LABO # 1 · 2017. 8. 14. · Labo de Microbiologie-2017 . 4 . DIRECTIVES GÉNÉRALES . 1. La...

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Labo de Microbiologie-2017

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Table des Matières DIRECTIVES GÉNÉRALES ......................................................................................................................................... 4

BARÈME ................................................................................................................................................................. 5

HORAIRE ................................................................................................................................................................ 6

LABO NO 1 .............................................................................................................................................................. 7

DILUTIONS ET CONCENTRATIONS ............................................................................................................................. 7 POURCENTAGE.......................................................................................................................................................... 7 MOLARITÉ ................................................................................................................................................................. 9 POIDS/VOLUME ........................................................................................................................................................ 9 LES RAPPORTS ........................................................................................................................................................... 9 LES DILUTIONS ........................................................................................................................................................ 10

EXERCICE 1.0 : GÉNÉRER UNE COURBE ÉTALON ET DÉTERMINER UNE CONCENTRATION INCONNUE DE BLEU DE MÉTHYLÈNE (Groupes de 2) .......................................................................................................................... 13

DIFFUSION............................................................................................................................................................... 14 OSMOSE .................................................................................................................................................................. 14 TONICITÉ ................................................................................................................................................................. 14 L’OSMOLARITÉ ........................................................................................................................................................ 15 L’OSMOLARITÉ VS LA TONICITÉ ............................................................................................................................... 15

EXERCICE 1.1 : DIFFUSION, OSMOSE ET TONICITÉ CHEZ LES GLOBULES ROUGES (Groupes de 2) ..................... 16 CROISSANCE MICROBIENNE EN LABORATOIRE ....................................................................................................... 17 MILIEUX MICROBIOLOGIQUES ................................................................................................................................ 17 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : ÉTALEMENT ................................................................................................ 18

EXERCICE 1.2 : COMPTE VIABLE D’UN ÉCHANTILLON DE SOL (Groupes de 2).................................................... 19 EXERCICE 1.3 : ÉCHANTILLONNAGE DE VOTRE ENVIRONNEMENT (Chaque personne) ....... Error! Bookmark not defined.

LABO NO 2 ............................................................................................................................................................ 20

LES COLIFORMES ..................................................................................................................................................... 20 TECHNIQUE MOLÉCULAIRE POUR ÉVALUER LA PRÉSENCE DE MICROBES .............................................................. 20

EXERCICE 2.0 : DÉTECTION DE COLIFORMES PAR PCR (Groupes de 2) ............................................................... 20 MIGRATION SUR GEL D’AGAROSE (GROUPES DE 4) .................................................................................................... 21 LES COMPTES LES PLUS PROBABLES ........................................................................................................................ 22

EXERCICE 2.1 : NPP DE COLIFORMES DANS VOTRE ENVIRONNEMENT (Groupes de 2) ..................................... 25 EXERCICE 2.2 : COMPTES BACTÉRIENS DANS LE SOL (GROUPES DE 2) ........................................................................ 26 EXERCICE 2.3 : COMPTES DES ACTINOMYCÈTES DANS LE SOL (GROUPES DE 2) ......................................................... 26 LES FUNGI ................................................................................................................................................................ 27

EXERCICE 2.4 : COMPTES DES FUNGI DANS LE SOL (Groupes de 2) ................................................................... 27 INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES ................................................................ 28

EXERCICE 2.5 : STRIES POUR COLONIES SIMPLES (Individuellement) ................................................................. 30

LABO NO 3 ............................................................................................................................................................ 31

EXERCICE 3.0 : NPP DE COLIFORMES DANS VOTRE ENVIRONNEMENT (GROUPES DE 2) ............................................ 31 COMPTES DIRECTS (LAME D'HÉMATIMÈTRE) ................................................................................................................ 32

EXERCICE 3.1 : COMPTE DIRECT D’UNE SUSPENSION DE LEVURE (Groupes de 2) ............................................. 33 VISUALISER LES MICROORGANISMES ..................................................................................................................... 34 VISUALISATION MACROSCOPIQUE – MORPHOLOGIES COLONIALES ...................................................................... 34

