NOUVELLES APPROCHES GENOTYPIQUES POUR LE...

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NOUVELLES APPROCHES GENOTYPIQUES POUR

LE MONITORING DE RESISTANCE DU VIH AUX

ARV DANS LES PAYS A RESSOURCES LIMITEES :

CAS DU TCHAD

Chatté Idékhim ADAWAYE

Matricule : s105285

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en

Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Soutenue publiquement le 1er décembre 2014

Jury :

Danièle SONDAG-THULL Université de Liège (Présidente)

Michel MOUTSCHEN Université de Liège (Promoteur)

Souad RAHMOUNI Université de Liège (Secrétaire)

Carole DEVAUX CRP-Santé de Luxembourg

Jacques PIETTE Université de Liège

Jean RUELLE Université Catholique de Louvain

Nathalie JACOBS Université de Liège

Patrick DE MOL Université de Liège

Année Académique 2014-2015

Université de Liège

Faculté de Médecine

Laboratoire de Référence Sida

i

Entre,

ce que je pense,

ce que je veux dire,

ce que je crois dire,

ce que je dis,

ce que vous avez envie d’entendre,

ce que vous croyez entendre,

ce que vous entendez,

ce que vous avez envie de comprendre,

ce que vous croyez comprendre,

ce que vous comprenez,

il y a dix possibilités qu’on ait des difficultés à communiquer.

Mais essayons quand même…

Bernard Werber: Encyclopédie du savoir relatif et absolu.

Table des matières

ii

Table des matières

Dédicaces ................................................................................................................................... v

Remerciements ........................................................................................................................ vi

Liste des sigles et abréviations ................................................................................................ ix

Liste des tableaux .................................................................................................................... xi

Liste des figures ...................................................................................................................... xii

Résumé ................................................................................................................................... xiii

CHAPITRE I - Introduction Générale .................................................................................. 1

I. Contexte et justification du sujet .......................................................................................... 1

II. Généralités sur le VIH et le Sida......................................................................................... 5

2.1 Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) .......................................................... 5

2.2 La diversité génétique des groupes et sous-types du VIH .............................................. 5

2.3 La situation du VIH/SIDA au Tchad .............................................................................. 7

2.4 Le monitoring biologique pour la prise en charge de l’infection à VIH ....................... 9

2.4.1 Evaluation des signes cliniques ................................................................................ 9

2.4.2 Mesure des lymphocytes CD4 ............................................................................... 10

2.4.3 Mesure de la charge virale ..................................................................................... 11

2.4.4 Tests de résistance: le phénotypage (antivirogramme) et le génotypage ............... 12

2.5 Les mécanismes d’action des antirétroviraux .............................................................. 15

2.5.1 Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase Inverse (INTI) 15

2.5.2 Inhibiteurs Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INNTI) .................. 16

2.5.3 Inhibiteurs de la Protéase (IP) ................................................................................ 16

2.5.4 Inhibiteurs d’Intégrase ............................................................................................ 17

2.5.5 Inhibiteurs d’entrée ................................................................................................ 17

2.6 La problématique et les mécanismes de résistance du VIH aux ARV .......................... 18

2.6.1 Problématique de la résistance du VIH aux ARV .................................................. 18

2.6.2 Mécanisme de résistance du VIH aux INTI ........................................................... 20

2.6.3 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux INNTI ..................................................... 21

2.6.4 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux IP ............................................................ 21

2.6.5 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux anti intégrases ......................................... 22

2.6.6 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux inhibiteurs d’entrée (de fusion) .............. 22

2.6.7 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux inhibiteurs de CCR5 ............................... 22

III. But, hypothèses, objectifs et plan du travail .................................................................... 23

3.1. Le but de l’étude .......................................................................................................... 23

3.2. Les hypothèses de recherche ........................................................................................ 23

3.3. L’objectif général ......................................................................................................... 23

3.4. Les objectifs spécifiques .............................................................................................. 23

3.5. Le plan du travail ......................................................................................................... 24

CHAPITRE II- Matériel et méthodes .................................................................................. 34

II.1 Le matériel ...................................................................................................................... 34

Table des matières

iii

2.1.1 Matériel de collecte des données ................................................................................. 34

2.1.2 Matériel de prélèvement ............................................................................................... 34

II.2 Les méthodes ................................................................................................................... 34

2.2.1 Site de l’étude............................................................................................................... 34

2.2.2 Description du site de l’étude ....................................................................................... 34

2.2.3 Type d’étude ................................................................................................................ 35

2.2.4 Durée de l’étude ........................................................................................................... 35

2.2.5 Taille de l’échantillon .................................................................................................. 35

2.2.6 Méthode d’échantillonnage .......................................................................................... 35

2.2.7 Critères d’inclusion ...................................................................................................... 36

2.2.8 Critères d’exclusion ..................................................................................................... 36

2.2.9 Procédure de recueil des données ................................................................................ 36

2.2.10 Procédure de collecte des échantillons .................................................................. 36

2.2.11 Procédure d’analyse des échantillons .................................................................... 37

2.2.11.1 Mesure des lymphocytes TCD4 ......................................................................... 37

2.2.11.2 Mesure de la charge virale ................................................................................. 37

2.2.11.3 Techniques d’amplification et de détection des mutations de résistance ........... 39

2.2.11.4 Détections des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR) ...... 43

2.2.12 Traitements des données et analyses statistiques .................................................. 47

2.2.13 Conditions éthiques ................................................................................................ 47

CHAPITRE III- Evaluation Immunovirologique du traitement antirétroviral .............. 50

3.1. Introduction ..................................................................................................................... 50

3.2. Caractéristiques générales de la population d’étude ....................................................... 50

3.3. Méthodologie .................................................................................................................. 51

3.4. Résultats originaux ......................................................................................................... 51

3.5. Résumé des résultats du chapitre III ............................................................................... 54

CHAPITRE IV- Comparaison des techniques de mesures de la charge virale ................ 62

4.1. Introduction ..................................................................................................................... 62

4.2. Méthodologie .................................................................................................................. 63


4.4. Résumé des résultats du chapitre IV ............................................................................... 70

CHAPITRE V- Utilisation du Dried Blood Spot (DBS) pour le monitoring biologique . 73

5.1. Introduction ..................................................................................................................... 73

5.2. Méthodologie .................................................................................................................. 73


5.4. Résumé des résultats du chapitre V ................................................................................ 76

CHAPITRE VI. Prévalence des mutations de résistance acquises et diversité génétique

.................................................................................................................................................. 79

6.1. Introduction ..................................................................................................................... 79

6.2. Méthodologie .................................................................................................................. 80


6.4. Résumé des résultats du chapitre VI ............................................................................... 91

Table des matières

iv

CHAPITRE VII- Détection des mutations de résistance ponctuelles (ASPCR) ............... 94

7.1. Introduction ..................................................................................................................... 94

7.2. Méthodologie .................................................................................................................. 95


7.4. Résumé des résultats du chapitre VII ........................................................................... 103

Discussion générale .............................................................................................................. 104

Conclusion générale ............................................................................................................. 117

Perspectives d’avenir ........................................................................................................... 120

Liste bibliographique ........................................................................................................... 121

Les annexes ........................................................................................................................... 138

Dédicaces

v

Dédicaces

Ce travail est dédié à :

Mon cher papa Chatté Idékhim, papa, c’est l’occasion pour moi de te remercier pour

tous les sacrifices que tu as déployés à l’égard de tes fils. Toi qui as pu nous former et diriger

nonobstant les moyens limités en traversant toutes les vicissitudes de la vie ; voici venu le

moment de profiter du fruit de ce travail qui a été possible grâce à ton amour et tes prières.

Qu’ALLAH te bénisse et t’accorde une longue vie.

Ma chère maman Djimié Abdelkerim, maman, toi qui m’as donné la vie, toi qui m’as

allaité, toi qui as gouverné mes premiers pas, je pense à toi. Qu’Allah te bénisse maman et te

prête longue vie. Pour tous les sacrifices consentis à mon égard, trouve ici l’occasion de

réjouissance maman.

Mon grand frère Abderahmane Chaté, tu as pu m'accompagner dans chaque

épreuve, comme tu l'as fait à chaque étape de ma vie. C'est un peu fou à dire, mais après

toutes ces années, je réalise vraiment ce que signifie avoir un frère et je me sens moins seul

de te savoir là. La valeur que tu m’accordes à chaque instant m’a aidé à grandir. Tu as été

pour nous tes frères un père et un exemple à suivre. Nos différences ne sont pas si

importantes au fond, et nous sommes toujours, à nous tous, une famille aimable. Que ce

travail fasse ta fierté.

Mon épouse Rabha Al-Adaouia Mahamat Doungous, merci pour ton soutien de tout

genre et merci d’avoir supporté mon absence auprès de toi durant ma formation.

Mes frères et sœurs : Nouracham, Abdelkerim, Abdelaziz Abdelsalam, Allamine,

Khadidja, Yaman, Mahamout et Abdelsamat, vous qui avez fait toujours de ma réussite votre

première préoccupation, c’est l’occasion pour moi de vous exprimer ma profonde gratitude

pour les sacrifices que vous avez toujours consentis pour ma formation. Merci encore pour

vos prières, encouragements, conseils et votre soutien. Feue ma tante Adjiti et feue ma petite

sœur Adjiti, vous qui nous avez quitté très tôt sans goutter le fruit de votre soutien et votre

encouragement. Qu’Allah vous accorde le paradis.

A tous mes oncles, tantes, cousins, cousines, neveux et nièces, ce travail est aussi le

fruit de votre soutien tout au long de ma formation. Ne vous laissez pas surprendre par le

temps, sachez que la clé de la réussite passe par la patience, la volonté et le travail.

Remerciements

vi

Remerciements

En préambule de cette thèse, qu’il me soit permis de présenter tout d’abord mes

louanges à Allah Le Tout Puisant, Le Très Miséricordieux pour Ses bienfaits pour m’avoir

donné la santé et la force nécessaires afin de mener à bien cette formation.

Il serait ingrat de ma part d’écrire ce document sans avoir une pensée à toutes les

personnes qui m’ont apporté de l’aide et de l’assistance nécessaires à l’élaboration de ce

travail.

Je tiens à remercier sincèrement le Professeur Michel Moutschen qui, en tant que

Directeur de thèse, a toujours été à l'écoute et très disponible tout au long de la réalisation de

ce document. Merci pour l'inspiration, l'aide et le temps qu'il a bien voulu me consacrer et

sans qui cette thèse n'aurait jamais vu le jour. Sa rigueur au travail, son dynamisme et ses

conseils éclairés m’inspirent une profonde reconnaissance à son égard. Je tiens à le

remercier non seulement d’avoir accepté de diriger ce travail mais aussi d’avoir mis à ma

disposition toutes les ressources nécessaires pour sa réalisation.

Je voudrais remercier aussi Dolorès Vaira, responsable du Laboratoire de Référence

Sida. Elle a été pour moi non seulement une formatrice mais aussi une mère durant toute ma

formation. Qu’elle reçoit ici tous mes remerciements pour les conseils, l’encadrement et la

disponibilité qu’elle a consentis à mon égard. C’est le moment de lui exprimer ici ma

profonde reconnaissance pour le goût de l’effort et le sens du travail bien fait qu’elle n’a

cessé de m’insuffler.

Un grand merci au Professeur Danièle Thull Sondag, présidente du comité de thèse

et à tous les autres membres du comité. Merci pour l’encadrement et les orientations durant

ma formation.

J’exprime ma gratitude à tous les membres du jury qui ont accepté de juger ce travail

et d’apporter leur contribution scientifique. Qu’ils acceptent ici, l’expression de mon plus

profond respect.

Remerciements

vii

Mes remerciements vont également :

Aux autorités administratives et communales du Royaume de Belgique de m’avoir

accepté/accueilli parmi les leurs.

Aux responsables universitaires et hospitaliers, merci de m’avoir permis de suivre

cette formation de qualité dans cette prestigieuse institution qu’est le CHU de Liège.

Au Professeur Pascal Leroy, Doyen de la Faculté de Médecine vétérinaire et Consul

Honoraire du Tchad à Liège, qui a été mon parrain ici à Liège et n’a ménagé aucun effort

avec son collègue le Professeur M. Moutschen pour que je puisse être accepté à l’ULg.

J’aimerais tout simplement leur dire, merci pour tout.

Au Professeur Mahamoud Youssouf Khayal, qui m’a toujours conseillé et soutenu

durant mes études supérieures ; qu’il trouve ici l’expression de mes sincères remerciements.

A Malloum Soultan, Directeur Général de l’Institut Universitaire des Sciences et

Techniques d’Abéché (IUSTA). Votre bon sens et votre abnégation dans le travail m’ont

permis d’achever cette formation dans de bonnes conditions.

A Issa Youssouf Adoum et Aoudalkarim Moussa Chahad, pour les précieux conseils

et les encouragements. Merci aussi pour avoir lu et corrigé ce document.

A Sébastien Bontems, responsable de l’assurance qualité pour le laboratoire de

Microbiologie. Il m’a toujours aidé à imprimer mes papiers. Mes articles ont rempli sa boite

mail et je suis sûr que j’ai une bibliothèque de réserve auprès de lui. Merci pour les précieux

conseils, la disponibilité et encadrement.

A Raphaël Boreux, spécialiste de la PCR en temps réel. Merci de m’avoir appris les

différentes techniques de PCR en temps réel sur différentes machines.

A mes collègues et amis Kamangu Erick et Fokam Joseph avec qui j’ai eu

l’opportunité de travailler et de discuter sur des sujets très pertinents.

A Fabrice Susin, Jonathan Meganck, Giuseppina Oliveri et Adjitey Caroline. Je leur

ferais arracher le sourire à cette équipe dynamique du LRS si je leur parlais du marqueur de

poids moléculaire PHIX174 RF ADN HaeIII ou s’il fallait lire l’écriture « wastle bottle ».

Nous avons travaillé dans une ambiance bon enfant, mais cela ne nous a pas fait perdre de

Remerciements

viii

vue la rigueur scientifique au travail bien fait. Leur contribution de tout genre à ce travail est

remarquable. Ils ont été gentils avec moi en me montrant beaucoup de choses. Je leur

exprime ma profonde gratitude pour l’effort consenti par tous. Merci aussi pour la pizza-

party de chaque fin de séjour.

A Francesca Lipari et Emilie Guissart, Secrétaires du Service d’Immunologie et des

Maladies Infectieuses, pour leur gentillesse, leur disponibilité et leur collaboration. Qu’elles

reçoivent ici ma profonde reconnaissance.

Un merci sincère et véritable à Jessica Monfort pour avoir sacrifié son temps afin

d’apporter des corrections pertinentes à ce travail.

Un grand merci aux compatriotes tchadiens de Liège pour la bonne cohabitation

durant cette formation. Je pense à Acheikh Ali Annadif, Issakha Alnadjib Senoussi, Brahim

Tchou, Youssouf MS Annadif, Abdelkhani Ezedine, Elhadj Adam, Haroun Hamat et

Oumar Souelymane.

A tous les PVVIH qui ont accepté de donner leur sang afin que cette étude ait lieu.

Que ce travail vous apporte réconfort et plein courage de vivre une vie normale.

Je n’oublie pas le personnel du laboratoire de Microbiologie du CHU de Liège pour

leur collaboration. Un grand merci aussi au personnel du laboratoire de l’Hôpital Général

de Référence National de N’Djaména (HGRN) d’avoir facilité la collecte des données.

Enfin, je tiens à remercier tous ceux que je n’ai pas cités dans ce travail et qui m’ont

apporté leur aide dans toute dimension ; qu’ils reçoivent ici tous mes remerciements.

Sigles et abréviations

ix

Liste des sigles et abréviations

3TC Lamivudine

ANRS Agence Nationale pour la Recherche sur le Sida

ARMS Amplification Refactory Mutation System

ARV Antirétroviral (aux)

ASPCR Allele-Specific Polymerase Chain Reaction

AZT (ZDV) Zidovudine

bp paire(s) de bases

CAP/CTM Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan

CD4 Cluster of Differentiation 4

CHU Centre Hospitalier et Universitaire

CNLS Centre National de Lutte Contre le Sida

d4T Stavudine

DBS Dried Blood Spot

ddc Zalcitabine

ddl Didanosine

DNA/ADN Desoxyribonucleic Acid/ Acide Désoxyribonucléique

DPS Dried Plasma Spot

EDTA Ethylène Diamine Tétra Acétique

EFZ Efavirenz

ENV Enveloppe

FTC Emtricitabine

GAG Group Antigen Gene

HAART High Active Antiretroviral Therapy

HGRN Hôpital Général de Référence Nationale

INNTI Inhibiteurs Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse

INTI Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase Inverse

LRS Laboratoire de Référence Sida

LTR Long Terminal Repeat

Min Minute

MMix Master Mix

NVP Névirapine

Sigles et abréviations

x

OMS Organisation Mondiale de la Santé

ONUSIDA Organisation des Nations Unies Pour la Lutte contre le SIDA

PCR Polymerase Chain Reaction

PI Protease Inhibitors

POL Polymérase

PRL Pays à Ressources Limitées

PTME Prévention de la Transmission Mère-Enfant

PVVIH Personne Vivant avec le VIH

RNA Ribonuicleic Acid

Sec Seconde

SIDA Syndrome de l’Immunodéficience Acquise

TAR Traitement Antirétroviral

TDF Ténofovir

TDR Test de Dépistage Rapide

ULg Université de Liège

VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine

WHO World Health Organisation

Liste des tableaux

xi

Liste des tableaux

Tableau 1: Classification de la maladie à VIH/ stades cliniques OMS ................................... 10

Tableau 2: Comparaison des différentes techniques de mesure de la charge virale .............. 12

Tableau 3: Préparation du MMix 1: Annealing ...................................................................... 44

Tableau 4: Préparation du Master Mix 2: Enzyme Mix .......................................................... 44

Tableau 5: Preparation du premier Master Mix pour ASPCR ................................................ 46

Tableau 6: Préparation du second MMix pour ASPCR .......................................................... 47

Tableau 7: Valeurs observées des CD4 avant et après traitement .......................................... 52

Tableau 8:Valeurs des charges virales observées avant et après traitement .......................... 52

Tableau 9: Mutations de résistance détectées sur plasma vs DBS .......................................... 74

Tableau 10: Comparison des sous-types détectés sur plasma vs DBS .................................... 75

Tableau 11: Nombre de patients par rapport au traitement administré ................................. 82

Tableau 12: Valeurs charges virales sur CAP/CTM vs Abbott RealTime ............................... 82

Tableau 13: Nombre de patients en échec par rapport au traitement administré .................. 83

Tableau 14: Distribution des sous-types et des mutations de résistance chez les patients en

echec sous Triomune ................................................................................................................ 83

Tableau 15: Distribution des sous-types et mutations de résistance chez les patients en echec

sous Duovir N ........................................................................................................................... 85

Tableau 16: Distribution des patients par rapport aux sous-types ......................................... 87

Tableau 17: Quantification de la résistance du VIH au traitement (Stanford) ....................... 90

Tableau 18: Coefficients de variation intra et inter-essais ..................................................... 99

Tableau 19: Mutations de résistance détectées par ASPCR (Plasma) .................................. 100

Tableau 20: Comparaison des mutations de résistance en fonction des sous-types détectés par

ASPCR vs plasma ................................................................................................................... 101

Tableau 21: Evaluation de la sensibilité de l'ASPCR par rapport au séquençage sur DBS vs

plasma .................................................................................................................................... 102

Tableau 22: Distribution des mutations de résistances détectées par ASPCR par rapport aux

sous-types détectés sur DBS ................................................................................................... 103

Liste des figures

xii

Liste des figures

Figure 1: Principe du séquençage selon la méthode de Sanger .............................................. 14

Figure 2: Distribution des tranches d'âge par rapport au sexe .............................................. 50

Figure 3: Nombre des patients par rapport au traitement administré .................................... 51

Figure 4: Répartition des patients en échec par rapport au traitement .................................. 53

Figure 5: Comparaison CAP/CTM et Abbott RealTime .......................................................... 67

Figure 6: Résultats de mesures CAP/CTM et Abbott RealTime .............................................. 67

Figure 7: Comparaison CAP/CTM et ANRS ........................................................................... 68

Figure 8: Comparaison Abbott RealTime et ANRS ................................................................. 69

Figure 9: Courbes de mesure entre CAP/CTM V2.0, ANRS et Abbott RealTime ................... 69

Figure 10: Fréquence des mutations de résistance associées aux INTI .................................. 88

Figure 11: Fréquence des mutations de résistance associées aux INNTI ............................... 89

Figure 12: Arbre phylogénétique des séquences de la protease (plasma) .............................. 91

Figure 13: Courbes standard des différences des Ct (sauvage-muté) pour les différentes

mutations .................................................................................................................................. 96

Figure 14: Courbes standard avec le primer générique et muté des différentes dilutions ..... 97

Figure 15: Exemple de la courbe d'amplification (générique et sauvage) avec différences des

Ct pour la K103N ..................................................................................................................... 97

Figure 16: Quantifications des mutations de resistance détectées par ASPCR vs plasma ... 102

Résumé

xiii

Résumé

Introduction

La lutte contre le VIH demeure jusqu’à présent un problème majeur de santé publique

dans les pays au sud du Sahara et ce, malgré les avancées notables enregistrées depuis

quelques années. Les ressources limitées pour la prise en charge des personnes vivant avec le

VIH (PVVIH) dans ces pays ont pour conséquence l’émergence et la transmission des

souches résistantes qui se traduit par la perte de l’efficacité du traitement administré.

Un traitement antirétroviral est administré dans l’objectif d’obtenir et de maintenir une

charge virale plasmatique indétectable, tandis que la prise en charge d'une situation d'échec

virologique (première ligne, lignes ultérieures ou multi-échecs) implique le plus souvent une

adaptation du traitement en fonction des résultats, le contrôle régulier de la charge virale et

des tests génotypiques de résistance. Or, la performance d’un test de résistance est influencée

par ses propriétés intrinsèques (sensibilité et spécificité), la qualité et le type de l’échantillon à

analyser, la connaissance de la prévalence de résistance et de la diversité génétique dans la

population. En tout état de cause, les techniques de mesure de la charge virale et les tests de

résistance standard nécessitent des infrastructures de laboratoire adéquats et du personnel bien

formé. Toutes ces méthodes, pour utiles qu’elles soient, se révèlent être inadaptées sinon très

onéreuses pour les pays à ressources limitées (PRL). C’est la raison pour laquelle, le

développement et la mise en place au Tchad des nouvelles alternatives, fiables et moins

coûteuses seraient à notre avis, la solution pour une meilleure surveillance épidémiologique

de la résistance du VIH au traitement.

Objectifs

Etant donné que les tests de résistance ne sont pas encore disponibles au Tchad ; et

afin de pouvoir aider les cliniciens sur leur prise de décision et contribuer à un meilleur suivi

des personnes vivant avec le VIH (PVVIH), nous nous sommes fixés comme objectif général

d’évaluer et de mettre en place des méthodes alternatives pour le monitoring biologique de la

résistance du VIH aux ARV au Tchad. L’atteinte de cet objectif général, passe nécessairement

par la réalisation d’objectifs spécifiques qui sont: 1) Faire une évaluation immunovirologique

avant et après traitement. 2) Quantifier la charge virale et évaluer les différentes techniques

disponibles. 3) Identifier chez ces sujets les différentes mutations de la Reverse Transcriptase

et de la Protéase associées à la résistance du virus et en évaluer la prévalence sur DBS et

Plasma. 4) Evaluer la technique ASPCR afin de détecter les mutations ponctuelles associées à

Résumé

xiv

la résistance du VIH-1 pour les sous-types non-B. 5) Déterminer la prévalence de la résistance

acquise et la diversité génétique des sous-types du VIH-1 circulants à N’Djamena.

Méthodologie

Notre échantillon est constitué de 116 patients (78 femmes et 38 hommes représentant

respectivement 67,24 % et 32,76 %). Ces patients sont recrutés sur base des critères

d’inclusion et d’exclusion bien définis. La moyenne d’âge de nos patients est de 41 6,87 ans

avec 84 ans pour le plus âgé et 17 ans pour le plus jeune. Deux types d’étude sont utilisés:

l’une traversable (prospective et rétrospective) et l’autre expérimentale. L’échantillonnage est

de type consécutif non exhaustif (tout venant). L’échantillon utilisé est le sang veineux

prélevé sur EDTA au pli du coude. Le plasma est aliquoté dans des cryotubes et conservé à -

80°C; 75 µl du sang total sont déposés sur papier buvard de type Whatman 903 (Whatman,

Maidstone, UK). La charge virale est évaluée à l’aide des trois techniques: Abbott RealTime,

Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) v2.0 et la technique de l’ANRS. La

conservation du DBS est faite à -20 °C jusqu’au transport en Belgique pour les analyses.

L’extraction de l’ARN viral est faite avec le kit QiAamp Viral RNA mini kit. Nous avons

recouru à la technique de l’ANRS (ANRS AC11 Resistance Study Group, 2008) pour réaliser

le séquençage sur la Réverse Transcriptase et la Protéase sur un total de 30 DBS.

En vue d’évaluer la réponse immunvirologique des PVVIH sous ARV et suivre

l’évolution de l’infection vers le stade SIDA à travers les deux marqueurs principaux qui sont

les lymphocytes TCD4 et la charge virale, nous avons effectué le suivi des 116 patients

pendant huit mois. Ces deux marqueurs sont mesurés avant le traitement (Jour 0) et après huit

mois de traitement. Les moyennes des CD4 et de la charge virale au J0 sont comparées aux

valeurs obtenues après 8 mois de traitement. Ensuite, concernant les patients sous Triomune,

ceux-ci ont fait l’objet d’une évaluation particulière pour déterminer le taux d’échec à la

Triomune.

Les méthodes d’amplification et de détection employées sont celles décrites dans la

procédure du groupe de résistance de l’ANRS AC11 (ANRS AC11 Resistance Study Group,

2008). L’amplification des régions concernées de la polymérase (Protéase et Reverse

Transcriptase) a été réalisée avec le Titan One tube RT-PCR Kit, Version 13 (Boehringer

Mannheim, Manneheim, Germany). La technique ASPCR (Allele-Specific PCR) est utilisée

pour la détection des mutations de résistances ponctuelles sur DBS et le plasma. Les

séquences de la Protéase et de la Reverse Transcriptase sont alignées avec le logiciel Bioedit

Résumé

xv

(version 7.2.5) et sur CLUSTAL W version 1.7 (Thompson, Higgins, & Gibson, 1994). Les

séquences obtenues de la Protéase et de la Reverse Transcriptase sont comparées à la banque

des sous-types non-B disponibles dans Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov/). Les sous-

types, les formes recombinantes et les mutations de résistance sont obtenus après analyse des

séquences sur le site de Stanford University/HIV Drug Résistance Database

(http://hivdb.stanford.edu/). Les résistances sont interprétées conformément à l’algorithme de

l’ANRS AC11, révisé en septembre 2013 (http://www.hivfrenchresistance.org/). Afin

d’autoriser des taux de mutations différents le long des branches, nous avons eu recours à la «

Neighbor Joining », méthode du plus proche voisin en vue de construire l’arbre

phylogénétique sur MEGA 5.2.2.

Résultats

En évaluant les paramètres immunovirologiques, nous avons remarqué que la médiane

des charges virales observée avant le traitement est loin d’être la même après huit mois de

traitement (5000 vs 51; U de Mann-Whitney significatif à p < 0,001 pour les deux médianes).

Par contre la moyenne au J0 n’a pas significativement changée au M8 (44739 vs 43460 ; p >

0,05). La moyenne des CD4 n’a pas considérablement fluctué chez les 116 patients avant et

après 8 mois de traitement (309 vs 344 ; p = 0,62). La médiane des CD4 au J0 est de 248 alors

que celle de M8 est de 298,5 (p = 0,75). Le taux d’échec à la Triomune est de 43,75 %

(21/48). L’étude ne relève également, aucune différence significative entre le taux d’échec et

le sexe (p > 0,05).

La corrélation entre la mesure de la charge virale sur CAP/CTM et Abbott RealTime

est excellente avec R2 = 0,96016. Si la mesure avec la technique de l’ANRS semble être

discordante des deux premiers tests, il n’empêche que la corrélation soit bonne avec R2 =

0,72603 pour CAP/CTM-ANRS et R2 = 0,81064 pour Abbott-ANRS. Un « blip » est observé

sur deux échantillons (2,23 et 2,68 Log10 copies/ml) avec la version 2.0 du Cobas. La

dégélation du plasma lors de la mesure avec la technique ANRS pourrait être à l’origine des

valeurs sous estimées obtenues comparativement à Abbott RealTime et le Cobas.

L’analyse nucléotidique des 44 échantillons indique la présence des sous-types

suivants : A = 4 (9,30 %), D = 4 (9,30 %), F = 2 (4,65 %), G = 7 (16,28 %) et J =13 (30,23

%). La seule forme recombinante que nous avons trouvée dans l’étude est CRF02_AG chez

13 patients, soit 30,23 %. Un échantillon était indéterminé après analyse des séquences. Il

ressort de cette étude qu’il y a présence d’un nouveau sous-type J qui circule à

http://www.hiv.lanl.gov/

http://hivdb.stanford.edu/

http://www.hivfrenchresistance.org/

Résumé

xvi

N’Djaména avec un taux de 30,23 % (13/43); il est apparenté au sous-type F après analyse

phylogénétique.

Sur DBS, nous avons obtenu un taux d’amplification de 80 % (24/30). La limite de

détection est de 3,33 log10, ce qui équivaut à 2150 copies/ml. Le CRF02_AG est également le

plus représenté sur DBS (29,17 %; 7/24) comme sur le plasma (30,23 %; 13/43). Le sous-type

K est présent (3/24; 12,5 %) sur DBS sur la Reverse Transcriptase alors qu’il est absent dans

le plasma.

Concernant les Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase

Inverse (INTI), les principales mutations enregistrées sont la M184V/I/L qui est largement

rencontrée chez 30 patients sur les 43, soit 69,77 %; la T215Y/F/I/S enregistrée chez 13 autres

patients (soit 30,23 %). D’autres mutations communes (A62V, V75I/L, M184V/I) ont aussi

été constatées chez deux patients, à hauteur de 4,65 %. Les analogues à la thymidine (TAMs)

sont représentées par la T215Y/F, la K70P/R/W et la K219E/N/Q respectivement à

concurrence de 30,23 % (13/43), de 9,30% (4/43) et de 9,30 % (4/43). Les résistances que

nous avons remarquées pour les INNTI sont représentées par la K103N/S/E chez 13/43 (30,23

%) et la Y181C/V/F/L chez 11/43 (25,58 %). Comme nous pouvions nous attendre dans le

cas des INNTI, nous avons noté l’association Y181C/F et K103N chez 3/43 (6,98 %).

Certaines mutations telles que L100I, F227L et P225H ne sont constatées que chez un seul

patient à hauteur de 2,33 %.

S’agissant de la quantification des résistances, nous avons observé qu’il existe une

résistance élevée aux INNTI chez plus de la moitié des patients, avec 74 % (32/43) pour la

NVP et 55,8 % (24/43) pour l’EFZ. Pour les INTI, nous avons noté une forte résistance à la

3TC à hauteur de 67,5 % (29/43).

Pour la détection des mutations ponctuelles, une spécificité de 10 % est obtenue avec

l’ASPCR comparativement au plasma. Pour les sous-types D, il s’agit de la Y181C; pour le

sous-type J, de laY181C et de la M184V et pour le CRF02_AG, de la Y181C et de la M184V.

