Mémoire de dea

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  • 1. SommaireRsumIntroductionMatriels et mthodes1 Matrielsa Types cellulairesb Amorces et sondes de RT-PCR quantitative en temps rel2 Mthodesa Conditions gnrales de cultureb Extraction des ARN messagersc Comparaison de la sensibilit au NGF des diverses lignes pithliales desein humaind Test de leffet de linhibition de contacte Effet de substances agissant sur la croissance et/ou lapoptosef RT-PCR quantitative en temps relg Immunoprcipitation et analyse en Western bloth Test dapoptose en Hoescht

2. Rsultats1 Expression du NGF et de ses rcepteurs (TrkA et p75) dans les lignesde cancer du sein et sur les cellules normales a Expression du gne p75 b Expression du gne TrkA c Expression du gne du NGF2 Variation de lexpression du NGF et de ses rcepteurs (TrkA et p75)en fonction de linhibition de contact3 Variation de lexpression du NGF et de ses rcepteurs (TrkA et p75)en fonction de substances agissant sur la croissance et/ou lapoptoseDiscution et conclusionBibliographieRemerciments 3. Sbastien DUPRAT, DEA biologie sant 1999-2000.REGULATION DE LEXPRESSION DU NGF ET DE SES RECEPTEURS (TRKA ET P75) DANS LESCELLULES DE CANCER DU SEIN.RESUME : Le cancer du sein touche prs dune femme sur dix. La meilleure comprhension decette maladie est un des dfis prioritaires de la sant publique lheure actuelle.Il a pralablement t prouv dans le laboratoire que le Nerve growth factor (NGF)stimule la croissance et la survie des cellules de cancer du sein par lintermdiaire de deuxrcepteurs : TrkA et p75 (Descamps et al. 1998). Dans cette recherche il a galement tdmontr que les cellules pithliales mammaires normales ne sont pas stimules prolifrerpar ce facteur de croissance. Lobjectif de mon travail de DEA est de dfinir la rgulation duNGF et de ses rcepteurs dans les lignes de cancer du sein en culture. Diffrentes lignes de cancer du sein ainsi que des cellules pithliales mammairesnormales ont t cultives en prsence de facteurs modifiant la prolifration et la surviecellulaire. Les rsultats ont alors t analyss en RT-PCR quantitative en temps rel ou enwestern blot. 4. INTRODUCTION :pralablement mon arrive dans monlaboratoire daccueil, cet effet a tdmontrsur les cellules pithlialesmammaires cancreuses (Descamps et al.La recherche en biologie cellulaire1998). Une particularit est intressantesur les cancers hormonaux dpendantsdans ce modle : le NGF stimule les cellulesrepose principalement sur ltude de lacancreuses du sein prolifrer mais resteprolifration, de la diffrentiation et desans effets mesurables sur les celluleslapoptose.Ces phnomnes sontnormales.conditionns par lenvironnement cellulaire,Le NGF agit par lintermdiaire denotammentparles molcules dedeux rcepteurs membranaires : TrkA etsignalisation.Ontrouvedanscettep75. Le proto-oncogne TrkA (p140trk) estcatgorie les facteurs de croissance, petitsun rcepteur activit tyrosine kinase, cestpolypeptides de faible poids cellulaire quile rcepteur haute affinit du NGF. P75agissent par lintermdiaire de rcepteursest un rcepteur accessoire, de bassemembranaires.affinit, et sans activit tyrosine kinase. CeLe NGF est le premier facteur dedernier semble pourtant possder une voiecroissance avoir t caractris. Ce travailde transduction propre lie aux fonctionsa valu le prix Nobel de mdecine en 1986 de survie cellulaire.Rita-Levi Montalcini. Cest larchtype desLtude du rle du NGF dans lefacteurs de croissance neurotrophique. Il acancer du sein en est ses dbuts. Dans let trs largement tudi pour son rlecadre de ce stage de DEA, nous nousdinduction de la croissance et de la surviesomme intress aux mcanismes rgulantdes neuronessympathiques. Plusla sensibilitdes cellules pithlialesrcemment, une activit mitogne lui a tmammaires humaines pour ce facteur deattribue sur certaines lignes de cellulescroissance.Notreapproche nousapithliales.Dans untravail effectu 5. renseign sur lvolution de cette sensibilit au NGF induite par des molcule agissant sur la croissance et/ou lapoptose. 6. MATERIEL & METHODES :proto-oncogneras1 - Matriel(dnomination :MCF-7 ras).Ces dernires se comportent enpermanence comme stimulesa) Types cellulairespar des facteurs de croissance,Un certainnombrede typesmme en milieu de sevrage (sanscellulaires ont t utiliss. Ce sont dessrum de veau ftal).lignes cancreuses ou des cellules- Les lignes T47D et SK-Br-3normales, mais toutessontdoriginesont galementhormono-pithliales mammaires humaines.dpendantes et peu invasives.-la ligne MCF-7 est hormono-Ellesont issues dpendante. Elle a t tablie dadnocarcinomes. SK-Br-3 partir deffusions pleurales dunsurexprime le rcepteur erb-B2, adnocarcinome. Cette ligne aet T47D possde des rcepteurs conserv denombreuses certains strodes. caractristiques dun pithlium- La ligne BT20 semble tre mammaire (particulirementhormono-dpendante, mais ceci pour la prsence des rcepteursestcontroversdansla haute affinit des strogneslittrature. Elle est issue de et progesterone). En plus de lacellules chapes dune tumeur ligne MCF-7 commune, nousen culture primaire. Elle a la avons galement utilis desparticularit de ne pas possder MCF-7 transfectespar lede rcepteurs aux strognes. 