSE DE L’ASPECT FINANCIER

Les 4 réactifs de lyse testés s’étalent sur une gamme de prix relativement large (passant du simple à un

prix 200 fois supérieur). NH4Cl est l’agent de lyse le moins cher, ce qui nous conforte dans l’idée de

garder cette lyse pour l’analyse des échantillons de routine. Quoiqu’il en soit, aucun des autres réactifs de

lyse testés ne présente un intérêt financier pour le laboratoire.

4.9. RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE

Pour l’analyse des myélomes, le but n’est pas de comparer les MFI mais les pourcentages de cellules que

nous considérons comme plasmocytes. Une première sélection est effectuée sur l’histogramme

biparamétrique α-CD38 FITC/ α-CD45 KO, puis un deuxième sur l’histogramme biparamétrique α-CD38

FITC/ α-CD138 PE ciblé sur la première sélection de cellules. (cf. « Annexe 15 : exemples Kaluza »

page : 107).

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

% c

iblé

Echantillons

% ciblé sur α-CD38 FITC/α-CD45 KO

LSW NH4Cl

SLW NH4Cl


)

51

4.10. DISCUSSION DES RÉSULTATS DU MYÉLOME MULTIPLE

Le premier graphique qui permet une première sélection des plasmocytes, montre des résultats proches

entre les 2 méthodes, exception faite de l’échantillon n°6. On constate cependant que les résultats obtenus

avec la méthode SLW ont tendance à être meilleurs.

Sur le deuxième graphique, permettant de confirmer que les cellules préalablement ciblées sont bien des

plasmocytes, on remarque clairement que les résultats obtenus avec la méthode SLW sont

systématiquement meilleurs ou équivalents à

ceux obtenus avec la méthode LSW.

Face à de tels résultats, nous nous sommes demandées si la méthode utilisée par le LCH n’altérait pas le

CD138. Dans ce cas, les pourcentages obtenus avec la méthode LSW seraient faussement diminués. Cette

théorie semble appuyée par le fait que de telles différences ne sont pas visibles sur le graphique « % ciblé

sur α-CD38 FITC/α-CD45 KO ».

5. CONCLUSIONS

5.1. CONCLUSIONS DE NOTRE TRAVAIL

Au terme de ce travail, après avoir testés 8 manières différentes de préparation d’un échantillon pour son

analyse sur l’appareil de CMF, nous pouvons tirer plusieurs conclusions.

Le constat général est que, parmi tous les protocoles étudiés, aucun ne semble se démarquer de celui

actuellement utilisé. En accord avec les résultats de notre travail, le laboratoire des moelles a donc décidé

de conserver le protocole actuel.

La préparation cellulaire idéale permettrait à la fois d’obtenir des MFI élevées, de conserver la

morphologie des leucocytes et de trouver des résultats de kappa/lambda corrects. Sur les 4 réactifs de lyse

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

% c

iblé

Echantillons

% ciblé sur α-CD38 FITC/α-CD138 PE

LSW NH4Cl

SLW NH4Cl


)

52

testés, un seul semble ne pas pouvoir répondre à l’ensemble de ces critères. Il s’agit de la Facslyse. Cette

dernière altère considérablement la morphologie leucocytaire. De plus, les résultats obtenus étaient

fréquemment variables en fonction de la méthode (LSW ou SLW) utilisée. Quant aux 3 autres réactifs de

lyse testés, ils ne présentaient pas de problèmes majeurs et des investigations plus poussées ont été

nécessaires. Ces dernières consistaient en une approche plus statistique et une évaluation financière. Elles

n’ont pas permis de mettre en évidence des arguments qui inciteraient à changer le réactif de lyse

actuellement utilisé (NH4Cl).

Quant à la méthode SLW, elle présente l’inconvénient de ne pas permettre une analyse fiable des

kappa/lambda. Cet élément écarte définitivement l’idée de remplacer LSW par SLW, bien que cette

dernière présenterait un avantage financier. Pour ce qui est des MFI, aucune des 2 méthodes ne s’est

démarquée. Comme nous l’avions déjà évoqué, la réalisation du protocole SLW est légèrement plus

longue que celle du protocole LSW et présente le désavantage de ne pas permettre de rajouts en cours

d’analyse. LSW semble donc plus adapté au travail d’un laboratoire de diagnostic.