EXERCICE 3.2 : MORPHOLOGIES COLONIALES (Groupes de 2) ........................................................................... 34 VISUALISATION MICROSCOPIQUE ........................................................................................................................... 35

EXERCICE 3.3 : VISUALISATION MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) ... 38 MORPHOLOGIES CELLULAIRES BACTÉRIENNES ....................................................................................................... 40


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LABO NO 4 ............................................................................................................................................................ 41

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM .................................................................................. 41 EXERCICE 4.0: COLORATION DE GRAM (Groupes de 2) ...................................................................................... 42

VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION ACIDO-RÉSISTANTE .................................................................. 42 EXERCICE 4.1 : COLORATION ACIDO-RÉSISTANTE (Groupes de 2) ...................................................................... 43 EXERCICE 4.2 : VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DES SPORES ................................................. 43

LABO NO 5 ............................................................................................................................................................ 45

CROISSANCE DES BACTÉRIES – COURBE DE CROISSANCE........................................................................................ 45 EXERCICE 5.0 : COURBE DE CROISSANCE D’E. COLI (Groupes de 2) .................................................................... 45

FERMENTATION PAR LA LEVURE ............................................................................................................................. 46 EXERCICE 5.1 : BIOESSAI DE FERMENTATION PAR LA LEVURE (Groupes de 2) .................................................. 47

CINÉTIQUE DE MORTALITÉ ...................................................................................................................................... 49 EXERCICE 5.2 : SUSCEPTIBILITÉ ET MUTAGENÈSE AUX ULTRAVIOLETS (Groupes de 2) ....... Error! Bookmark not defined. EXERCICE 5.3 : LES COLORANTS DIFFÉRENTIELS ET LA STÉRILISATION (Groupes de 2) ...................................... 49

LABO NO 6 ............................................................................................................................................................ 51

CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE - ANTIBIOTIQUES ........................................................................... 51 ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER .................................................................................................................... 51

EXERCICE 6.0 : ESSAI DE KIRBY-BAUER (Groupes de 2) ...................................................................................... 52 E-TEST ..................................................................................................................................................................... 53

EXERCICE 6.1 : SUSCEPTIBILITÉ DE S. FAECALIS À LA VANCOMYCINE (Groupes de 2) ....................................... 53 DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE ..................................................................................................... 54

EXERCICE 6.2 : DÉTERMINATION DES CMI (Groupes de 2) ................................................................................ 54

LABO NO 7 ............................................................................................................................................................ 55

CONTRÔLE DE LA CROISSANCE MICROBIENNE (SUITE) ............................................................................................. 55 EXERCICE 7.0: ESSAI DE DIFFUSION DE KIRBY-BAUER ........................................................................................ 55 EXERCICE 7.1 : SUSCEPTIBILITÉ DE S. FAECALIS À LA VANCOMYCINE - E-TEST (Groupes de 2) ......................... 55 EXERCICE 7.2: DÉTERMINATION DE LA DOSE THÉRAPEUTIQUE - LES CMI (Groupes de 2) ............................... 56

MÉTABOLISME BACTÉRIEN ET LES TESTS DIFFÉRENTIELS........................................................................................ 56 UTILISATION DE SOURCES DE CARBONE COMPLEXES : ENZYMES EXOCELLULAIRES ............................................... 57

EXERCICE 7.3 : DÉGRADATION DE SOURCES DE CARBONES COMPLEXES (Groupes de 2) .................................. 57 MÉTABOLISME DES SUCRES – BOUILLON DE PHÉNOL ROUGE ................................................................................ 58

EXERCICE 7.4 : MÉTABOLISME EN MILIEU DE PHÉNOL ROUGE (Groupes de 2) ................................................. 58 CROISSANCE EN MILIEU TSI (TROIS SUCRES ET FER) ................................................................................................ 58

EXERCICE 7.5 : CROISSANCE EN MILIEU TSI (Groupes de 2) ............................................................................... 59 L'UTILISATION DU CITRATE COMME SOURCE DE CARBONE .................................................................................... 60