L’ASPCR est une méthode fiable de détection de mutation de résistance ponctuelle mineure à

hauteur de 0,01 %. Elle est la méthode de choix pour la détection des mutations de résistance

mineures dans un échantillon; les coefficients de variation en intra et inter-essais sont tous

inférieures à 0,50. Cela montre que l’estimation de la technique est plus précise.

Le taux de suppression virale (CV < 1000 copies/ml) est de 56,9 % (66/116). La

prévalence de la résistance parmi les individus ayant une CV ≥ 1000 copies/ml est de 74 %

Résumé

xvii

(37/50) alors que celle de la résistance acquise chez tous les patients est donc de 31,9 %

(37/116).

Conclusion

Promouvoir la collecte des échantillons sur DBS, c’est une manière de résoudre en

partie la problématique liée à la conservation de l’échantillon. Ainsi, le suivi de l’efficacité

d’un traitement bien régulié, bien toléré et bien observé passe nécessairement par un contrôle

immunovirologique constant et des tests de résistances. Plusieurs mutations associées à la

résistance aux ARV à différents niveaux sont présentes chez les PVVIH à N’Djamena

occasionnant dès lors l’échec au traitement et l’apparition des souches résistantes dans la

population. La présence de ces mutations serait liée à la mauvaise observance notifiée dans

l’étude (80 %; p < 0,05). Pour la mesure de la charge virale, la technique de l’ANRS semble

être la plus simple et la moins onéreuse ; mais pour les pays à ressources limitées,

l’application de cette technique nécessite un personnel qualifié et des infrastructures de

laboratoire suffisants. La Triomune ne doit pas être utilisée comme traitement de première

intention à cause de l’échec immunovirologique relatif à son utilisation. Nous osons croire

enfin, que l’approvisionnement régulier en molécules antirétrovirales, l’adéquation des

infrastructures de laboratoire et la formation continue du personnel technique dans les PRL,

paraissent l’une des options fiables pour réduire au maximum le risque d’émergence de

résistance du VIH.

Chapitre I : Introduction Générale

ii

Chapitre I

Introduction Générale


1

CHAPITRE I - Introduction Générale

I. Contexte et justification du sujet

Plusieurs années après sa découverte, le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH)

reste encore une des causes majeures des décès dans le monde et c’est l’Afrique

Subsaharienne qui en paye le lourd tribut. Parmi les 35,3 millions [32,2-38,8] de personnes

qui vivent avec le VIH dans le monde en fin 2012, près de 69 % résident en Afrique

Subsaharienne, une région qui ne représente que 12 % de la population mondiale (Onusida,

2013). Malgré les avancées thérapeutiques pour la lutte contre le Sida, l’émergence de la

résistance aux antirétroviraux dans les pays à ressources limitées se révèle être l’un des

problèmes majeurs de la thérapeutique antirétrovirale. C’est ainsi que divers sous-types de

virus circulent en Afrique Centrale et sont responsables d'environ 85 % des nouvelles

infections, dont les plus fréquents sont A (A1, A2, A3, A4, A5), C, CRF02_AG et D.

Récemment, un nouveau groupe putatif désigné P a été retrouvé chez deux patients

camerounais (Lihana et al., 2012; Plantier et al., 2009).

A l’instar des autres pays, au Tchad, la pandémie du Sida fait de nombreux décès

chaque année. La prévalence chez la population tchadienne de 15 à 45 ans, estimée à 7

millions d’habitants en 2005 est de 3,3 % (Ouagadjio et al., 2005). Le type de VIH qui circule

au Tchad depuis l’avènement du SIDA est le VIH-1. A notre connaissance, jusqu’à présent,

une seule étude, publiée en 2003 renseigne sur les différents groupes du VIH-1 qui circulent

au pays. Parmi ces groupes, seul le M avec les 4 sous-types (A, D, F et G) et trois

recombinants (CRF01-AE, CRF02-AG et CRF11-cpx) est majoritairement retrouvé. Le

groupe O est minoritaire et le N n’a pas été rencontré. De même, des cas de VIH-2 n’ont pour

l’heure pas été observés au Tchad (Vidal et al., 2003).

Cette situation a conduit le gouvernement tchadien à réévaluer les priorités nationales

en matière de santé, et plus particulièrement à se concentrer sur les difficultés qu’affrontent

les personnes vivant avec le VIH (PVVIH) et d’origine tchadienne, personnes qui ont souffert

depuis longtemps d’un manque d’accès à l’éducation et à des soins de santé appropriés. Afin

de relever ces défis, le Gouvernement du Tchad, avec le concours de bailleurs de fonds

extérieurs, a élaboré en 1998, une stratégie nationale de la santé ainsi qu’un plan national

stratégique de lutte contre le SIDA. C’est pourquoi, depuis 2007, le Gouvernement tchadien a

instauré la gratuité des antirétroviraux (ARV) et tous les examens complémentaires afférents à


2

l’infection à VIH. Depuis lors, un protocole de traitement basé sur une trithérapie a vu le jour.

Cette trithérapie était fondée sur la Triomune (Cipla-Inde) jusqu’à fin 2012, année au cours de

laquelle, elle fut abandonnée non seulement à cause de ses effets secondaires, mais aussi à

cause de l’échec immunovirologique associé à son utilisation (Adawaye et al., 2014). Les

molécules d’actualité sont aujourd’hui au Tchad le Duovir N (AZT, 3TC et NVP) et le

Viraday ou Atripla (FTC, TDF et EFZ). Depuis lors, ces molécules n’ont fait l’objet d’aucune

évaluation dans le pays; c’est pourquoi, pour vérifier leur efficacité, un monitoring biologique

régulier s’impose.

Problématique

Un traitement antirétroviral quelle que soit la situation thérapeutique du patient est

administré dans l’objectif d’obtenir et de maintenir une charge virale plasmatique indétectable

(Palella et al.,1998) sinon inférieure à 50 copies/ml (Hocini & Andreoletti, 2009). La charge

virale permet d’apprécier l’évolutivité de la maladie en complément de la mesure des CD4 et

de l’appréciation des signes cliniques. Ces résultats doivent en tout état de cause être

confrontés au taux de CD4 et aux signes cliniques, le dialogue clinicien-biologiste reste

primordial pour l’interprétation des résultats (Hocini & Andreoletti, 2009).

Ces indicateurs biologiques, pour utiles qu’ils soient, s’avèrent être très rares dans les

pays à ressources limitées (PRL), en raison des coûts élevés des différentes techniques et des

exigences strictes pour le stockage et le transport du plasma. Pourtant ces indicateurs

présentent des sérieuses limites dès lors qu’il s’agit de mettre en place des moyens de suivi

permettant de faire évoluer les traitements pour les patients en situation d’échec et de

résistance aux traitements (Johannessen et al., 2009; Palella et al., 1998). Ainsi donc, l’OMS

recommande que l’échec virologique soit évalué par les signes cliniques ou par la mesure des

taux des CD4 pour les PRL (Hirsch et al., 2008), bien que ces derniers aient une faible

sensibilité et spécificité dans l’évaluation de l’échec virologique (D. E. Bennett et al., 2009).

De manière générale, les méthodes standards de l’évaluation du traitement et de

l’évolution de la maladie nécessitent le cas échéant des techniques et des exigences strictes

pour le stockage et le transport du plasma, du personnel qualifié et les infrastructures d’un

laboratoire de biologie moléculaire (Johannessen et al., 2009). Le coût élevé et la complexité

de toutes ces méthodes les rendent inadaptées pour les PRL et notamment pour le Tchad.

Cette situation nous a amené à poser la question de savoir « Quelles pourraient être les


3

approches alternatives pour le monitoring de résistance du VIH aux antirétroviraux au

Tchad »?

Tenant compte des conditions dérisoires de nos laboratoires et du manque d’une main

d’œuvre qualifiée, la meilleure stratégie pour une surveillance épidémiologique fiable serait

de développer de nouvelles alternatives permettant la mesure de la charge virale et la

détection des mutations de résistance ponctuelles sur papier buvard et sur plasma, avec des

techniques efficaces et moins onéreuses, d’où l’intérêt de notre étude. C’est la raison pour

laquelle, la technique du papier buvard, dénommée DBS (Dried Blood Spot) ou DPS (Dried

Plasma Spot) parait la mieux indiquée pour élargir la surveillance virologique au traitement

anti-VIH au Tchad.

La technique consiste à collecter du sang total (DBS) ou du plasma (DPS) sur un

papier filtre appelé buvard. Cette technique se révèle être très pratique ne nécessitant pas

forcément un personnel qualifié. Elle a démontré ses preuves dans les enquêtes séro-

épidémiologiques car elle a pour avantage d’être facile à réaliser. Le DBS est acheminé vers

les laboratoires pour les analyses moléculaires sous forme de courrier. La conservation ne

nécessite pas une chaine de froid continue car il se conserve à température ambiante

(Bertagnolio et al., 2010; Fiscus et al., 1998; Leelawiwat et al., 2009; Mee et al., 2008). Il

faut noter cependant que récemment, plusieurs études réalisées en Amérique du Nord, en

Europe et même en Afrique (Cameroun, Malawi, Tanzanie etc.) ont montré la faisabilité et la

fiabilité de l’utilisation du DBS pour le contrôle de la charge virale et les mutations de

résistance aux antirétroviraux (Adawaye et al., 2013; Bertagnolio et al., 2010; Johannessen et

al., 2009). L’amplification pour la mesure de la charge virale à 1000 copies/ml et

l’identification des mutations associées à la résistance sur DBS étaient similaires à celles

déterminées sur le plasma (Arredondo et al., 2012). Une revue à la fin de ce chapitre nous

renseigne plus sur les avantages du DBS dans le monitoring biologique dans les PRL.

Nonobstant, les tests génotypiques de résistance sur buvard ou sur plasma se révèlent

eux aussi être très onéreux et nécessitent des laboratoires équipés de type « Référence » et du

personnel qualifié. Les tests génotypiques standard quant à eux ne détectent une mutation de

résistance dans un échantillon que quand sa proportion dans l’échantillon atteint 20 % (Brun-

Vézinet et al., 2004; Halvas et al., 2006; Kuritzkes et al., 2003). C’est pourquoi, l’évaluation

et la mise en place au Tchad d’une technique basée sur la détection des mutations de

résistances ciblées (ASPCR pour Allele-Specific PCR) ainsi que la détection des mutations de


4

résistance sur DBS seraient une panacée pour répondre aux besoins croissants des cliniciens

dans leur prise de décision. L’ASPCR permet la détection des mutations mineures mêmes si

elles sont présentes à faibles proportions ou celle de plusieurs mutations dans un même

échantillon. Il est question pour nous ici, de rechercher les mutations de résistance

sélectionnées essentiellement pour les médicaments utilisés au Tchad et qui en elles mêmes,

confèrent une résistance majeure à l’exemple de la K103N ou la Y181C pour les INNTI et la

M184V ou la T215F/Y pour les INTI. La barrière génétique étant faible pour ce groupe de

médicaments (NVP et EFZ), une seule mutation pourrait entrainer une résistance irréversible

(loi de tout ou rien).

Dans ce document, nous allons tout d’abord, donner un aperçu général sur les

techniques utilisées pour la prise en charge des personnes vivant avec le VIH, en évaluant la

faisabilité de chaque technique de prélèvement et de conservation de l’échantillon, de mesure

de la charge virale et du génotypage. La technique ASPCR sera utilisée pour la détection des

mutations ponctuelles. Nous allons enfin dégager les avantages et les limites de chaque

technique qui sera par la suite transposable au Tchad.

Intérêt de l’étude

Etant donné que les tests de résistance n’étaient jusqu’à présent pas disponibles au

Tchad, ce travail apporte une connaissance approfondie sur la diversité génétique et l’enjeu de

la résistance dans la surveillance épidémiologique. Les recommandations tirées de cette étude,

permettrons l’implantation à court ou à moyen terme au Tchad des techniques de biologie

moléculaire testées et validées au laboratoire de Référence Sida de Liège durant notre

formation. La biologie moléculaire au Tchad est à l’état embryonnaire et ne se limite qu’à la

charge virale sur Abbott RealTime. La création d’un Centre de Référence Sida au Tchad serait

à notre avis un cadre idéal pour promouvoir cette discipline à l’échelle nationale et permettre

aussi aux cliniciens le choix des méthodes alternatives de prise en charge. Ceci leur permettra

de prendre des décisions rapides et efficaces pour donner de grandes chances aux malades de

vivre une vie longue, saine et quasi normale.


5

II. Généralités sur le VIH et le Sida

2.1 Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH)

Le VIH appartient à l’ordre des Rétroïdes, à la grande famille des Rétroviridae,

lesquels se caractérisent par leur génome d’ARN, qui est rétrotranscrit en ADN proviral à

l’aide de la Transcriptase Inverse (TI) appelée encore Reverse Transcriptase (RT). Cette

enzyme qui n’est pas pourvue d’activité correctrice comme l’ADN polymérase cellulaire

laissera sur son passage, au cours de la rétrotranscription, de nombreuses erreurs à l’origine

du fort taux de mutations présentes dans l’ADN rétroviral. Ce dernier, nanti désormais de la

possibilité de pouvoir échapper à tout contrôle du système de défense de l’hôte et aux

thérapies, s’intégrera dans le génome de la cellule hôte, restera en forme latente ou se

reproduira pendant toute la durée de vie des cellules infectées. Il appartient au genre des

lentivirus.

Suivant la structure de leur génome et le type d’infection dont ils sont la cause

(lytique ou oncogène), les Rétrovirus se subdivisent en trois sous-familles: les lentivirus

(parmi lesquels le VIH-1 et VIH-2), les oncovirinae et les spumavirinae.

Les lentivirus sont exogènes, non oncogènes et infectent principalement les cellules du

système immunitaire (macrophages et lymphocytes T CD4+) ce qui explique le fait que les

infections lentiformes résistent aux assauts du système immunitaire et causent généralement

des immunodéficiences.

2.2 La diversité génétique des groupes et sous-types du VIH

A ce jour, ont été identifiés deux types de VIH, le VIH-1 (en 1983) et le VIH-2 (1986)

qui se différencient sur la base de leur origine géographique, de l’organisation de leur génome

et de leur lien de parenté avec le SIV (Simian Immunodefisciency Virus). L’origine de la

diversité génétique s’explique par l’action de l’enzyme Reverse transcriptase qui est

dépourvue d’activité 3’-5’ exanucléasique et qui est dépourvue d’activité correctrice comme

l’ADN polymérase cellulaire. Elle laissera sur son passage, au cours de la retro transcription,

un taux d’erreur très élevé de l’ordre de 10-3 à 10-4; ce qui correspond à une à deux

mutation(s) par cycle de réplication.

Le VIH-1 est classé depuis 1998 selon les critères phylogénétiques en quatre groupes,

dont chacun correspondrait à des transmissions indépendantes de SIV à l’Homme (Gao et al.,


6

1999). Le plus répandu à travers le monde est le groupe M qui se subdivise en 9 sous-types ou

clades (A, B, C, D, F, G, H, J et K), obtenus sur l’analyse génomique des gènes env et gag. La

majorité des sous-types du VIH-1, responsable de la pandémie du VIH/SIDA, appartiennent à

la lignée du VIH-1 du groupe M (Doualla-bell et al., 2010). Le groupe O (pour outlier group),

présent en Afrique Centrale; le groupe N (pour non-M, non-O group) présent au Cameroun et

un nouveau groupe putatif désigné P a été retrouvé chez deux patients camerounais (Lihana et

al., 2012). Ce même groupe P a déjà été identifié chez une patiente camerounaise vivant en

France (Plantier et al., 2009).

Les sous-types B correspondent au VIH que l’on soupçonne d’être à l’origine de

l’épidémie dans les pays industrialisés (Amérique, en Europe et en Australie). Les sous-types

non-B (qui regroupent tous les autres sous-types) seraient proportionnellement en

augmentation. Parmi les sous-types non-B, les sous-types A, C, D et E se retrouvent

largement en Afrique. Les sous-groupes N et O principalement présents au Cameroun

demeurent plus rares (Bodelle et al., 2004).

La diversité génétique du VIH-1 augmente dans le monde. La majorité des cas est du

aux virus VIH-1 de sous-types non-B, le sous-type B étant majoritaire uniquement sur le

continent américain, en Europe de l’Ouest et en Australie. Ainsi, ce sont les VIH-1 de sous-

type C qui sont responsables de plus de 50 % des infections dans le monde. Ceux-ci

prédominent en Afrique du Sud, alors que les sous-types A et D sont présents en Afrique de

l’Est (Peeters, Chaix, & Delaporte, 2008). Les sous-types de virus circulants en Afrique

Centrale et responsables d'environ 85 % des nouvelles infections sont A (A1, A2, A3, A4,

A5), C, CRF02_AG et D (Lihana et al., 2012). Certains sous-types se recombinent entre eux

pour donner des virus recombinants, les CRF, composant de véritables mosaïques des

différents sous-types. La prévalence des sous-types non-B est croissante, y compris en

Europe, passant de 17 % en 1996-1999 à 28 % en 2000-2003 (S. Matheron et al., 2010).

En Europe et notamment en France, hormis le sous-type B, de nombreux autres sous-

types ou CRF non-B comme les virus A, C, D, F, G, H, CRF01_AE et aussi CRF02_AG y

circulent. La moitié des virus non-B isolés en France sont des virus CRF02_AG, ce qui

témoigne des liens existants entre la France et l’Afrique de l’Ouest (Peeters et al., 2008). Il

faut noter cependant que l’évolution de la maladie ne semble pas différente chez les patients

infectés par le CRF02_AG et ceux infectés par d’autres sous-types non-B (Atlas et al., 2005).


7

Le type de VIH circulant au Tchad depuis l’avènement du SIDA est le VIH-1. Parmi

les groupes circulants, seul le M avec les 4 sous-types (A, D, F et G) et trois recombinants

(CRF01-AE, CRF02-AG et CRF11-cpx) sont majoritairement retrouvés. Le groupe O est

minoritaire et le N n’est pas encore rencontré. Le VIH-2 lui aussi n’a pas encore été rencontré

au Tchad (Vidal et al., 2003).

Le VIH-2 isolé en 1986 trouve son origine chez le singe Cercocebus torquatus et il est

principalement retrouvé en Afrique de l’Ouest. Il faut y ajouter la prolifération et la

circulation de nombreuses formes recombinantes qui sont sources de résistance croisée aux

antirétroviraux. Pour le VIH-2, au moins huit transmissions inter-espèces de SIVsmm (Simian

immunodeficiency virus from sooty mangabey monkeys) ont eu lieu entre l’homme et le

mangabey enfumé, ce qui a conduit à définir 8 groupes de VIH-2 (A, B, C, D, E, F, G, H).

Les groupes A et B sont les plus représentés (Yeni, 2010).

2.3 La situation du VIH/SIDA au Tchad

Pays enclavé de l’Afrique Centrale d’une superficie de 1 284 000 km2, le Tchad est

limité au Nord par la Libye, au Sud par la République Centrafricaine, à l’Est par le Soudan et

le Soudan du Sud et à l’Ouest par le Niger, le Nigeria et le Cameroun. Cet enclavement

extérieur est aggravé par une insuffisance des réseaux routiers qui rendent difficile

l’évacuation des malades durant la saison des pluies car plusieurs formations sanitaires sont

inaccessibles.

La population du Tchad est estimée en 2009 à 11 274 106 habitants avec un taux

d’accroissement annuel de 3,6 %; ce qui permet d’estimer la population du pays à 12 100 453

habitants en 2011(CNLS, 2012; INSEED, 2009). La population féminine représente 50,7 %

de la population totale contre 49,3 % pour les hommes. Les jeunes de moins de 18 ans

représentent 57% du total. Près de la moitié (47 %) de la population total du pays est

concentrée sur seulement 10 % de la superficie nationale, dans le Sud du pays. Près de 78,3 %

de cette population vit en milieu rural, le reste vit dans la capitale N’Djaména et dans

quelques grandes villes (Abéché, Moundou, Sarh, Bongor, Doba). La population nomade est

estimée à 3,5 %.

Le Tchad est une mosaïque ethnolinguistique constituée de plus de 250 groupes

différents. Les deux langues officielles sont le Français et l’Arabe. Depuis 2003, le Tchad est

devenu un pays exportateur de pétrole. Le Gouvernement a identifié un certain nombre de


8

secteurs définis comme prioritaires dont ceux de la santé et de l’éducation, pour bénéficier

d’une partie de ces ressources additionnelles, particulièrement en termes d’infrastructures à

construire. Selon l’OMS, sur le plan économique, le Tchad reste encore un pays très pauvre

malgré l’exploitation de son bassin pétrolier de Doba au sud du pays. En 2006, le pays

occupait le 171ième rang sur 177 pays du classement mondial et 55 % de sa population vit en

dessous du seuil de la pauvreté (OMS, 2009). Son système de santé est peu performant dû

essentiellement à l’insuffisance des ressources humaines qualifiées, des infrastructures

sanitaires et des équipements médicaux.

L’épidémie du VIH au Tchad est de type évolutif et généralisé qui pourrait être en

légère baisse ces dernières années, selon les dernières estimations de l’ONUSIDA (Onusida,

2013). Il est à noter que des pics de séroprévalence sont observés à Ndjamena, la capitale du

Tchad (8,3 %) et au Logone Oriental (9,8 %). Il existe en plus, une disparité entre le milieu

urbain (7 %) et le milieu rural (2,3 %). En fonction des tranches d’âges, la plus touchée pour

le sexe masculin (3,5 %) est la tranche d’âge de 25 à 29 ans ; pour le sexe féminin (5,6 %)

celles les plus concernées sont celles de 25 à 29 ans et celles de 30 à 34 ans. La tendance

évolutive de cette pandémie s’explique par la persistance des conflits armés et des

comportements sexuels à risque favorisés par les pesanteurs socio culturelles,

l’analphabétisme et la pauvreté. Malgré l’absence des résultats d’une enquête récente sur le

sujet, la première datant de 2005 donne une prévalence de 3,3 % chez les adultes de 15 à 49

ans dont 4 % chez les femmes et 2,6 % chez les hommes, avec des grandes disparités sous

régionales (Onusida, 2013; Ouagadjio et al., 2005). Ce même rapport stipule que les

estimations de l’ONUSIDA pour 2012 notifient que 210000 (180000-270000) personnes de

tous âges vivent avec le VIH au Tchad ; il semblerait aussi que 16000 (12000-21000)

nouvelles infections à VIH se produisent au Tchad (CNLS, 2012).

La Sérosurveillance sentinelle auprès des femmes enceintes lors de la consultation

prénatale organisée en 2010 dans 13 sites a montré une séroprévalence de 3,4 % (CNLS,

2012). Cette prévalence est plus élevée dans certains sites, comme ceux des régions du Lac et

de Logone occidental qui se chiffrent respectivement à 4,8 % vs 6,1 %. En termes de

couverture de centre de PTME, le Tchad est passé de 107 sites en 2010 à 140 sites en 2011.

Le nombre des femmes enceintes ayant bénéficié de la prophylaxie contre le VIH est passé de

834 en 2010 à 1611 en 2011. En 2012, 1680 femmes enceintes vivant avec le VIH ont reçu

des ARV pour la PTME (CNLS, 2012). Malgré tous ces efforts fournis, la PTME demeure un

maillon faible.


9

S’agissant de la couverture pour les ARV, l’ONUSIDA estime qu’en 2012, 35 014

adultes recevaient des ARV, soit environ 43% (38-51%) des patients qui en auraient besoin,

puisque selon les recommandations de l’OMS de 2010, environ 82000 personnes (73000-

98000) devraient en bénéficier (Onusida, 2013). Les décès dus au sida en 2012 ont été estimés

à 14000 cas (12000-19000). Entre 2011 et 2015, le nombre moyen annuel de personnes vivant

avec le VIH dont l’état de santé nécessitera un traitement par les ARV est estimé à 105 071

personnes ; les besoins actuellement couverts sont d’environ 4 % (CNLS, 2012).

Par ailleurs, une enquête socio comportementale et de séroprévalence sous régionale

menée en 2011 par le Projet d’Initiative du Bassin du Lac Tchad (PAIBLT) dans 4 régions du

Sud du pays appartenant au basin conventionnel du lac Tchad, a révélé une prévalence de 5,5

% dans la population générale. Ces régions sont caractérisées par une grande mobilité des

populations pour des raisons économiques. Cette prévalence relativement élevée tiendrait au

fait que l’échantillonnage utilisé est constitué en grande partie des groupes à risque

d’infection à VIH et n’a concerné que 4 régions sur les 22 que compte le pays.

Les données sur la situation au Tchad étant obsolètes, une Enquête Démographique de

Sérosurveillance (EDS) est prévue en 2014 mais n’a pas encore vu le jour.

2.4 Le monitoring biologique pour la prise en charge de l’infection à VIH

2.4.1 Evaluation des signes cliniques

La classification en stades cliniques est prévue pour les patients dont l’infection par le

VIH est confirmée par un test anticorps. Elle doit faire partie de l’évaluation initiale réalisée

au cours de la première visite à l’entrée d’un programme de prise en charge et de traitement.

Dans les pays à ressources limitées, l’OMS recommande que le suivi biologique soit réalisé

par la mesure des lymphocytes TCD4 et par l’évaluation des signes cliniques. Si la

numération des TCD4 n’est pas disponible, l’évaluation des signes cliniques doit être utilisée

pour guider les décisions quant à la mise sous prophylaxie par le Cotrimoxazole, à la mise

sous TAR ou au changement de TAR. Le traitement antirétroviral améliore l’état clinique et

contribue à un retour en arrière du stade clinique chez les patients ayant une maladie

symptomatique.

Toutefois, pour suivre l’efficacité du TAR, pour définir un échec thérapeutique ou

pour pointer la nécessité d’un changement de traitement, la validité de l’utilisation du stade

clinique est moins bien connue. Il est urgent que des études déterminent la pertinence des


10

critères cliniques (stade clinique sous traitement) afin de décider du moment opportun et de

changer le traitement en l’absence des tests de numération des CD4 et de la charge virale

(OMS, 2006).

Ces différentes phases de la maladie sont classées selon l’OMS en quatre stades (1, 2,

3 et 4) et selon la CDC en trois catégories (A, B et C).

Tableau 1 Classification de la maladie à VIH/ stades cliniques OMS

Classification de la maladie Stades Cliniques OMS

Asymptomatique 1

Modérée 2

Avancée 3

Sévère 4

2.4.2 Mesure des lymphocytes CD4

Le nombre de CD4 demeure le meilleur facteur pour prédire la survenue de

complications liées au VIH même après avoir commencé le traitement (Gadelha et al., 2002).

Le seul paramètre immunologique pertinent pour surveiller et prendre en charge les patients

infectés par le VIH est le nombre absolu de lymphocytes TCD4 circulants dans le sang.

Cependant, pour les distinguer des autres lymphocytes, on pratique un immuno-marquage

avec des anticorps anti-CD4 fluorescents et on compte les cellules marquées par cytométrie de

flux (une technique de numération automatique).

Valeurs normales des TCD4 : entre 600 et 1200/mm3

Il existe normalement en règle générale 1500 à 4000 lymphocytes/mm3 dont 70 % de

lymphocytes T parmi lesquels 60 % de TCD4 et 40 % de TCD8. Ainsi, le taux de TCD4 est

normalement supérieur à 600/mm3. Le taux de lymphocytes TCD4. Ce taux peut varier d'une

mesure à l'autre en raison de la variabilité du nombre de lymphocytes circulants.

Définition de l’échec virologique

Les définitions à la fois acceptables et fonctionnelles de l’échec immunologique sont

les suivantes: si le nombre de CD4 est inférieur à 100 cellules/mm3 après six mois de


11

traitement; ou encore s’il y a un retour au niveau des CD4 précédant le début du traitement

(ou chute en dessous de ce niveau) après six mois de traitement; ou si s’il y a chute du nombre

de CD4 à moins de 50 % de la valeur du pic obtenue sous traitement (lorsque cette valeur est

connue).

Le nombre de CD4 peut également permettre de déterminer quand il ne faut pas

changer de traitement (exemple: le cas d’un patient qui présente une nouvelle pathologie

définissant un stade 3 en raison de laquelle on envisage de changer de traitement, ou le cas

d’un patient asymptomatique dans le cadre de son suivi de routine habituel). Selon les

recommandations de l’OMS datant de 2006, il ne devrait pas être recommandé de changer de

traitement si le nombre de CD4 est supérieur à 200 cellules/mm3 (OMS, 2006). Les nouvelles

recommandations de l’OMS de 2013 encouragent par contre tous les pays à mettre en route le

TAR chez les adultes vivant avec le VIH quand leur système immunitaire est encore fort;

c’est à dire dès que le nombre des LTCD4 devient inférieur à 500cellules/mm3 ou moins. Les

précédentes recommandations de l’OMS, formulées en 2010, incitaient à proposer le

traitement au stade de 350 cellules CD4/mm3 ou moins. Plusieurs pays (90%) avaient adopté

les recommandations de 2010. Certains pays comme l’Algérie, l’Argentine et le Brésil,

proposaient déjà le TAR au seuil de 500 cellules CD4/mm3(OMS, 2013).

2.4.3 Mesure de la charge virale

La mesure de la concentration plasmatique de l'ARN du VIH (ou charge virale) évalue

l'intensité de la réplication du virus dans l'organisme qui se situe en fait non dans le sang mais

bien dans les organes lymphoïdes. Le niveau de réplication du virus, estimé par la charge

virale, est le paramètre le plus précis et le plus précoce pour prédire l'évolution clinique

ultérieure. L'ARN viral est évalué par une technique d'amplification génique, la technique de

polymérisation en chaîne PCR.

Compte tenu des variations de sensibilité des tests utilisés, il est important qu'un

patient soit suivi dans un même laboratoire avec la même technique. Les résultats sont

présentés à la fois sous la forme de la charge virale proprement dite (nombre de molécules

d'ARN viral ou copies par ml de plasma) et sous sa transformation logarithmique (log10 du

nombre de copies/ml). Toutefois, l'incertitude sur la mesure de la charge virale est élevée. On

considère que seule une variation de 0,5 log10 copies/ml est significative. Ce qui équivaut à


12

un nombre de copies multiplié ou divisé par 3. Ainsi, une charge virale qui passe de 10 000 à

50 000 copies/ml correspond à une réelle augmentation, alors que le passage de 100 000 à 200

000 copies/ml n'est pas significatif.

La variabilité de la mesure est liée à deux phénomènes intriqués. Le premier

phénomène est technique: Il fait référence à la variabilité des conditions de mesure au

laboratoire. Le deuxième porte sur la fluctuation de la quantité de virus présents dans le

plasma qui cause souvent des résultats faux positifs appelés « blips ».

Les principales méthodes de mesure de la charge virale sont résumés dans le tableau ci

dessous (Hocini & Andreoletti, 2009; Serge et al., 2009).

Tableau 2 Comparaison des différentes techniques de mesure de la charge virale

2.4.4 Tests de résistance: le phénotypage (antivirogramme) et le génotypage

De nos jours, deux méthodes sont employées pour évaluer la résistance du VIH aux

différents médicaments: les tests phénotypiques et génotypiques. Les premiers reposent sur la

détermination de la concentration de produit actif nécessaire pour inhiber la réplication virale

de 50 % ou 90 %. S’agissant de la résistance phénotypique, elle est mesurée en comparant la

valeur de la concentration inhibitrice (CI) des isolats viraux testés à celle d’isolats de souche

sauvage. Une valeur élevée de la CI reflète cependant une perte de sensibilité du virus vis-à-

vis de tel ou tel agent antirétroviral (Larder B.A., 2000).