En ce qui concerne les MM, nous voyons 2 manières d’envisager la suite. La première consisterait à

adopter la méthode SLW pour les patients atteints de myélome. Dans ce cas, une adaptation de la part du

laboratoire serait nécessaire. Cette solution générerait, entre autre, une plus grande masse de travail pour

les TAB du laboratoire des moelles car, comme nous l’avons expliqué au point « 3.4.4. Protocole n°4 :

cytospin » (page : 36), un tube supplémentaire serait nécessaire pour l’obtention d’une image

morphologique interprétable. De plus, le laboratoire a effectué, ces dernières années, tout un travail

d’uniformisation des méthodes. (cf. « 1.2. Intérêt de ce sujet » page : 5). La seconde solution consisterait

à conserver le protocole actuellement utilisé, mais à cibler le graphique α-CD19 A700/α-CD56 PC5.5 à

partir du premier graphique (α-CD38 FITC/α-CD45 KO), en partant du principe que la population ciblée

sur le graphique α-CD38 FITC/α-CD45 KO est bien constituée de plasmocytes. L’intensité de l’ α-CD138

PE serait, semble-t-il, altérée lors de la préparation cellulaire, si bien qu’une partie de la population

plasmocytaire se retrouve dans la zone négative de l’histogramme α-CD38 FITC/α-CD138 PE.

L’histogramme α-CD19 A700/α-CD56 PC5.5 étant normalement ciblé à partir de l’histogramme α-CD38

FITC/α-CD138 PE, cette solution permettrait ainsi de ne pas perdre les éventuels plasmocytes se trouvant

dans la zone négative de l’histogramme CD38 FITC/CD138 PE. L’histogramme CD19 A700/CD56

PC5.5 est important car les plasmocytes malins n’expriment généralement plus le CD19. Pour une

meilleure compréhension, se référer à l’ « Annexe 15 : exemples Kaluza » (page : 107).

5.2. SUITES POSSIBLES À NOTRE TRAVAIL

Au terme de notre travail de diplôme, diverses perspectives sont envisageables. La première serait de

traiter encore quelques échantillons afin d’obtenir de grandes séries de données et de pouvoir tirer des

conclusions statistiques claires et significatives. A l’inverse, certaines données ont peu ou pas été

exploitées. Il pourrait être intéressant d’analyser cette série de données, mais le nombre de pages et le

temps autorisé pour ce travail de diplôme ne nous l’ont pas permis.

Dans ce travail, nous nous sommes contentées de comparer les MFI obtenues et de tirer des conclusions à

partir de ces observations. Comme nous l’avons déjà évoqué, il serait très intéressant de comprendre

pourquoi il existe des différences entre certains résultats. Il faudrait approfondir nos observations en

cherchant à expliquer les mécanismes qui expliquent les différences observées. Nous pensons notamment


)

53

à éclaircir pourquoi la méthode SLW permet de mettre en évidence plus de plasmocytes que la méthode

LSW. Évidemment, nous avons émis quelques hypothèses : fragilité de l’antigène, plasmocytes détruits

durant l’étape de lyse, etc. Le but pourrait être maintenant de donner une réponse claire à ces diverses

questions.

5.3. CONCLUSIONS PERSONNELLES

Comme conclusion personnelle, nous souhaiterions dire que nous avons eu beaucoup de plaisir à réaliser

ce TD. Le sujet proposé était particulièrement intéressant et ce travail nous a permis de découvrir la CMF.

Nous avons notamment apprécié le fait de pouvoir travailler à deux. Nous nous sommes rendues compte

combien il était agréable de pouvoir gérer ensemble la partie analytique et la rédaction d’un tel travail. Ce

travail nous a également permis de percevoir la difficulté, pour un laboratoire, de mettre au point une

nouvelle méthode.

Nous avons rencontré quelques problèmes au moment de débuter notre TD, notamment à cause de réactifs

de lyse qui ont mis beaucoup de temps à nous parvenir. De plus, il n’a pas été facile de penser à tous les

paramètres dès le départ et nous avons certainement perdu un peu de temps inutilement. Nous avions 8

manières différentes de traiter un seul échantillon, il nous a donc fallu un peu de temps pour pouvoir

conjuguer la réalisation de ces différents protocoles de manière optimale.

Ce travail a nécessité une grande collaboration avec l’équipe du laboratoire des moelles. D’une part parce

que les échantillons utilisés provenaient de leur routine et d’autre part parce que nous utilisions les mêmes

appareils qu’eux. Nous avons donc dû apprendre à gérer notre temps en fonction de leur planning.

Quant à la rédaction de ce travail, nous avons trouvé que le plus difficile était de sélectionner les

informations pertinentes et indispensables à la compréhension. Comme nous étions 2 à rédiger, nous

avons dû faire attention à ne pas nous répéter. Au vu du nombre de données obtenues, du temps et du

nombre de pages à disposition, nous avons également mis beaucoup de temps à décider de la manière de

traiter nos résultats.

Mais aujourd’hui, nous en sommes convaincues, ce TD nous a beaucoup apporté et les éléments appris

nous seront utiles dans le cadre de notre future vie professionnelle au sein des laboratoires.


)

54

6. REMERCIEMENTS

Nous tenions à remercier chaleureusement tout le personnel du laboratoire central d’hématologie du

CHUV pour leur aide et leur soutien lors de la réalisation de notre TD.

