Méthode d ’étude de la cellule normale et pathologique : Mise en culture des cellules et tissus

Master M1: cellule normale à cellule cancéreuse

Dr Mossuz P

27/01/06

I : les tissus

Ensemble de cellules de types et d ’origine embryonnaire différente

Associés en général à une matrice extra cellulaire (glycoprotéine, protéoglycane, fibronectine..)

Origine

prélèvements biopsiques, fragment de tissus

Contraintes

Les tissus pure sont rares; nombreux tissus accessoires (tissus conjonctifs, vaisseaux sanguins, tissu nerveux..)

2 types de cultures possibles

- culture direct du fragment= culture primaire

-fragmentation de la pièce biopsique = dissociation des tissus pour récupérer la fraction cellulaire d ’intérêt

1) mécanique

scalpel, broyeur , filtration , sonication

2) chimique

solution sans calcium, chelateurs de calcium, de Mg… (cations divalents)

3) enzymatique

digestion par la trypsine, la collagénase, hyaluronidase

Rmq :

* Très grande diversité des tissus = très grande diversité des protocoles

le plus souvent mélange de 2 ou 3 étapes

* Le mieux est l ’ennemi du bien : les cellules sont fragiles!!

Dissociation des tissus

Culture de kératinocytes

Prélèvement cutanée

Fragmentation au scalpel

Dissociation cellulaire (x4/5)

mécanique

trypsine

EDTA

Surnageant + cellules en suspension

Culture sur sous couche après numération

Application : recherche,

thérapeutique

II : les cellules

1) Les cellules circulantes / en suspension

Origine

le sang périphérique,

la moelle osseuse ,

les liquides physiologiques (liquides pleuraux,... )

le sang de cordon

Intérêts

source relativement pure (peu de types cellulaires mélangés)

facilité d ’accès

matériel riche

mise en culture directe

Purification cellulaire

Pour obtenir une culture pure (un seul type cellulaire) nécessité de séparer les différents types cellulaires

* Cellules en suspensions

Sang périphérique : cellules granuleuses, lymphocytes , monocytes

Moelle osseuse : progéniteurs érythroïdes, mégacaryocytaire, granuleux

Liquide biologique : cellules épithéliale, cellules différenciées , cellules tumorales

* Tissus

en culture primaire à partir de la suspension cellulaire obtenue par dissociation du tissus

formation d ’une couche adhérente contenant les différents type cellulaire présents dans le

tissus

1) méthode physique :

séparation basée sur les différences de densité des cellules

centrifugation différentielle en gradient de densité

ultracentrifugation

electrophorèse

cytométrie de flux

2) avantage prolifératif, métabolique

croissance en milieu sans facteur de croissance

milieu sans sérum

3) tri par adhérence

ex monocyte/macrophage

Méthode de purification

4) Tri immunologique

séparation à l ’aide de marqueurs protéiques (antigènes) de surface spécifique

d ’un type cellulaire

ex : glycoprotéine érythrocytaire

marqueurs tumoraux

marqueurs de lignée

marqueur épithélial : kératine

marqueur leucocytaire : CD45

cytométrie de flux

FACS sorter

billes immuno-

magnétiques

Tri sur boite

« imuno capping »

Tri par cytométrie de flux

Principe :

Séparation des cellules à l ’aide d’un cytomètre de flux

-analyse des cellules en suspension

-caractérisation par la taille (FSC) et le contenu (SSC)

-analyse de l ’expression d ’antigène de surface

Séparation des cellules en les isolant dans une goutte, par

fractionnement du flux d'eau physiologique qui les contient au travers d'une

buse(0.05mm).

Analyse des caractéristiques de chaque cellule sur différents critères

(taille, diffraction, la densité de granulation évaluée par absorbance, la

présence ou non d'antigènes sur la surface cellulaire).

Tri des cellules dans des gouttes plus ou moins chargées, selon que la

cellule corresponde aux critères fixés par l'opérateur. Leur trajectoire sera

plus ou moins déviée en passant entre 2 électrodes qui ménagent un

champs électrique.

Récupération de la fraction d ’intérêt

laserélectrodes

Cellules chargéesCellules non chargées

Suspension cellulaire

Tri par billes immuno-magnétiques

Purification de cellules souches hématopoïétiques CD34+/HLA DR-

CD34 = glycoprotéine membranaire spécifique des cellules souches hématopoïétiques, absentes des cellules du sang périphérique

HLA DR = antigène d ’histocompatibilité de classe II absent des CSH

Principe : tri en 2 étapes, purification des cellules CD34+ puis

déplétion des cellules DR+

Moelle humaine normale

Fraction CD34+/DR-

Ac AntiCD34

Fraction CD34+/ DR+

Ac Anti DR

1)

2)

2) Les Lignées cellulaires immortalisées

Rmq : les cellules normales en culture primaire ont un potentiel limité de prolifération in vitro, même en présence de facteur de croissance (50 à 60 temps de doublement maxi)

mortalité par senéscence, raccourcissement des télomères

le potentiel prolifératif est inversement proportionnel au degré de différenciation

Une lignée cellulaire immortalisée peut être définie par la capacité de plus de 150-200 tps de doublement, ou la possibilité de cultiver les cellules plus d ’un an, sans interruption

Principe : expression par transfection cellulaire d ’une protéine virale

Immortalisation de cellules normales (non cancéreuses) par infection virale

* Expression d ’un oncogène

- Expression stable d ’un oncogène virale responsable de la transformation des cellules

Ex C-Myc oncogène codant pour un facteur de transcription régulant la prolifération et la mort cellulaire / rôle ++ dans la lymphomagénèse

* Sur-expression d ’un récepteur de facteur de croissance

Ex : Rcp GM-CSF

* Sur-expression d ’une protéine kinase régulant la prolifération cellulaire

Ex : p210 protéine dérégulée dans la LMC

Immortalisation de cellules normales (non cancéreuses) par transfection

Sélection antibiotique

Principe : expression d ’un gène de résistance à un ATB (ex néomycine) permettant de sélectionner les cellules transfectées (obtention de lignée clonale stable)

A) Sans sélection

B )Avec sélection, population non transfectée

C-D) Avec sélection, population transfectée

Ex : lignées cellulaires dérivées de patients présentant une hémopathie/tumeurs solides...