13

Les tests génotypiques sont fondés sur l’analyse des séquences du gène de la Protéase

et de la Reverse transcriptase. La résistance génotypique reflète la présence de mutations à

l’origine de résistances phénotypiques ou cliniques (Sheldon & Condra, 1999). Il existe

généralement une corrélation entre le nombre de mutations associées à la résistance aux

différents médicaments et l’augmentation de la CI50. La résistance à un médicament

antirétroviral dépend de la présence de mutations majeures ou mineures. Une mutation

majeure est celle dont l’unique présence induit un niveau de résistance élevé à un ARV

donné. Dans le cas des mutations mineures, l’accumulation de plusieurs substitutions

secondaires est nécessaire pour observer un phénotype de résistance élevé (Larder B.A.,

2000).

Le Séquençage

Le séquençage de l’ADN a été inventé dans la deuxième moitié des années 1970.

Deux méthodes ont été développées indépendamment: l’une par l’équipe de Walter Gilbert,

(Maxam and Gilbert 1977) aux États-Unis, et l’autre par celle de Frederick Sanger (Sanger,

Nicklen et al. 1977) en Grande-Bretagne. Ces deux méthodes sont fondées sur des principes

diamétralement opposés: l’approche de Sanger est une méthode par synthèse enzymatique

sélective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une méthode par dégradation chimique

sélective. Pour cette découverte, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de

chimie en 1980 (Kolata 1980). Par ailleurs, la première méthode non Sanger ayant fait ses

preuves dans le domaine du séquençage a été introduite en 1988 (Hyman, 1988; Ronaghi,

2001). Il s’agit du pyroséquençage, une technique principalement basée sur l’addition d’un

seul nucléotide qui est révélé en temps réel par détection de la luminescence.

Principe de la méthode de Sanger et Nicklen

Cette méthode se base sur l’interruption de la synthèse enzymatique d’un brin d’ADN

complémentaire (arrêt d’élongation). L’ADN à séquencer est cloné et de nombreuses

molécules d’ADN simple brin sont produites. Une courte amorce d’oligonucléotides

(généralement synthétisée chimiquement et éventuellement marquée) est ajoutée à l’ADN. Le

point de fixation de l’amorce sert de point de départ pour la synthèse du brin complémentaire

(Lamoril et al., 2008).


14

Comme pour la méthode précédente, les bandes sont révélées par autoradiographie et

la séquence est lue directement sur le gel. Une adaptation de cette technique consiste à

marquer les didéoxynucléotides plutôt que les amorces, ce qui permet de n’utiliser qu’un seul

mélange au lieu des quatre nécessaires dans le cas d’un marquage des amorces. Chaque

didésoxyribonucléotides est marqué par un fluorochrome spécifique. Les fragments d’ADN

synthétisés portent ce fluorochrome terminal. On les appelle des terminateurs d’élongation ou

des «BigDye Terminators» ou des «Dye-labeled terminator». Dans ce cas on parle d’un

séquençage par arrêt de synthèse à l’aide d’un terminateur marqué « dye terminator

sequencing» tel que proposé par Smith et al. (Smith, Sanders et al. 1986). C’est la technique

actuellement utilisée dans certains séquenceurs automatisés.

Figure 1 Principe du séquençage selon la méthode de Sanger

Après dénaturation du produit amplifié par séquençage, l’un des deux brins s’hybride

à une amorce spécifique. Le mélange réactionnel contient, outre les tampons et l’ADN

polymérase, des déoxynucléotides triphosphates (dNTP, dA-, dC-, dG-, dT-TP), mais aussi

des didéoxynucléotides triphosphates (ddNTP, ddA-, ddC-, ddG-, ddT-TP). L’incorporation

aléatoire d’un ddNTP à la place d’un dNTP ne permet plus la polymérisation par l’ADN

polymérase entrainant l’arrêt de l’extension.

À la fin de la réaction de séquence effectuée selon des cycles thermiques identiques à

ceux de la PCR (on parle de PCR asymétrique, une seule amorce étant utilisée au lieu de

deux), nous avons des fragments de taille différente. Ces fragments sont soumis à migration

dans un champ électrique. Il s’agit le plus souvent d’une électrophorèse capillaire. Chaque

ddNTP étant marqué par un fluorochrome différent, un signal lumineux sera généré,

spécifique de la base didéoxy incorporée. Les fragments étant de taille différente et la

résolution allant jusqu’à une base de différence, il sera simple de recueillir ce signal et en


15

déduire la séquence. Les signaux lumineux sont analysés par un logiciel spécifique, et le

résultat de l’analyse peut être lu, par exemple, sous forme d’un électrophorégramme de

lecture facile. Des logiciels d’interprétation des séquences sont également disponibles. Pour

confirmer un résultat, toute réaction de séquence d’un fragment d’ADN est systématiquement

faite sur le brin sens et le brin antisens.

Principe de la Méthode de Maxam & Gilbert (Maxam & Gilbert, 1977)

Cette technique est pratiquement abandonnée de nos jours. Nous la décrirons

brièvement pour des raisons historiques. Cette méthode utilise des échantillons d’ADN double

brin et ne nécessite donc pas le clonage de l’ADN dans un vecteur pour produire de l’ADN

simple brin comme c’est le cas pour la méthode de Sanger. Cette méthode est basée sur une

dégradation chimique de l’ADN et emploie les réactivités différentes issues des quatre bases

A, T, G et C, pour réaliser des coupures sélectives. En reconstituant l’ordre des coupures, on

peut remonter à la séquence des nucléotides de l’ADN correspondant.

La méthode de Maxam et Gilbert nécessite des réactifs chimiques toxiques et reste

limitée quant à la taille des fragments d’ADN qu’elle permet d’analyser (< 250 nucléotides).

Moins facile à robotiser, son usage est devenu aujourd’hui confidentiel.

2.5 Les mécanismes d’action des antirétroviraux

2.5.1 Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase Inverse

(INTI)

Ces molécules sont des pro-médicaments qui doivent être triphosphorylés dans la

cellule pour être actifs. Ils entrent alors en compétition avec les nucléosides naturels. Ils sont

dépourvus de groupement hydroxyles en 3’ de sorte que leur incorporation empêche l’enzyme

de procéder à l’incorporation d’un nouveau nucléotide, entraînant l’arrêt simple de

l’élongation. La principale toxicité imputée à cette classe de molécules concerne la toxicité

mitochondriale due à l’inhibition non spécifique de l’ADN polymérase mitochondriale.

Plusieurs organes et tissus sont concernés comme le pancréas et les muscles. En particulier,

les analogues de la thymidine sélectionnés essentiellement pour l’AZT et la d4T sont

impliqués dans la survenue de lipoatrophies plus ou moins sévères.


16

2.5.2 Inhibiteurs Non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INNTI)

Les médicaments de cette classe ne sont pas des analogues compétitifs de nucléosides.

Ils ne rentrent pas non plus en compétition avec l'ARN génomique viral au site actif de

l'enzyme. Ces molécules se fixent sur des résidus aminoacides de l'enzyme, à proximité du

site catalytique dont ils modifient la structure, ce qui rend l'enzyme inactive.

Ces médicaments agissent sans interférer directement avec les substrats de l'enzyme,

ce sont donc des inhibiteurs non compétitifs. Ils sont spécifiques de la Reverse Transcriptase

du VIH1 et donc inactifs sur le VIH 2. L'action sur le cours de l'infection est la même que

celle des INTI. Il s'agit de NVP (Viramune®), de Delavirdine (Rescriptor®) et d’EFZ

(Sustiva®).

2.5.3 Inhibiteurs de la Protéase (IP)

Les inhibiteurs de la Protéase appelés aussi antiprotéases comme le Saquinavir

(Invirase®) sont des molécules de nature encore différente qui ciblent une autre étape du

cycle viral. Développés par génie biochimique à partir de la structure tridimensionnelle de la

Protéase, le saquinavir est un pseudopeptide (nature chimique proche du peptide avec

structure similaire) analogue d’un point de vue structural de la séquence peptidique du site de

clivage reconnue par la Protéase. Il s'insère au site catalytique, à l'interface entre les deux sous

unités du dimère qui constitue l'enzyme, et bloque son activité protéolytique de façon

sélective et réversible. Son activité sur les Protéases humaines analogues est

approximativement 50000 fois plus faible.

Ces molécules sont métabolisées par le cytochrome P450, ce qui est à l’origine de

nombreuses interactions médicamenteuses. De ce fait, les associations de deux IP ou d’IP et

INNTI peuvent nécessiter des ajustements posologiques. L’utilisation des IP est associée à

des degrés divers, à une redistribution des graisses, à des troubles de la glycorégulation et à

des hyperlipidémies.

En présence d'antiprotéases, la maturation des précurseurs des protéines constitutives

de la particule virale est donc rendue impossible ce qui bloque la formation des particules

virales ou engendre des particules incomplètes et non infectieuses. Leur action se situe en aval

de celle des inhibiteurs de la Reverse Transcriptase.


17

2.5.4 Inhibiteurs d’Intégrase

En 2013, la molécule de cette classe ayant une AMM est le Raltégravir (Isentress®)

qui est disponible depuis 2007. L’intégrase du VIH-1 catalyse à la fois les réactions de 3’

processing et de transfert de brin. Les anti-intégrases quant à eux bloquent spécifiquement

cette réaction de transfert du brin, empêchant ainsi l’incorporation de l’ADN viral dans la

cellule hôte. Ce mécanisme interrompt le cycle de multiplication du virus. Ces inhibiteurs de

l’Intégrase sont appelés des INSTI « Integrase Strand Transfer Inhibitor ». Cette dernière a

eu un impact majeur sur les stratégies de traitement contre le VIH. D’autres molécules sont en

cours de développement: il s’agit de l’Elvitégravir (GS 9137) et du Dolutégravir (S/GSK 572)

(Javaugue, 2014).

2.5.5 Inhibiteurs d’entrée

Des nouvelles classes de molécules sont maintenant utilisables pour améliorer la prise

en charge thérapeutique des patients VIH et pour permettre de diminuer la multiplication du

virus. Ces molécules agissent sur les différentes étapes d’entrée du virus dans la cellule cible :

fixation sur la molécule CD4 (anti-CCR5), fusion entre l’enveloppe et la membrane cellulaire

(inhibiteurs de fusion) et intégration du génome viral (anti-intégrase).

a. Inhibiteurs des récepteurs aux chimiokines

Appelées encore antagonistes du CCR5 (Maraviroc), ces molécules se fixent sur la

région transmembranaire du récepteur gênant ainsi la fixation de la GP120. Elles sont

utilisables en primo-infection sur un virus à tropisme CCR5. Elles ont des effets non

spécifiques sur les récepteurs aux chimiokines des cellules non infectées.

b. Inhibiteurs de fusion

Ce groupe de médicament est représenté par l’Enfuvirtide (ou T20) qui est un

analogue d’une région de la protéine d’ancrage GP 41 du virus empêchant dès lors la fusion

de la GP120 avec la membrane cellulaire et donc la pénétration cellulaire. Ces médicaments

sont utilisables en association avec les autres molécules sur les souches virales résistantes.

Leurs effets secondaires indésirables sont essentiellement locaux (nodules).

c. Inhibiteurs de l’intégration du génome viral

Le Raltégravir, inhibiteur d’intégrase qui a son AMM depuis janvier 2007, agit par


18

inhibition du transfert de brin de l’ADN proviral sur le génome cellulaire(J.-M.M., 2008).

2.6 La problématique et les mécanismes de résistance du VIH aux ARV

La résistance se définit comme étant la capacité du VIH à se répliquer en présence

d’antirétroviraux qui empêchent habituellement sa réplication. La résistance du VIH aux

antirétroviraux est provoquée par des changements au niveau génétique (mutations). Ces

mutations sont très fréquentes dans le cas du VIH car ce dernier se réplique très rapidement et

n’est pas doté d’une machinerie de correction des erreurs au cours de ces processus.

Mutation majeure: c’est une mutation dont l’unique présence induit un niveau de résistance

élevé à un médicament donné.

Mutations mineures: ce sont des mutations dont l’accumulation de plusieurs substitutions

secondaires est nécessaire pour observer un phénotype de résistance élevé.

Résistance primaire: c’est la transmission d’une souche virale résistante; elle s’observe chez

un patient naïf de tout traitement antirétroviral. Elle peut être naturelle ou transmise lors de

l’infection.

Résistance secondaire: c’est une mutation qui est due à la sélection d’un virus résistant sous

traitement non-optimal. Elle apparait chez un patient VIH en échec thérapeutique.

Résistance croisée: Elle apparait lorsqu’une ou plusieurs mutations sélectionnées par un

antirétroviral causent aussi des résistances à d’autres molécules antirétrovirales de la même

classe. A titre illustratif, la M41L qui crée une résistance à l’AZT, à la d4T, à la ddI, à l’ABC

et à la TDF.

2.6.1 Problématique de la résistance du VIH aux ARV

Les mécanismes et la cinétique d’acquisition des mutations de résistance diffèrent

selon les classes des antirétroviraux. La prévention des mutants résistants nécessite de

maintenir une charge virale sous traitement inférieur à la limite de détection. L’adhérence du

patient au traitement est le facteur le plus important pour prévenir l’émergence de la

résistance du VIH. Cependant, le choix des ARV dans un traitement de relais requiert une

concertation multidisciplinaire associant cliniciens, virologues et pharmacologues.

La résistance du VIH-1 aux antirétroviraux est liée à la présence des espèces virales

présentant des mutations sur le génome viral, lesquelles réduisent la sensibilité du virus par


19

rapport à celle d’un virus sauvage. Cette résistance peut être naturelle, comme celle du VIH2

pour les INNTI ou de l’enfuvirtide, transmise ou primaire (en l’absence de traitement

préalable). La fréquence de la résistance à au moins un antirétroviral est plus grande chez les

patients diagnostiqués au moment de leur primo-infection que chez les patients plus

anciennement infectés. La souche sauvage possède une capacité réplicative meilleure que les

souches mutées qui ne seront plus détectées par les tests de routine au fur et à mesure de

l’évolution de l’infection.

La résistance peut être également secondaire, acquise, liée à l’émergence de souches

comportant des mutations dans les gènes qui codent les cibles des antirétroviraux sous l’effet

de la pression de sélection d’un traitement non optimal. Les différentes mutations sont

archivées dans les cellules à durée de vie longue et préexistent déjà dans les cellules de l’hôte

avant la mise en place du traitement. Le développement de ces résistances est un facteur

indépendant d’échec virologique (Bigaillon, Mérens, & Rapp, 2010).

Plusieurs facteurs favorisants peuvent être responsables de l’installation des

résistances. Ces facteurs peuvent être entre autres, la préexistence chez les sujets des

mutations de résistances. Cela est favorisé le plus souvent par l’inefficacité du traitement

administré, sinon par la mauvaise observance, ou encore par les interactions médicamenteuses

ou la malabsorption. Certains facteurs cellulaires, tels que des défauts de métabolisation ou

des mécanismes d’efflux, pourraient également être un facteur favorisant le développement de

la résistance. Cependant, leur implication est encore mal connue. Ces souches résistantes ont

le plus souvent une capacité réplicative inférieure à la population sauvage (Delaugerre et al.,

2007). Leurs mutations sont responsables de modifications structurales ou fonctionnelles des

cibles des antirétroviraux.

Néanmoins, le nombre et le type de mutations entraînant un phénomène de résistance

est variable selon la molécule antivirale concernée. Par exemple, la résistance aux INNTI est

un phénomène de « tout ou rien » liée à une seule mutation qui entraînera une résistance

croisée à tous les INNTI de première génération (NVP et EFZ). Ces molécules ont une faible

barrière génétique à l’inverse des inhibiteurs de Protéase pour lesquels plusieurs mutations

sont nécessaires pour induire une résistance (Kempf et al., 2001).

Pour les pays à faibles revenus, avec l’extension des traitements ARV qui s’est opérée

entre 2003 et 2010, la prévalence de la résistance transmise a augmentée culminant à 6,6 % en


20

2009 [IC] à 95 % : 5,1–8,3 %. Elle s’est notamment accrue pour les INNTI en Afrique où elle

a atteint un taux de 3,4 % [IC] à 95 % : 1,8–5,2 %. Cette prévalence est qualifiée de modérée

(5-15 %) dans 20 des 72 enquêtes OMS (soit 28 %) relatives à la résistance transmise menée

entre 2004 et 2010. Concernant les résistances acquises, les personnes en échec virologique, si

elles sont mises sous schéma thérapeutique de deuxième intention peu de temps après l’échec,

ont des chances de ne pas développer de résistance aux médicaments. L’OMS affirme

qu’entre 2006 et 2010, la prévalence à un ARV quelconque est passée de 4,8 % en 2007 à 6,8

% en 2010 chez des patients débutant un TARV (OMS, 2012).

L’échec thérapeutique n’est pas seulement dû à l’apparition d’une mutation de

résistance au niveau du virus, mais peut également s’expliquer aussi par une faible observance

ou une interruption prolongée du traitement. Nous nous intéresserons dans un premier temps,

tout au long de ce travail, à étudier la résistance acquise puisque sa connaissance permettrait

l’évaluation de la performance du programme de surveillance mis en place au niveau national,

en termes de suppression de la réplication virale. Nous décrivons dans un deuxième temps, les

profils des résistances aux ARV chez les PVVIH sous traitements. Ceci permettrait aux

cliniciens, une optimisation du choix des combinaisons des antirétroviraux à prescrire.

2.6.2 Mécanisme de résistance du VIH aux INTI

Ce sont des analogues des nucléosides ou des nucléotides naturels avec lesquels ils

entrent en compétition. Ne disposant pas de groupements OH en 3’, ils agissent en bloquant

l’élongation de la chaine. Le virus développe cependant deux mécanismes de résistance à ce

groupe des médicaments (Hirsch et al., 2008): le premier mécanisme concerne l’excision de

l’analogue Nucléosidiques incorporé permettant ainsi la reprise de l’élongation de la chaine.

L’excision de l’analogue Nucléosidiques déjà incorporé est conférée par les mutations

appelées TAMs pour « thymidine analogue mutations ». Elles sont sélectionnées

séquentiellement par les analogues de la thymidine et comprennent les mutations M41L,

D67N, K70R, L210W, T215Y/F et K219Q/E. Elles confèrent une forte résistance à l’AZT et

à la d4T. La plus fréquente de ce groupe de 6 mutations TAMs est la T215Y/F, alors que

K70R et K219Q/E ont moins d’impact que les quatre autres dans cette résistance croisée. Ces

TAMs peuvent entraîner un niveau de résistance variable aux autres INTI dont l’ABC, la ddI,

le TDF, et la ddC. Elles peuvent favoriser l’apparition d’autres mutations telles que la 44D/A

et 118I.


21

Notons que dans tous les cas, l’impact de la résistance dépend du profil et du nombre

de TAMs observés (Calvez et al., 2002; Johnson et al., 2010; Kellam, Boucher, & Larder,

1992; Kuritzkes et al., 2004; Larder & Kemp, 1989; Whitcomb, Parkin, Chappey, Hellmann,

& Petropoulos, 2003). La mutation M184V en présence de TAMs augmente la résistance in

vivo à l’ABC et n’a pas d’impact sur le TDF et la ddl (Doualla-bell et al., 2010). Cette

mutation peut être responsable d’une faible résistance à l’ABC et à la ddl (Whitcomb et al.,

2003). Le second mécanisme consiste en la diminution de l’incorporation des

nucléosides/nucléotides artificiels au profit des nucléosides naturels induite par des mutations

au site actif de l’enzyme ou à distance. Il convient de mentionner que la barrière génétique

pour ce groupe des ARV est variable selon les molécules (Bigaillon et al., 2010).

2.6.3 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux INNTI

Ils inhibent l’action de l’enzyme (la Reverse Transcriptase) de façon non compétitive

en se fixant directement sur une poche hydrophobe de l’enzyme située près du site actif et en

empêchant la mobilité de certains domaines de l’enzyme. Un seul changement d’acide aminé

entraine une diminution de l’affinité de l’inhibiteur (Bigaillon et al., 2010). La barrière

génétique est très faible pour ce groupe de médicament si bien qu’une seule mutation telle que

la K103N ou la Y181C pour ce groupe peut engendrer une résistance totale et irréversible

(Villar et al., 2009). Cependant, la mutation K103N n’a aucun impact délétère sur la réponse

virologique à l’Etravirine. En outre, la Y181C n’est associée à une diminution de la réponse

virologique qu’en présence d’autres mutations dans cette classe des INNTI (Vingerhoets et

al., 2007).

2.6.4 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux IP

Les Inhibiteurs de la Protéase agissent selon le modèle de la «clé et la serrure» c’est à

dire qu’il y a perte d’affinité. Les mutations majeures ou mineures sont souvent sélectionnées

et sont plus ou moins spécifiques de l’inhibiteur et ont un effet important sur la diminution de

la sensibilité du virus à l’antirétroviral concerné.

Les inhibiteurs de la Protéase ont une action tardive dans le cycle en bloquant l’action

de la Protéase qui clive les polypeptides précurseurs. Ils empêchent la maturation des néo

virions qui ne pourront pas infecter d’autres cellules. La résistance intervient lorsqu’il y a

accumulation des mutations dont toutes n’ont pas les mêmes impacts. Les mutations


22

secondaires ou mineures ont peu d’effet sur le niveau de résistance déjà atteint La barrière

génétique des IP est élevée, il faut cependant l’accumulation de plusieurs mutations pour voir

apparaître la résistance (Bigaillon et al., 2010).

2.6.5 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux antiintégrases

L’intégrase du VIH agit en se fixant sur l’extrémité de l’ADN viral après retro

transcription pour digérer l’extrémité 3’, puis elle insère l’ADN-VIH proviral dans l’ADN

génomique. Les Inhibiteurs d’Intégrase se fixent sur le complexe ADN viral-enzyme au

niveau du site catalytique de l’intégrase en bloquant la fixation cellulaire. Les mutations de

résistance apparaissent cependant autour du site catalytique de l’enzyme. Elles entrainent

ainsi donc des changements conformationnels qui diminuent l’affinité du médicament qui ne

peut plus exercer son pouvoir de chélateur des cations nécessaires au fonctionnement de

l’enzyme. La barrière génétique pour ce groupe de médicaments est faible, une seule mutation

suffit pour induire une résistance (Bigaillon et al., 2010).

2.6.6 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux inhibiteurs d’entrée (de fusion)

Le médicament se lie à la région HR1 de la gp41 et bloque son changement

conformationnel qui permet l’insertion du peptide de fusion dans la membrane cellulaire. La

résistance du VIH-1 à l’Enfuvirtide ou T20 est liée à l’acquisition par le virus des mutations

dans le région HR-1 du gène de la gp41 dans une région allant des acides aminés 36 à 45 (A.

Marcelin & Calvez, 2007; Yeni, 2008).

2.6.7 Mécanisme de résistance du VIH-1 aux inhibiteurs de CCR5

C’est par l’intermédiaire de la boucle V3 que les corécepteurs CCR5 et CXCR4

interagissent en réponse à la formation de la liaison gp120-CD4 entrainant le changement de

la conformité de l’enveloppe. Les molécules antirétrovirales bloquent donc l’interaction de la

gp120 avec le CCR5 en modifiant sa conformation. Ces ARV sont efficaces sur les virus à

tropisme R5 mais pas sur ceux à tropisme X4 ou mixte (R5+X4) ou encore sur les doubles

populations R5/X4. Néanmoins, deux mécanismes de résistance à ces médicaments : le

premier correspond au changement de tropisme du virus par l’émergence de souches X4

préexistantes sous forme d’une population minoritaire non initialement détectée (Bigaillon et

al., 2010). Le second mécanisme consiste en l’apparition des mutations dans la boucle V3 ou


23

dans d’autres régions de la gp120. Même si les mutations des acides aminés 13 et 26 semblent

importantes, il n’y a aucune signature spécifique de résistance identifiée à ce jour (Hirsch et

al., 2008; Morand-joubert, 2009). Aucune résistance croisée n’existe entre les inhibiteurs de

CCR5 et les autres classes thérapeutiques des antirétroviraux (A. Marcelin & Calvez, 2007;

Yeni, 2008).

III. But, hypothèses, objectifs et plan du travail

3.1. Le but de l’étude

Le but de cette étude est de contribuer au bien être des PVVIH en proposant des

méthodes alternatives pour une meilleure prise en charge.

3.2. Les hypothèses de recherche

L’utilisation du DBS pour les tests de résistance, permettra de limiter les exigences

strictes liées à l’échantillon (stockage, transport et conservation).

Un monitoring biologique basé sur les méthodes de l’ANRS pour la détection des

mutations de résistance permettra un suivi biologique efficace et à moindre coût des

patients VIH-1 positifs.

La connaissance du profil génotypique du VIH chez des patients sous traitement ARV

permettra de proposer des protocoles thérapeutiques plus efficaces.

3.3. L’objectif général

Etant donné qu’au Tchad les tests de résistance ne sont pas encore disponibles, notre

objectif dans le cadre de cette thèse, est d’évaluer et de mettre en place des méthodes

alternatives pour le monitoring biologique de la résistance du VIH aux ARV chez les PVVIH

au Tchad.

3.4. Les objectifs spécifiques

Chez les patients vivants avec le VIH au Tchad, sous traitement pendant au moins 6

mois, nous entendons:

faire une évaluation immunovirologique avant et après traitement;

quantifier la charge virale et évaluer les différentes techniques disponibles;


24

identifier chez ces sujets les différentes mutations de la Reverse Transcriptase et de la

Protéase associées à la résistance du virus et en évaluer la prévalence sur DBS et plasma;

évaluer la technique ASPCR afin de détecter les mutations ponctuelles associées à la

résistance du VIH-1 pour les sous-types non-B;

déterminer la prévalence de la résistance acquise et la diversité génétique des sous-types

du VIH-1 circulants à N’Djamena.

Chaque objectif spécifique énuméré ci-dessus fait l’objet d’un chapitre dans ce document.

3.5. Le plan du travail

Ce travail est structuré en sept chapitres et chacun d’eux répond à une problématique

bien définie. Les deux premiers chapitres retracent la situation globale du VIH, les

médicaments antirétroviraux ainsi que leurs mécanismes d’action et de résistance Le matériel

et la méthodologie sont aussi décrits dans ces deux premiers chapitres. Les résultats

répondants aux objectifs spécifiques sont résumés dans les cinq derniers chapitres.

Le premier chapitre est une introduction générale qui donne une brève définition du

VIH/SIDA. Il décrit les différentes classes de médicaments antirétroviraux avec leurs

mécanismes d’action ainsi que leurs mécanismes de résistance. La problématique de la

résistance est aussi décrite dans ce chapitre. A la fin de ce chapitre, une revue nous renseigne

d’avantage sur l’importance de l’utilisation du DBS pour le monitoring biologique dans les

pays à ressources limitées.

Le deuxième chapitre décrit le matériel utilisé et la méthodologie adoptée pour

répondre à la question de recherche à travers nos objectifs généraux et spécifiques.

Les cinq autres chapitres font partie des résultats et répondent aux objectifs spécifiques

et seront structurés de la façon suivante:

Le troisième chapitre renseigne sur la possibilité d’une prise en charge des PVVIH

par l’évaluation immunovirologique (mesure des lymphocytes TCD4 et la Charge Virale).

Une première partie est consacrée à l’évaluation immunovirologique. La dernière partie traite

l’évaluation immunovirologique uniquement chez les patients qui étaient sous Triomune. Un

article publié à ce sujet est mis à la fin du chapitre.

Le quatrième chapitre compare trois différentes techniques de meures de la charge

virale (Abbott RealTime, CAP/CTM V2.0 et la technique de l’ANRS) disponibles au


25

Laboratoire de Référence Sida du CHU de Liège. Ce chapitre donne le nombre des patients en

échec virologique et la prévalence de la suppression virale chez les patients.

Le cinquième chapitre traite l’importance de l’utilisation du DBS pour le monitoring

biologique dans les pays à ressources limitées.

Le sixième chapitre relate de long en large la diversité génétique du VIH et la

prévalence de la résistance acquise à N’Djaména au Tchad.

Le Septième chapitre reprend la prise en charge par le monitoring biologique mais en

utilisant la technique de détection des mutations ponctuelles (ASPCR) sur du plasma et sur

DBS.

Nous introduisons chaque chapitre par une brève présentation, suivie de la

méthodologie utilisée. Nous présenterons ensuite les résultats originaux et nous résumerons

les résultats à la fin du chapitre.

A la fin de ce document, sera présentée une discussion générale qui reprend les

différents chapitres pour une discussion beaucoup plus approfondie. Enfin, une conclusion

générale et les perspectives d’avenir viendront mettre un terme à ce travail.

26

Article: Utilisation du Dried Blood Spots (DBS) pour améliorer le

diagnostic et la prise en charge du VIH en milieux à ressources limitées.

Cet article comme nous l’avions dit dans la problématique en début du chapitre I, nous

renseigne d’avantage sur l’utilisation du DBS dans les milieux à ressources limitées. Il décrit

largement les avantages et les limites liés à l’utilisation du DBS dans le diagnostic de

l’infection à VIH ainsi que dans le monitoring biologique.

Chapitre II : Matériel et Méthodes

33

Chapitre II

Matériel et Méthodes


34

CHAPITRE II- Matériel et méthodes

II.1 Le matériel

2.1.1 Matériel de collecte des données

Ce matériel est constitué essentiellement d’une fiche de consentement éclairé (Annexe

4) et d’une fiche contenant un questionnaire standardisé pour la collecte des informations

socio-épidémiologiques et professionnelles (Annexe 3).

2.1.2 Matériel de prélèvement

Le prélèvement du sang veineux a lieu à l’aide de matériel adéquat stérile. Il est

constitué de : garrot, tubes à EDTA de 4ml, cryotubes de 2ml, aiguille vacutainer, douille

pour prélèvement, compresse stérile, alcool à 70° pour désinfection de la zone à ponctionner ;

papier buvard Wathman 903, desséchants, sparadrap.

II.2 Les méthodes

2.2.1 Site de l’étude

Notre étude s’est déroulée à l’Hôpital Général de Référence National de N’Djaména

(HGRN). Le choix du site n’est pas fortuit, car pendant la période de la collecte de nos

échantillons, cet hôpital est le seul où l’on pratique le suivi immunovirologique (charge virale

et CD4). Il se trouve à N’Djaména, la capitale de la République du Tchad. Les analyses de

biologies moléculaires sont réalisées au Laboratoire de Référence Sida du CHU de Liège.

2.2.2 Description du site de l’étude

L'Hôpital Général de Référence Nationale (HGRN) est un établissement public à

caractère administratif doté de la personnalité morale et de l’autonomie financière. Il est placé

sous la tutelle du Ministère de la Santé Publique et d'un Conseil d'Administration. Il dispose

essentiellement des services et d'unités de soins qui couvrent la quasi-totalité des besoins de

santé. L’éventail très large des activités s’adresse à toute la population tchadienne. Sur le plan

organisationnel, l’hôpital se divise en quatre grands départements regroupant des différents

services techniques et médicaux. La population de N'Djaména s’élève à 993 492 habitants

pour une population générale de 11 274 106 habitants en 2009. Jusqu’au moment où nous


35

avons collecté les échantillons, le HGRN demeurait le seul endroit où se réalisait la charge

virale sur Abbott RealTime pour le suivi biologique de l’infection à VIH. Les tests

génotypiques ne sont actuellement pas encore disponibles au Tchad.

2.2.3 Type d’étude

Pour atteindre notre objectif, nous avons eu recours à deux types d’études: l’une étant

transversale prospective et rétrospective et l’autre étant expérimentale.

