Le peignage moléculaire de l'ADN génomique

Un nouveau test diagnostique de laDystrophie Facio-Scapulo-Humérale

Karine Nguyen, Pierre Walrafen, Charlène Chaix, Catherine Vovan, Rafaelle Bernard, Shahram Attarian, Jean Pouget, Nathalie Dufrane, Anne Vannier,

Aaron Bensimon, Nicolas Lévy

Département de Génétique Médicale /UMR Inserm U 910

Marseille

FSHD : une maladie génétique complexe

3ème dystrophie musculaire en fréquence (1/10000 à 1/20000)

Autosomique dominante à pénétrance incomplète et expressivité variable

~ 1/3 de cas sporadiques: pénétrance incomplète

mutations de novo

mosaïques somatiques

FSHDFSHD 1 - 10 répétitions (< 35 Kb)1 - 10 répétitions (< 35 Kb)

TelomereTelomereFRG2TUB4QFRG1

D4Z4D4Z4DUX4CDUX4C

TelomereTelomere

TelomereTelomere

4qB4qB

4qA4qAnormalnormal

FSHDFSHD

FRG2TUB4QFRG1

FRG2TUB4QFRG1

D4Z4D4Z4

D4Z4D4Z4

DUX4CDUX4C

DUX4CDUX4C

normalnormal 11 - >100 répétitions (35 - >300 Kb)11 - >100 répétitions (35 - >300 Kb)

TelomereTelomereFRG2TUB4QFRG1 Homologie 10q26

D4Z4D4Z4DUX4CDUX4C

FSHD : une anomalie moléculaire complexe

Locus 4q35Locus 4q35

FSHD : un diagnostic moléculaire complexe

Chr. 4

p13E11EcoRI

EcoRI

BlnI

Chr. 10

E E/BE/B E/BE E

PFGE

2 3

Southern blot sur ADN génomique

• L'exploration des patients est incomplèteEnviron 20% de diagnostic ambigu

• Variants génomiques mal diagnostiqués

• Mosaiques somatiques fréquentes

• Translocations entre D4Z4 du chr4 et du chr10

• Délétions non canoniques (p13E11)

FSHD : un diagnostic moléculaire complexe

E E+B

2 UR

E E+B E E+B

La technologie: le peignage moléculaire de l'ADN

Analyse d'une molécule d'ADN génomique unique• molécules d'ADN de haut poids moléculaire, individualisées, étirées,

fixées, linéaires et parallèles

• Facteur d'étirement constant, conversion 1µm = 2 kb

• 100 génomes sur une lame, fibres de 100kb à 2 Mb de long

2.106

Bensimon et al., Science 1994

106

Le peignage moléculaire de l'ADNcouplé au Code Barre Génomique

Répétitions Distance Longueur Couleur

Cartographie physique de grandes régions génomiques à la résolution de 1 kb et à l'échelle d'une molécule d'ADN unique

4qB

10q(A)

4qA5

5

5

35

35

35

D4Z4

10 10 10 10 10 10 10

10 10 10 10 10 10 10 28

28

5 5 5 5 5 5 5 7

4 ≠10qA ≠ qB

chr. 10

chr. 4

Cartographie physique du locus FSHDdesign des sondes

Visualisation directe des 4 allèles chez un patient

FSHD : résultats

4qA(10.4 kb)

4qB (66.3 kb)

10q (99 kb)

10q (152 kb)

10 kb

4q 4q 10q 10q

All

4q

10q

FSHD : résultats

FSHD: mosaïque somatique

All

4q

4q 4q10q 10q 4q

10 kb

10q

Foetus Mother

E E+B E E+B

2 UR

4q 4q10q 10q

All

4q

10q

4q

10 kb

FSHD: mosaïque somatique

10q50 kb 10 kb 20 kb

D4Z4

Remaniements complexes…

FSHD : résultats

Le peignage comme nouveau test diagnostique de la FSHD

Visualisation directe et simultanée des 4 allèles en 1 seule manip

Détection des mosaïques, des remaniements complexes

Test rapide, fiable, sensible et spécifique

Supprime les inconvénients liés à la technique du SB

Nouvel outil de recherche pour explorer la région

Le peignage moléculaire de l'ADN