Un grand merci à l’équipe du laboratoire des moelles. Nous avons apprécié l’intérêt qu’ils ont porté à

notre travail, leur disponibilité et tous leurs précieux conseils. Cela a été un plaisir de travailler quelques

semaines à leurs côtés. Nous tenions à remercier particulièrement M. Valentin Carfagno pour ses

corrections, son aide et les conseils donnés pour la mise en page de ce document.

Nous remercions aussi Mme Gnaegi de la firme Beckman Coulter qui nous a fourni gratuitement une

partie des réactifs de lyse utilisés pour notre travail de diplôme.

Nous aimerions également remercier M. Frédéric Bauer pour avoir consacré du temps à la relecture de

notre travail. Ses suggestions étaient toujours pertinentes.

Un merci tout particulier à M. Stéphane Quarroz qui nous a soutenues et s’est beaucoup impliqué tout au

long de ce travail de diplôme. Il a fait preuve d’une grande gentillesse et d’une patience remarquable.


)

55

7. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] CHUV. (09.01.2013). Hématologie Service et Laboratoire : Service (HEM) et Laboratoire central

d'hématologie (LCH) [Page Web]. Accès: http://www.hematologie.chuv.ch/. (Page consultée le

06.11.2013)

[2] CHUV. (23.10.2013). CHUV Départements des laboratoires. [Page Web]. Accès:

http://www.chuv.ch/dml (Page consultée le 06 11 2013)

Chemin : Service d'hématologie (LCH) → Domaines d'activités

[3] Cours de Quarroz, S. (05.2013). La cytométrie : Mode opératoire. Lausanne CHUV

[4] Ronot, X. Grunwald, D. Mayol, J-F et Boutonnat, J. (2006). La cytométrie en flux. Paris: Editions

TEC & DOC

[5] Kalina, T. Flores-Montero, J. van der Velden, V. Martin-Ayuso, M. Böttcher, S. Ritgen, M. Almeida,

J. Lhermitte, L. Asnafi, V. Mendoça, A. de Tute, R. Cullen, M. Sedek, L. Vidriales, M. Pérez, L. te

Marvelde, J. Mejstrikova, E. Hrusak, O. Szczepanski, T. van Dongon, J. et Orfao, A. (09.2012)

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immunophentyping protocols : Full text

[6] Leach,M. Drummond, M. et Doig, A. (2013). Practical Flow Cytometry in Haemotology Diagnosis.

Singapour: WILEY-BLACKWELL

[7] Cours de Spertini, O. (19.09.2013) Leucémies aiguës. Lausanne:CHUV

[8] L'Italien, R.et Lord Dubé, H. (1998). Hématologie. (2ème édition) Québec: Les éditions Le Griffon

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[9] Swerdlow, S.H. Campo, E. Lee Harris, N. Jaffe, E. S. Pileri, S. A. Stein, H. Thiele, J. et Vardiman, J.

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[10] Gérard, S. (1998). Hématologie clinique et biologique. France: Arnette

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[12] Laboratoire Central d'Hématologie. (14.11.2012). Marqueurs immunologiques - Principes, Matériel

et Réactifs (Version 7.0) (Vdoc: LCH HSP PR 023). Lausanne: CHUV

[13] Laboratoire Central d'Hématologie. (10.06.2013). Marqueurs immunologiques - Préparations

cellulaires (Version 6.0) (Vdoc: LCH HSP 32 PR 018). Lausanne:CHUV

[14] Laboratoire Central d'Hématologie. (13.03.2013) Stabilité et conservation des échantillons avant

analyse (Version: 3.0) ( Vdoc: LCH LCH 31 FO 002) Lausanne: CHUV

[15] Cours de Bystranowski, G. (2011). Immunologie: FPA 2ème année. Lausanne: ESsanté

[16] Cours de Quarroz, S. (2013). Cytométrie de flux : Rappels Immunologiques. Lausanne: CHUV.

[17] Cours de Quarroz, S. (2013). Cours cytémétrie de flux. Lausanne: CHUV


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56

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https://www.ipmc.cnrs.fr/fichiers/recherche/microscopie/FP_Cytometrie/Intro_Generalites.pdf.

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[19] C. Duperray, Bienvenue sur CYTOBASE - Service de cytométrie en flux de l'Institut de Recherche en

Biothérapie. [Page Web]. Accès: http://cytobase.montp.inserm.fr/. (Page consultée le 19.11.2013).

Chemin: La cytométrie qu'est-ce que c'est → un document word

[20] C. Duperray, Bienvenue sur CYTOBASE - Service de cytométrie en flux de l'Institut de Recherche en

Biothérapie. [Page Web]. Accès: http://cytobase.montp.inserm.fr/. (Page consultée le 19.11.2013).

Chemin: La cytométrie qu'est-ce que c'est → une présentation Power Point

[21] Cours de Quarroz, S. (2013). Cytométrie de flux : Interprétation des histogrammes. Lausanne:

CHUV

[22] Ortolani, C. (2011). Flow Cytometry of Hematological Malignancies. Singapour: WILEY-

BLACKWELL

[23] Cours de Gregoretti, C. Cytométrie de flux. Lausanne: ESsanté.