2.2.4 Durée de l’étude

La collecte des échantillons a duré 10 mois (1er avril 2011 au 31 janvier 2012). La

durée totale de l’étude est de quatre années. La première année était consacrée à la revue

bibliographique sur le sujet et à l’apprentissage de techniques de biologie moléculaire au LRS

de Liège. La deuxième année était dédiée à la collecte des données et des échantillons au

Tchad et leur transport à Liège. Au cours de cette deuxième année, les premières analyses et

notamment les charges virales, ont été réalisées et les résultats ont été transmis aux médecins

traitants au Tchad. Au cours de la troisième et quatrième année, s’en est suivi la suite des

analyses, la rédaction des articles et de la thèse.

2.2.5 Taille de l’échantillon

Puisqu’il s’agit d’une étude transversale, nous avons utilisé la formule de Lorentz (n=

Z21-α [p (1-p)/α

2]) pour calculer la taille de notre échantillon :

n: taille de l’échantillon recherchée; La prévalence de la résistance rapportée par Koyalta et

al. (2009) est de 64% (p = 0,64); α: marge d’erreur à 5 %= 0.05; Z1-α: intervalle de confiance

95% = 1.96.

n = 92,16; or nous avons enrôlé 116 patients dans l’étude.

2.2.6 Méthode d’échantillonnage

Notre échantillonnage se compose des sujets sous traitement ARV en échec

virologique ou en suspicion d’échec des deux sexes et suivis à l’Hôpital Général de Référence


36

Nationale au Tchad depuis plus de six mois. Au moins 116 patients (soit 78 femmes et 38

hommes respectivement 67,24 % et 32,76 %) ont été enrôlés dans notre étude.

Notre échantillonnage utilisé est de type consécutif non exhaustif. Tout patient qui

vient à l’hôpital pendant la période de l’étude et qui répond aux critères de sélection est inclus

dans l’étude.

2.2.7 Critères d’inclusion

Patient sous traitement ARV, des deux sexes et suivis à l’Hôpital Général de

Référence Nationale pendant au moins 6 mois.

Sujet en situation d’échec thérapeutique ou suspicion d’échec notifiée par le médecin.

2.2.8 Critères d’exclusion

Sujet refusant volontairement de faire partie de l’étude.

Tout sujet en transit dans à l’Hôpital Général de Référence Nationale et dont le

dossier ne contient pas ou contient peu d’informations.

2.2.9 Procédure de recueil des données

Les objectifs de l’étude, son importance et sa bienfaisance sont expliqués à tous les

patients afin d’obtenir leur consentement éclairé. Les informations socioprofessionnelles du

patient sont récoltées dans un questionnaire bien standardisé après qu’il ait accepté de faire

partie de l’étude. Une fiche de consentement éclairé est signée par chaque patient avant le

prélèvement.

2.2.10 Procédure de collecte des échantillons

L’échantillon que nous avons utilisé est le sang veineux qui est d’abord recueilli dans

deux tubes EDTA de 4 ml chacun. Les deux tubes sont remués doucement pour mélanger le

sang avec l’anticoagulant.

Pour le DBS, un papier buvard de type Wathman 903 est employé avec ce sang total.

Sur le DBS dûment préparé, il est inscrit les informations suivantes: les initiales du patient, sa

date de naissance, la date du prélèvement et le numéro d’identification de la fiche. A partir du

sang total prélevé sur tube EDTA, 75 µl sont prélevés à l’aide d’une micropipette et sont


37

déposés sur le buvard. Cinq spots sont utilisés pour chaque patient. Le séchage a lieu pendant

une nuit à température ambiante et à l’abri de la lumière conformément à plusieurs études.

Le lendemain, ces buvards sont mis dans un emballage en plastique contenant deux

desséchants. La conservation est faite à -20°C jusqu’au transport en Belgique pour les

analyses.

Pour le plasma, le sang est centrifugé pendant 10 mn à 2 000 g. Le plasma est aliquoté

dans trois cryotubes de 2 ml (2 à 3 cryotubes sont utilisés selon le volume du plasma). Ils sont

ensuite mis dans une boite et conservés à -80°C jusqu’au transport en Belgique.

2.2.11 Procédure d’analyse des échantillons

Les échantillons de sang collectés sur papier buvard (DBS) ou sur tube (plasma) et

sont analysés conformément à la procédure définie. Pour les papiers buvard, il a été d’abord

question d’extraction du matériel génétique du virus (ARN) avant toute analyse. Le buffy coat

est également sollicité pour l’extraction de l’ADN proviral des lymphocytes. Le plasma

aliquoté est employé pour la charge virale et le séquençage.

2.2.11.1 Mesure des lymphocytes TCD4

Cette mesure est réalisée sur sang total par le FACS Count (Becton Dickinson

Immunocytometry Systems, USA.). La première a lieu avant le traitement au J0 et la seconde

après huit mois de traitement.

2.2.11.2 Mesure de la charge virale

Pour la charge virale, l’échantillon utilisé est le plasma. Les mesures sont réalisées au

Laboratoire de Référence Sida du CHU de Liège à l’aide des trois techniques: le CAP/CTM et

Abbott RealTime.

2.2.11.2.1 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-Test, v2.0

La technique CAP/CTM permet l'automatisation de la préparation des échantillons

pour le dosage quantitatif ou qualitatif des acides nucléiques. La préparation des échantillons

est suivie de la transcription inverse, de l’amplification par PCR et de la détection automatisée

de l’ARN cible du HIV-1 et de l’Armored RNA du Standard de Quantification (QS) du HIV-


38

1. Le mélange réactionnel contient des amorces et des sondes spécifiques à la fois de l’ARN

du HIV-1 et de l’ARN du QS du HIV-1. Le mélange réactionnel a été conçu de façon à

permettre une détermination quantitative équivalente des sous-types du HIV-1 du groupe M et

du groupe O. La détection de l’ADN amplifié est réalisée par l’utilisation de sondes

doublement marquées spécifiques de la cible et du QS, permettant l’identification

indépendante des amplicons du HIV-1 et du QS du HIV-1.

Cette technique est destinée à être utilisée en complément du tableau clinique et

d’autres marqueurs biologiques indiquant l’évolution de la maladie, en vue du traitement

clinique des patients infectés par le HIV-1 de groupe M et le HIV-1 de groupe O. Le

CAP/CTM v2.0 utilise des amorces de transcription inverse et d’amplification par PCR qui

définissent des séquences dans les régions hautement conservées du gène gag du HIV-1 et de

la région LTR du HIV-1 (Troppan et al., 2009). Le test permet d’évaluer le pronostic du

patient en déterminant le niveau de base d’ARN du HIV-1 ou d’examiner les effets du

traitement antirétroviral en fonction de la charge virale dans le plasma prélevé sur tube EDTA

tout au long du traitement.

Ce test a été validé exclusivement pour l’analyse de plasma humain prélevé sur tube

contenant l’anticoagulant EDTA. L’analyse de types d’échantillons différents de ceux du type

indiqué peut aboutir à des résultats inexacts. La performance de la technique n’a été évaluée

ni avec des échantillons contenant le HIV-1 du groupe N, ni avec des échantillons contenant

le HIV-2.

2.2.11.2.2 Abbott RealTime

Abbott RealTime HIV-1 in vitro test, est un dosage in vitro par RT-PCR pour la

détermination quantitative du VIH-1 dans le plasma d'individus infectés. Le système Abbott

m2000 est une plate-forme. Il permet la détection qualitative in vitro de l’ADN et de l’ARN

du virus sur le système m2000. C’est un test réalisable sur plasma et sur du sang total récolté

sur papier buvards sur des échantillons adultes et pédiatriques. Il permet la détection des sous-

types HIV-1: groupe M sous-types A, B, C, D, CRF01_AE, F, CRF02_AG, G et H, groupe N

et O.

2.2.11.2.3 PCR en temps réel de l’ANRS

Cette technique a pour intérêt la détection et la quantification de l’ARN du VIH-1


39

ciblant le gène du LTR. Elle permet la détection de la plupart des sous-types du VIH-1 du

groupe M, et constituent désormais une alternative intéressante. Elle nécessite cependant du

personnel entraîné et une supervision importante au début de la mise en place. La technique

en elle-même est moins chère, mais la maintenance des appareils n’est souvent pas assurée.

L’utilisation de ces appareils pour un passage à l’échelle est en cours d’évaluation (Francois

Rouet et al., 2005).

En ce qui concerne l’extraction de l’ARN par le kit d’extraction QIAamp DNA mini

kit, 140 µl du plasma conservé à -80°C sont utilisés pour l’extraction afin d’obtenir un éluat

final de 60 µl. S’agissant du contrôle, 10 µl sont mis dans tous les échantillons avant

extraction. Pour la RT-PCR, un volume total de 25 µl contenant 20 µl de Mix et 5 µl d’extrait

ARN est employé. Les amorces (forward et Reverse; une concentration finale de 500 nM

chacune), la sonde (une concentration de 200 nM) et Taqman One-Step RT-PCR Master Mix;

(Applied Biosystems).

La Sonde et les amorces utilisés sont: La séquence de l’amorce sens est: (HIV1MGF)

5’-GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’. La séquence de l’amorce anti-sens est:

(HIV1MGR) 5’-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’ .La séquence de la sonde LTR :

HIV1MGP FAM5’AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTRTKTGACT- 3’. Le reporter pour la

sonde se trouve en 5’: 6-carboxyfluorescéine et en 3’ le quencher: le 6-

carboxytétraméthylrhodamine (Applied Biosystems, Foster City, CA). La sonde est marquée

en 5’ avec le 6-FAM (Fluorochrome) et en 3’ avec le TAMRA (Quencher) et purifiée par le

HPLC. La courbe de contrôle est faite par un facteur de dilutions de 10 sur un contrôle, le

Cy5 RNA Detection Probe.

Définition de l’échec au traitement

Les comparaisons des moyennes des lymphocytes CD4 et la CV plasmatique (1000

copies) ont été utilisés pour définir l’échec au traitement. Tous les échantillons ayant une CV

(1000 copies; n = 50) sont soumis au séquençage pour la détection des mutations de

résistance et la distribution des sous-types circulantes.

2.2.11.3 Techniques d’amplification et de détection des mutations de résistance

Puisqu’il s’agit des patients sous première ligne, le séquençage ne concernera que

deux enzymes du gène POL: la Reverse Transcriptase et la Protéase.


40

La technique utilise des amorces et des sondes qui peuvent interagir avec des acides

nucléiques, par exemple les acides nucléiques qui codent pour la Reverse Transcriptase ou la

Protéase du VIH. Cette technique concerne également un oligonucléotide comprenant une

quelconque séquence nucléotidique parmi la liste des différentes séquences identifiées.

Chacun desdits oligonucléotides est une sonde ou une amorce (ANRS AC11 Resistance Study

Group, 2008).

Cette méthode se rapporte également à des mélanges d'amorces et de sondes, destinés

à être employés dans des réactions RT-PCR et des réactions PCR primaires. Elle concerne en

outre des procédés pour détecter de manière spécifique plusieurs mutations du VIH. Les

mutations au sein de la Reverse Transcriptase et de la Protéase du VIH peuvent être détectées

au moyen desdits procédés.

Le principe de la technique consiste à comparer les amplifications différentielles d'une

PCR spécifique de mutation et une PCR totale, qui détecte toutes les séquences présentes. Le

dosage peut utiliser le modèle généré à partir de la RT-PCR de l'ARN viral ou de PCR de

l'ADN proviral de cellules infectées.

Pour l’Amplification, des mélanges d'amplification sont prévus, qui comprennent une

sonde pour un usage dans une réaction de PCR en temps réel. Les mélanges peuvent ainsi

comprendre une amorce sens, une amorce antisens et une sonde. Par exemple, un mélange

d'amplification est prévu, comprenant une amorce sens ou un mélange d'amorces sens qui

amplifie le 103N, 65R, 69T et 70R mutations, dans lequel le mélange comprend en outre un

oligonucléotide ayant les nucléotides bien définis.

La détection d’une mutation ponctuelle sur la Reverse Transcriptase du VIH consiste

en la transcription inverse de l’ARN extrait à l’aide d’un primer défini pour obtenir de

l’ADNc. Ce dernier est mis en contact avec une amorce anti sens et un jeu d’amorces

spécifiques pour amplifier le ADN virale contenant la mutation à rechercher.

Amplification

Tout comme la Protéase et la Reverse transcriptase, la reverse transcription et la

première PCR ont été réalisées avec le Titan One tube RT-PCR Kit, Version 13. Le kit est

commercialisé par Roche et contient : Titan Enzyme Mix, RNAse Inhibitor (5 U/l), dNTP

Mix à 10mM (2,5mM pour chacun), Human Control RNA (2 pg/l), Control Primer Mix (20

M), H2O free, RT-PR Buffer (contenant du MgCl2 à 7,5 mM et du Dimethylesulfoxyde

(DMSO)), DTT ou dithiothréitol à 100 mM, du MgCl2 (25 mM) en stock.


41

Le Master Mix pour une réaction est préparé avec: Eau (24,5 l), RT buffer (10 l),

dNTP (4 l), DTT (2,5 l), RNAse Inhibitor (1 l), Enzyme Mix (1 l) et les oligos: MJ3

(5’-AGTAGGACCTACACCTGTCA-3’(2480-2499)) et MJ4 (5’-

CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT-3’(3399-3420)) pour la Reverse transcriptase (1 l de

chaque), 5’Prot1 (5’-TAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC-3’(2082-2109)) et

3’Prot1 (5’-GCAAATACTGGAGTATTGTATGGATTTTCAGG-3’(2703-2734)) pour la

Protéase (1 l de chaque). Les primers alternatifs pour la Reverse transcriptase sont RT18 (5’-

GGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGG -3) et RT21 (5’-CTG

TATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3). Ceux de la Protéase sont 5’eprB (5’-

AGAGCTTCAGGTTTGGGG-3) et 3’eprB (5’-GCCATCCATTCCTGGCTT-3’).

Le Mix est toujours prévu pour n+1 échantillons. Sous la hotte free ADN/ARN, la

plaque 96 puits étant sur Eppendorf Cooler, le Mix est reparti dans les puits de la plaque à

raison de 45 l, on y ajoute 10 l d’extrait d’ARN dans la chambre d’assemblage. Le volume

total pour une réaction est de 55 l.

La reverse transcription et l’amplification ont été réalisées sur le thermocycleur 9700

(les temps sont adaptés au thermocycleur et à l’enzyme utilisée conformément au Kit

TITAN). Il est allumé quelques minutes avant le lancement du run.

Conditions de la RT-PCR pour la Reverse Transcriptase et la Protéase: 1 cycle à 30 min

à 50°C, 1 autre cycle à 94°C pendant 2 min. Puis: (30 sec à 94°C; 30 sec à 55°C; 1 min à

68°C) x 40 cycles et enfin 1 cycle à 68°C pendant 7mn et 4°C pour toujours.

PCR Nichée ou Nested PCR

Au total 10 l du produit de la première PCR sont utilisés dans 45 l du MMix2. Le

kit employé pour la Nested PCR est “AmpliTaq ADN polymérase with GeneAmp 10X PCR

BufferII MgCl2 solution”. Le Mix pour la Nested pour une réaction contient: dNTP à 1,25

mM (8,8 l), Tampon 10X (5,5 l), Eau free RNA (18,8 l), MgCl2 (25 mM), Taq

Polymérase (0,3 l) et les oligos à 20 mM: A35 (5’-

TTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’ (2530 to 2558)) et NE1 (35) (5’-

CCTACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAGCT-3’(3300 to 3334)) pour la Reverse

transcriptase et 5’prot2 (5’-TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA-3’ (2136 to

2163)) et 3’Prot2 (5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC-3’ (2621 to 2650))

pour la Protéase (2,5 l de chaque oligo). Le Primers alternatifs pour la Nested de la Reverse

transcriptase sont RT1 (5’- CCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGA -3) et RT4 (5’-


42

AGTTCATAACCCATCCAAAG-3). Pour la Protéase, c’est 5’prB (5’-

GAAGCAGGAGCCGATAGACA-3’) et 3’prB (5’-ACTGGTACAGTTTCAATAGG-3’). Le

volume total pour la réaction est de 55 l.

Conditions de la Nested pour la Reverse Transcriptase et la Protéase : 1 cycle à 94°C

pendant 3 min, puis (30 sec à 94°C, 30 sec à 55°C, 1,30 min à 72°C) x 40 cycles et enfin 1

cycle à 72°C pendant 7 min; puis 4°C à l’infini.

Dépôt sur gel : l’électrophorèse sur gel d’agarose est utilisée pour déterminer les bandes

spécifiques. Les produits de la Nested sont déposés sur gel d’agarose contenant du bromure

d’éthidium à 4 %. Une bande est considérée comme spécifique si sa taille correspond à celle

du contrôle aux alentours de 731 paires de base pour la Reverse Transcriptase et 507 pour la

Protéase. Le contrôle de poids moléculaire utilisés est le Tacklt TM X174 RF ADN/Hae III

fragment qui a un intervalle de 72 à 1 353 paires de bases.

Purification des produits de la réaction de séquençage

La résine de Sephadex G-50 est utilisée pour la purification du produit de séquençage.

Elle permet de dé-saler les échantillons, d’éliminer les nucléotides non incorporés et les

amorces en excès. La limite d’exclusion est d’environ 20 bases. La plaque 96 Nucleo Fast 96

de Machery Nagel est utilisée comme support inerte à la résine de Sephadex G.

Le principe est celui d’une chromatographie par gel filtration qui consiste en la

séparation des composés en fonction de leur poids moléculaires. En fonction de la dimension

des pores du gel, les composés qui sont en trop dans le mélange (excès d’amorces, de

didésoxyribonucléotides, les sels) sortiront en premier. Le produit issu de la réaction de

séquence sera incorporé dans la colonne puis extraits à l’aide d’un tampon d’élution.

Détection des mutations de résistances

Le protocole de l’ANRS (ANRS AC 11 Resistance Study Group/PCR and Sequencing

Procédures: HIV-1/Version de février 2008: http://www.hivfrenchresistance.org/) est utilisé

pour le séquençage. L’analyse des séquences et la détection des mutations des résistances sont

faites en utilisant le site de Stanford University/HIV Drug Resistance Database

(http://hivdb.stanford.edu/). L’interprétation des résultats est effectuée conformément à

l’algorithme de l’ANRS AC11 révisé en septembre 2013 (N°23).


43

2.2.11.4 Détections des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR)

La technique ASPCR ou encore ARMS-PCR est utilisée pour détecter le

polymorphisme bi-allélique. Son principe est issu de certaines propriétés observées dans

l’étude des duplex amorce/ADN cible lors d’une réaction de PCR réalisée avec une ADN

polymérase dépourvue d’activité 3’-5’ exonucléasique, ou activité Proof reading free. Parmi

ces propriétés, deux sont importantes: Premièrement, la présence d’un mésappariement au

niveau du duplex amorce/ADN cible surtout en 3’ de l’amorce ralenti considérablement

l’extension de ce dernier par rapport à un duplex sans mésappariement et deuxièmement la

présence d’un mésappariement en 3’ de l’amorce déstabilise considérablement le duplex.

En pratique, quand une mutation est connue, il est possible de dessiner une amorce qui

sera spécifique à la mutation. La technique elle-même repose sur l’utilisation des trois

amorces: deux amorces A1 et A2 complémentaires chacune d’un des deux allèles étudiés

(l’allèle normal et l’allèle muté) et une troisième antisens (reverse) A3 commune aux deux

allèles. La réaction de PCR est réalisée dans deux types différents:

dans le premier tube, PCR avec l’amorce A1 spécifique à l’allèle normal et l’amorce

A3 commune aux deux allèles (normal et muté) ;

dans le deuxième tube, PCR avec l’amorce A2 spécifique à l’allèle muté et l’allèle A3

commune aux deux allèles (normal et muté).

Après amplification, la détection de la mutation, par exemple A/C, peut se faire sur gel

d’agarose ou électrophorèse capillaire. Si le sujet est hétérozygote pour la mutation étudiée

(génotype A/C), la réaction PCR sera positive dans les deux tubes (tube A1-A3 puis tube A2-

A3. Si le sujet est homozygote sauvage (génotype A/A), la réaction de PCR ne sera positive

que dans le tube 1 contenant l’amorce A1 non mutée et l’amorce A3. Chez un sujet

homozygote muté (génotype (C/C), la réaction de PCR sera positive uniquement dans le tube

2 contenant A2 et A3 (Ameziane, Bogard, & Lamoril, 2005).

Procédure de la Reverse transcription, de l’Outer RT-PCR et de la PCR Spécifique

L’ARN est extrait avec le kit QiAamp Viral RNA mini kit à partir de 140 l de

plasma centrifugé à 14 000 rpm, à 4°C pendant 90 min. L’éluât final est de 60 l. Des

aliquotes de10 l sont réalisés et conservés à -70°C.


44

Les produits utilisés

Hexanucléotide Mix, (10X concentré) /Random hexamers: Roche: Réf 11 277 081

001. dNTP: Roche diagnostic : 1127704901. SuperScript II Transcriptase 10,000U:

Invitrogen: 18064-014. Rnasin Ribonuclease Inhibitor 10 000U: Promega: N2515.

LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I: (Roche, Mannheim, Germany):

03515885001. Ultra Pure. 1M Tris-HCL: Life Technologie: 15568-025.

Tableau 3 Préparation du MMix 1: Annealing

Produits Pour 1 réaction Pour 10 réactions

Eau 8 l 80 l

Random Hexamer 10X 2 l 20 l

10 l d’extrait RNA sont ajoutés à 10 l de MMix pour un volume final de 20 l

Thermocycler 9 700: Annealing primer à 70°C pendant 10 min; 25°C pendant 10 min et

conservé à 4°C à l’infini.

Tableau 4 Préparation du Master Mix 2: Enzyme Mix


5X first Straind Buffer 8 l 80 l

DTT 4 l 40 l

dNTPs (10 mM) 2 l 20 l

RNAse inh (40 U) 1 l 10 l

SuperScript II 1 l 10 l

Eau 4 l 40 l

Dans le Cycler 9700 déjà programmé, 20l de Master Mix2 sont ajoutés à chaque tube

de la 1ère réaction puis le run est lancé. Le volume final est de 40l. Les conditions de cycling

sont: 25°C pendant 10 min, 37°C pendant 45 min, 42°C pendant 45 min, 70°C pendant 15

min puis 4°C à l’infini. Le dNTPs, le 5Xfirst Straind Buffer utilisés sont les produits du Kit

SuperScript II.

A la fin du run, on obtient un ADNc sur lequel on a pu faire toute la suite de l’analyse

pour la détection des mutations de résistance. Puisqu’il n’est pas dilué, il est conseillé de ne

prendre que 2 l pour la réalisation de la PCR (Outer PCR).


45

Première PCR ou Outer PCR

Elle est réalisée avec le Kit LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I.

En général, ce kit est utilisé pour amplifier des régions ne dépassant pas 900 bp. Il donne des

résultats concluants pour amplifier une région de moins de 700 bp. Dans notre cas, nous

avons amplifié une région de Pol contenant 644 bp (FOR = 2613-2635 et REV = 3234-3256

HXB2).

Préparation du MMix

Dégeler le tube 1b avec capuchon vert de la « Reaction Mix » ;

Centrifuger brièvement le tube 1a capuchon blanc contenant l’enzyme ;

Garder les deux tubes dans un portoir réfrigéré ;

Prendre 14 l de l’enzyme (1a) et le mettre dans le tube 1b de la « Reaction Mix » ;

Chaque tube d’enzyme contient un volume suffisant pour 3 réactions Mix avec les tubes

1b ;

Mélanger par refoulement mais sans trop agiter ;

Ré-étiqueter le tube 1b réaction mix avec les étiquettes disponibles dans le kit « Master

Mix 5x conc ». Une fois le Master Mix préparé, il se conserve entre -15 et - 25°C pour

maximum 3 mois ou entre + 2 et + 8°C pour une semaine ;

Le Mix est composé d’un milieu réactionnel qui contient l’enzyme. Pas besoin d’ajouter

encore du MgCl2 ou autres réactifs ;

Le volume final de 20 l doit contenir 2 l du ADNc puisqu’il est non purifié et 0,75 M

de chaque primer (Outer Forward et Outer Reverse) ;

La réaction est faite sur le thermocycleur 9 700 d’Applied Biosystems. Les conditions de

cycling: le mélange est d’abord incubé 10 min à 95°C, puis 10 min à 94°C (dénaturation)

puis 50 cycles d’amplification (15 sec à 94°C ; 20 sec à 62°C et 1 min à 72°C) et 72°C

pendant 7 minutes puis 4°C à plus infini ;

Une analyse des points de fusion des produits de PCR de 60 ° C à 95 ° C a été

effectuée afin de s'assurer de la spécificité des produits amplifiés, et seulement ceux des

échantillons ayant une température prévue de 78 ° C ont été analysés par ASPCR.

Le produit de l’Outer PCR est dilué: 1/200 dans du 5 mM de Tris HCl Buffer à PH =

8. La solution mère du Tris HCl est à 1 M. Pour obtenir une solution à 5 mM, on prend 50 l

du Tris HCl à 1 M que l’on met dans 9 950 l d’eau. Pour obtenir un produit PCR dilué à

1/200, on prend 5 l du produit PCR que l’on met dans 995 l d’eau.


46

Tableau 5 Preparation du premier Master Mix pour ASPCR


Water, PCR Grade (Vial 2, colorless Cap) 12,5 l 125 l

Primer 1 Fwd (20 M) 0,75 l 7,5 l

Primer 2 Rev (20 M) 0,75 l 7,5 l

Master Mix, 5x conc 4 l 40 l

Total 18 l 180 l

Dans le local Post PCR, sur Eppendorf cooler, 2 l de l’ADNc sont ajoutés au 18

l de MMix contenus dans la plaque. Le volume final pour la réaction est de 20 l.

Deux réactions par mutation sont réalisées séparément : une pour l’allèle normal et

l’autre pour l’allèle muté: 2 l du produit de l’Outer PCR (dilué au 1/200) et chaque primer à

0,5 l sont utilisés avec le LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I pour un

volume final de 20 l.

La détection des mutations ponctuelles se fait dans deux tubes différents pour chaque

mutation. L’un pour le virus sauvage (allèle normal et allèle commun) et l’autre pour l’allèle

muté (allèle commun et allèle muté). Les conditions de température diffèrent d’une mutation à

une autre (Hauser et al., 2009, 2012).

Pour K103N (AAC/AAT): Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10

sec, 62°C pendant 10 sec et 72°C pendant 10 sec).

Pour Y181C: Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 60°C

pendant 10 sec et 72°C pendant 10 sec).

Pour M184V: Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 56°C


Pour K70R: Dénaturation= 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec, 48°C


Pour T215Y et T215F: Dénaturation = 5 min à 95°C, puis 45 cycles (95°C pendant 10 sec,

56°C pendant 10 secondes et 72°C pendant 10 sec).

NB : Chaque run est réalisé en double et la moyenne arithmétique est utilisée pour

l’interprétation. Chaque essai a été effectué avec un ensemble complet de contrôles d'ADN

mutant et de type sauvage.


47

Tableau 6 Préparation du second MMix pour ASPCR


Water, PCR Grade (Vial 2, colorless Cap) 13 l 130 l

Primer 1 Fwd (20 M) 0,5 l 5 l

Primer 2 Rev (20 M) 0,5 l 5 l

MMix, 5xconc 4 l 40 l

Total 18 l 180 l

Sur Eppendorf cooler, 18 l de MMix sont distribués dans une plaque 96 puits puis on

a ajouté 2 l du produit de Outer PCR dilué dans le Tris HCl à 5mM, PH = 8. Le volume final

pour la réaction est de 20 l. Sur LightCycler 480 (Roche), le run est lancé et dure environ

1h20mn. L’interprétation du résultat est détaillée dans la partie résultats de la détection des

mutations ponctuelles.

2.2.12 Traitements des données et analyses statistiques

Le Logiciel Microsoft World et Excel 2011 pour Mac et EPI INFO (version 3.3.2) sont

utilisés pour le traitement des données. Le test Chi2 et celui de Student sont quant à eux

utilisés pour mesurer les relations entre les variables; une différence de p < 0,05 entre les

variables est considérée comme significative. Le test non paramétrique U de Mann-Whitney

nous a permis de comparer les différentes moyennes. Ensuite, grâce au logiciel BioEdit

(version 7.2.5) et Clustral W, nous avons aligné et comparé les séquences avec des sous-types

non-B disponibles dans Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov). Nous avons utilisé la base de

données de Stanford University (http://www.hivdb.stanford.edu) pour l’analyse des séquences

et la détermination des sous-types et des mutations de résistance. Le Logiciel MEGA 5.2.2

nous a servi pour construire l’arbre phylogénétique. Enfin, nous nous sommes recouru à

Mendeley Desktop (version 1.11) pour les références bibliographiques.

2.2.13 Conditions éthiques

Cette étude est réalisée tout en obéissant à certains principes généraux et

fondamentaux de l’éthique en recherche biomédicale et dans le respect de certains

mécanismes qui sont:


http://www.hivdb.stanford.edu/


48

l’obtention de l’accord du promoteur de thèse;

l’obtention d’une autorisation de collecte des données du promoteur ULg et du

responsable site d’étude (Hôpital Général de Référence National de N’Djaména);

l’obtention de l’accord des patients inclus dans l’étude (principe du consentement

éclairé);

les mesures garantissant la protection de la vie privée, l’anonymat et la confidentialité

des données : les données des patients sont anonymes, seuls les investigateurs (chercheur,

médecins traitant et promoteurs) de cette étude sont habilités à les consulter;

la déclaration de tous les conflits d’intérêts (principe de justice);

la garantie d’une large diffusion des conclusions (principe de bienfaisance). A chaque

étape de l’analyse, les résultats sont transmis aux médecins traitant au Tchad.

Chapitre III : Evaluation Immunovirologique du traitement antirétroviral

49

Chapitre III

Evaluation immunovirologique du

traitement antirétroviral


50

CHAPITRE III- Evaluation Immunovirologique du traitement antirétroviral

3.1. Introduction

Certaines personnes qui vivent avec le VIH présentent souvent des symptômes

évidents même s’ils ne sont pas mis sous traitement antirétroviral. D’autres par contre,

maintiennent un taux des CD4 normal et ne présentent pas de symptômes pendant longtemps

même sans traitement ; on emploie le terme de « non progression » pour décrire ces cas

(Fener, 2011). Dans l’objectif d’évaluer la capacité de la reconstitution immunitaire afin de

juger de l’efficacité du traitement administré, nous avons fait une évaluation

immunovirologique chez tous les 116 patients inclus dans l’étude. Dans ce chapitre, nous

décrivons d’abord les caractéristiques générales de la population. Nous illustrons ensuite dans

les résultats originaux les taux des lymphocytes CD4 et les valeurs des charges virales

obtenues avant le traitement (J0) et après huit mois de traitement (M8). Et enfin, nous

présenterons les résultats de l’évaluation immunovirologique faite uniquement chez les

patients qui étaient sous Triomune ; un article sur le sujet termine ce chapitre.

3.2. Caractéristiques générales de la population d’étude

Notre échantillon se constitue de 116 patients (soit 78 femmes et 38 hommes

représentant respectivement 67,24 % et 32,76 %); la moyenne d’âge de nos patients est de

41 6,87 ans avec 84 ans pour le plus âgé et 17 pour le plus jeune. La charge virale est

mesurée chez tous les 116 patients sous traitement parmi lesquels 50 (43,10 %) ont une

charge virale supérieure ou égale à 1 000 copies/ml.

Figure 2 Distribution des tranches d'âge par rapport au sexe


51

La tranche d’âge la plus dominante dans cette étude est celle de l’intervalle 36-40 ans ;

les femmes sont les plus représentées avec un pourcentage équivalent à 83,33 % (25/30). La

tranche d’âge où les hommes sont les plus nombreux est celle de l’intervalle 41-45 ans.

