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Le processus de cicatrisation

pathologique, interactions entre

clinique et recherche

Prof B Pittet - Laboratoire expérimental

Service de Chirurgie Plastique et Reconstructive,

Hôpitaux Universitaires de Genève

Faculté de Médecine, Université de Genève

University Hospitals of Geneva

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2

Groupe « plaie et cicatrisation »

infirmières spécialistes cliniques

médecins :

- dermatologie

- gériatrie

- paraplégiques

- chirurgie plastique

et reconstructive

Protocoles de soins

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Comprendre la plaie pour

choisir le traitement adapté…

Traitement conservateur: pansements

Traitement chirurgical

- geste chirurgical + pansements

- fermeture, couverture de la plaie

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Le processus de cicatrisation comprend 4 phases:

– phase inflammatoire ou exsudative

– phase proliférative

– phase de contraction et d’épithélialisation

– phase de remodelage de la cicatrice

Connaître la physiologie du

processus de cicatrisation,

et ces dérèglements ….

plaie

1. phase inflammatoire ou exsudative

2. phase proliférative

formation de tissu de granulation

3. phase de contraction et

d’épithelialisation

fermeture de la plaie

4. phase de remodelage de la cicatrice

cicatrice

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1. phase inflammatoire:

- cascade de coagulation, aggrégation plaquettaire

PDGF

cellules inflammatoires,

monocytes macrophages

2. phase de prolifération:fibroblastes cellules

endothéliales

myofibroblastes néovaisseaux

matrice extra-cellulaire

TISSU DE GRANULATION

bFGF, VEGF

TGFb

bFGF

GM-CSF

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tissu de granulation

Myofibroblastes

Prof G Gabbiani

Presence of modified fibroblasts in

granulation tissue and their possible role in

wound contraction

Gabbiani G, Ryan GB, Majno G

Experimentia, 1971

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3. phase de contraction …

-actine muscle lisse

fibroblastes myofibroblastes

fibroblaste: RER myofibroblaste: filaments contractiles

rapprochement des

berges de la plaie

Myofibroblasts: Cells with MUSCLES

Fibroblast Myofibroblast

α-smooth muscle actin

immunohystochemistry

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HOW TO ASSESS MYOFIBROBLAST DIFFERENTIATION ?

IMMUNOFLUORESCENCE

-actin / nuclei (DAPI) / α-smooth muscle actin

Myofibroblastes

Fibroblast Myofibroblasts

Myofibroblastes

contraction sur feuille de silicone

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3. phase de contraction …

…et d’épithélialisation :

prolifération des cellules épitheliales à

partir des berges et des annexes EGF

étanchéité de la plaie

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prolifération des cellules épitheliales

à partir des berges et des annexes

Martin, P. (1997): Science 276, 75-81

4. phase de remodelage :

tissu de granulation

apoptose

cicatrice

Histo: - diminution du nombre des

cellules et des capillaires

- disparition des myofibroblastes

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Etude1: Quantification des myofibroblastes

( -actine muscle lisse) dans différents

processus de cicatrisation pathologique

-actine muscle lisse

• plaie +

• escarre -

• plaie chronique -

• cicatrice -

• cicatrices hypertrophiques +

Lab Invest 1989

Situations Characterized by the Presence of Myofibroblasts

Normal tissues (e.g. pulmonary alveolar septa)

Kapanci et al., J. Histochem. Cytochem. 40:1995, 1992

Schmitt-Gräff et al., Virchows Arch.(B) 57:291, 1989

Normally healing granulation tissueGabbiani et al., Experentia 27:549, 1971

Darby et al,. Lab.Invest. 63:21, 1990

Desmoulière et al., Am. J. Pathol. 146:56, 1995

AsthmaRoche W.R., Clin. Exp. Allergy 21:545, 1991

Hypertrophic scarsEhrlich et al., Am. J. Pathol. 145:105, 1994

Pittet et al., Plast.Reconstr. Surg. 93:1224, 1994

Dupuytren’s disease and fibromatosesGabbiani and Majno, Am. J. Pathol. 66:131, 1972