[24] Phillips, W. Hosking, C. et Shelton, M. (07.1983). Journal of Clnical Pathology [Page Web]. Accès:

http://jcp.bmj.com/ (Page consultée le 07.01.2014)

Chemin: Archive 1983 July Effect of ammonuim chloride treatment on human

polymorphonuclear leucocyte iodination: [PDF]

[25] Becton Dickinson and Company. (01.2010). Solution de Lyse BD FACS Cencentré 10x San José:

BENEX Limited,

[26] Beckman Coulter.(05.09.2012). VersaLyse Lysing Solution France: IMMUNOTECH SAS

[27] Beckman Coulter. (2011). Lysing Solution IOTest 3 10x concentrate, France: IMMUNOTECH SAS

[28] Laboratoire Central d'Hématologie (14.11.2012). Romabowsky pour Cytospin (Version 2.1) (Vdoc

LCH HSP 32 PR 025 ) Lausanne: CHUV .

http://jcp.bmj.com/


)

57

8. ICONOGRAPHIE

Figure n°1 : Cours de Gregoretti, C. Leucocytes. (diapositive : 3) Lausanne : ESsanté

Figure n°2 : Swerdlow, S. H. Campo, E. Lee Harris, N. Jaffe, E. S. Pileri, S. A. Stein, H. Thiele J. et

Vardiman J. W. (2008). WHO Classification of tumours of Haematopoetic and Lymphoid Tissues (4th

Edition) (pages : 10 à 13). Lyon: International Agency for Research on Cancer

Figure n°3: Swerdlow, S. H. Campo, E. Lee Harris, N. Jaffe, E. S. Pileri, S. A. Stein, H. Thiele J. et

Vardiman J. W. (2008). WHO Classification of tumours of Haematopoetic and Lymphoid Tissues (4th

Edition) (page : 203). Lyon: International Agency for Research on Cancer

Figure n°4 : Cours de Rosselet, A. (05.09.2013). Lymphomes malins (1. (diapositive : 58). Lausanne :

ESsanté

Figure n°5 à n°11 : Photographies personnelles

Figure n°12 : Réalisée personnellement, inspirée du Cours de Quarroz S. (mai 2013) Cytométrie – Mode

opératoire (diapositive : 26). Lausanne : CHUV

Figure n°13 : Cours de Bystranowski G. (09.2011). Les molécules du système immunitaire. (diapositive :

9). Lausanne : ESsanté

Figure n°14 : ZeSchool-Le savoir c’est vous. (14.06.2012). ZeSchool- Le savoir c’est vous. [Page Web]

Accès : http://zeschool.com (Page consultée le 12.12.2013)

Chemin : SVT Immunologie Le système immunitaire

Figure n°15 : Cours de Quarroz S. (05.2013) Cytométrie – Mode opératoire (diapositive : 13).

Lausanne : CHUV


Lausanne : CHUV


Lausanne : CHUV

Figure n°18 : Ronot, X. Grunwald, D. Mayol, J.-F. and Boutonnat, J. (2006). La cytométrie en flux

(page : 48). Paris : Editions TEC & DOC.

Figure n°19 : Métézeau, P. Miglierina, R. & Ratinaud, M-H. (1994). La cytométrie en flux – Guide

pratique de la préparation à l’analyse des cellules. (page : 19). France : Edition PULIM Presses de

l’Université de Limoges.

http://bio-mol.eu/index.html


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58

Figure n°20 : Leach, M. Drummond, M. & Doig, A. (2013). Practical Flow Cytometry in Haematology

Diasgnosis (page : 4). India: Editions Wiley Blackwell


(page : 6). Paris : Editions TEC & DOC.


(page : 7). Paris : Éditions TEC & DOC.

Figure n°23 : Blin, M. (date introuvable). Imagif-La plateforme du vivant-expertise et technologies pour

l’étude du vivant. [Page Web] Accès : https://www.imagif.cnrs.fr (Page consultée le 12.12.2013)

Chemin : Pôle de Biologie Cellulaire : Plateforme de Cytométrie

Figure n°24 : Cours de S. Quarroz (05.2013). La cytométrie de flux (diapositive : 11). Lausanne : CHUV

Figure n°25 : Grégori, G. (22.10.2013). PRECYM : Plate-forme Régionale de Cytométrie pour la

Microbiologie [Page Web]. Accès : http://www.com.univ-mrs.fr/PRECYM/ (page consultée le

20.11.2013) (diapositive : 18)

Chemin : Formation & cours / training Diaporamas Introduction à la cytométrie en flux Principes

de la cytométrie en flux



20.11.2013) (diapositive : 19)





20.11.2013) (diapositive : 21)





20.11.2013) (diapositive : 27)



Figure n°29 : Métézeau, P. Miglierina, R. & Ratinaud, M-H. (1994). La cytométrie en flux – Guide

pratique de la préparation à l’analyse des cellules. (page : 28). France : Edition PULIM Presses de

l’Université de Limoges.