7. - Nous avons galement tudi 3 Dr.Pellerin) et mises en culturelignes de MDA. Elles sontprimaire au laboratoire.toutestrois hormono-indpendantes.Cesontlesb) Amorces et sondes de RT-lignes MDA-MB-231 (issues PCR quantitative en tempsdeffusions pleurales rl.dadnocarcinomes,fortement Les squences des amorces sens etinvasive.Ces cellulesantisens ainsi que des sondes sont lesnexpriment pas de rcepteurssuivantes :auxstrogneset laprogestrone),MDA-MB-453TrkA :(possdant de nombreuxSens : CATCGTGAAGAGTGGTCTCCGrcepteurs aux andrognes etAntisens :GAGAGAGACTCCAGAGCGTTGAAtrs invasive. Elle surexprimeSonde :galement erb-B2) et MDA- AGGAGTGAAATGGAAGGCATCTGGCMB-468 (possde de nombreux Grcepteurs lEGF etP75 :surexprime le FGF-2). Sens :- Enfin, nous avons utilis des CCTACGGCTACTACCAGGATGAGAntisens : TGGCCTCGTCGGAATACGcellules pithliales mammairesSonde :humainesnormalesCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGC(dnomination : CEMN). CesNGF :cellules sont issues de rductionSens :mammaires non pathologiques Antisens :(venant du dpartementdeSonde :chirurgie plastique, CHU Lille, 8. trypsine est inhibe par 5 ml de MEM SVF2 mthodes(dcrit ci-dessus).Lescellules en culture sontrgulirement observes au microscope a) Conditions gnrales deinvers contraste de phase. Cela permetculturede suivre lvolution de la confluance et desassurer du maintient de la morphologie Enroutine, les cellules sontpithliale.maintenues en MEM (Milieu essentielAvant un traitement de facteurs deminimum, avec des sels de Eagle) (Gibcocroissance, les cellules sont sevres dans duBRL) supplment avec 5% de srum deMEM supplment comme pour le MEM veau ftal (SVF) (Eurobio ? ? ? ?), 1%SVF dacides amins non essentiels, de L-dacides amins essentiels (Eurobio), 2 mMglutamine, de pnistreptomycine,dede glutamine (Eurobio), 5 l/ml dinsulinegentamycine, de bicarbonate de sodium, et(Organon), et des antibiotiques (Penicilline-dHEPES. A ceci, nous ajoutons 2 g/mlStreptomycine : 100 U/ml et Gentamycine :de fibronectine et 30 g/ml de transfrine.50 l/ml) (Eurobio). Les cellules sontencemences dans des flasques de plastiquede 75 cm2 (Falcon) et incubes dans unb) Extractiondes ARNatmosphre humide, 37C en prsence de5% de CO2. Le milieu est chang tous les 2messagersjours. Les cellules sont rgulirementdcoles, avant la confluance dans uneLes ARN totaux ont t extraitssolution de trypsine (0,1%) EDTAavec le kit Quiagen selon le protocole(0,25%) (eurobio), 37C pendant 5 10dcrit par Quiagen. Ensuite, on value laminutes (en fonction du type cellulaire). Laquantit dARN en spectrophotomtrie 9. 260 nm de longueur donde. On vrifie Ensuite, les cellules sont trypsinises. Laaussi la puret du rsultat en sassurant que quantit de cellules comprise dans chaquele ratio 260/280 est compris entre 1,7 et chantillon est dtermine par comptagesur lame de Malassez.Ensuite, on2. Les ARN sont dilus 10g /ml puis lescentrifuge 10 minutes 1200 tour parsolutions mres et dilus sont stockes minutes. Les culots sont conservs 80C80C.en attendant den extraire les ARNmessagers. Les ARN seront analyss en c) Comparaison de laRT-PCR quantitative en temps rel.sensibilit au NGF des diverseslignes pithliales de sein humain d)Testde leffet de Pour valuer le niveau dexpressionlinhibition de contactdu NGF et de ses rcepteurs, les cellulesont t ensemences dans des boites de Lescellules MCF-7 onttpetri 100mm (), 10000 cellulesensemences 10000 cellules par cm2 dans 2par cm ,puis cultives dansdeuxdes boites de Petri de 100mm de diamtreconditions standard :puis cultives en MEM SVF. Le milieu - 48 heures en MEM SVF :est rgulirement chang. Chaque jours, condition de srum.trois boites sont rcoltes par une solution - 48 heures en MEM SVF puisde trypsine, le nombre de cellules est 48 heures en MEM sevrage :dtermin par un compteur de cellules condition de sevrage.automatique. A partir de ces cellules, on(Remarque : dans cette partie, le milieu MEM deextrait les ARN messager que lon analysesevrage ne contient pas de rouge de phnol. Cenest pas le cas dans le reste de ltude.) en RT-PCR quantitative en temps rel. 10. MEM SVF a t renouvel e) Effet de substances agissant24h puis les cellules ont ttraites 48h dans du MEM sur la croissance et/ou lapoptoseSVF supplment de 1mM de Les cellules (MCF7 et BT-20) ont NaB ou 10M de C2.t ensemences 5000 cellules par cm2dans des boites de petri de 100mm dediamtre. Les cellules ont t laisses 48hf) RT-PCR quantitative enen MEM SVF dans un incubateur (37C,temps rel.5% de CO2). A partir de cette tape, il fautdiffrencier deux cas : La raction est faite en une seule - Pour le test du FGF-2, ainsi quetape. Le mlange de raction se compose le test conjoint du butyrate dedans chaque tube de : 50ng dADN total sodium (NaB) et du C2 avec ledchantillon, MgCl2 : 6mM pour TrkA ; NGF, les cellules ont t laves3mM pour p75 ; 4mM pour NGF, 5 l de 2 fois ave