3.3. Méthodologie

En vue d’évaluer la réponse immunvirologique des PVVIH sous ARV et suivre

l’évolution de l’infection vers le stade SIDA à travers les deux marqueurs principaux qui sont

les lymphocytes TCD4 et la charge virale, nous avons suivi les patients pendant 8 mois. Le

taux des lymphocytes TCD4 et la charge virale sont mesurés avant le traitement (Jour 0) et

après huit mois de traitement. L’automate utilisé pour la mesure est le FACS Count (Becton

Dickinson Immunocytometry Systems, USA.). Les moyennes des CD4 et de la charge virale

au J0 sont comparées aux valeurs obtenues après 8 mois de traitement. Ensuite, pour les

patients sous Triomune, ils ont fait l’objet d’une évaluation particulière pour déterminer le

taux d’échec à la Triomune. L’article que vous trouverez à la fin du chapitre renseigne

d’avantage sur ces patients sous Triomune.

3.4. Résultats originaux

Figure 3 Nombre des patients par rapport au traitement administré

La plus part des patients sélectionnés pour l’étude étaient sous Duovir N (45,69 %;

53/116) alors que ceux qui étaient placés sous Triomune représentaient 41,38 % (48/116) de

l’échantillon total. Durant l’étude, la Triomune était progressivement abandonnée au profit du

Duovir N.


52

Tableau 7 Valeurs observées des CD4 avant et après traitement

CD4 J0 CD4 au 8° Mois

Maximale 684 1008

Minimale 11 70

Médiane 248 298,5

Moyenne 309 344

200 40 (34,48 %) 27 (23,26 %)

200 X 500 46 (39,66 %) 70 (60,34 %)

500 30 (25,86 %) 19 (16,38 %)

Nous remarquons dans ce tableau que le nombre de patients qui étaient à plus de 500

CD4/mm3 avant le traitement est passé de 30 à 19. La médiane des CD4 au J0 est de 248

alors que celle au M8 est de 298,5. L’étude n’a mis en relief aucune différence entre les deux

valeurs. Ces dernières sont quasi les mêmes (test de Mann-Whitney, p = 0,75). La moyenne

des CD4 avant le traitement et après le 8ième mois de traitement n’a pratiquement pas évoluée:

309 vs 344 (p = 0,62).

Avant le début du traitement, la charge virale n’a été mesurée que chez 49 patients

(42,24 %; 49/116) avec Abbott RealTime. Après huit mois de traitement, tous les 116

échantillons ont été testés pour la mesure de la charge virale avec le CAP/CTM et Abbott

RealTime. Pour la commodité de nos résultats, nous comparerons seulement les valeurs

obtenues sur Abbott RealTime après le traitement pour les 49 patients. Le tableau ci-dessous

nous renseigne sur les différentes valeurs de la charge virale.

Tableau 8 Valeurs des charges virales observées avant et après traitement

CV J0 CV au M8

CV Max 649 000 885 196

CV Min 00 00

CV Médiane 5 000 51

CV Moyenne 44 739 43 460

200 15 (30,61 %) 63 (54,31 %)

200 X 500 00 (0,0 %) 04 (3,45 %)

500 34 (69,39 %) 49 (42,24 %)


53

Le chiffre zéro (00) indique que la charge virale est indéterminée. La médiane

observée avant le traitement est loin d’être la même après huit mois de traitement (5 000 vs

51; p < 0,001); Par contre la moyenne au J0 n’a pas significativement changée au M8 (44 739

vs 43 460; p > 0,05) pour les 49 patients comparables par les deux techniques.

Parmi les 116 patients, 50 avaient une charge virale supérieure ou égale à 1 000

copies/ml, soit un taux d’échec virologique de 43,10 %. La figure ci-dessous nous donne une

idée sur le traitement des patients en échec virologique.

Figure 4 Répartition des patients en échec par rapport au traitement

Nous constatons que 23/50 des sujets soit 46 % étaient sous Triomune (d4T, 3TC et

NVP) qui est la trithérapie d’actualité au moment de notre étude. Cette molécule était

progressivement abandonnée au profit du Duovir N représentée ici avec 38% (19/50). Cette

situation nous a amené à faire une évaluation immunovirologique spécifiquement chez tous

les patients sous Triomune avant le traitement et après huit mois de traitement. Les résultats

sont détaillés dans l’article en fin de chapitre.

Résumé de l’article :

Au total, 48 patients, soit 28 femmes (58,33 %) et 20 hommes (41,66 %) sous

Triomune sont enrôlés dans cette étude d’évaluation, puis suivis pendant 8 mois. Chez tous

ces patients, nous avons ensuite mesuré au Tchad, le nombre de lymphocytes CD4 avant le

traitement et après 8ième mois de traitement. A ce moment, nous avons évalué la charge virale

plasmatique au Laboratoire de Référence Sida du CHU de Liège avec deux automates


54

Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 Test Version 2.0 et Abbott RealTime HIV-1 in

vitro test Ref 2G3190.

Chez les patients sous Triomune, la moyenne des CD4 était passée de 462 179,22

[56-981] cellules/mm3 au J0 à 327,23 153,77 [10 -1 008] cellules/mm3 au 8ième mois. La

moyenne de la charge virale plasmatique pour les patients en échec était de 66.008,62

copies/mm3. Le taux d’échec à la Triomune est de 43,75 % (21/48). Nous n’avons pas

constaté une différence significative entre le taux d’échec et le sexe (p > 0,05).

En conclusion, nous pouvons dire que le taux d’échec à la Triomune trouvé dans cette

étude est de 43,75 %. Ce taux nous parait très élevé pour un pays où tous les médicaments

antirétroviraux et les tests afférents à la maladie sont gratuits. Le protocole de régime

thérapeutique sous Triomune à administrer en première intention doit cependant être révisé.

3.5. Résumé des résultats du chapitre III

En l’absence des tests génotypiques de résistance, le taux des lymphocytes TCD4 et la

charge virale peuvent être utilisés pour évaluer le traitement antirétroviral et

déterminer l’échec virologique.

Pour estimer la mesure de la charge virale, la médiane observée avant le traitement est

loin d’être la même après huit mois de traitement (5 000 vs 51; Mann-Whitney

significatif à p < 0,001 pour les deux médianes). Par contre la moyenne pour la charge

virale au J0 n’a pas significativement changée au M8 (44 739 vs 43 460 ; p > 0,05).

La moyenne des CD4 n’a pas significativement changée chez les 116 patients avant et

après 8 mois de traitement (309 vs 344; p = 0,62). La médiane au J0 est de 248 alors

que celle de M8 est de 298,5 (p = 0,75).

Le taux de suppression virale (CV < 1000 copies/ml) chez les patients est de 56,9 %

(66/116).

Le taux d’échec à la Triomune chez 48 patients suivis à l’Hôpital Général de

Référence National de Ndjamena est de 43,75 % (21/48).

La Triomune ne doit pas être utilisée comme traitement de première intention.


55

Article : Evaluation immunovirologique de la thérapie antirétrovirale par

la Triomune (Lamivudine, Stavudine et Névirapine).

Cet article résume les résultats obtenus lors de l’évaluation

immunovirologique réalisée chez 48 patients qui étaient traités à la Triomune

(3TC, d4T et NEV). Il a été mesuré chez ces patients, le taux des lymphocytes

TCD4 et la charge virale avant le traitement (J0) et après huit mois de traitement

(M8).


56


57


58


59


60

Chapitre IV Comparaison des techniques de mesure de la charge virale

61

Chapitre IV

Comparaison des techniques de

mesure de la charge virale


62

CHAPITRE IV- Comparaison des techniques de mesures de la charge virale

4.1. Introduction

L’application de la biologie moléculaire dans le domaine du VIH est née des

premières mesures de l’ADN proviral dans les cellules mononuclées du sang périphérique

(Ou et al., 1988). Elle a été ensuite appliquée dans le cadre de l’infection pédiatrique (De

Rossi et al., 1988; Laure et al., 1988) qui a succédé aux méthodes de mesure de l’antigénémie

p24 et aux cultures quantitatives du VIH-1. Bon nombre de techniques commercialisées de

nos jours reposent sur la RT-PCR en temps réel permettant une amplification et une détection

simultanée des fragments amplifiés (Wittek et al., 2007).

La charge virale et l’évaluation génotypique de la résistance sont considérées comme

étant des marqueurs de l’efficacité du traitement. Mais pour utiles soient elles, ces méthodes

exigent du matériel adéquat et du personnel qualifié. La complexité de ces techniques et leurs

coûts élevés font qu’elles ne sont pas utilisées ou du moins rarement dans les pays à

ressources limitées. C’est la raison pour laquelle, l’OMS recommande pour ces pays que le

suivi des patients vivant avec le VIH soit fait avec les signes cliniques et la mesure des

lymphocytes CD4 (OMS, 2012). Bien qu’il existe des structures de prise en charge telles que

les hôpitaux et les laboratoires, elles sont pour la plupart, limitées et sous équipées pour

pallier à ce problème du suivi de l’infection à VIH. A cela s’ajoutent aussi les difficultés

logistiques telles que le transport des échantillons sanguins et le respect de la chaîne de froid

qui rendent difficile le monitoring des patients vivant dans des zones reculées, loin des centres

spécialisés (Adawaye et al., 2013).

La mesure de la charge virale est utilisée pour évaluer l’efficacité du traitement et pour

observer l’évolution de la maladie. Cependant, afin que la mesure soit significative, la

différence entre deux résultats doit être d’au moins 0,5 log10, soit une différence du simple au

triple. Ainsi une charge virale de 100 000 copies/ml (5 log10) et une charge virale de 250 000

copies/ml (5,4 log10) ne sont pas considérées comme étant significativement différentes

(Belan et al., 2008; Viard, 2009). La diversité des différents sous-types dans les pays à

ressources limitées est généralement favorisée par l’émergence de résistances du VIH au

traitement. Ce qui impose le choix d’une technique pouvant détecter plusieurs sous-types du

VIH-1 du groupe M, N et du groupe O. Dans ce même ordre d’idée que l’«International AIDS

Society» a rappelé en 2008 l’importance de disposer des techniques de mesure de la charge


63

virale performantes, sensibles, reproductibles, coût-efficaces et accessibles à la majorité des

équipes médicales (Hammer et al., 2008).

Dans ce chapitre, nous décrivons beaucoup plus en détail chaque technique dans la

partie méthodologie. La partie résultats originaux sera consacrée à la présentation des résultats

obtenus et aux comparaisons des trois techniques utilisées. L’évaluation de la technique de

l’ANRS pour la mesure de la charge virale sur des patients infectés par les sous-types non-B à

Kinshasa (RDC) est décrite dans l’article mis en annexe (Annexe 1). Un article sur la

comparaison des techniques utilisées dans ce chapitre est en cours de rédaction.

4.2. Méthodologie

La taille totale de notre échantillon est de 116 patients, soit 78 femmes et 38 hommes

représentant respectivement 67,24 % et 32,76 %. Les patients enrôlés dans notre étude sont

sous traitement ARV et recrutés sur la base des critères d’inclusion et d’exclusion. La collecte

des échantillons a duré 10 mois (du 1er avril 2011 au 31 janvier 2012). Un échantillon de sang

veineux est prélevé à l’Hôpital Général de Référence Nationale de N’Djamena (Tchad). Deux

tubes EDTA de 4 ml chacun sont utilisés pour recueillir le sang prélevé au pli du coude. Les

deux tubes sont remués doucement pour mélanger le sang avec l’anticoagulant. Le sang est

centrifugé pendant 10 mn à 2 000 g. Le plasma est distribué dans trois cryotubes de 2 ml (2 à

3 cryotubes sont utilisés selon le volume du plasma). Ils sont ensuite mis dans une boite et

conservés à - 80°C. Le choix du site n’est pas fortuit car il est le seul endroit où il était

possible de faire une charge virale au moment de notre étude. Nous avons utilisé un

échantillonnage tout venant, consécutif et non exhaustif.

Trois techniques sont utilisées pour mesurer la charge virale sur les échantillons

collectés des patients infectés par des sous-types non-B du VIH-1. Nous avons également

comparé ces trois techniques sur un échantillon de plasma qui a subi l’effet de

congélation/dégélation au moins deux fois.

Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan (CAP/CTM) V2.0

C’est un test basé sur l’amplification in vitro de l’ARN du VIH à partir du plasma

recueilli sur tube EDTA. Il peut quantifier de 20 à 10 000 000 copies /ml d’ARN du HIV-1 du

groupe M et O. C’est un test qui comprend trois opérations principales : d’abord la

préparation de l’échantillon dans le but d’isoler l’ARN du VIH-1; ensuite la transcription

inverse de l’ARN cible pour produire l’ADN complémentaire (ADNc); et enfin


64

l’amplification par PCR de l’ADNc cible en même temps que la détection de la sonde de

détection d’oligonucléotides clivés, doublement marqués, spécifiques à la cible.

Le mélange réactionnel, conçu pour permettre une détermination quantitative

équivalente des sous-types du groupe M et O du VIH-1 contient des amorces et des sondes

spécifiques à la fois de l’ARN viral et de l’ARN Standard de Quantification (QS). La

détection de l’ADN amplifié est réalisée grâce à l’utilisation des sondes oligonucléotidiques

doublement marquées spécifiques de la cible et du QS, permettant l’identification

indépendante des amplicons du VIH-1 et du QS. La quantité d’ARN viral est évaluée à l’aide

du QS du VIH-1. La quantité de l’ARN viral est mesurée à l’aide du QS du VIH-1. Elle

compense les effets d’inhibition et contrôle la préparation et le processus d’amplification en

permettant une quantification plus précise de l’ARN. Le QS est ajouté à chaque échantillon en

un nombre connu de copies et il a subi toutes les étapes de préparation de l’échantillon,

transcription inverse, amplification par PCR et détection simultanée des sondes.

Ce test utilise des amorces de transcription inverse et d’amplification par PCR qui définissent

des séquences dans les régions hautement conservées du gène GAG et de la région LTR.

Extraction

Bien que la machine utilise 850 µl de plasma, il est recommandé de distribuer plus de

1 000 µl afin de minimiser le risque de non extraction. Ainsi donc, nous avons utilisé 1 100 µl

qui sont distribués dans les tubes contenus dans le rack.

Le CAP/CTM recourt à une préparation et à une extraction automatisée des

échantillons sur l’instrument Cobas AmpliPrep à l’aide d’une technique générique de capture

basée sur silice. La procédure traite 850 µl de plasma.

Transcription inverse et amplification par PCR

La transcription inverse et l’amplification sont faites avec l’ADN polymérase de

l’enzyme recombinante thermostable Thermus species (Z05). En présence de magnésium

(Mn2+) et sous conditions tampon appropriées, Z05 exerce à la fois les activités de la Reverse

Transcriptase de l’ADN polymérase. Ceci permet donc à la transcription inverse et à la PCR

de se produire en même temps que la détection en temps réel de l’amplicon. Le mélange

réactionnel est chauffé pour permettre aux amorces anti sens de s’hybrider spécifiquement à

l’ARN cible du VIH-1 et à l’ARN du QS du VIH-1. En présence de Mn2+ et d’un excès de

déoxynucléotides triphosphates (dNTPs) comprenant les triphosphates de desoxyadénosine,

desoxyguanosine, desoxycytidine, desoxyuridine et désoxythymidine, la polymérase Z05


65

allonge les amorces hybridées, produisant ainsi des brins d’ADN complémentaire de l’ARN

cible.

Abbott RealTime

Le dosage Abbott RealTime HIV-1 est une RT-Real Time (Reverse Transcription en

temps réel). Une RT PCR est une PCR classique après transcription inverse de l'ARN en

ADNc. Autrement dit, une PCR réalisée sur un ADNc qui lui est obtenu d'un ARN par

l'action d'une Reverse Transcriptase. Le test est réalisable sur plasma et sur du sang total

récolté sur papier buvard sur des échantillons adultes et pédiatriques. Ce test permet la

détection des sous-types HIV-1 : groupe M sous-types M (A- H) groupe N et O. La PCR en

temps réel est basée sur l'amplification et la détection d'un reporteur fluorescent. Soulignons

que l'activité 5' exonucléase est spécifique à l'ADN double brin. Une séquence d'ARN non

liée à la séquence cible VIH-1 est introduite dans chaque échantillon au début de la

préparation des échantillons. Cette séquence d'ARN non liée est simultanément amplifiée par

RT-PCR et sert de contrôle interne (IC) afin de démontrer le traitement correct de chaque

échantillon. La quantité de séquences cibles de VIH-1 présente à chaque cycle d'amplification

est mesurée à l'aide de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence sur l'appareil

Abbott m2000rt. Les sondes ne génèrent aucun signal à moins d’être spécifiquement liées au

produit amplifié. Le cycle d'amplification au cours duquel le signal fluorescent est détecté par

le m2000rt est proportionnel au log10 de la concentration d'ARN VIH-1 présente dans

l'échantillon d'origine.

PCR en temps réel de l’ANRS

Elle a pour intérêt la détection et la quantification de l’ARN du VIH-1 ciblant le gène

du LTR qui est décrit comme la région la moins changeante du génome du VIH-1 (Drosten et

al., 2006; F Rouet & Rouzioux, 2007a, 2007b; Francois Rouet et al., 2005). Le kit pour la

mesure de la charge virale est commercialisé par Biocentric. Cette technique de l’ANRS

permet la détection de la plupart des sous-types du VIH-1 du groupe M, et constituent

désormais une alternative intéressante dans les pays à forte diversité génétique et à ressources

limitées. Elle nécessite cependant du personnel entraîné et une supervision importante au

début de la mise en place. La technique en elle-même est moins chère, mais la maintenance

des appareils n’est souvent pas assurée (absence de réseau commercial). L’utilisation de ces

appareils pour un passage à l’échelle est en cours d’évaluation.


66

Cette technique, contrairement aux autres utilise l’ARN extrait pour la PCR. Le kit

d’extraction employé est le kit Qiagen. Un volume de 140 µl du plasma conservé à - 80°C est

utilisé pour l’extraction pour un éluât final de 60 µl. Un volume de 10 µl de contrôle (RNA

virus) est mis dans tous les échantillons avant extraction.

Pour la RT-PCR, un volume total de 25 µl contenant 20 µl de MMix et 5µl d’extrait

ARN est utilisé. Les amorces (forward et reverse ; une concentration finale de 500 nM

chacune), la sonde (une concentration de 200 nM) et Taqman One-Step RT-PCR MMix;

(Applied Biosystems). La sonde et les amorces utilisées sont: l’amorce sens HIV1MGF 5’-

GCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’. La séquence de l’amorce anti-sens est HIV1MGR

5’-GGCGCCACTGCTAGAGATTTT-3’. La sonde utilisée est HIV1MGProbe

5’AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTRTKTGACT-3’. Le reporter pour la sonde se trouve

en 5’: 6-carboxyfluorescéine et le quencher en 3’: le 6-carboxytétraméthylrhodamine

(Applied Biosystems, Foster City,CA). La sonde est marquée en 5’ avec le 6-FAM

(Fluorochrome) et en 3’ avec le TAMRA (Quencher). L’enzyme utilisée est le TaqMan one

step.

La courbe de contrôle est construite à l’aide d’un contrôle, le Cy5 RNA Detection

Probe kit (DIA-EIC/RNA (Cy5)-050 Diagenode) dilué au dixième.


Au total 110 échantillons étaient comparables avec le test Abbott RealTime et

CAP/CTM. L’objectif de la réalisation de ces différentes techniques de charge virale, est

justement d’obtenir une grande possibilité de détection des sous-types par une technique

fiable, moins onéreuse et qui ne demande pas trop d’expertise du personnel technique.

Chaque technique utilisée a une sensibilité spécifique aux différents groupes et sous-

types du VIH-1. Le CAP/CTM est sensible aux sous-types A-H du groupe M; Abbott

RealTime détecte les groupes N, O et les sous-types A-G du groupe M, enfin la RT-PCR

ANRS G2-LTR détecte les sous-types A-H du groupe M (Hocini & Andreoletti, 2009).


67

Les deux courbes de mesures sont presque superposables sur la figure 5a. Nous

remarquons aussi qu’il y a une excellente corrélation entre ces deux techniques avec un

coefficient de corrélation R2 = 0,96016 (fig 5b). Un blip est détecté avec la version 2.0 du

Cobas sur deux échantillons qui sont bien visible sur la figure 5b et figure 5c.

La première mesure est faite d’abord sur CAP/CTM puis sur Abbott RealTime. A

l’issue de la comparaison des deux techniques, les résultats sont transposés dans la figure ci-

dessous:

Figure 6 Résultats de mesures CAP/CTM et Abbott RealTime

Fig.5b: Corrélation CAP/CTM vs Abbott Fig.5c: Différence des Log10 CAP/CTM vs Abbott

Fig.5a: Courbes de mesures CAP/CTM vs Abbott real time

Figure 5 Comparaison CAP/CTM et Abbott RealTime


68

Le nombre d’échantillon ayant une charge virale supérieure ou égale à 1 000 copies/ml

(48) est le même avec Abbott et Cobas, tandis que les non détectés avec Abbott sont

supérieurs de ceux non détectés avec Cobas. Ceci s’explique par le fait que les limites de

détection inferieures ne sont pas les mêmes pour les deux techniques : 20 copies/ml pour le

CAP/CTM contre 40 copies/ml pour Abbott RealTime.

Parmi les échantillons ayant une CV supérieure ou égales à 1000 copies/ml, 42 ont été

testés avec la technique ANRS et comparés avec la mesure au CAP/CTM et Abbott

RealTime. Les résultats sont représentés sur les graphiques ci dessous.

Une bonne corrélation est observée entre ces deux techniques avec R2 = 0,72603 (fig

7b). Les deux courbent de mesures montrent qu’une légère différence existe entre ces deux

mesures (fig 7a) ainsi qu’au niveau des différences des Log (fig7c). Il pourrait bien s’agir du

fait que la mesure avec CAP/CTM a été faite en première position quand le plasma était dans

son état «normal», alors que pour la mesure avec la technique ANRS, le plasma a subit le

phénomène de congélation/dégélation.

Fig.7b : Corrélation CAP/CTM vs ANRS Fig.7c : Différences des Log CAP/CTM vs ANRS

Fig.7a : Courbes de mesure CAP/CTM vs ANRS

Figure 7 Comparaison CAP/CTM et ANRS


69

Pour ces deux techniques, la corrélation est aussi bonne avec R2 = 0,81064 (fig.8a) et

ce, malgré quelques dispersions au niveau des différences des Log (fig. 8c). Les deux

courbent montrent une dispersion (fig.8a). Ce constat serait dû comme nous l’avions déjà

signalé aux différentes périodes de mesure et au phénomène de congélation/dégélation.

Après comparaison des deux premières techniques, pour les échantillons ayant une CV

supérieure ou égale à 1 000 copies/ml et dont il y a encore du plasma disponible, 42 ont été

testés ensuite avec la technique de l’ANRS. Nous souhaiterions signaler qu’avec la méthode

de l’ANRS, le sang a subit le phénomène de congélation/dégélation au moins deux fois de

suite. Ceci pourrait interférer sur le résultat final. Les résultats pour n = 42 sont donnés dans

la figure ci-dessous.

Figure 9 Courbes de mesure entre CAP/CTM V2.0, ANRS et Abbott RealTime

fig.8b : Corrélation Abbott vs ANRS fig.8c : Différences des Log Abbott-ANRS

Fig.8a : courbes de mesures Abbott vs ANRS Figure 8 Comparaison Abbott RealTime et ANRS

Fig. 8a : Courbes de mesures Abbott et ANRS


70

L’ensemble des 42 échantillons testés ont une CV ≥ 1000 copies/ml. La superposition

des courbes traduit la fidélité des différentes techniques utilisées. Nous remarquons que la

courbe pour CAP/CTM est au-dessus par rapport aux deux autres. La corrélation entre la

mesure de la charge virale sur CAP/CTM et Abbott RealTime est parfaite avec R2 =

0,89793 ; les deux courbes semblent se coïncider alors que la mesure avec la technique de

l’ANRS semble être discordante des deux premières. La courbe est légèrement en dessous des

deux premières. Cette discordance pourrait s’expliquer par le fait que pour la mesure avec la

méthode ANRS, le plasma a été congelé et dégelé au moins deux fois. Un blip est observé sur

deux échantillons mesurés à l’aide du Cobas avec respectivement 2,23 et 2,68 log10

copies/ml.

La technique de l’ANRS G2-LTR commercialisée par Biocentric est connue pour sa

bonne performance quel que soit le sous-type viral VIH-1 groupe M (Gueudin et al., 2007;

François Rouet et al., 2007). Elle est utilisée en routine en Côte d’ivoire, au Cambodge, au

Vietnam, au Gabon, au Cameroun (François Rouet et al., 2007). Bien que la fiabilité générale,

l'exactitude de la technique CAP/CTM v2.0 et le dosage avec Abbott RealTime, ciblant la

région de l'intégrase, étaient jugés similaires par certaines études (Foulongne, Montes,

Didelot-Rousseau, & Segondy, 2006; Sloma et al., 2009; Taylor et al., 2009), les rapports

initiaux décrivent quand même une variabilité importante entre ces deux techniques autour de

la limite de quantification (Naeth et al., 2013).

La diversité des virus, en particulier des formes recombinantes complexes, rend

difficile la mise au point d’une technique « universelle » permettant l’amplification de tous les

variants quel que soit leur niveau de complexité. Il est donc préférable de suivre un patient

avec le même test et de changer de test pour toute discordance immunologique et/ou clinique.

4.4. Résumé des résultats du chapitre IV

La corrélation entre la mesure de la charge virale sur CAP/CTM et Abbott RealTime est

parfaite avec R2 = 0,96016; tandis que la mesure avec la technique de l’ANRS semble

être discordante des deux premiers tests. La corrélation est toute fois, bonne: R2 =

0,72603 pour CAP/CTM-ANRS et R2 = 0,81064 pour Abbott-ANRS.

Un blip est observé sur deux échantillons (2,23 et 2,68 Log10 copies/ml) avec la version

2.0 du CAP/CTM.


71

Abbott RealTime et CAP/CTM ont la même capacité de détection pour les échantillons

avec une CV ≥ 1000 copies/ml (48 vs 48).

La dégélation répétée du plasma interfère sur le résultat final avec une diminution de la

charge virale d’au moins 1 log10 copies/ml.

Chapitre V : Utilisation du DBS (Dried Blood Spot) pour le monitoring biologique

72

Chapitre V

Utilisation du DBS (Dried Blood Spot)

pour le monitoring biologique


73

CHAPITRE V- Utilisation du Dried Blood Spot (DBS) pour le monitoring biologique

5.1. Introduction

Facilement applicables, les prélèvements sur papier buvard permettent de recueillir du

sang prélevé sur tube EDTA ou par piqûre au talon ou au doigt, tant en ville que dans des

régions décentralisées. Ils permettent de conserver les échantillons de sang séché à

température ambiante (ou congelés), dans des sacs étanches en prévenant l’humidité. L’ARN

viral contenu sur le buvard imbibé de sang total ou de plasma peut se conserver à

température ambiante ou à –70°C et est stable durant au moins un an (Fiscus et al., 1998).

Le DBS a également l’avantage de s’acheminer facilement vers les laboratoires, ce

qui favorise dès lors la décentralisation. Par ailleurs, la technique du recueil de sang sur

papier buvard évite le déplacement d’équipes spécialisées puisque le prélèvement peut être

réalisé par toute personne correctement formée.

Les données indiquent que la détermination de la charge virale et l’évaluation de la

résistance génotypique du VIH-1 par le DBS et le DPS sont possibles ; plusieurs études ont

obtenu des résultats comparables même après stockage à long terme (Hamers et al., 2009).

C’est pour cette raison que nous avons décidé d’étudier cette sensibilité du DBS sur des

échantillons des patients tchadiens infectés par des sous-types non-B. Dans ce chapitre, nous

décrivons la méthodologie utilisée pour la collecte du sang sur DBS, sa conservation,

l’extraction du matériel génétique ainsi que la technique utilisée pour le séquençage. Dans la

partie résultats originaux, nous allons présenter les résultats obtenus (sous-types et mutations

de résistance) sur DBS par la technique de l’ANRS que nous comparerons avec les résultats

obtenus sur le plasma.

5.2. Méthodologie

Le sang est prélevé sur EDTA au pli du coude et 75 µl sont déposés sur papier buvard

de type Whatman® 903. Il est noté les informations suivantes : les initiales du patient, sa date

de naissance, la date du prélèvement et le numéro d’identification de la fiche. Cinq spots (375

µl de sang au total) sont utilisés pour chaque patient. Le séchage est fait pendant une nuit à

température ambiante et à l’abri de la lumière conformément à plusieurs études. Le

lendemain, ces buvards sont mis dans un emballage en plastique contenant deux dessiccants.

La conservation est faite à -20 °C jusqu’au transport en Belgique pour les analyses.


74

L’extraction de l’ARN viral est effectuée avec le kit QiAamp Viral RNA mini kit. Nous

avons fait recours à la technique de l’ANRS pour réaliser le séquençage (ANRS AC11

Resistance Study Group, 2008) sur un total de 30 DBS.


Les mutations de résistances sont recherchées sur 30 échantillons de patients VIH-1

positif sur DBS et sur plasma. Un taux d’amplification de 80 % (24/30) est obtenu sur le

DBS. La limite de détection du buvard est de 3,33 log10 ce qui équivaut à 2 150 copies/ml.

Cette différence par rapport au plasma pourrait s’expliquer par les techniques d’extraction

utilisées et aussi par la limite de détection du DBS pour les charges virales faibles. Il faut

noter cependant que certains sous-types sont moins sensibles sur papier buvard que sur

plasma. Les virus archivés dans les lymphocytes peuvent être différents de ceux présents dans

le plasma (CNS & ANRS, 2013). C’est pour cette raison que nous avons remarqué la

présence du sous-type K sur DBS alors qu’il n’a pas été trouvé dans le plasma.