Figure n°30 : Image tirée des échantillons de la routine

http://bio-mol.eu/index.html


)

59

Figure n°31 : Cours de Quarroz, S. (05.2013). Interprétation des histogrammes. (diapositive : 23).

Lausanne : CHUV


Lausanne : CHUV

Figure n°33 : Institut de recherche en biothérapies du CHU de Montpellier, (date introuvable). Bienvenue

sur CYTOBASE, Service de cytométrie en flux de l’institut de recherche en biothérapie [Page Web].

Accès : http://cytobase.montp.inserm.fr/ (Page consultée le 19.11.2013)

Chemin : la cytométrie, qu’est-ce que c’est ? Un document word

Figure n°34 : histogramme tiré d’une de nos analyses et annoté par nos soins selon le Cours Quarroz, S.

(05.2013) Interprétation des histogrammes (diapositive : 29). Lausanne : CHUV

Figure n°35 : Image tirée des échantillons de la routine et retouchée par nos soins



Lausanne CHUV / Image tirée d’un échantillon de la routine



Lausanne : CHUV / Image tirée d’un échantillon de la routine

Figure n°40 à n°41 : Images tirées des échantillons de la routine


Lausanne : CHUV

http://cytobase.montp.inserm.fr/


)

60

9. LEXIQUE

α-…

anti-…

A700

Alexa Fluor 700.

A750

Alexa Fluor 750.

Allogénique

Provenant de la même espèce, mais pas du même individu.

Amine cyclique

Molécule organique contenant de l’azote et dérivée de l’ammoniac.

Anhydrase Carbonique

Enzyme qui permet la réaction suivante : H2O + CO2 ↔ H2CO3 ↔ HCO3- + H

+. Cette enzyme se trouve à

la surface des érythrocytes.

APC

AlloPhycoCyanine.

CD34

Antigène présent à la surface des cellules hématopoïétiques immatures (blastes).

Cryoglobuline

Immunoglobuline caractérisée par sa propriété de précipiter à froid (inférieur à 37°C) et non à chaud.

Cytospin

Appareil permettant, par cytocentrifugation, de concentrer les cellules sur une petite pastille d’une lame

porte-objet.

ECD

PhycoErythrin lié au Texas Red.

Électrophorèse des protéines

Technique de laboratoire permettant, grâce à un champ électrique, la séparation des protéines en 6

fractions distinctes : Albumine, alpha1 globuline, alpha2 globuline, bêta1 et bêta2 globulines et gamma

globuline.

FITC

Fluorescein IsoThyocyanate Conjuguée.

http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/8040-albumine-definition

http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/19321-globuline-definition

http://sante-medecine.commentcamarche.net/faq/19321-globuline-definition


)

61

Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)

Maladie hématologique causée par la mutation du gène PIG-A. Cette maladie cause une anémie

hémolytique corpusculaire.

Immunofixation

Technique de laboratoire utilisant le principe de la précipitation pour révéler une immunoglobuline

monoclonale. L’immunofixation permet la typisation d’une immunoglobuline monoclonale (classe

d’immunoglubulines et type de chaînes légères).

KO

Krome Orange.

Laser

Source lumineuse ayant pour caractéristique d’émettre une lumière unidirectionnelle et

monochromatique.

PB

Pacific Blue.

PC5.5

PhycoErythrin en liaison covalente cyanine 5.5.

PC7

PhycoErythrin en liaison covalente cyanine 7.

PE

PhycoErythrin.

Phénotypique

Le phénotype est l’expression du génotype.

Photons

Particule qui compose la lumière. La lumière peut se définir de 2 façons, soit par un ensemble de

longueurs d’onde, soit par des particules appelées photons.

Pink test

Test utilisé pour le dépistage de la sphérocytose héréditaire. La sphérocytose héréditaire est une anomalie

corpusculaire du globule rouge. Ce dernier prend une forme sphérique caractéristique, le rendant plus

fragile qu’un globule rouge normal.

Test de falciformation

Test utilisé pour le dépistage de la drépanocytose. La drépanocytose est une maladie héréditaire touchant

les globules rouges. Cette pathologie est due à une anomalie structurelle de la chaîne bêta de la globine.

Les érythrocytes prennent une forme caractéristique de faucille (=drépanocyte).


)

62

10. ANNEXES

ANNEXE 1 : TRAÇABILITÉ


)

63


)

64

ANNEXE 2 : SOLUTIONS DE TRAVAIL


)

65

ANNEXE 3 : FACSLYSE


)

66


)

67


)

68


)

69


)

70


)

71

ANNEXE 4 : VERSALYSE


)

72


)

73


)

74

ANNEXE 5 : IOTEST


)

75


)

76

ANNEXE 6 : COLORATION ROMANOWSKY


)

77


)

78


)

79

ANNEXE 7 : GIEMSA


)

80

ANNEXE 8 : LA FABRICATION DES ANTICORPS

Les anticorps utilisés en CMF sont des anticorps monoclonaux achetés sur le marché et produits par des

firmes.