Lignée Hela : carcinome cervical

Raji = lymphome de Burkitt

HL60 = LAM3

Lignée établie spontanément en culture par sélection de clone prolifératif

Possibilité de sélection par passage sur la souris

A partir de cellules tumorales

Un cas particulier : les cellules souches

*Les cellules souches embryonnaires de souris

obtenue à partie de blastocytes de souris

établissement de lignées cultivées en présence de facteur de croissance (LIF)

différenciation orientée par des facteurs de croissance

intérêt : étude des mécanismes moléculaires de la différenciation cellulaire (oncogénèse et ontogénèse)

souris KO

*Les cellules souches humaines

-les cellules souches dérivés d ’embryon au stade très précoce (ES)

*les cellules germinatives dérivées de fœtus avortés

cellules de la lignée germinales (ovule et spermatozoide) = embryonnic germ cells (EG)

*Les cellules souches adultes

III Méthodes de culture

1) Les milieux de cultureDoivent répondre aux exigences minimum des cellules animales

H2o

ions minéraux( nacl, Kcl, mgcl2….)

osmolarité = 9g/1000

source de carbone et d ’énergie (glucose)

source d ’azote (acides aminées)

facteurs de croissance : acides aminées éssentiels, vitamines, acide gras, cytokines

Gaz O2 et CO2

système tampon , Ph stable 7.4 (indicateur de pH)

RPMi, HBS DMEM, MEM…….+ sérum (SVF) + ATB

La température (37°c)

l ’hygrométrie (contrôle de l ’évaporation) 90% d ’humidité

le pH

CO2…

la densité cellulaire

le pourcentage de sérum

la dépendance en facteur de croissance (ex lignée IL3 dépendante)

2) Paramètres régulant la prolifération cellulaire

1 contrainte majeure : la stérilité microbienne

protection des cellules et des manipulateurs

Cinétique de la croissance cellulaire

1er phase = phase de latence

pas de division cellulaire

dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire

2eme phase = phase exponentielle

Phase de division cellulaire

temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h)

3eme phase = phase stationnaire

épuisement du milieu = arrêt de la prolifération

4ém phase = poursuite de la croissance cellulaire (repiquage)

ou mort cellulaire

Cinétique de la croissance cellulaireN

om

bre

de

cell

ule

s 10

.6/m

l

Temps (jours)

Pha

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Phase exponentielle Phase stationnaire

Mort cellulaire

Temps de doublement

Pendant la phase exponentielle les cellules sont distribuées de façon hétérogène dans les différentes parties du cycle cellulaire.

La culture cellulaire est donc un ensemble hétérogène de cellules

caractérisées par des propriétés métaboliques différentes

Il est possible de synchroniser les cellules

privation en facteur de croissance = mise en G0

séparation cellulaire par gradient de Ficoll

ultra centrifugation

méthode chimique

drogue bloquant la phase S (hydrea)

déplétion calcique

Croissance cellulaire

les cellules adhérentes : la confluence

Confluence = occupation de toute la surface de la boite de culture par les cellules

s ’accompagne en général d ’un arrêt de la prolifération par inhibition de contact

Cas particulier des cellules transformées (virus, oncogènes..)

perte de l ’inhibition de contact

culture non régulée

témoin de transformation

* en suspension (cellules non adhérentes)

* en couche mono cellulaire (cellules adhérentes)

* sur sous couche nutritive (feeder)

culture sur un support cellulaire (fibroblaste ++, cellule endothéliale , adipocytes )

Ex lignée stromale murine produisant de l ’IL3

* cultures en milieu semi solide / cultures clonogéniques

utilisation de collagène, méthyl cellulose, agar dans lesquels sont implantées les cellules

permet la formation de colonies clonale (dérivée d ’une seule cellule)

III Différents types de culture

Cultures clonogéniques de progéniteurs hématopoïétiques

Principe :

Identification rétrospective des progéniteurs différenciés par leur capacité à produire des colonies (CFU) dans un milieu

de culture semi-solide.

Les colonies résultent de la prolifération clonale d’un

progéniteur en présence de facteurs de croissances hématopoïétiques

Systèmes de culture permettant d’identifier et de quantifier les progéniteurs hématopoïétiques différenciés (différenciation myéloïdes)

Lignée érythroïdes BFU-ELignée érythroïdes BFU-E

Lignée granulo-macrophagique CFU-GMLignée granulo-macrophagique CFU-GM

Lignée mégacaryocytaire CFU-MKLignée mégacaryocytaire CFU-MK

Microscope-inversé MGGMGG APAAP-CD41APAAP-CD41

Une suspension cellulaire (même purifiée) est le plus souvent oligoclonale

plusieurs types cellulaires possibles

hétérogénéité d ’une population tumorale

intérêt du clonage

Principe : isoler par dilution limite des populations monoclonale

les cellules sont cultivées dans des petits volume en dilution au 1/10, 1/100, 1/1000; jusqu ’à obtenir une implantation théorique de une cellule par puit qui donnera une population monoclonale vraie ( cellules totalement identique, phénotypiquement, cytogénétiquement, morphologiquement..)

Clonage cellulaire

Population oligoclonale A+ B

oligoclonale Clone A - Clone A Clone B -