Tableau 9 Mutations de résistance détectées sur plasma vs DBS

ID CV

Log10/ml

DBS/Plasma PI

Major

PI

Minor

INTI INNTI

2 4,67 K/A NA NA M184V K103N, Y188F

5 5,46 CRF02_AG/

CRF02_AG

M46I,

I54V,

V82S

L10V,

K20I

A62V, L74V,

V75T, M184I

V90I, K103N, V108I, Y181C,

H221Y

9 4,81 F/D NA NA M184V, T215F K101E, V108I, Y181C

12 4,58 D/D None L10I NA NA

15 4,47 D/D NA NA M41L, T69D,

K70R

K103E, V108I

23 5,56 J/J None L10I K65E, M184V K103N

30 5,98 G/G None K20I M41L, D67E,

T69Si, L74V,

M184V, L210W,

T215Y

A98G, K103N, V108I, P225H

31 5,14 D/NA None L10V T69N, K70R,

M184V

V106I, V179D, Y181C

32 5,41 J/J NA NA M41L, D67N,

L74V, M184V,

T215Y, K219E

V106M, V108I, Y181V,

H221Y

35 4,77 G/G NA NA D67N, T69d, V75I,

F116Y, Q151M,

M184V

K101E, G190A, K238T

48 3,33 K/G NA NA None None

49 5,19 K/NA None L10I,

K20I

M184V V106I


75

Pour les analyses des séquences, nous avons remarqué que pour un même patient,

nous pouvions avoir un sous-type différent sur la Reverse Transcriptase et (un autre différent)

sur la Protéase. Cette distribution est représentée dans le tableau ci-dessous :

Tableau 10 Comparison des sous-types détectés sur plasma vs DBS

DBS/Plasma Nombre Pourcentage (%)

CRF02_AG/CRF02_AG 7 29,17

CRFF02_AG/J 1 4,17

D/D 3 12,50

D/Ind 1 4,17

F/D 1 4,17

F/J 1 4,17

G/G 2 8,33

J/J 4 16,67

J/Ind 1 4,17

54 5,26 CRF02_AG/

CRF02_AG

None K20I K219N K103N, Y181C

59 5,18 CRF02_AG/

CRF02_AG

None K20I None None

62 5,09 F/J NA NA None L34A, V35N, E36R, I135V,

S162C, K173T, Q174K,

I180V, T200A, Q207D,

R211K, P226H, F227i,

M230V, E233L, P236A,

K238R, W239R, T240A,

Q242P, P243T, I244L,

V245L, P247X, K249E,

S251X, N255D, D256X,

I257V, K259Q

65 4,41 J/J NA NA M184V K103N, Y181C

67 4,63 J/J None L10I D67N, K70R,

M184V

Y188L

71 3,88 CRF02_AG/J None K20I NA NA

79 5,30 J/NA None None NA NA

92 4,68 CRF02_AG/

CRF02_AG

None L10I,

K20I

NA NA

93 5,72 D/D None None K70R, M184V,

K219Q

K103N, V108I, H221Y

107 4,87 CRF02_AG/

CRF02_AG

None K20I M184V V90I, K101E, V106I, G190A

108 4,39 CRF02_AG/

CRF02_AG

None K20I None V90I

110 5,09 CRF02_AG/

CRF02_AG

None K20I M41L, D67N,

M184V, T215F

A98G, Y181C


76

K/G 1 4,17

K/A 1 4,17

K/Ind 1 4,17

24 100

Ind: indéterminé

Pour le résultat final, nous avons retenu les sous-types obtenus sur les séquences de la

Protéase qui est la région la moins changeante du virus. Le CRF02_AG est le plus représenté

tant sur DBS (29,17 %; 7/24) que sur le plasma (30,23 %; 13/43). Il existe des concordances

entre le DBS et le plasma comme le montre le tableau ci-dessus. Le sous-type K est présent

(3/24; 12,5 %) sur DBS alors qu’il est absent dans le plasma. Ceci serait l’une des

conséquences de l’utilisation du BDS qui favorisera l’apparition des souches virales

archivées dans les cellules comme nous l’avions dit ci haut.

Le sous-type K est décrit dans la littérature comme minoritaire et retrouvé en Afrique

Centrale (Hemelaar et al., 2011). Selon Javaugue, il était initialement apparenté au sous-type

F pour former un sous-type F3 (Javaugue, 2014).

5.4. Résumé des résultats du chapitre V

Mise à part l’utilisation du buvard pour le diagnostic précoce chez l’enfant comme le

recommande l’OMS (GIP Esther., 2008) et pour la surveillance de la résistance au

traitement (Bennett et al., 2008), le DBS est utilisé pour le dépistage des troubles

métaboliques chez les nouveaux nés (McCabe etal., 1987), pour la détection des anticorps

VIH-1 (Hoff et al., 1988) mais aussi pour le diagnostic infantile du VIH-1 par PCR ADN

(Stevens et al., 2008). Le DBS peut cependant très bien servir pour l’évaluation du

traitement antirétroviral pour les sous-types non-B.

Le kit QiAamp Viral RNA mini kit pourrait être utilisé pour l’extraction de l’ARN viral

en vue de la détection des mutations de résistance par séquençage ou par ASPCR.

Sur DBS, un taux de réussite d’amplification de 80 % (24/30) par rapport au plasma est

observé.

Pour un même patient, des variations des sous-types sont parfois observées au niveau de

la Protéase et de la Reverse Transcriptase.

Le séquençage sur DBS a montré la présence du sous-type K (3/24 ; 12,5 %) au niveau de

la Reverse Transcriptase alors qu’il est absent dans le plasma après séquençage.


77

La limite de détection du papier buvard pour le test de résistance par la méthode de

l’ANRS est de 3,33 log10 ce qui équivaut à 2150 copies/ml.

Chapitre VI : Prévalence des mutations de résistance acquises et diversité génétique

78

Chapitre VI

Prévalence des mutations de résistance

acquise et diversité génétique


79

CHAPITRE VI. Prévalence des mutations de résistance acquises et diversité génétique

6.1. Introduction

A défaut d’éliminer le virus dans le sang, le traitement antirétroviral inhibe la

réplication virale et permet le maintien d’une charge virale indétectable (Damond &

Descamps, 1998; Grant et al., 2002). L’évaluation de l’efficacité d’un médicament nécessite

le cas échéant, un suivi régulier par la mesure de la charge virale et des tests génotypiques.

L’apparition des mutations de résistance favorise l’émergence des souches résistantes

conduisant à l’échec thérapeutique; ce qui constitue l’un des problèmes majeurs de la

trithérapie antirétrovirale (Roquebert et al., 2009). L’émergence des mutations de résistance

est fonction de la réplication résiduelle (puissance du traitement) et de la barrière génétique

(pression de sélection). La prévalence de résistance aux médicaments de 1ère ligne à l’Hôpital

Général de Référence nationale rapportée en 2009 est de 64 % (Koyalta et al., 2009).

Dans les premières années de la prise en charge des PVVIH au Tchad, le protocole de

traitement mis en place est basé sur une trithérapie (Triomune Cipla-Inde) qui est une

combinaison de deux inhibiteurs nucléosidiques (la d4T et la 3TC) et un inhibiteur non

nucléosidique (la NVP). Mais cette combinaison n’est plus utilisée depuis début 2012 non

seulement à cause de ses effets secondaires mais aussi à cause de l’échec immunovirologique

lié à son usage (Adawaye et al., 2014). Les trithérapies prescrites actuellement au Tchad sont

le Viraday (TDF, FTC et EFZ) et le Duovir-N (3TC, AZT et NVP).

Cependant, l’absence d’un suivi biologique régulier ou la non observance aux

médicaments favorise l’émergence des résistances aux antirétroviraux. Ces résistances

favorisent quant à elles la prolifération des certains sous-types qui se recombinent entre eux

pour donner des virus recombinants appelés CRF. Ceux-ci donnent de véritables mosaïques

des différents sous-types. Dans ce chapitre, nous présenterons les résultats du séquençage qui

vont nous permettre de présenter les sous-types et les mutations de résistances chez les

patients. Ensuite nous donnerons la prévalence des mutations de résistance acquise et enfin,

nous présenterons la diversité génétique des souches du VIH qui circulent à N’Djamena au

Tchad. Les techniques utilisées pour l’extraction, l’amplification et la détection seront aussi

décrites dans la partie méthodologie. Un article sur ce chapitre est rédigé et est soumis pour

publication.


80

6.2. Méthodologie

Nous rappelons que tous nos patients sont sous traitement de première ligne. Les

charges virales sont réalisées sur 116 échantillons au Laboratoire de Référence Sida du CHU

de Liège avec deux techniques différentes : la première technique utilisée est le Cobas®

AmpliPrep/CobasTaqman® HIV-1 version 2.0 (v2.0). C’est un test basé sur l’amplification in

vitro de l’ARN du VIH à partir du plasma recueilli sur tube EDTA. Il peut quantifier de 20 à

10 000 000 copies /ml d’ARN du HIV-1 du groupe M et O. L’autre technique utilisée est

l’Abbott RealTime HIV-1 in vitro test Réf 2G3190, qui est basée sur un dosage in vitro par

RT-PCR pour la détermination quantitative du virus de l'immunodéficience humaine de type 1

(VIH-1) dans le plasma d'individus infectés par ce virus.

Les comparaisons des moyennes des lymphocytes CD4 et la CV plasmatique ( 1000

copies/ml) ont été utilisées pour définir l’échec au traitement. Tous les échantillons ayant une

CV supérieure ou égale à 1 000 copies (n = 50) sont soumis au séquençage pour la détection

des mutations de résistance et la distribution des sous-types circulantes.

Extraction de l’ARN, RT-PCR, Outer PCR et séquençage

L’ARN est extrait du plasma en utilisant le kit QIAamp ADN mini kit. A partir du

plasma conservé à -80°C, 140µl sont utilisés pour l’extraction pour un éluât final de 60 µl.

Les méthodes d’amplification et de détection utilisées auxquelles nous avions eu recours, sont

celles décrites dans la procédure du groupe de résistance de l’ANRS AC11(ANRS AC11

Resistance Study Group, 2008). L’amplification des régions concernées de la polymérase

(Protéase et Reverse Transcriptase) a été effectuée avec le Titan One tube RT-PCR Kit,

Version 13 (Boehringer Mannheim, Manneheim, Germany).

La première PCR (outer) est réalisée en utilisant le couple d’amorce MJ3/MJ4 pour

amplifier 941 bp du gène de la Reverse transcriptase (RT) et 5’Prot1/3’Prot1 pour amplifier

653bp du gène de la Protéase. La deuxième PCR (nested) est accomplie avec les amorces

A35/NE (1) 35 afin d’amplifier 731 bp de la Reverse Transcriptase et 5’prot2/3’prot2 afin

d’amplifier 507 bp de la Protéase. Les primers (outers) alternatifs utilisés pour la Reverse

Transcriptase sont RT18/RT21 et 5’eprB/3’eprB pour la Protéase. Les alternatives pour la

nested sont RT1/RT4 pour la Reverse transcriptase et 5’prB/3’prB pour la Protéase. Tous les

«primers» utilisés ont fait l’objet d’un alignement sur Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov/).

Le séquençage est exécuté sur le 3730 DNA Analyser 48 capillaires avec l’amorce A20



81

(HIV55 alternative) pour la Reverse Transcriptase et avec 5’prB pour la Protéase. Un contrôle

négatif est introduit dans chaque run. L’amplification est faite avec le thermocycleur

GeneAmp PCR System 9700. Les temps sont adaptés au thermocycleur et à l’enzyme utilisée

(AmpliTaq DNA polymerase) conformément au Kit Titan. L’électrophorèse sur gel d’agarose

au bromure d’éthidium à 4 % est employée pour déterminer les bandes spécifiques du produit

PCR : 731 paires de base pour la Reverse Transcriptase et 507 pour la Protéase. Le contrôle

de poids moléculaire utilisé est le Tacklt TM X174 RF ADN/Hae III Fragment. Les produits

PCR sont purifiés sur NucleoFast® 96 PCR de Macherey Nagel et les produits de séquence

par le biais de la Résine Séphadex G. Le séquençage est réalisé par la méthode de Sanger avec

ABI 3730 Automatic cappilar sequencer.

Analyse des séquences et phylogénie

Les séquences de la Protéase et de la Reverse Transcriptase sont alignés avec le logiciel

Bioedit (version 7.2.5) et sur CLUSTAL W version 1.7 (Thompson et al., 1994). Les

séquences obtenues de la Protéase et de la Reverse Transcriptase sont comparées à la banque

des sous-types non-B disponible dans Los Alamos (http://www.hiv.lanl.gov/). La

détermination des sous-types, des formes recombinantes et des mutations de résistance sont

obtenues après analyse sur le site de Stanford University/HIV Drug Resistance Database

(http://hivdb.stanford.edu/). L’interprétation des résistances est faite conformément à

l’algorithme de l’ANRS AC11 (septembre 2013) (http://www.hivfrenchresistance.org/). Afin

d’autoriser des taux de mutations différents le long des branches, la méthode du plus proche

voisin «Neighbor Joining» nous a permis de construire l’arbre phylogénétique sur MEGA

5.2.2.


Caractéristiques de la population étudiée

Au total 116 patients (soit 68 femmes et 48 hommes respectivement 58,62 % et 41,38

%) ont participé à l’étude. La moyenne d’âge de nos patients était de 41 6,87 ans avec 84

ans pour le plus âgé et 17 ans pour le plus jeune. La tranche d’âge la plus dominante dans

cette étude est celle comprise entre 36 et 40 ans dont la majorité des représentants sont de

sexe féminin (83,33 % (n = 30)). Tous les patients étaient sous première ligne. La plupart des

patients (48/116 ; 41,38 %) étaient sous Triomune (d4T+3TC+NVP) alors que 53 patients

(45,69 %) étaient sous Duovir-N (AZT+3TC+NVP).


http://hivdb.stanford.edu/

http://www.hivfrenchresistance.org/


82

Tableau 11 Nombre de patients par rapport au traitement administré

Traitement Nombre Pourcentage

ABC + 3TC + EFV 1 0,86 %

AZT + 3TC + NVP 53 45,69 %

d4T + 3TC + EFV 1 0,86 %

d4T + 3TC + NVP 48 41,38 %

FTC + TDF + EFV 13 11,21 %

Total 116 100 %

Les patients sous Duovir N sont les plus nombreux avec 45,69 % ( soit 53/116) tandis

que ceux qui sont sous Triomune représentent 41,38 % (soit 48/116).

Amplification, détection et sous typage

La charge virale a été mesurée auprès de l’ensemble des patients sous traitement avec

les deux techniques précédemment citées (Abbott et Cobas).

Tableau 12 Valeurs charges virales sur CAP/CTM vs Abbott RealTime

CAP/CTM V2.0 Abbott RealTime

Copies/ml Log10 Copie/ml Log10

CV Minimum 0,00 0,00 0,00 0,00

CV Maximum 966 000 5,98 885 196 5,95

CV Moyenne 43 301 4,64 43 460 4,6

CV Médiane 85 1,93 51 1,7

Après mesure de la charge virale sur les 116 échantillons par les deux techniques

(CAP/CTM et Abbott RealTime), 109 étaient comparables parmi lesquels 50 échantillons ont

une CV ≥ 1 000 copies/ml, soit un taux d’échec de 43,10 %. Les moyennes (43 301 et 43 460)

et les médianes (85 et 51) sont quasiment les mêmes (respectivement p = 0,16 et p = 0,32; test

de Mann-Whitney).

Tous les 50 échantillons ont fait l’objet d’un séquençage par la méthode de l’ANRS

parmi eux, 44 échantillons ont été amplifiés avec succès; soit un taux de réussite

d’amplification de 88 % (44/50). Le taux de la suppression virale (CV < 1 000 copies/ml)

s’élève à 56,897 % (66/116). La prévalence de la résistance parmi les individus ayant une CV

≥ 1000 copies/ml est de 74 % (37/50). Un échantillon n’a pas donné de résultat après analyse


83

des séquences. La prévalence de la résistance acquise est donc de 31,89 % (37/116). La

distribution du traitement utilisé parmi les patients en échec est présentée dans le tableau ci

dessous:

Tableau 13 Nombre de patients en échec par rapport au traitement administré

Traitement Nombre pourcentage

AZT + 3TC + NVP 19 38,00 %

ABC + ddl + EFV 1 2,00 %

AZT + ddl + EFV 1 2,00 %

d4T + 3TC + NVP 23 46,00 %

FTC + TDF + EFV 6 12,00 %

Nous remarquons que parmi ces patients en échec, 23 étaient sous Triomune et 19

étaient sous Duovir N. La tendance au moment de cette étude reflète l’abandon de la

Triomune au profit du Duovir N.

Parmi les 23 patients en echec sous Triomune, une amplification de 82,61 % (19/23).

La distribution des différentes mutations et de sous-types est donnée dans le tableau suivant:

Tableau 14 Distribution des sous-types et des mutations de résistance chez les patients en

échec sous Triomune

ID Log10

(Copie/ml)

Sous-type IP

Maj.

IP Min. INTI INNTI

1 4,12 J None L10V, V11I NA NA

6 3,43 F NA NA M184V, T215F V90I, Y181V

15 4,47 D None None M41L, T69D,

K70R

K103E, V108I

18 5,43 G None L10I D67N, T69D,

K70R, M184V,

T215I, K219Q

K103S, E138Q

20 3,46 J None V32L, G48R M184V K101E, V106I, G190S

23 5,56 J None L10I K70P, V75F,

M184V

K103N

24 3,62 J None K20I V75M, M184V V106A, F227L

31 5,14 NA NA NA NA NA

35 4,77 G None None D67N, T69d,

V75I, F116Y,

K101E, G190A,


84

Q151M, M184V K238T

39 4,31 G None K20I, L90W M184V V108I, G190A

48 3,33 G None K20I A62V, V75L,

M184V

G190A, H221Y

50 3,47 J NA NA M184V A98G, K101E, Y181C,

H221Y

57 3,55 F None None M184V, T215F V90I, Y181V

74 3,25 J NA NA M184V Y188L

82 3,32 A None L10I, K20I M184V V108I, Y181C, H221Y

92 4,68 CRF02_A

G

None L10I, K20I M184L, T215F Y181V

93 5,72 D None None K70W, M184V,

K219Q

A98G, K103N, V108I,

H221Y

97 4,51 G None L10I, K20I V75I, M184V K103N, V106I

101 3,56 J None None None None

IP Min. :Inhibiteurs de la Protéase mineures ; IP Maj. : Inhibiteurs de la Protéase majeures

Parmi les 19 échantillons amplifiés des patients sous Triomune, un échantillon (N°31)

était indeterminé après analyse des séquences. Il apparait donc la réprésentation suivante des

sous-types parmi les 18 autres: A = 1 (5,56 %) ; D = 2 (11,11 %) ; F = 2 (11,11 %) ; G = 5

(27,78 %) ; J = 7 (38,89 %) et CRF02_AG = 1 (5,56 %). Aucune mutation majeure associée à

la Protéase n’a été observée chez ces patients. Par contre, quelques mutations mineures pour

la Protéase sont observées chez 11 patients: K20I = 4 (22,22 %) ; L10I = 4 (22,22 %) ; L90W

= 1 (5,56 %) et V32L/G48R = 1 (5,56 %). Le patient N°101 n’a présenté aucune mutation tant

sur la Protéase que sur la Reverse Transcriptase.

Les mutations observées pour les INTI sont largement representées par la M184V = 14

(77,78 %). Deux patients ne présentent aucune mutation pour cette classe de médicaments.

Les autres mutations rencontrées sont: V75F/I/L/M = 5 (27,78 %) ; T215F/Y = 4 (22,22 %) ;

K70R/P/W = 3 (16,67 %.) ; T69d/D = 3 (16,67 %) ; D67N = 2 ; K219Q = 2 (11,11 %) ; A62V

= 1 (5,56 %) ; F116Y = 1 (5,56 %) et Q151M = 1 (5,56 %).

Quant aux INNTI, nous avons constaté une représentation à parts égales pour la V108I

, la G190A/S et la H221Y rencontrées chez 4 patients chacune, soit 22,22 %. La K103N, la

K101E et YA81V sont constatées chez 3 patients chacunes, soit 16,67 %. Les autres


85

mutations sont: Y181C = 2 (11,11 %) ; K103E/S = 2; V90I = 2 (11,11 %) ; A98G = 2 (11,11

%) ; E138Q = 1 (5,56 %) ; V106A/I = 1 (5,56 %) et Y188L = 1 (5,56 %).

Dix neuf patients en echec virologique étaient sous Duovir N. Tous les 19 échantillons

ont été amplifiés avec succès (100%). La réprésentation des sous-types et la distribution des

mutations de résistance sont données dans le tableau suivant:

Tableau 15 Distribution des sous-types et mutations de résistance chez les patients en échec

sous Duovir N

ID Log10

(Copies/ml)

Sous-types IP Maj. IP Min. INTI INNTI

5 5,46 CRF02_AG M46I,

I54V,

V82S

L10V,

K20I

A62V, V75I,

M184I

K103N,

V108I,

Y181C,

H221Y

10 4,29 CRF02_AG None K20I M184V Y188L

30 5,98 G None K20I M41L, D67E,

T69Si, L74M,

M184V, L210W,

T215Y

A98G,

K103N,

V108I, P225H

32 5,41 J None None M41L, D67N,

L74V, M184V,

T215Y, K219E

V106M,

V108I,

Y181V,

H221Y

56 3,84 CRF02_AG None K20I None None


62 5,09 J None None None None

65 4,41 J None None M184V K103N,

Y181C

67 4,63 J None L10I M184V, T215F Y188L

68 4,73 A None L10I,

K20I

None V108I

73 4,26 CRF02_AG None K20M M184V G190A

75 4,67 A None L10I,

K20I

V75A, M184I,

T215F

V106I,

Y188L,

H221Y,

K238N

90 5,69 CRF02_AG None L10V,

L76S,

None V90I


86

N88D

91 5,76 CRF02_AG None None Y115F K101H,

V108I, E138R


105 4,55 J None L10I M184V, T215F Y188L

107 4,87 CRF02_AG None K20I M184V K101E,

G190A

108 4,39 CRF02_AG None K20I V75I, M184V L100I, K103N

110 5,09 CRF02_AG None K20I M41L, D67N,

M184V, T215F

A98G, Y181C

IP Min. :Inhibiteurs de la Protéase mineures ; IP Maj. : Inhibiteurs de la Protéase majeures

Le CRF02_AG est rencontré chez 11 patients en échec sous Duovir N soit 57,89 %.

Viens ensuite le sous-type J chez 5 patients (soit 26,31 %). Le sous-type A chez 2 patients

(10,53 %) et le sous-type G retrouvé chez un seul patient (5,26 %).

Il a été retrouvé chez un seul patient (soit 5,26 %) des mutations majeures associées

aux IP : M46I, I54V, V82S. Les mutations mineures sont observées chez 15 patients : K20I/M

(11/19; 57,89 %) ; L10I/V (5/19 ; 5,26 %). La mutation L76S est présente chez un seul patient

(soit 5,26 %) . La N88D est aussi présente chez un seul (soit 5,26%).

Pour les mutations de résistance aux INTI, elles sont présentes chez 13 patients sur les

19 (68,42 %). Elles sont representées essentiellement par la M184V/I retrouvée ches 12

patients (soit 63,16 %) suivie de la T215F/Y presente chez 6 patients (soit 31,58 %) . Les

autres mutations sont distribuées de la facon suivante : A62V = 1 (5,26 %) ; V75A/I = 3

(15,79 %) ; M41L = 3 (15,79 %) ; D67N/E = 3 (15,79 %) ; T69Si = 1 (5,26 %) ; L74M/V = 2

(10,53 %) et Y115F = 1 (5,26 %).

Concernant les mutations de résistance observées pour les INNTI, 15 patients

présentent au moins une mutation, soit 78,95 %. Les plus représentées sont la Y181C/V et la

V108I qui sont rencontrées à part égales chez 5 patients, soit 26,31 % chacune. On rencontre

la K103N chez 3 patients (soit 15,79 %) ainsi que la H221Y avec 15,79 %). Les autres sont :

G190A = 2 (10,53 %) ; Y188L = 2 (10,53 %) ; K101H/E = 2 (10,53 %) ; A98G = 2 (10,53 %)

; V106M/I = 2 (10,53 %) ; K238N = 1 (5,26 %) ; V90I = 1 (5,26 %) ; P225H = 1 (5,26 %)

E138R = 1 (5,26 %) et L100I = 1 (5,26 %).


87

L’analyse nucléotidique des 44 échantillons indique la présence des sous-types décrits

dans le tableau suivant:

Tableau 16 Distribution des patients par rapport aux sous-types

Sous-types Nombre Pourcentage (%)

A 4 9,3

D 4 9,3

F 2 4,65

G 7 16,28

J 13 30,23

CRF02_AG 13 30,23

Ces sous-types sont basés sur les séquences de la Protéase. La représentation observée

est: A = 4 (9,30 %), D = 4 (9,30 %), F = 2 (4,65 %), G = 7 (16,28 %) et J = 13 (30,23 %). La

seule forme recombinante rencontrée est CRF02_AG = 13 (30,23 %). Un échantillon était

indéterminé après analyse des séquences dans Stanford. La littérature décrit que parmi toutes

les souches du VIH-1 incriminées dans l’infection dans le monde, la part globale des sous-

types F, G, H, J et K réunit avoisine le 6 %; la majorité d’entre elles (5 %) étant dues au sous-

type G (Javaugue, 2014).

Des mutations des résistances sont observées au niveau du gène de la Reverse

transcriptase et à celui de la Protéase.

Prévalence des mutations de résistance

Nous rappelons d’ores et déjà que certains polymorphismes occasionnent l’installation

des mutations silencieuses et cela a pour conséquence l’acquisition d’une mutation au niveau

d’un codon de résistance qui peut différer selon le sous-types (Brenner et al., 2003).

La présence d’au moins une mutation majeure observée au niveau de la Reverse

Transcriptase est de 86,04 % (37/43). Il en est de même pour la Protéase et la Reverse

Transcriptase car la présence d’au moins une mutation majeure sur les deux gènes est de

86,04 % (37/43). Quant à la prévalence de la résistance acquise chez tous les patients, elle est

de 31,9 % (37/116). Six patients soit 13,95 % (n = 43) ne présentent aucune mutation de

résistance sur la Reverse Transcriptase pour les deux groupes de médicaments. Pour les INTI,

9 patients (soit 20,93 %) ne présentent aucune mutation tandis que pour les INNTI, ceux qui

ne présentent aucune mutation de résistance sont 6 (soit 13,95 %).


88

Mutations associées à la Protéase

Au niveau de la Protéase, il n’y a pas eu des mutations majeures sauf chez un seul

patient (1/43 ; 2,33 %) où nous avons a remarqué la présence de M46I, I54V, V82S. Ce

patient est infecté par une forme recombinante CRF02_AG. Outre les mutations majeures

associées à la Protéase, ce même patient porte aussi des mutations pour les INTI (A62V,

V75I, M184I et H221Y) et pour les INNTI (K103N, V108I et Y181C). Les mutations

mineures observées chez les autres patients sont: K20I/M (21/43 ; 48,84 %) ; L10I/V (15/43 ;

34,88 %) ; L90W (1/43 ; 2,33 %) ; L76S (1/43; 2,33 %) ; N88D (1/43; 2,33 %) ; V11I (1/43 ;

2,33 %) ; V32L (1/43 ; 2,33 %) et G48R (1/43 ; 2,33 %).

Mutations associées à la Reverse Transcriptase

Pour les INTI (Inhibiteurs Nucléosidiques et Nucléotidiques de la Transcriptase

Inverse), les principales mutations observées sont: M184V/I/L largement rencontrée chez 30

patients sur les 43, soit 69,77 % ; T215Y/F/I/S chez 13 patients (soit 30,23 %) ; d’autres

mutations communes (A62V, V75I/L et M184V/I) sont aussi observées chez deux patients à

hauteur de 4,65 %.

Figure 10 Fréquence des mutations de résistance associées aux INTI

Les analogues à la thymidine (TAMs) sont incarnés par la T215Y/F à 30,23 % (13/43),

la K70P/R/W à 9,30 % (4/43) et la K219E/N/Q à 9,30 % (4/43).


89

La figure suivante indique les mutations de résistance observées pour les INNTI.

Figure 11 Fréquence des mutations de résistance associées aux INNTI

Les résistances observées pour les INNTI sont symbolisées par la K103N/S/E chez

13/43 (30,23 %) et par la Y181C/V/F/L chez 11/43 (25,58 %). Comme on pouvait s’y

attendre dans le cas des INNTI; une association Y181C/F et K103N a été retrouvée chez 3/43

(6,98 %). Ces deux mutations confèrent une résistance croisée à l’EFZ et à la NVP. Certaines

mutations ne sont retrouvées que chez un seul patient à hauteur de 2,33 % sont: L100I, F227L

et P225H.

Ces mutations confèrent une résistance du virus au traitement administré. Les résultats

des tests génotypiques sont habituellement présentés par des logiciels auxquels des règles

d’interprétation ont été transmises. Pour chaque antirétroviral, le résultat est exprimé avec la

mention « résistance » ou « résistance possible » ou « sans évidence de résistance ». La

quantification de cette résistance par rapport au traitement est résumée dans le tableau suivant.


90

Tableau 17 Quantification de la résistance du VIH au traitement (Stanford)

ARV High-level

resistance

score Intermediate

resistance

score Susceptible score Potential

low-level

resistance

score Low-level

resistance

score

3TC 29 (67,5 %) 60-110 00 (00,0 %) 0 13 (30,2 %) 0-5 00 (00,0 %) 0 00 (00,0 %) 0

AZT 06 (13,9 %) 65-155 09 (20,9 %) 30-45 27 62,8 %) -10-0 00 (00,0 %) 0 00 (00,0 %) 0

d4T 06 (13,9 %) 65-155 10 (23,3 %) 30-45 26 (60,5 %) -10-0 00 (00,0 %) 0 00 (00,0 %) 0

EFV 24 (55,8 %) 60-110 10 (23,3 %) 30-55 07 (16,3 %) 0 02 (04,7 %) 10 00 (00,0 %) 0

NVP 32 (74,4 %) 60-150 02 (04,7 %) 40-55 07 (16,3 %) 0 00 (00,0 %) 0 00 (00,0 %) 15

FTC 30 (69,8 %) 60-110 00 (00,0 %) 0 13 (30,2 %) 0-5 00 (00,0 %) 0 00 (00,0 %) 0

TDF 01 (02,3 %) 110 03 (06,9 %) 30-35 33 (76,7 %) -10-5 01 (2,3 %) 10 04 (09,3 %) 15-25

ABC 04 (09,3 %) 100-135 09 (20,9 %) 30-45 09 (20,9 %) 0 00 (00,0 %) 0 20 (46,51 %) 15-25

Nous observons qu’il y a une résistance élevée aux INNTI chez plus de la moitié des

patients avec 74 % (32/43) pour la NVP et 55,8 % (24/43) pour l’EFZ. Pour les INTI, une

forte résistance à la 3TC est observée à hauteur de 67,5 % (29/43).

Afin de pouvoir identifier les homologies (liens évolutifs) et les homoplasies

(convergence, parallélisme et réversion) des souches du VIH-1 qui circulent à N'Djamena

(Tchad), le logiciel sur MEGA 5.2.2 est utilisé pour construire l’arbre phylogénétique par la

méthode du plus proche voisin « joining Neighbor ».


91

Figure 12 Arbre phylogénétique des séquences de la protease (plasma)

Les bootstraps observés entre les branches sont tous supérieurs à 70 %. Nous

remarquons aussi sur cet arbre que le nouveau sous-type J apparu dans cette étude est

apparenté au sous-type F. Dans la littérature, il est décrit que le sous-type F occupe une

position basale dans un arbre phylogénétique (Guimarães et al., 2009). Le sous-type J est lui

aussi décrit comme rare et est retrouvé en Afrique Centrale chez 1,8 % des PVVIH (Javaugue,

2014).

6.4. Résumé des résultats du chapitre VI

A l’issue des résultats observés dans notre étude, le taux d’échec aux médicaments de

première ligne à N’Djamena au Tchad est de 43,10 % (n = 116). Aucune association

significative entre le taux d’échec et le sexe n’a été observée (p 0,05). Il est important de

noter que l’échec thérapeutique n’est pas seulement dû à une apparition d’une mutation de


92

résistance au niveau du virus, mais peut s’expliquer aussi par une faible observance ou

une interruption prolongée du traitement (OMS, 2012).

Le taux de suppression virale (CV < 1000 copies/ml) est de 56,897 % (66/116) ; la

prévalence de la résistance parmi les individus ayant une CV ≥ 1000 copies/ml est de 74%

(37/50).

La prévalence de la résistance acquise est de 31,9 % (37/116). Cette prévalence est

inférieure à celle trouvée par Koyalta et al. (2009) dans la même population

N’Djaménoise qui est de 64 % (n = 88).