La première étape consiste à immuniser une souris avec l’antigène contre lequel un anticorps doit être

produit. Parallèlement, une culture de cellules cancéreuses est effectuée. Quelques temps après

l’immunisation, la rate de la souris est prélevée. Ce sont plus précisément les lymphocytes B qu’elle

contient qui sont importants. Les lymphocytes B de la souris et les cellules cancéreuses sont ensuite

incubées ensemble afin qu’il y ait une fusion. Le but étant de fabriquer des hybridomes. Puis, une culture

est effectuée dans une plaque multi puits.

Il est fait en sorte qu’une seule cellule

soit inoculée par puits dans un milieu

spécial (= sélection par dilution limite).

Le milieu de culture est un milieu HAT

(milieu de culture sélectif spécifique

pour la fabrication des anticorps). Les

lymphocytes B meurent dans ce milieu,

car ils n’ont pas la capacité de se

reproduire indéfiniment. Les cellules

cancéreuses meurent également. Elles

n’ont pas la capacité de survivre dans ce

milieu HAT car leur gène HGPRT n’est

pas fonctionnel. Seuls les hybridomes

peuvent survivre et se multiplier. Ils

survivent, car ils ont gardé la

fonctionnalité du gène HGPRT

provenant du lymphocyte B, et se

multiplient, car ils ont gardé cette

capacité provenant de la cellule

cancéreuse. Une dizaine de jours plus

tard, on recherche la présence

d’anticorps dirigés contre l’antigène

avec lequel la souris a été immunisée.

Les hybridomes peuvent être conservés

dans de l’azote liquide.

Source : ESsanté. (2011). METHODOLOGIE : CFC Laborantins orientation biologie (page : 7)

Figure : La fabrication des anticorps monoclonaux.

Source : Cours de Quarroz S. (mai 2013) Cytométrie de flux : Rappels immunologiques.

Lausanne : CHUV. (Diapositive : 16)

Ag inoculé à une souris

Prélèvement de la rate

Suspension de lympho B

plasmocytesmutants provenantde myélome

culture

Suspension deplasmocytes malins

Fusion des 2 typescellulaires= formation d'hybridome

Transfert descellules en milieudéficient (HAT)

Les hybridomes vontse multiplier - mortdes autres cellules

Culture à grande échelledes hybridomes quiproduisent l'ac recherché

PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX


)

81

ANNEXE 9 : FLUOROCHROMES

Voici un exemple de quelques fluorochromes avec leur longueur d’onde d’excitation et d’émission ainsi

que le laser utilisé pour les exciter.

Figure : exemple de fluorochromes.

Source : Cours de Quarroz S. (mai 2013). Cytométrie de flux : Rappels immunologiques. Lausanne : CHUV. (Diapositive : 20)


)

82

ANNEXE 10 : PRÉPARATION POUR LA CMF


)

83


)

84


)

85


)

86

ANNEXE 11 : COMPTAGE

Conformément au protocole du LCH, lors de l’étape de marquage, la concentration cellulaire des

suspensions doit idéalement se situer entre 1 et 5 millions de cellules par ml.

La concentration des suspensions cellulaires est évaluée à l’aide de diverses chambres de comptage. En

exemple, voici une représentation d’une chambre de Türk.

Figure : chambre de comptage

Source : image réalisée personnellement

On compte les leucocytes se trouvant dans les parties grisées du schéma ci-dessus et on multiplie ensuite

le résultat obtenu par 10'000 pour obtenir la concentration cellulaire en cellules/ml de l’échantillon. Voici

l’explication de ce calcul :

Surface de la chambre : 9.0 mm2

Profondeur de la chambre : 0.1 mm

Volume de la chambre 0.9 mm3

On compte les cellules dans un volume de 0.1 mm3 (1 mm x 1 mm x 0.1 mm). En multipliant ce résultat

par 10, on obtient donc le nombre de cellules par mm3 de l’échantillon (1 mm

3 = 1μl). Puis, en multipliant

encore ce résultat par 1000, on obtient le nombre de cellules/ml de l’échantillon (1000 μl = 1 ml). On

multiplie donc finalement le nombre de cellules comptées par 10'000. Le résultat doit encore être

multiplié par l’inverse de la dilution s’il a été nécessaire d’en effectuer une, notamment pour le protocole

SLW où les cellules ont été diluées 10x avec le réactif Leucostase.

Évidemment, il est possible d’adapter le volume dans lequel on compte les cellules en fonction de la

concentration cellulaire. Le calcul se trouve naturellement modifié.