Tomasek and Haaksma, Anat. Rec. 230:175, 1991

Lung fibrosisAdler et al., Lab. Invest 60:473, 1989

Zhang et al,. Am. J. Pathol. 145:121, 1995

Kidney fibrosisJohnson et al., J. Clin. Invest. 87:847, 1991

Diamond et al., Am. J. Pathol. 146:121, 1995

Liver cirrhosis

Ramadori et al., J. Clin. Invest. 87:847, 1991

Schmitt-Gräff et al., Am. J. Pathol. 138:1233, 1991

Friedman, New Engl. J. Med. 328:1829, 19931

Heart fibrosisSun et al., J. Mol. Cell Cardiol. 29:2001, 1997 Stroma reaction to epithelial tumors

Cintorino et al., Int. J. Cancer 47:316, 1991

Ronnov-Jessen et al., J. Clin. Invest. 95:859, 1995

Chiavegato et al., Virchows Arch. 426:77, 1995

Vitreo-retinopathyBochaton-Piallat et al., IOVS 41:2136-2142, 2000

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Cicatrisation pathologique

1. phase infammatoire ou exsudative

2. phase proliférative

plaie atone

3. phase de contraction et d’épithélialisation

• plaie chronique

4. phase de remodelage de la cicatrice

cicatrice hypertrophique, kéloïde

Stopper la contraction de la

cicatrice

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Etude 2: Effet de l’application locale de

l’interféron gamma (IFN ) sur les cicatrices

hypertrophiques

Cicatrices hypertrophiques myofibroblastes

néovaisseaux

IFN fibroblaste: diminution de la prolifération et de la

synthèse de collagène

cellule musculaire lisse: diminution de l’expression de

l’ -actine muscle lisse

Plast Reconstr Surgery, 1994

Effet de l’application locale de l’IFN sur les

cicatrices hypertrophiques

Etude pilote:

• tolérance des infiltrations intra-lésionnelles de IFN 200 µg (6x10 U)

• évolution clinique des symptômes

• mesure de l’ -actine muscle lisse dans des

biopsies de cicatrices

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Plast Reconstr Surgery, 1994

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avant traitement 12 semaines après traitement

IFN 3/sem

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Effet de l’application locale de IFN sur les

cicatrices hypertrophiques

Conclusions

Diminution

• symptômes cliniques

• taille et volume des cicatrices

• nombre des myofibroblastes

Plast Reconstr Surgery, 1994

maturation de la cicatrice

Wound contraction

Healing wound

•Médicaments

•diabète

•radiothérapie

•cicatrice

•âge

Tissu de granultation

insuffisant

Plaies chroniques

Hypoxie

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Etude 4: Rôle des

myofibroblastes dans le retard

de cicatrisation des plaies

ischémiques

Modèle de plaie ischémique chez le rat

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10jrs

Taille de la plaie au cours du temps

Expression de l’ -actine

muscle lisse par immuno-

histo-chimie

plaie contrôle plaie ischémique

J5 J5

J7 J7

J10 J10

j

r

s

jrs après la plaie

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Etude 4: Conclusion

• L’ischémie persistante empêche le

développement des myofibroblastes dans le

tissue de granulation

– retard d’apparition

– diminution du nombre absolu des myofibroblastes

• La diminution de la contraction de la plaie

ischémique joue un rôle important dans le

retard de cicatrisation

Etude : Effet de l’hypoxie sur les

myofibroblastes in vitro

Cellules: fibroblastes sous-cutané de rats (passages 2-7)

Culture: 5 jrs w/o medium changeà différents taux d’oxygène:

Normoxie 21% O2 ≈ 140 mmHg

Hypoxie 5% O2 ≈ 30 mmHg

Hypoxie sévère 2% O2 ≈ 15 mmHg

avec un inducteur des myofibroblastes TGFβ1

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0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

1

Cell

pro

life

rati

on

(a.u

.).