Il ressort de cette étude qu’un nouveau sous-type J circule à N’Djaména avec un taux de

30,23 % (13/43). Après analyse phylogénétique, il s’est avéré que ce nouveau sous-type J

est apparenté au sous-type F. La littérature décrit que les sous-types F, H, J et K sont

incriminés dans un nombre restreint d’infections dans le monde (0,94 %) avec

prédominance du sous-type F1 (0,45 %) (Javaugue, 2014). Ceux-ci sont généralement

rencontrés en Afrique Centrale (Burda et al., 2004; Triques et al., 1999, 2000).

Une résistance élevée de plus de 50 % est observée pour les INNTI chez plus de la moitié

des patients avec 74 % pour la NVP et 55,8 % pour l’EFZ. Pour les INTI, une forte

résistance à la 3TC est observée chez 29 patients, soit 67,5 %. Ces résultats se révèlent

être alarmants quant aux patients qui sont sous Viraday et Duovir N actuellement à

N’Djaména.

Chapitre VII : Détection des mutations ponctuelles de résistance (Allele-Specific PCR)

93

Chapitre VII

Détection des mutations ponctuelles de

résistance (Allele-Specific PCR)


94

CHAPITRE VII- Détection des mutations de résistance ponctuelles (ASPCR)

7.1. Introduction

Utilisée pour la première fois en 1991 pour la détection des mutations de résistance du

VIH-1 (Larder et al., 1991), l’ASPCR est une technique qui permet de détecter une mutation

de résistance à faible proportion (1 %) dans un échantillon. Les techniques génotypiques

standard quant à elles ne détectent un variant (un nucléotide muté) que s’il est majoritaire et

représente au moins 20 % de la population virale totale (Brun-Vezinet et al., 2004; Grant et

al., 2003; Halvas et al., 2006; Palmer et al., 2005). Avec les récentes technologies de la PCR

en temps réel, l’ASPCR a vu sa sensibilité augmenter (Metzner et al. 2003, 2005). Cette

sensibilité de détection des mutations mineures à moins de 20 % a un intérêt clinque majeur

dans les PRL et surtout quand il s’agit du développement de la résistance à la Névirapine dans

la PTME (Eshleman et al., 2001; Jackson et al., 2000). Cependant, La nature exacte de

l'importance clinique de mutations mineures reste incertaine, mais les données indiquent que

la circulation des souches virales résistantes au traitement contribue à l'échec virologique

(Jourdain et al., 2004; Lecossier et al., 2005) et peut permettre la prédiction d'échec

virologique à un stade précoce.

La résistance à la classe des INNTI est conférée par une seule mutation au niveau du

gène de la Reverse Transcriptase. Il s’agit de la K103N ou de la Y181C occasionnant ainsi

une résistance croisée à la Névirapine ou à la l’Efavirenz du fait de leur faible barrière

génétique.

La mutation M184V au niveau de la Reverse Transcriptase est impliquée dans la

résistance élevée à la Lamivudine. Il a été démontré que les virus qui développent cette

mutation sont incapables de subir une mutagenèse compensatoire suite à la suppression de la

boucle située en amont du site de liaison de l’amorce (Wei et al., 2002, 2003).

Considérant les molécules utilisées pour le traitement au Tchad, compte tenu aussi de

l’importance de chacune des mutations de résistance suscitées et conformément à celles

rencontrées dans notre étude, celles qui sont choisies pour la technique ASPCR sont les

suivantes: K103N (AAC); Y181C (TGT); M184V (GTG); T215Y/F (TAC ou TTC) et K70R

(AGA). Nous décrivons dans ce chapitre les résultats de la technique ASPCR obtenus sur

DBS et sur le Plasma. Dans la partie résultats originaux, la sensibilité de la technique ASPCR


95

par rapport aux différentes mutations obtenues par séquençage sur plasma et sur DBS sera

aussi décrite.

7.2. Méthodologie

Au niveau du plasma, six mutations conférant des résistances majeures ont été

sélectionnées pour l’ASPCR tandis que pour le DBS, nous n’avons étudié que deux de ces

mutations. Il s’agit de la K103N et de la M184V. Pour le plasma, 44 échantillons ont été

utilisés contre 24 pour le DBS ; ces échantillons sont ceux ayant donnés des résultats positifs

au séquençage. La procédure de cette méthode est détaillée dans la partie méthodologie de ce

document. Pour chaque mutation, deux PCR sont réalisées dans deux tubes différents. Une

première PCR avec l’allèle normal (générique) et une seconde PCR avec l’allèle muté. Les

amorces utilisées sont celles générées spécifiquement pour les sous-types A, C et D. Nous

avons testé tous les sous-types et formes recombinantes retrouvés par séquençage pour en

évaluer la sensibilité de la technique pour les autres sous-types présents chez nos patients qui

sont F, G, J et CRF02_AG.

La PCR est réalisée sur LightCycler480 (Roche). La technique utilisée détermine la

quantité absolue de la séquence d’acide nucléique à l’intérieur d’un échantillon inconnu. Des

séries des dilutions des échantillons connues sont utilisées pour générer la courbe standard.

Des échantillons contrôles ont été employés pour chaque run. Pour chaque mutation, un

échantillon connu contenant la mutation à rechercher est dilué cinq fois et testé avec le primer

générique et le primer muté. Un autre échantillon connu, de sous-type non-B, servant de

contrôle négatif, ne contenant pas de mutation (sauvage) est aussi dilué et inséré dans chaque

run.


Evaluation de l’ASPCR

Nous avons utilisé un échantillon positif à la mutation recherchée (muté) à 105 log

copies/ml et un autre échantillon négatif à la mutation (sauvage) pour évaluer la technique.

Tous deux étaient de sous-types non-B des patients africains. Des dilutions ont été effectuées

pour chacun des deux contrôles utilisés. Ils sont ensuite dilués (de 0,01 % à 100 %) et testés


96

avec des primers spécifiques pour chaque mutation recherchée. Au total 5 dilutions ont été

exécutées pour construire la courbe standard: 100 % ; 10 % ; 1 % ; 0,1 % et 0,01 %.

Pour évaluer la discrimination de la technique, nous avons utilisé la différence des

threshold cycles (Ct) ou crossing points (Cp) obtenues entre le virus muté et le mélange

(sauvage-muté). Pour chaque dilution, nous avons fait deux réactions avec l’allèle normal et

deux avec l’allèle muté ; la valeur moyenne des Ct de chaque dilution est utilisée nous a

permis de mesurer la sensibilité et la précision de la technique pour les différentes mutations.

Pour obtenir le mélange sauvage-muté, nous avons mis du virus sauvage dans les

dilutions de l’échantillon muté. Le cycle seuil est déterminé par la valeur des Ct moyenne ± 2

(écart type).

NB: La présence du virus muté dans le mélange est avérée si la valeur du Ct est

inférieure à celle du seuil retenu pour chaque type de mutation.

Figure 13 Courbes standard des différences des Ct (sauvage-muté) pour les différentes

mutations


97

Pour chacune des courbes, le coefficient de corrélation de Pearson indique une bonne

corrélation avec R2 > 0,97 pour le virus muté et R2 > 0,96 pour le virus wild-type.

Figure 15 Exemple de la courbe d'amplification (générique et sauvage) avec différences des

Ct pour la K103N

Une valeur Ct seuil est fixée (35 pour cette courbe) et toutes les courbes qui sortent

après cette valeur sont considérées comme négatives. La différence de Ct entre la première

Ct

fig.14a : Corrélation Y181/Y181C fig.14b : Corrélation M184/M184V fig.14c : Corrélation K103/K103N

Fig.14d : Corrélation T215/T215F fig.14e : Corrélation T215/T215Y fig.14f : Corrélation K70/K70R

Figure 14 Courbes standard avec le primer générique et muté des différentes dilutions


98

courbe (Ct = 7) et la deuxième (Ct =20) permet de définir une différence de Ct (Ct) qui est

de 13.

Spécificité de l’ASPCR

Pour mesurer la spécificité de la technique pour chaque mutation, nous avons calculé

les différences des Ct des différentes dilutions du mélange (sauvage-muté). Une valeur seuil

est fixée et est utilisée pour la comparaison avec celle de l’échantillon sur lequel est

recherchée la mutation. Les valeurs des différences des Ct (Ct) de toutes les mutations sont

plus de 9 sauf pour la K70R qui est de 6 ; ce qui indique que toutes les amorces spécifiques

peuvent distinguer avec précision le virus muté.

Les différences des Ct retenues pour la validation des résultats sont : Ct= 13 pour la

K103N ; Ct = 9 pour la M184V ; Ct =12 pour la T215F ; Ct =12 pour la T215Y ; Ct =9

pour Y181C et Ct = 6 pour K70R. Tous les contrôles positifs sont en dessous du seuil de ces

valeurs.

Sensibilité, précision et reproductibilité de la technique

Au total 5 dilutions variant de 0,01 % à 100 % ont été réalisées et amplifiées avec des

amorces spécifiques. Les valeurs des Ct observées sont inférieures à la valeur seuil définie,

ceci voudra dire que les mutations de résistance peuvent être détectées même avec une faible

proportion de 1 %.

Chaque analyse est réalisée en double. La différence des Crossing point (ct) de

chaque échantillon comparée au Ct (Cycle Threshold) ou Cp (Crossing point) des contrôles

sauvage et muté est utilisée pour la validité des résultats. Si la mutation recherchée (A/C) est

présente, le test est considéré comme positif. Le test peut seulement être positif pour une seule

réaction. Dans ce cas, s’il n’est positif qu’avec le primer générique, on dit que le sujet est

sauvage homozygote (A/A). S’il n’est positif qu’avec le primer muté, on dit que le sujet est

homozygote muté (C/C). Le résultat est considéré comme faux positif si la valeur du Ct est

supérieure à la valeur seuil retenue pour chaque mutation et que la différence des Ct apparaît

en dehors du seuil de positivité défini.

Classiquement, la précision est estimée à partir de la reproductibilité intra-essais et de

la reproductibilité inter-essais. Ces paramètres qui sont alors quantifiés par le coefficient de

variation (CV %) ou écart-type relatif: CV = (Ecart-type/moyenne) x 100. Le coefficient de

variation est le rapport de l'écart-type à la moyenne. Plus la valeur du coefficient de variation

http://www.insee.fr/fr/methodes/default.asp?page=definitions/moyenne.htm


99

est élevée, plus la dispersion autour de la moyenne est grande. Il est généralement exprimé en

pourcentage. Sans unité, il permet la comparaison de distributions de valeurs dont les échelles

de mesure ne sont pas comparables. Lorsqu'on dispose de valeurs estimées, le CV rapporte

l'écart-type de l'estimation à la valeur de cette estimation. Plus la valeur du coefficient de

variation est faible, plus l'estimation est précise.

Pour évaluer la reproductibilité intra-essais et inter-essais de la technique, nous avons

dosé trois fois dans la même série les dilutions du mélange de 1 % à 100 %. La moyenne et

l’écart type observés nous ont permis de calculer pour chaque série le coefficient de variation.

Nous avons ensuite calculé les coefficients de variation à partir des différentes valeurs

observées pour chaque type de mutation.

Tableau 18 Coefficients de variation intra et inter-essais

Coefficients de Variation intra-essais

Proportion du mutant (%) M184V Y181C K103N T215F T215Y K70R

100 0,13 0,12 0,08 0,05 0,13 0,02

10 0,29 0,15 0,23 0,24 0,34 0,21

1 0,39 0,36 0,42 0,43 0,41 0,28

Coefficients de Variation inter-essais

Proportion du mutant (%) M184V Y181C K103N T215F T215Y K70R

100 0,23 0,31 0,12 0,04 0,19 0,12

10 0,33 0,25 0,31 0,32 0,37 0,24

1 0,42 0,37 0,37 0,45 0,41 0,37

Les coefficients de variation intra-essais observées sont inférieurs à 0,13 pour la

proportion 100 % du virus sauvage (wt) ; inférieurs à 0,35 pour 10 % wt et aux alentours de

0,41 pour la dernière proportion qu’est de 1 % wt. Pour les CV inter-essais, ils sont inférieurs

à 0,32 pour le 100 % sauvage; d’environ 0,31 pour le 10 % wt et inferieurs à 0,46 pour la

proportion 1 % du virus sauvage.

Toutes les valeurs en inter et intra-essais sont faibles et ne dépassant pas 0,46. Ceci

signifie que l’estimation de la technique est beaucoup plus précise.


100

Tableau 19 Mutations de résistance détectées par ASPCR (Plasma)

CV Log10 Résultats ASPCR

ID (Copie/ml) Subtyes K103N Y181C M184V T215F T215Y K70R

1 4,12 J wt wt wt wt wt wt

2 4,67 A + wt + wt wt wt

5 5,46 CRF02_AG + + wt wt wt wt

6 3,43 F wt wt + wt wt wt

9 4,81 D wt wt + wt wt wt

10 4,29 CRF02_AG wt wt + wt wt wt

12 4,58 D wt wt + wt + wt

15 4,47 D Faux + wt wt wt wt +

18 5,43 G wt wt wt wt wt wt

20 3,46 J wt wt + wt wt wt

23 5,56 J + wt + wt wt wt

24 3,62 J wt wt + wt wt wt


31 5,14 NA wt wt wt wt wt wt

32 5,41 J wt + + wt wt wt




50 3,47 J wt + + wt wt wt

54 5,26 CRF02_AG + wt wt wt wt wt

56 3,84 CRF02_AG wt wt wt wt wt wt

57 3,55 F wt wt + wt wt wt



65 4,41 J + wt wt wt wt wt

67 4,63 J wt wt wt + wt wt

68 4,73 A wt wt wt wt wt wt




101

ID = Identification patient. wt = wild type = virus sauvage (pour réaction négative) ; + =

réaction positive (pour la mutation recherchée). Un faux positif (N°15) est observé pour la

K103N.

Les résultats obtenus par les deux méthodes (séquençage et ASPCR) nous ont permis

de comparer les différentes mutations par rapport aux sous-types.

Tableau 20 Comparaison des mutations de résistance en fonction des sous-types détectés par

ASPCR vs plasma

Mutations Résultats Séquençage Résultats ASPCR

Nombre Sous-types Nombre Sous-types

K103N 10 A (1) ; D (1) ; G (3) ; J (2) et

CRF02_AG (3)

6 A (1) ; D (1) ; J (2) et

CRF02_AG (2)

Y181C 6 A (1) ; J (3) et CRF02_AG (2) 5 A (1) ; J (2) et CRF02_AG (2)

M184V 27 A (2) ; D (3) ; F (2) ; G (6) ; J

(9) et CRF02_AG (5)

15 A (2) ; D (3) ; F (2) J (5) et

CRF02_AG (5)

T215F 8 A (1) ; D (1) ; F (2) ; J (2) et

CRF02_AG (2)

4 CRF02_AG (2) et J (2)

T215Y 3 D (1) ; G (1) et J (1) 1 D (1)

K70R 2 D (1) et G (1) 1 D (1)



75 4,67 A wt wt wt wt wt wt

82 3,32 A wt + + wt wt wt



92 4,68 CRF02_AG wt wt wt + wt wt

93 5,72 D + wt + wt wt wt




105 4,55 J wt wt wt + wt wt



110 5,09 CRF02_AG wt + + + wt wt


102

Au total 44 échantillons positifs au séquençage sont soumis à la technique ASPCR

comme nous l’avons mentionné plus haut. Pour les sous-types A et D pour lesquels les

primers sont conçus spécialement, nous remarquons une sensibilité de 100 % de l’ASPCR par

rapport au séquençage pour toutes les mutations sauf à la Y181C qui n’était pas présente pour

le sous-type D même au séquençage. Une spécificité est observée pour le sous-type J et

CRF02_AG pour la K103N, la Y181C, la M184V et la T215Y. Le sous-type F a lui aussi une

spécificité de 100 % pour la M184V par l’ASPCR.

Figure 16 Quantifications des mutations de résistance détectées par ASPCR vs plasma

Détection des mutations ponctuelles sur DBS avec la technique du séquençage de

l’ANRS et l’ASPCR

Cette technique de la détection des mutations ponctuelles (ASPCR) est très spécifique

puisqu’elle détecte aussi d’autres sous-types tels que le sous-type J, F et CRF02_AG avec des

primers conçus pour les sous-types A et D. Cela révèle l’existence d’un polymorphisme

spécifique pour les sous-types testés positifs.

Tableau 21 Evaluation de la sensibilité de l'ASPCR par rapport au séquençage sur DBS vs

plasma

Mutations Séquencage (plasma) ASPCR (DBS)

K103N 7 5

M184V 13 8


103

Pour le DBS, nous n’avons testé que 24 échantillons pour deux mutations par ASPCR,

il s’agit de la K103N et de la Y181C. Les primers sont générés spécifiquement pour les sous-

types A, D et C. En l’absence du sous-type C dans notre étude, et du sous-type A sur DBS, la

proportion des sous-types D, J et du CRF02_AG détectés par séquençage et par ASPCR sont

résumés dans le tableau suivant :

Tableau 22 Distribution des mutations de résistances détectées par ASPCR par rapport aux

sous-types détectés sur DBS

Mutations Résultats Séquençage Résultats ASPCR

Nombre sous-types Nombre sous-types

K103N 7 CRF02_AG (2) ; J (2) ; G

(1) ; K (1) et D (1)

5 CRF02_AG (2) ; J (2) et D (1)

M184V 13 CRF02_AG (2) ; J (4) ; G

(2) ; K (2), F (1) et D (2)

8 CRF02_AG (2) ; J (4) et D (2)

Nous remarquons que la sensibilité de la technique de détection des mutations

ponctuelles sur DBS est quasi égale à celle sur le plasma.

7.4. Résumé des résultats du chapitre VII

1. L’Allele-Specific PCR (ASPCR) peut être utilisée pour une évaluation qualitative des

mutations de résistance et aussi quantitative pour la mesure de la charge virale.

2. Une spécificité de 100 % est obtenue avec l’ASPCR sur DBS pour les sous-types D,

CRF02_AG et J pour toutes les deux mutations recherchées (K103N et M184V). Il

pourrait bien s’agir d’un polymorphisme spécifique des sous-types non-B au niveau de la

Reverse Transcriptase.

3. L’ASPCR est une méthode fiable de détection de mutations de résistance ponctuelles

mineures à hauteur de 0,01 %.

4. Elle est la méthode de choix pour la détection des mutations de résistance mineures dans

un échantillon; les coefficients de variation en intra et inter-essais sont tous inférieurs à

0,50; ce qui montre que l’estimation de la technique est plus précise.

5. L’ASPCR peut être utilisée pour détecter plusieurs mutations dans un même échantillon.

6. La technique ASPCR fournit aussi des informations sur l’évolution de la résistance.

Discussion générale

104


Evaluation immunovirologique du traitement antirétroviral

Lors d’une infection par le VIH, les principales cellules cibles du VIH sont les

lymphocytes TCD4 du système immunitaire, qui portent à leur surface des molécules CD4

indispensables à la pénétration cellulaire du virus. En utilisant les lymphocytes CD4 pour se

répliquer, le VIH entraîne leur destruction entrainant la circulation importante du matériel

viral dans la circulation sanguine et aussi l’épuisement du système immunitaire ; ce qui

permet l'apparition des infections opportunistes. C’est pour cette raison que nous avons

d’abord fait une évaluation immunovirologique chez tous les 116 patients et ensuite chez les

patients qui étaient sous Triomune. Cette évaluation est faite dans l’objectif de mesurer

l’efficacité du traitement et apprécier la réponse du système immunitaire.

Les lymphocytes TCD4 et la charge virale sont évalués avant le traitement (J0) et

après huit mois de traitement (M8). L’étude a montré que le nombre des patients qui étaient à

plus de 500 CD4/mm3 avant le traitement est passé de 30 à 19. La médiane au J0 est de 248

alors que celle de M8 est de 298,5 (test de Mann-Whitney, p = 0,75). La moyenne des CD4

avant le traitement et après 8 mois de traitement n’a pratiquement pas évoluée: 309 vs 344 (p

= 0,62). Ces résultats témoignent la faible reconstitution du système immunitaire chez nos

patients. Normalement, la charge virale devient indétectable dans le plasma (inférieure à 50

copies/ml) une dizaine de semaines après le début du traitement tandis que les CD4 amorcent

leurs remontée dans les quatre à huit semaines du traitement, mais cette première remontée est

attribuée au passage des CD4 des ganglions lymphatiques au flux sanguin (Routy, 2009).

Le taux d’échec aux médicaments de première ligne trouvé dans notre étude est de

43,10 % (50/116). La mauvaise observance est notifiée à hauteur de 80 % des patients chez

tous ceux ayant fait partie de notre étude. Une corrélation positive est observée entre la

mauvaise observance et le taux d’échec immunovirologique (p < 0,05). La mauvaise

observance peut avoir diverses raisons liées au patient, à son environnement et à la molécule

utilisée ou aux acteurs de la santé. Certains patients sautent des prises, par oubli ou par

négligence, ce qui peut favoriser l’émergence de résistance du VIH aux traitements. D’autres

se fient aux marabouts et guérisseurs traditionnels qui leur font croire que la guérison du Sida

est possible. Il faut noter que cette pratique n’est pas sans conséquences car elle contribue à la

dégradation de l’état de santé des patients qui sont parfois sujets à des nombreuses infections


105

opportunistes.

Parmi les 48 patients qui étaient sous Triomune, nous avons observé cependant que le

taux d’échec à la Triomune est de 43,75 % (21/48) et plus de 81 % de ces patients étaient en

mauvaise observance. Cette mauvaise observance comme l’ont notifiée les médecins pourra

aussi favoriser l’émergence de résistance aux médicaments dont la barrière génétique est

faible à l’exemple des INNTI. Une seule mutation telle que la K103N ou la Y181C pour ce

groupe (NVP et EFZ) peut entrainer une résistance totale et irréversible.

En somme, les CD4 et la charge virale constituent les paramètres primordiaux pour

l’évaluation immunovirologique quand ils sont réalisés régulièrement c’est à dire à 1 mois et

3 mois de traitement, puis tous les 3 mois la première année. Nous rappelons aussi que la

fréquence pour le suivi immunovirologique à l’HRGN n’est pas standard. Les rendez-vous ne

sont pas respectés ou les examens ne sont pas réalisés pour une raison ou une autre (manque

des réactifs, panne des appareils, grève du personnel, etc.). Généralement, pour les patients

ayant une charge virale indétectable au-delà d’un mois de traitement, un contrôle

immunologique doit en principe être réalisé tous les 3 à 4 mois si les CD4 sont inférieurs à

500 cellules/mm3 et tous les 4 à 6 mois si les CD4 sont supérieurs à 500 cellules/mm3 (Yeni,

2008). Fener déclare aussi qu’un taux de CD4 plus bas à l’initiation du traitement associé à

une charge virale plasmatique supérieure à 100 000 copies/ml et un antécédent d’événement

classant sida, sont associés à une moins bonne évolution clinique sous traitement (Fener,

2011). Routy affirme quant à lui que beaucoup des patients ont réussi l’augmentation de leurs

CD4 jusqu’à 350 à 500 celles/mm3 et que ceci reste un objectif thérapeutique additionnel ;

ceci est la conséquence d’une meilleure reconstitution du système immunitaire si le traitement

est entrepris avant la chute des CD4 à moins de 350 cellules/mm3 (Routy, 2009).

Comparaison des techniques de mesure de la charge virale

Evaluer les différentes techniques de mesure de la charge virale pour les sous-types

non-B est l’un des objectifs spécifiques de cette étude. S’agissant de la mesure entre Cobas et

Abbott RealTime, deux échantillons non détectés à l’aide d’Abbott sont détectés avec le test

Cobas V2.0 avec respectivement 2,23 et 2,68 Log10. Cette variation pourrait être due à une

erreur de manipulation ou à un blip comme décrit dans la littérature pour la version V 2.0 du

Cobas (Ruelle et al., 2012; Wojewoda et al., 2013). Un blip est défini par une élévation

transitoire de l’ARN VIH plasmatique, en général entre 50 et 1 000 copies/ml, observée sur


106

un seul prélèvement, et ne justifie pas la prescription d’un test de Résistance (Wojewoda et

al., 2013).

Pour les méthodes de mesure de la charge virale, le choix d’une méthode dépend tout

d’abord de la diversité des sous-types incriminés qui circulent dans le pays, de la capacité du

laboratoire et de l’expertise de son personnel. La technique de Roche (CAP/CTM) et celle

d’Abbott (Abbott RealTime) sont des techniques qui utilisent toutes deux un système fermé

d’extraction, d’amplification et de détection. Ce procédé limite les erreurs de manipulation.

Toutefois, elles sont trop chères pour les pays à ressources limitées mais nécessitent aussi un

système d’approvisionnent régulier en réactifs et consommables. Un entretien régulier des

machines et des mises à jour des logiciels sont aussi nécessaires. Abbott RealTime a une

variabilité de détection de sous-type plus large que le Cobas car elle détecte le groupe N en

plus du groupe M (A à H) et O ; tandis que le Cobas lui ne détecte que le groupe M (A à G) et

groupe O.

Diverses évaluations de concordance pour CAP/CTM V2.0 et le Cobas Monitor V1.5

ont été faites par Rouet et al. (François Rouet et al., 2007) dans divers pays avec un

coefficient de corrélation moyen de 0,79. Les différents valeurs de ce coefficient par pays

sont : France (0,8701; n = 88), Maroc (0,8624; n = 50), Zimbabwe (0,8703; n = 52),

Cambodge et Thaïlande (0,8446 ; n = 34), République Centrafricaine (0,8924, n = 25) et

Madagascar (0,6814; n = 22).

Comparant le CAP/CTM V2.0 et le CAP/CTM V1.0, Pas et al. (Pas et al., 2010) ont

démontré que la V2.0 du CAP/CTM a une plus forte sensibilité que la V1.0. La version 2.0

détecte aussi le sous-type O qui n’est pas détecté par la version1.0 (Gueudin et al., 2007).

Dans notre étude, en comparant la technique de l’ANRS avec le CAP/CTM V2.0, nous avons

trouvé un coefficient de corrélation de Pearson de 0,72603 avec la version 2.0 de Cobas

malgré que le plasma ait subit le phénomène de congélation et dégélation pour la mesure avec

la technique de l’ANRS.

En ce qui concerne la méthode de l’ANRS, le kit pour la mesure de la charge virale est

commercialisé par Biocentric. Cette technique permet la détection de la plupart des sous-types

du VIH-1 du groupe M et constitue désormais une alternative intéressante. Des résultats

satisfaisants ont été obtenus avec des échantillons de plasma collectés chez des individus

infectés par les sous-types non-B à Kinshasa (Annexe 1). L’application de cette technique

nécessite cependant du personnel entraîné et une supervision importante au début de la mise


107

en place. La technique en elle-même est moins chère, facile à réaliser, mais la maintenance

des appareils n’est souvent pas assurée (absence de réseau commercial). En l’absence d’un

laboratoire de biologie moléculaire et d’un réseau commercial dans un pays comme le nôtre,

la technique de l’ANRS n’est recommandée que si toutes les conditions sont réunies.

Notre étude a révélé un taux de suppression virale (CV < 1000 copies/ml) de 56,9 %

(66/116) chez les individus qui sont sous traitement pendant au moins 8 mois. Ce taux est plus

élevé que celui retrouvé chez la même population, dans le même hôpital en 2009 après 6 mois

de traitement qui est de 47% (n = 88) (Koyalta et al., 2009). Cette augmentation de ce taux

serait du bien entendu à l’amélioration du système de santé au Tchad entre 2009 et 2012,

permettant ainsi une couverture plus élargie en ARV. Il est important de souligner ici que

toutes les techniques utilisées se reposent sur l’hybridation d’une amorce avec une séquence

cible pour l’amplification et sur l’hybridation d’une sonde avec l’amplicon pour la détection.

Par ailleurs, du fait de la variabilité génétique qui constitue un défi majeur pour la conception

des amorces et de sondes, la performance d’une technique reste basée sur le choix des cibles

d’amplification hautement conservées parmi l’ensemble des variants viraux, groupes, sous-

types et CRF (F Rouet & Rouzioux, 2007b).

Diversité génétique et prévalence des mutations de résistance du VIH

L’un des problèmes majeurs de la trithérapie antirétrovirale est l’émergence de la

résistance aux antirétroviraux favorisant ainsi l’apparition des souches résistantes (Roquebert

et al., 2009). D’une manière générale, la distribution des mutations de résistance est variable

d’un individu à un autre et d’une région à une autre qu’il s’agisse d’un patient naïf ou sous

traitement et dépend aussi de type de virus en cause. Le taux d’échec aux médicaments de

première ligne trouvé dans notre étude est de 43,10 % (50/116). Il faut noter cependant que

l’échec thérapeutique n’est pas seulement dû à une apparition d’une mutation de résistance au

niveau du virus, mais peut être expliqué aussi par une faible observance ou une interruption

prolongée du traitement (OMS, 2012).

Les souches isolées chez des patients traités sélectionnés dans notre étude

appartiennent tous au groupe M et comprennent les sous-types A, D, F, G et J ainsi qu’une

forme recombinante, CRF02-AG. Par ordre d’importance, il apparaît d’abord le CRF02_AG

suivi du sous-type J qui arrive à égalité chez 13 patients chacun (soit 30,23 %). Vient ensuite

le sous-type G avec 16,28 %, A et D avec chacun 9,30 % ; le moins représenté est le sous-

type F qui est retrouvé chez deux patients avec 4,65 %. Ces sous-types sont décrits comme


108

étant fréquemment rencontrés en Afrique Centrale, de l’Est et de l’Ouest (Roquebert et al.,

2009; Vergne et al., 2000; Vidal et al., 2003). Il est intéressant de signaler que le sous-type D

qui circule au Tchad, forme de façon intéressante une lignée phylogénétique qui

s’individualise au sein des autres variants D caractérisés en Afrique de l’Est ou ailleurs en

Afrique Centrale (Vidal et al., 2003).

Nos résultats corroborent avec ceux de Vidal et al. qui ont trouvé en 2003 dans ce

même hôpital de la capitale, les sous-types A (20.5 %), D (18.7 %), F1(0.9 %) et G (3.7 %);

nous avons retrouvé une forte représentation du sous-type J avec 30,23% qui n’était pas

présent en 2003 et la forme recombinante CRF02-AG avec 30,23 % contre 13.1 % pour ces

auteurs (Vidal et al., 2003). La littérature décrit que les sous-types F, H, J et K sont incriminés

dans un nombre restreint d’infections dans le monde (0,94 %) avec prédominance du sous-

type F1 (0,45 %) (Javaugue, 2014). Deux variants du sous-type F sont décrits, le F1 et le F2;

le F1 est d’origine africaine et est localisé en Afrique Centrale (Bandea et al., 1995). Le F2,

lui est endémique au Cameroun, pays frontalier avec le Tchad (Burda et al., 2004; Triques et

al., 2000). Le sous-type J est lui aussi décrit comme rare et retrouvé en Afrique Centrale chez

1,8 % des PVVIH (Javaugue, 2014). Dans une étude réalisée en Angola, Bartolo et al. ont

rapporté un taux d’infection associé au sous-type H de 5,7 % et 3,1 % des 159 isolats analysés

ont été rattachés au sous-type J (Bártolo et al., 2011).

Aghokeng et al. (2009) ont trouvé aussi une forte prédominance des CRF02_AG

jusqu’à 62 % sur des échantillons de patientes enceintes collectés dans 4 pays (Congo, Tchad,

Cameroun et République Centrafricaine). Le CRF02_AG domine aussi chez les patients naïfs

car A Derache et al. ont découvert également une prédominance nette des CRF02_AG dans

75 % des cas chez des patients au Mali (n = 98) (Derache et al., 2007). Guillaume et al.