Source : Marqueurs immunologiques - Préparations cellulaires LCH HSP 32 PR 018 version 6.0


)

87

ANNEXE 12 : LISTE DES ÉCHANTILLONS TRAITÉS

No

m

Da

te

Pré

lèv

emen

t

Qu

an

tité

uti

lisé

e (μ

l)

Pa

nel

Tu

bes

Mét

ho

de

Ly

se

Co

mp

tage

(mil

lio

ns

de

c/m

l)

Dil

uti

on

/

Co

nce

ntr

ati

on

TD essai 0 31.10.2013 Moelle 40 MM1 + MM2 SLW NH4Cl 1)

TD essai 1 04.11.2013 Sang

1 A + B + C + D SLW

NH4Cl

Facslyse

LSW NH4Cl

Facslyse

TD essai 2 05.11.2013 Moelle 300 40 MM1 + MM2 SLW

NH4Cl

Facslyse

LSW NH4Cl

Facslyse

TD essai 3 06.11.2013 Sang 500 3 A + F + M SLW

NH4Cl 5.2 -

Facslyse 4 -

LSW Facslyse 8.8 /2 1)

TD essai 4 08.11.2013 Moelle 300 40 MM2 SLW

NH4Cl 13.3 /3

Facslyse 11.4 /3

LSW Facslyse 8.8 /2


NH4Cl 1.1 -

Facslyse

LSW Facslyse 1.8 - 1)


NH4Cl 3.3 -

Facslyse

TD essai 7 12.11.2013 Moelle 300 11 A + G SLW

NH4Cl 2.5 -

Facslyse


TD essai 8 14.11.2013 Moelle 300 40 MM2

SLW

NH4Cl

0.9 x2

Facslyse

IOTest

600

LSW

NH4Cl 1.42 -

Facslyse 2.51 -

IOTest 2.36 -

TD essai 9 19.11.2013 Sang 500 11 A + G SLW

Facslyse 2.5 -

NH4Cl


TD essai 10 19.11.2013 Moelle 300 11 A + G SLW

Facslyse 21.4 /5

NH4Cl


)

88

LSW Facslyse 22 /5 1)


Facslyse 1.6 -

NH4Cl



Facslyse 6.3 oublié

NH4Cl

LSW Facslyse 6.08 /2 1)


Versalyse 3.5 -

NH4Cl

LSW Versalyse 5.38 - 1)

TD essai 14 22.11.2013 Sang 500 3 A + F SLW

Versalyse 0.9 x2

NH4Cl


TD essai 15 22.11.2013 Moelle 300 3 A + F SLW

Versalyse 27.1 /6

NH4Cl

LSW Versalyse 22.4 /5 1)

TD essai 16 22.11.2013 Sang 500 3 A + F SLW

Versalyse 4.2 -

NH4Cl

LSW Versalyse 6 /2 1)


Versalyse 2 -

NH4Cl


TD éch 1 26.11.2013 Moelle 300 40 MM2

SLW

NH4Cl

0.7 x3

2)

Facslyse

Versalyse

IOTest

LSW

NH4Cl 0.68 x2

Facslyse 0.41 x3

Versalyse 0.6 x3

IOTest 0.3 x3

TD éch 2 29.11.2013 Moelle 300 3 A + F

SLW

NH4Cl

11 /2.5

Facslyse

Versalyse

IOTest

LSW

NH4Cl 12.3 /3

Facslyse 8.9 /2

Versalyse 12.3 /3

IOTest 9.6 /2

TD éch 3 02.12.2013 ? 400 1 A + B

SLW

NH4Cl

5.5 -

Facslyse

Versalyse


)

89

IOTest

LSW

NH4Cl 8.8 /2

3) Facslyse 6.08 /2

Versalyse 5.28 -

IOTest 5.28 -

TD éch 4 03.12.2013 Sang 500 1 D

SLW

NH4Cl

0.5 x2

Facslyse

Versalyse

IOTest

LSW

NH4Cl 0.96 x2

3) Facslyse 1.47 x2

Versalyse 1.24 x2

IOTest 1.45 x2

TD éch 5 04.12.2013 Moelle 300 1 B

SLW

NH4Cl

1.5 x2

Facslyse

Versalyse

IOTest

LSW

NH4Cl 0.7 x2

Facslyse 0.91 x2

Versalyse 1.07 x2

IOTest 0.97 x2

TD éch 6 04.12.2013 Sang 100

0

1 B

SLW

NH4Cl

6 /2

Facslyse

Versalyse

IOTest

LSW

NH4Cl 7.36 /2

Facslyse 7.68 /2

Versalyse 8.8 /2

IOTest 7.2 /2

TD éch 7 05.12.2013 Sang 100

0

1 B

SLW

NH4Cl

0.6 x3

Facslyse

Versalyse

IOTest

LSW

NH4Cl 2.2 Resus-

pendu

dans

200 µl

Facslyse 2.64

Versalyse 3.4

Iotest 2.2

TD éch 8 06.12.2013 Sang 100

0

11 G

SLW

NH4Cl

0.9 x2

Facslyse

Versalyse

Iotest


)