20%5%2%

Résultat: l’hypoxie stimule la prolifération des fibroblastes

2% O220% O2 5% O2

Ce

ll p

rolif

era

tio

n

** p<0.01 vs. 20%

****

Myofibroblastes et hypoxie

nuclei (DAPI)

20% 2%5%

Résultats: l’hypoxie réduit l’expression d’α-SMA

20% O2 2% O25% O2

** **-SM

A / D

AP

I

** p<0.01 vs. 20%

Vimentin

-SMA

20% 2%5%

20% 2%5%

α-SMA / DAPI

Myofibroblastes et hypoxie

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Silicone coated with collagen

add SCF

grow cells 7 days+ TGFβ

Myofibroblastes et hypoxie

Résultats: l’hypoxie réduit la contraction des myofibroblastes

20% O2 2.5% O2

-T

GF

40 % wrinkling 20 % wrinkling

5% O2

10 % wrinkling

+ T

GF

50% wrinkling80 % wrinkling 40 % wrinkling

Myofibroblastes et hypoxie

Résultats: l’hypoxie réduit la contraction des myofibroblastes

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Réversibilité des effets induits par l’hypoxie

20% PO2 2% PO2 20% PO22% PO2 2% PO2 20% PO2

Résultats: le rétablissement de la normoxie permet la restauration de la

fonction du myofibroblaste

Réversibilité en clinique

Rétablissement de la normoxie?

?

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Micromechanical forces

“Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation” Hinz et al. Am J Pathol 2001

Shockwave

V.A.C.

Fibroblast Myofibroblast

Réveribilité: rôle des forces mécaniques

TGF-

β

Réversibilité: rôle des forces mécaniques

J10 VAC

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P +: 510

P -: 90 Temps

Pression [bar]

33 ns

1 μs

Ondes de choc (Shock waves)

02468

1012141618

Controls 200 Pls 400 Pls 800 Pls

α-SMA

Contr

ol

200pls

400pls

1000pls

Contr

ol

200pls

4%

4%

4%

4%

5% 6% 6%

6% 9% 13%

Control 200 400 1000

2

10

6

% m

yo

fib

rob

laste

s

14

18

Fig 1: Differentiation des

fibroblastes en myofibroblastes

Fig 2: Influence de la rigidité du substrat sur la différentiation des

myofibroblastes

1kPa 5kPa 15kPa 50kPa 1MPa

Substats souples (~ plaies aigues) Substats rigides (~ plaies chroniques)

0

10

20

30

40

50

60

Controls SW 200 SW 400 SW 800Control 200 400 1000

0

20

40

60

Co

ntr

acti

on

gel (%

)

Fig 3: Contraction

*

*

*

*

Effet des ondes de choc in vitro

Résultats: 1. Ondes de choc stimulent la différentiation des myofibroblastes,

d’une manière dose-dépendante (fig 1.) et seulement sur des substrats rigides (fig 2.)

2. Ondes de choc stimulent la contraction du gel de culture, d’une manière dose-dépendante (fig 3.)

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24

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

D7 D14 D31

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

D7 D14 D31

0

20

40

60

Co

ntr

ac

tio

n p

laie

(%

)

80

100

0

20

40

60

Fe

rme

ture

pla

ie (

%)

80

100

d31

d31

d31

Contr

ol

OC

-IO

C-R

7 14 31

Temps après création de la plaie (jours)

**

**

control

OC-début Immediat

OC-debut Retardé à 1 semainemoyenne ± SEM. * p < 0.05 vs controle

Effet des ondes de choc in vivo

Résultats: Ondes de choc stimulent la contraction de la plaie, seulement après 31

jours - temps où le lit de la paie devient cohésif/rigide.

Mechanical stretch

Hypoxia + stretch 24hHypoxia

Effet des forces mécaniques sous

hypoxie in vitro

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Hypoxia Hypoxia

Effet des forces mécaniques sous

hypoxie in vivo

Augmente la contraction de la plaie

d 10

Effet des forces mécaniques sous

hypoxie in vivo

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α-S

MA

Quantificatio

n (

px)

Hypoxia Hypoxia + V.A.C.

Effet des forces mécaniques sous

hypoxie in vivo

Ethiopathogénie

hypoxie (2% - 5%): in vivo et in vitro

proliferation cellulaire

différentiation des fibroblastes en myofibroblastes

contraction

Conclusions: Myofibroblasts et hypoxie

caisson hyperbare?rétablissement de la normoxie

application de forces mécaniques : Vac, Shock waves

restaure la fonction des myofibroblastes

Traitement

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Laboratoire expérimental

de chirurgie plastique:

• N Alizadeh

• A Modarressi

• G Pietramaggiori

• M Tobalem

• E Vigato

• B Hinz• H Majd

Département de Pathologie • G Gabbiani

• ML Piallat

Remerciements

• 3 fonds

Thank you

Hôpitaux Universitaires de Genève