(2012) ont affirmé que les sous-types circulant à Abidjan étaient largement représentés par la

forme recombinante CRF02_AG avec 76,9 % suivi du sous-type A avec 7,7 % pour n = 39.

En Mauritanie, Malick et al. (2014) ont signifié aussi la prédominance nette des CRF02_AG

avec 64,6 % pour n = 65 chez des patients adultes sous traitements comme les nôtres.

Contrairement à notre étude, Kamangu et al. (2013) ont affirmé qu’en République

Démocratique du Congo les sous-types circulants sont majoritairement ceux du groupe M et

notamment A, G, C et D avec prédominance du sous-type A avec une prévalence de 50.40 %

[31.2-68.9] mais le CRF02_AG est très peu rencontré. Les résultats trouvés dans notre étude

concordent avec celle de la littérature qui décrivent les CRF02_AG comme étant

majoritairement circulant en Afrique de l’Est (Cote d’Ivoire, Niger, Nigeria et Sénégal), ainsi


109

qu’en Afrique Centrale et notamment au Tchad (Adjé et al., 2001; Aghokeng, Mpoudi-Ngole,

et al., 2009; Laurent et al., 2002; Manus, 2013; Montavon et al., 2000). L’assertion selon

laquelle la diversité des séquences A et G constitue le CRF02_AG semble vérifiée car cette

diversité aussi grande que les sous-types parentaux « purs » (Carr et al., 1998) , suggérant que

le CRF02_AG pourrait être aussi ancien que ses sous-types d’origine. Abecasis et al. ont

proposé l’idée selon laquelle, le CRF02_AG pourrait être une forme parentale du sous-type G

qui serait lui-même un virus recombinant (Abecasis, Vandamme, & Lemey, 2009).

S’agissant de la résistance aux médicaments antirétroviraux, selon le groupe de

résistance de l’ANRS AC11, la prévalence globale de VIH résistants à au moins un

antirétroviral en 2006, estimée sur 385 patients, était de 10 %. Koyalta et al.(2009) ont

affirmé que le taux d’échec aux médicaments de 1ère ligne à l’Hôpital Général de Référence

Nationale en 2009 était de 64 %. Dans cette même année, Aghokeng et al. (2009) publient

une étude dans laquelle le taux d’amplification était le même que celui trouvé dans notre

étude 88 % (37/42) versus 88 % (44/50). Le taux d’échec à la Triomune dans ce même hôpital

avant l’abandon de la Triomune début 2012 était de 43.75 % (21/48) (Adawaye et al., 2014)

tandis que celui lié au traitement chez tous les patients est de 43,10 % (50/116).

Quant aux mutations de résistance aux médicaments, Adjé et al. (2001) ont recherché

les mutations des souches chez 68 sujets en Côte d’Ivoire et ont identifié des mutations

majeures conférant une résistance aux inhibiteurs de la réverse transcriptase ou aux

antiprotéases dans une majorité des souches (57,4 %). La répartition était la suivante : 42,6 %

des souches portaient des mutations associées à la résistance à l’AZT et 14,7 % au 3TC,

moins de 2 % des souches présentaient une résistance aux INNTI ou aux IP. Pour les INNTI,

notre étude révèle une résistance élevée à plus de 50 % pour la NVP et l’EFZ avec

respectivement 74 % et 55,8 %. Les tests phénotypiques pratiqués montraient que 39 % des

souches étaient résistantes à au moins un INTI, tandis que dans notre étude ce taux est de 31,9

%. Au niveau de la Protéase, ces mêmes auteurs ont mis en évidence d’autres mutations

(K20R, L10V et L10I) à des fréquences plus faibles et concluent que chez les malades

africains traités, les mêmes mutations ont été identifiées avec des fréquences analogues. En

Afrique du Sud, une étude menée sur 200 souches de VIH-1 a montré que 97,5 % des virus

présentaient une sensibilité diminuée d’un facteur 5 à 10 aux trois molécules de la classe des

INNTI (Harrigan et al., 2001). En Ouganda, l’étude de 11 souches (A = 6, C = 1 et D = 4), n’a

pas mis en évidence de mutation de résistance dans le gène de la Reverse Transcriptase

(Harrigan et al., 2001).


110

Pour les INTI, les mutations sont sélectionnées séquentiellement par les Analogues de

la Thymidine (TAMs), d4T et AZT et comprennent: M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F

et K219Q/E (Yeni, 2008). La plus fréquente de ce groupe de 6 mutations TAMs est la

T215Y/F alors que K70R et K219Q/E ont moins d’impact que les quatre autres dans cette

résistance croisée. Ces TAMs sont associées à la résistance à la d4T et AZT et peuvent

entraîner un niveau de résistance variable aux autres INTIs dont l’ABC, ddI, TDF, et ddC. Ils

peuvent favoriser l’apparition d’autres mutations telles que la 44D/A et 118I. Mais l’impact

de la résistance dépend du profil et du nombre de TAMs observés (Vincent Calvez et al.,

2002; Johnson et al., 2010; Kellam et al., 1992; Kuritzkes et al., 2004; Larder & Kemp, 1989;

Whitcomb et al., 2003).

La mutation T215F/Y/I/S est largement retrouvée dans notre étude avec 30,23 %

tandis que T215Y/F est celle qui est plus responsable de la transmission des mutations de

résistance pour les INTI (D. Bennett et al., 2005). Les mutations M41L, L210W et T215Y

sont souvent associées à des résistances croisées d’une part et d’autre part ce sont les D67N,

K70R, T215F et K219Q/E qui sont rencontrées ensemble dans certains cas de résistance aux

INTI (Cozzi-Lepri et al., 2005; De Luca et al., 2006). Toutefois, les mutations K70R et

L210W sont rarement rencontrés ensembles (Yahi et al., 2000).

La mutation M184V est celle qui est la plus rencontrée pour les INTI dans notre étude.

Cette mutation correspond au remplacement d’une méthionine par une valine en position 184

et entraîne une résistance de haut niveau à la 3TC. Elle est aussi décrite dans la littérature

comme la plus fréquente (Shafer & Schapiro, 2008). En présence des TAMs, la M184V

augmente in vitro, la résistance à la 3TC et FTC, une faible résistance à la ddl et ABC et une

susceptible résistance à la AZT, d4T et TDF (Whitcomb et al., 2003). La M184V passe

souvent par une mutation transitoire (la M184I) après échec sous 3TC (Boucher et al., 1993).

Doualla et al. (2010) affirment que la M184V augmente la résistance in vivo à l’ABC et n’a

pas d’impact sur le TDF et la ddl. Cependant, d’autres études ont démontré que la M184V en

association avec la K65R et la L74V donne une forte résistance à l’ABC et la ddl (Rhee et al.,

2004) mais en elle-même n’a pas d’effet sur l’ABC et la ddl (Brun-Vézinet et al., 2003;

Lanier et al., 2004; A.-G. Marcelin et al., 2005; Molina et al., 2005; Winters et al. 2003).

D’une manière générale, la présence d’au moins 3 TAMs plus la M184V confèrent une

résistance élevée à l’ABC et à la ddl (Lanier et al., 2004; A.-G. Marcelin et al., 2005; S. Rhee

et al., 2004; Whitcomb et al., 2003).


111

S’agissant de la résistance aux INNTI et du fait de la faible barrière génétique pour ce

groupe de médicaments (NVP et EFZ), une ou deux mutations suffisent pour leur conférer

une résistance de haut niveau (Hirsch et al., 2008; Richman et al., 1994; Shafer & Schapiro,

2008; Torti, Pozniak, Nelson, Hertogs, & Gazzard, 2001). Les mutations associées aux INNTI

peuvent être classées en deux catégories: la première catégorie est celle des mutations de

résistance primaire qui peuvent causer une résistance de haut niveau et qui sont les premiers à

se développer au cours d’une thérapie aux INNTI. Chacune de ces mutations primaires

(K103N/S, V106A/M, Y181C/I/V et G190A/S/E) confère une résistance de haut niveau à la

NVP et à l’EFZ (Bacheler et al., 2001; S.-Y. Rhee et al., 2006; Vingerhoets et al., 2005). La

seconde catégorie concerne les mutations de résistance secondaire qui causent de résistance

qu’en association avec les premiers mais ont aussi des conséquences cliniques quant au choix

d’une molécule et notamment l’Etravirine (Shafer & Schapiro, 2008).

De façon générale, les mutations « accessoires » aux INTI comme la E44D et V118I

(Mihailidis et al., 2008) et les mutations mineures de résistance aux INNTI comme la A98G,

la V179D et la V106I sont présentes chez 1 à 2% des sujets naïfs (Shafer et al., 2007; Shafer,

Rhee, & Bennett, 2008). Toutes ces mutations n’ont pas de rôle direct dans la résistance mais

peuvent faciliter l’émergence de résistances et influencer les voies des mutations du virus à ce

groupe de médicaments. Elles renforcent par ailleurs le niveau de résistance de mutations

majeures sur le gène de la Reverse Transcriptase (Pillay et al., 2002; Spira et al., 2003;

Wainberg, 2004).

Malick et al. (2014) ont retrouvé en Mauritanie, des résultats semblables aux nôtres

avec aussi une prédominance de la M184V/I (n = 32 ; 49,2 %) suivi de la K103N (n= 28 ; 43

%) et la Y181C (n = 13 ; 20 %). Contrairement à notre étude, ces auteurs ont trouvé des

analogues à la Thymidine (TAMs) chez 26 % (n = 17) et qui sont fortement représentées par

la T215Y (n = 11, 16.9 %). Dans notre étude, pour n = 43, les TAMs sont représentées par la

T215Y/F à 30,23 % suivie de la K70P/R/W à 9,30 % et de la K219E/N/Q à 9,30 %.

Sous NVP, la mutation Y181C apparaît le plus souvent, mais elle ne confère pas une

résistance croisée de haut niveau avec l'EFZ. Tandis que la mutation K103N n’est pas très

fréquente sous NVP mais confère une résistance de haut niveau à l’EFZ si elle est présente.

En association avec L100I et la K101P, la K103N engendre une susceptibilité de résistance à

la NVP et l’EFZ (S.-Y. Rhee et al., 2006). Des études ont révélé que lors d’un traitement à la

NVP, l'utilisation concomitante de la AZT favorisa l’émergence de la K103N en

désélectionnant la Y181C (Hanna et al., 2000).


112

La prévalence des mutations de résistance acquise dans notre étude est de 31,9 %

(37/116). Ce taux s’avère être important dans un pays comme le Tchad où tous les ARV et les

examens complémentaires sont gratuits. Selon le rapport des experts de 2013, la prévalence

de la résistance du VIH aux ARV en France est de 6,4 % chez les patients infectés par des

virus de sous-types non-B (CNS & ANRS, 2013).

Le Dried Blood Spot (DBS) pour le monitoring biologique de la résistance du VIH aux

ARV

Dans les pays à ressources limitées, l'échec au traitement passe généralement inaperçu

jusqu'à l’apparition des symptômes graves, et souvent les mutations de résistance

s’accumulent et les options de médicaments de seconde ligne sont limitées. Avec les

techniques standard, les prélèvements doivent être très rapidement pris en charge, ou

congelés, limitant encore d’avantage l’accessibilité aux analyses et notamment à la PCR. La

technique du papier buvard comme nous l’avons décrite dans l’article permet de réaliser

facilement un prélèvement et l’acheminer à un laboratoire de référence sous forme d’un

courrier évitant ainsi le déplacement d’équipes spécialisées pour le prélèvement.

Mise à part l’utilisation du buvard dans le diagnostic précoce chez l’enfant comme le

recommande l’OMS (GIP Esther., 2008) et pour la surveillance de la résistance au traitement

(Bennett et al., 2008), le DBS est utilisé pour le dépistage des troubles métaboliques chez les

nouveaux nés (McCabe et al., 1987), pour la détection des anticorps VIH-1 (Hoff et al., 1988)

et aussi pour le diagnostic infantile du VIH-1 par PCR ADN (Stevens et al., 2008), le DBS

peut cependant très bien servir pour l’évaluation du traitement antirétroviral pour les sous-

types non-B. Les données indiquent que la détermination de la charge virale et l’évaluation de

la résistance génotypique du VIH-1 par le DBS et le DPS est possible. Toutefois, l’efficacité

du buvard dépend du type et de la qualité du buvard utilisé car certains papiers s’avèrent

moins adaptés pour la réalisation de tests de biologie moléculaire. Beaucoup des études à

l’instar de la nôtre ont utilisé le papier filtre Whatman 903 (Whatman, Maidstone, UK) pour

la charge virale et les tests de résistance.

L’efficacité de la technique dépend aussi de la charge virale en question et des

techniques d’extraction utilisée. Pour la quantification de la charge virale, la technique du

buvard donne des très bons résultats en utilisant le DBS comparativement au plasma. Des

études ont montré, que l’extraction de l’ARN virale avec le kit NucliSENS EasyQ HIV-1

(BioMerieux), donne une sensibilité de 91 % et une spécificité de 97 % pour la détection des


113

principaux échecs virologiques et la détection d’une charge virale plasmatique supérieure ou

égale à 5 000 copies/ml. Nous avons démontré dans notre étude que l’extraction de l’ARN est

aussi possible avec le kit QiAmp mini kit Qiagen. Le DBS a également été évalué pour les

sous-types non-B et a montré des résultats satisfaisants. Notre étude a révélé un taux

d’amplification de 80 % (24/30); cela témoigne que la technique utilisée pour le l’extraction

de l’ARN et celle utilisée pour l’amplification (ANRS) sont sensibles pour les sous-types

non-B sur DBS. Plusieurs études ont trouvé des résultats comparables même après stockage à

long terme (Hamers et al., 2009).Cependant, nous pouvons affirmer sans risque de nous

tromper que le Kit Qiagen pourrait bien être utilisé pour l’extraction de l’ARN viral en vue

des tests de résistances sur DBS.

Pour la détection des mutations de résistance, des succès d’amplification ont été

obtenu en utilisant le Kit commercialisé ViroSeq (Abbott Molecular, USA) ou TRUGENE

pour le génotypage du VIH-1 (Siemens USA) qui donnent des taux d’amplification de 80 à 90

%. L’expérience faite en Tanzanie dans la zone rurale avec l'utilisation de DBS appui ces

conclusions ; 90 % des échantillons prélevés sur DBS provenant de patients en échec

virologique ont été amplifiés avec succès et il y a eu une bonne concordance avec les

mutations trouvées dans le plasma et le DBS (Johannessen et al., 2011) même lorsqu’il s’agit

des mutations mineures (Xierong Wei et al., 2011).

Il faut noter cependant que l’utilisation du DBS a beaucoup des avantages mais a aussi

des limites. Le sang recueilli sur DBS doit être quantitativement suffisant pour que l’ARN

viral puisse être détecté (utiliser 5 spots de 75 µl si possible). Pour un échantillon de 50 µl

obtenu sur DBS, on peut avoir environ un Log de 3,5 copies/ml. Pour les tests de résistance

avec la technique de l’ANRS, la sensibilité du DBS dans notre étude est de 3,33 Log10

copies/ml (2150 copies/ml). La limite de détection du DBS décrite dans la littérature par

certains auteurs semble se situer autour de 3 log10 copies/ml, soit 1000 copies (Hamers et al.,

2009; Mbida et al., 2009; Pirillo et al., 2011; Viljoen et al., 2010). Chaque papier buvard doit

être bien sec et protégé (pochette plastique ou film cellophane) afin d’éviter tout contact entre

les échantillons lors du transport. Un système d'acheminement au laboratoire doit être en

place. La simplification au niveau du terrain (prélèvement) demande cependant une

adaptation du laboratoire qui doit faire face à quelques manipulations supplémentaires.

L’inconvénient de la technique du recueil du sang sur papier buvard est souvent lié

aux faibles quantités de sang collecté sur DBS (utilisation de moins de 3 spots sur les 5); ce


114

qui a pour conséquence une sensibilité réduite lors de la détection de l’ARN viral si la charge

virale est faible (1000-4000) (Johannessen et al., 2009; Youngpairoj et al., 2008).

Enfin, lorsqu’il s’agit du sang total déposé sur buvard (DBS) au lieu du plasma (DPS),

l’ADN proviral archivé dans les différentes cellules associées peut interférer au produit final

d’extraction et donnera des résultats faussement positifs de la charge virale. Les virus archivés

dans les lymphocytes peuvent être différents de ceux présents dans le plasma (CNS & ANRS,

2013). C’est pour cette raison qu’en utilisant le sang total pour le DBS, nous avons remarqué

la présence du sous-type K sur DBS alors qu’il n’a pas été trouvé dans le plasma. Le sous-

type K est décrit dans la littérature comme minoritaire et retrouvé en Afrique Centrale

(Hemelaar et al., 2011). Il était initialement apparenté au sous-type F pour former un sous-

type F3 (Javaugue, 2014). En 2000, sur des études réalisées au Cameroun et en République

Démocratique du Congo, des chercheurs ont permis de rattacher les souches caractérisées

dans ces deux pays à un nouveau sous-type appelé K (Auwera et al., 200; Triques et al.,

2000). Hemelaar et al. notifient que le sous-type K « pur » est impliqué dans moins de 10 000

infections dans le monde avec localisation majeure en Afrique Centrale (Hemelaar et al.,

2011).

En somme, nous disons qu’une stratégie de surveillance basée sur l’utilisation du DBS

est pour nous la meilleure alternative pour répondre aux besoins croissants des cliniciens pour

la mesure de la charge virale et la surveillance de résistance génotypique de résistance du VIH

dans les pays à ressources limitées. Une nouvelle technologie basée sur le DBS nommée

HemaspotTM est en cours d’évaluation par Spotonsciences et qui serait moins invasive et plus

économique que la technologie actuelle (Http://www.spotonsciences.com/contact/).

Détection des mutations ponctuelles de résistance

En utilisant la méthode de séquençage de l’ANRS, nous avons mis en évidence des

mutations de résistance acquises chez 44 des 116 patients sous traitement. Une autre

technique de détection des mutations ponctuelles qu’est l’ASPCR est utilisée pour 44

échantillons du plasma et 24 échantillons de DBS. Les mutations recherchées sont la K103N

(AAC), la Y181C (TGT), la M184V (GTG), la T215Y/F (TAC ou TTC) et la K70R (AGA)

pour le plasma. Pour le DBS, nous avons recherché la M184V et la K103N. Les résultats

obtenus avec le séquençage sont quasi semblables à ceux obtenus par ASPCR avec une

sensibilité de 100 % pour les sous-type A, D, J et CRF02_AG. Il pourrait bien s’agir d’un

polymorphisme spécifique pour ces différents sous-types. Javaugue définit le polymorphisme


115

génétique comme étant l’existence des variations dans une séquence d’acides nucléiques par

rapport à un consensus de référence. Un virus de sous-type B appelé HXB2 dans le cas du

VIH-1(Javaugue, 2014). C’est un polymorphisme naturel présent en l’absence de toute

pression de sélection antivirale. Toutefois, un résultat faux positif est observé pour un

échantillon (plasma) pour la K103N ; ceci pourrait être lié aux sous-types étudiés ou à la

nature du contrôle utilisé (virus sauvage).

L’ASPCR est une technique très sensible et reproductible car les coefficients de

variations retrouvées en inter et intra-essais sont toutes inferieures à 0,50. Quand les tests

génotypiques standard détectent une mutation de résistance que quand elle est présente à plus

de 20 %, cette technique (ASPCR) permet la détection de plusieurs mutations de résistance

dans un même échantillon. Elle permet aussi de détection une seule mutation contenue dans

un mélange même à faible proportion (0,01 %).

Il est important de signaler ici quelques difficultés auxquelles nous nous sommes

confrontés durant cette étude. Tout d’abord, la collecte des données n’a pas du tout été facile

du fait que les patients ne viennent voir les médecins que quand ils ne vont pas bien. Les

rendez-vous pour le contrôle immunovirologique ne sont pas du tout respectés par les

patients. La plus part des patients viennent seulement pour le renouvellement de leur

ordonnance au niveau du major de l’hôpital sans pour autant aller voir leur médecin. En 10

mois, nous n’avons collecté que 116 échantillons alors que pour un hôpital comme le HGRN,

on aurait pu avoir plus des échantillons.

Il faut noter aussi que pour bon nombre des malades au Tchad, la maladie reste encore

un tabou car certains patients refusent volontairement de faire partie de l’étude. Ceci est aussi

favorisé par les pratiques religieuses très fréquentes au Tchad. L’autre problème est celui des

perdus de vue, certains patients une fois prélevés, sont difficilement joignables pour le

prochain rendez-vous. Nous rappelons aussi que cette étude est la première du genre qui a

permis de tester le protocole de la charge virale HIV-1 sous Abbott RealTime pour les sous-

types non-B au Laboratoire de Référence Sida du CHU de Liège.

Cette étude, par sa nature expérimentale et technique, ne fournit pas assez des

informations sur les données sociodémographiques des patients et aussi sur la transmission de

la résistance de la mère à l’enfant au niveau de la PTME. Cela s’explique par le fait que les

femmes enceintes sont suivies dans un autre centre que le site choisi pour notre étude. Elle

aurait dû être plus intéressante si la taille de notre échantillon était plus grande avec des


116

informations suffisantes sur les sujets. Cela permettra une analyse statistique approfondie afin

de mesurer les relations entre les différentes variables. Tous ces manquements seront pris en

compte dans des études ultérieures que nous comptons menées; cela constitue d’ailleurs l’un

de nos perspectives d’avenir.

Conclusion générale

117


Au terme de cette étude d’évaluation, nous pouvons affirmer que les objectifs que

nous nous sommes fixés sont atteints. Nous espérons avoir contribué à une meilleure

connaissance de la problématique de la résistance du VIH aux ARV au Tchad. Cette

connaissance facilite aux cliniciens de prendre une meilleure décision permettant ainsi une

prise en charge efficace des PVVIH. Cette étude nous a permis aussi d’apprendre et de

maitriser différentes techniques de biologie moléculaire qui peuvent être utilisées à court ou

moyen terme au Tchad.

Nous retenons donc à la fin de l’étude que la collecte du sang (DBS) ou du plasma

(DPS) sur papier buvard en vue des analyses génotypiques pourrait bien être mise en place

dans nos laboratoires tant au niveau central que périphérique. Il pourrait aussi être utilisé tant

pour le diagnostic sérologique de l’infection à VIH que pour la détection des mutations de

résistance. Cela permettra de limiter les exigences liées à l’échantillon et notamment la

conservation. Pour les centres de prise en charge des provinces, le papier buvard pourrait être

envoyé au laboratoire central sous forme de courrier simple sans une conservation

particulière.

Pour suivre l’évolution de la maladie et l’efficacité du traitement au cours de

l'infection à VIH, les deux meilleurs marqueurs d'évolutivité de la maladie sont la charge

virale plasmatique et le taux de lymphocytes CD4. Si la charge virale est élevée et que le taux

des lymphocytes TCD4 est faible, cela témoigne l’évolution rapide vers la maladie Sida et

ramène à poser des questions sur l’efficacité du traitement administré. En effet, nous avons

remarqué dans cette étude que la moyenne et la médiane des CD4 n’ont pratiquement pas

évolué après huit mois de traitement. Il serait donc primordial de faire une évaluation

immunovirologique au début de l'infection, lorsque l'immunité est encore peu diminuée, car

c'est à ce stade qu'il reste du temps pour décider d'un traitement qui permettra de freiner la

progression vers le stade Sida. Le choix d’une technique de mesure de la charge virale doit

être fait en fonction du problème réel et de la caractéristique de la population cible.

Cependant, le choix dépend aussi de la diversité des sous-types incriminés qui circulent dans

le pays, de la capacité du laboratoire et de l’expertise de son personnel. Dans le cas où le

laboratoire est équipé en matériel de biologie moléculaire et le personnel est bien formé, le

rapport coût/efficacité doit être le critère primordial de choix d’une technique.


118

Il est important de noter que la technique de l’ANRS pour la détection des mutations

de résistance est bien sensible pour les sous-types non-B tant sur DBS que sur le plasma. Les

sous-types du VIH-1 qui circulent au Tchad selon la littérature sont A, D, F, G et 3 formes

recombinantes (CRF01-AE, CRF02-AG et CRF11-cpx) (Vidal et al., 2003). La prévalence

de la résistance acquise au traitement de première ligne observée est de 31,9 % (37/116). Un

autre sous-type est trouvé dans notre étude, il s’agit du sous-type J avec 30,23 %. Ce nouveau

sous-type est apparenté avec le sous-type F précédemment circulant au Tchad (voir arbre

phylogénétique). Cela prouve que des nouveaux sous-types circulent encore au pays et ceci

serait certainement favorisé par l’émergence de la résistance. Un sous-type K est retrouvé sur

DBS (3/24 ; 12,5 %) alors qu’il est absent sur le plasma. Le CRF01_AE et CRF11-cpx ne

sont pas trouvés dans notre étude. Le sous-type C décrit comme étant responsable de la plus

part des infections en Afrique n’est pas aussi rencontré dans notre étude. Malgré le fait que

cette technique de l’ANRS est facile à réaliser avec des appareils ouverts et adaptables aux

pays à ressources limitées, elle est aussi moins onéreuse. Pour toutes ces raisons, nous la

recommandons pour les pays du Sud et plus précisément pour le Tchad. La recommandation

que nous aimerions faire aux cliniciens, c’est de plaider auprès des autorités compétentes pour

la mise en place au Tchad des tests de résistance afin de mieux juger l’efficacité du traitement.

Ils pourront ensuite prescrire un test génotypique de résistance en cas d’échec virologique.

Les techniques standard de détection de mutations de résistance pour le monitoring

biologique des personnes vivant avec le VIH sont très chères et nécessitent des laboratoires

bien équipés et un personnel aguerri en technique de biologie moléculaire. Cependant, la

technique de détection des mutations ponctuelle (ASPCR) semble être la mieux indiquée pour

les PRL car elle se révèle être moins chers en terme des réactifs et très spécifique tant pour les

sous-types A, D, C, J et les CRF02_AG. Elle a pour avantage de détecter plusieurs mutations

de résistance dans un même échantillon et aussi une seule mutation parmi tant d’autres même

lorsqu’elles sont présentes en des faibles proportions.

Il est déjà temps de mettre en place un véritable système efficace de surveillance

épidémiologique des résistances au Tchad. Ceci passe nécessairement par la création d’un

Centre de Référence Sida pour une meilleure prise en charge des personnes vivant avec le

VIH. Le système de surveillance qui existe au Tchad actuellement, n’existe que de nom et est

limité seulement au dépistage systématique des femmes enceintes au niveau des PTME.

Tenant compte de la diversité génétique du virus, et en particulier la prolifération des

formes recombinantes complexes qui rendent difficile le choix et/ou la mise au point d’une


119

technique « universelle » permettant l’amplification de toutes les variantes quel que soit leur

niveau de complexité, il serait donc préférable de suivre un patient avec le même test et de ne

le changer qu’en cas de discordance immunologique, virologique et/ou clinique. Cependant, il

faut garder à l’esprit que la persistance d’une réplication virale sous traitement favorise la

sélection des mutations de résistance et ceci quel que soit le facteur incriminé dans l’échec

virologique; la conséquence qui en découle est la diminution des chances d’efficacité du

traitement qui pourra avoir un impact négatif sur la survie du malade.

Dans un pays comme le Tchad où plus de la moitié de la population est illettrée, un

pays où les personnes vivant avec le VIH meurent à cause de la rupture de stock des

médicaments dans certaines localités, ou à cause d’un suivi immunovirologique moribond, ou

encore à cause de l’absence des tests génotypiques de résistance, nous osons croire enfin qu’à

travers cette étude, nous apporterons notre pierre à l’édifice en fournissant des données de

bases qui serviront à d’autres scientifiques et chercheurs à l’échelle nationale et internationale

de poursuivre la même bataille. Cette bataille «interminable» est celle d’une vie saine et

normale pour les personnes vivant avec le VIH d’une part et l’éradication de la maladie de

toute la surface de la terre d’autre part. En somme, le thème développé dans cette étude

apporte une connaissance approfondie de la résistance au traitement et facilite le choix des

méthodes alternatives quant à la prise en charge des PVVIH au Tchad.

Perspectives d’avenir

120

Perspectives d’avenir

Notre souci, est que dans un proche avenir, les techniques apprises et évaluées à Liège

pour le monitoring biologique, soient mises en place au Tchad ; ceci passe nécessairement par

la création d’un Centre de Référence Sida avec du personnel qualifié et du matériel adéquat.

Afin de pouvoir étudier la diversité génétique dans tous ses états, nous allons étendre

l’étude de la résistance chez des patients naïfs et femmes enceintes (résistances transmises) et

des patients sous traitement (résistances acquises) dans les différentes villes du pays avec un

échantillonnage beaucoup plus représentatif.

Pour la détection des mutations ponctuelles, nous entendons faire une étude plus

diversifiée permettant la détection des mutations ponctuelles par ASPCR en même temps la

quantification de la charge virale sur plasma et sur DBS. Pour cela, nous allons utiliser un

plasmide que nous allons cloner avec les différentes mutations, qui servira de contrôle.

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Annnexes

137

ANNEXES

Annnexes

138

Les annexes

Annexe 1 Implementation of an In-House Quantitative Real-Time PCR for Determination of

HIV Viral Load in Kinshasa

Kamangu Ntambwe Erick, Chatté Adawaye, Boreux Raphael, Kalala Lunganza Richard,

Mvumbi Lelo Georges, Demol Patrick, Vaira Dolores, Hayette Marie Pierre

Open Access Library Journal, 1: e855. http://dx.doi.org/10.4236/oalib.1100855

Annnexes

139

Annnexes

140

Annnexes

141

Annnexes

142

Annnexes

143

Annnexes

144

Annexe 2: Primers utilisés pour la technique ASPCR

Annnexes

145

Annexe 3: Fiche d’identification du sujet

N° fiche :_____________

1. Code ……………………………… …………………………………………….……..

2. Nom et Prénom:................................................................................................................

3. Age……............................................................................................................................

4. Sexe : a)Masculin b) Féminin

5. Structure sanitaire et localisation:……………….……………………………………..

6. Statut sérologique : a) VIH-1 b) VIH-2 /Date……………….

7. Dernier TCD4 :……………………….cellules par ml/ Date…………………………

8. Dernière charge virale :…………………………….cop par ml/Date………...………..

9. Patient de type : a) naïf / b) déjà reçu traitement

10. Si déjà sous traitement, énumérer :

a)Traitements reçus 1ère ligne (Date) : ………………………………………………….

b) Traitements reçus 2ème ligne (Date): …………………................................................

11. PTME ; a) Non / b) Oui

12. si PTME Oui, traitements administrés (Date/durée) :

a) 1ère ligne ……………………………………………………………………..……..

b) 2ème ligne …………………………………………………………………………...

13. Autres informations :

a) raison de changement thérapeutique :.………………………………………….…………….

b) indications sur l’observance ………………………………………………………..………..

c) autres : ………………………………………………………………………………….…….

Annnexes

146

Annexe 4: Fiche de consentement éclairé

Je soussigné(e), Mme, Mlle, Mr,…………………………….........................................

Adresse :………………………………………………………………………………...

atteste par la présente avoir reçu des explications claires et précises sur le but de cette

recherche dont le thème est « Nouvelles approches génotypiques pour le monitoring de

résistance du VIH aux ARV dans les pays à ressources limitées : cas du Tchad» ainsi que

sur son importance et sa bienfaisance.

Cependant, j’accepte de faire partie de l’étude en donnant mon sang sans conditions

préalables. Je peux par ailleurs, me retirer de l’étude à n’importe quel moment.

Le présent engagement est établi pour servir et valoir ce que de droit.

Le chercheur Le (la) participant(e)

Adawaye Chatté

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