90

LSW

NH4Cl 2.8 Resus-

pendu

dans

200 µl

Facslyse 2.4

Versalyse 3

Iotest 3.08

TD éch 9 09.12.2013 Moelle 300 3 F

SLW

NH4Cl

7.3

/2

(resus-

pendu

dans

400

µl)

Facslyse

Versalyse

Iotest

LSW

NH4Cl 2.2 -

Facslyse 3.6 -

Versalyse 3.72 -

Iotest 2.25 -

TD éch 10 09.12.2013 Sang 400 1 B

SLW

NH4Cl

0.8

(resus-

pendu

dans

400

µl)

Facslyse

Versalyse

Iotest

LSW

NH4Cl 2.48 (resus-

pendu

dans

150

µl)

Facslyse 1.8

Versalyse 1.64

Iotest 1.76

TD éch 11 11.12.2013 Moelle 300 40 MM2

SLW

NH4Cl

16.4 /4

Facslyse

Versalyse

Iotest

LSW

NH4Cl 16 /4

Facslyse 16 /4

Versalyse 11.2 /3

Iotest 11.2 /3

TD éch 12 11.12.2013 Sang 800 1 D

SLW

NH4Cl

10 /2

Facslyse

Versalyse

Iotest

LSW

NH4Cl 15.2 /3

Facslyse 13.6 /3

Versalyse 12.8 /3

Iotest 13.6 /3

TD éch13 12.12.2013 Moelle 300 3 F

SLW

NH4Cl

20.9 /5

Facslyse

Versalyse

Iotest


)

91

LSW

NH4Cl 4 -

Facslyse 4 -

Versalyse 4.8 -

Iotest 4.8 -

TD éch 14 12.12.2013 Sang 300 1 D

SLW

NH4Cl

8.4 /2

Facslyse

Versalyse

Iotest

LSW

NH4Cl 5 -

Facslyse 5 -

Versalyse 4.8 -

Iotest 4 -

TD éch 15 08.01.2014 Moelle 300 40 MM2 LSW NH4Cl 1.5 - 1)

TD éch 16 10.01.2014 Moelle 300 40 MM2 SLW NH4Cl 1.5 -

LSW NH4Cl 0.2 x4

1) L'échantillon LSW NH4Cl a été traité par les TAB du laboratoire des moelles

2) Appareil de CMF en panne, l'échantillon a été fixé. Il n'est pas pris en compte pour les résultats.

3) Une cytospin a été effectuée


)

92

ANNEXE 13 : DÉTAIL DES PANELS UTILISÉS


)

93

ANNEXE 14 : RÉSULTATS BRUTS


)

94


)

95


)

96


)

97


)

98


)

99

ANNEXE 15 : EXEMPLES KALUZA

Exemple Kaluza MFI α-CD2 APC, α-CD3 A750, α-CD4 PE, α-CD8 PB, α-CD45 KO, α-CD56

PC5.5, α-HLA DR ECD. Provient d’un tube B.

MFI


)

100


)

101


)

102

Exemple Kaluza MFI α-CD19 PC5.5, α-HLA DR PC7. Provient d’un tube F.


)

103


)

104

Exemple Kaluza MFI α-CD19 A700, α-kappa FITC, α-lambda PE. Provient d’un tube D.


)

105


)

106

Exemple Kaluza MFI α-CD13 FITC. Provient d’un tube F.

Attention, pour les α-CD13 FITC, le « gating » a dû être déplacé sur les neutrophiles afin d’obtenir des

valeurs positives.


)

107

Exemple Kaluza % de plasmocytes ciblés sur les histogrammes 38 FITC/45 KO et sur 38FITC/138

PE. (Myélome multiple).


)

108


)

109

ANNEXE 16 : DONNÉES DES GRAPHIQUES DE COMPARAISON DES MFI

MFI α-CD2 APC


)

110

MFI α-CD3 A750


)

111

MFI α-CD4 PE


)

112

MFI α-CD8 PB


)

113

MFI α-CD13 FITC


)

114

MFI α-CD19 A700


)

115

MFI α-CD19 PC5.5


)

116

MFI α-CD45 KO


)

117

MFI α-CD56 PC5.5


)

118

MFI α-HLA DR ECD


)

119

MFI α-kappa FITC


)

120

MFI α-lambda PE


)

121

ANNEXE 17 : DONNÉES UTILISÉES POUR LES CORRÉLATIONS

MFI α-CD2 APC

MFI α-CD3 A750

MFI α-CD4 PE


)

122

MFI α-CD8 PB

MFI α-CD13 FITC

MFI α-CD19 PC5.5


)

123

MFI α-CD45 KO

MFI α-CD56 PC5.5

MFI α-HLADR ECD


)

124

MFI α-HLADR PC7

Optimalisation de procédures analytiques en vue d'analyses en ...

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