EXERCICE 7.6 CROISSANCE SUR PENTE DE CITRATE DE SIMMON (Groupes de 2) .............................................. 60 MÉTABOLISME DE L’URÉE ....................................................................................................................................... 60

EXERCICE 7.7 : CROISSANCE SUR PENTE D’URÉE (Groupes de 2) ....................................................................... 60 LES DÉCARBOXYLASES ET LES DÉAMINASES ............................................................................................................ 61

EXERCICE 7.8 : ESSAIS DÉCARBOXYLASES ET DÉSAMINASES (Groupes de 2) ..................................................... 61 SIM: PRODUCTION DE SULFIDE D’HYDROGÈNE, D’INDOLE ET LA MOTILITÉ ........................................................... 62

EXERCICE 7.9 : TEST SIM (Groupes de 2) ............................................................................................................ 62 RÉDUCTION DU NITRATE ET DU NITRITE ................................................................................................................. 63

EXERCICE 7.10 : ESSAI DE RÉDUCTION DU NITRATE (Groupes de 2) .................................................................. 63 TEST ENTEROPLURI : SYSTÈME ENTEROBACTERIACEAE .......................................................................................... 64

EXERCICE 7.11 : TEST ENTEROPLURI (Groupes de 2) .......................................................................................... 64 LES STREPTOCOCCI ET LES STAPHYLOCCOCI ............................................................................................................ 66 HÉMOLYSE SANGUINE ............................................................................................................................................ 66


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EXERCICE 7.12 : PRÉLÈVEMENT DE LA GORGE SUR GÉLOSE DE SANG (Groupes de 2) ...................................... 67

LABO NO8 ............................................................................................................................................................. 68

EXERCICE 8.0 : DÉGRADATION DE SOURCES DE CARBONES COMPLEXES (Groupes de 2) .................................. 68 EXERCICE 8.1 : MÉTABOLISME EN MILIEU DE PHÉNOL ROUGE (Groupes de 2) ................................................. 69 EXERCICE 8.2 : CROISSANCE EN MILIEU TSI (Groupes de 2) ............................................................................... 70

FERMENTATION DU GLUCOSE: PRODUCTION D'ACIDES MIXTES OU D'ACÉTOINE .................................................. 72 EXERCICE 8.3 : TEST DE MÉTHYL-ROUGE-VOGUES-PROSKAUER (MRVP) (Groupes de 2) .................................. 72 EXERCICE 8.4 : CROISSANCE SUR PENTE DE CITRATE DE SIMMON (Groupes de 2) ............................................ 72 EXERCICE 8.5 : CROISSANCE SUR PENTE D’URÉE (Groupes de 2) ....................................................................... 73 EXERCICE 8.6 : ESSAIS DÉCARBOXYLASES ET DÉSAMINASES (Groupes de 2) ..................................................... 73 EXERCICE 8.7 : TEST SIM (Groupes de 2) ............................................................................................................ 74 EXERCICE 8.8 : ESSAI DE RÉDUCTION DU NITRATE (Groupes de 2) .................................................................... 75 EXERCICE 8.9 : TEST ENTEROPLURI (Groupes de 2) ............................................................................................ 76

TESTS DIFFÉRENTIELS POUR L’IDENTIFICATION DES COCCI GRAM POSITIFS ........................................................... 78 Famille des Micrococcaceae ............................................................................................................................... 78 Famille des Streptococcaceae ............................................................................................................................ 78 EXERCICE 8.10 : HÉMOLYSE SANGUINE (Groupes de 2) ..................................................................................... 79 EXERCICE 8.11 : CATALASE (Groupes de 2) ........................................................................................................ 79

BILE-ESCULINE ......................................................................................................................................................... 80 SENSIBILITÉ À LA BACITRACINE, L’OPTOCHINE ET LA NOVOBIOCINE ...................................................................... 80 GÉLOSES DE MANNITOL + SELS ............................................................................................................................... 80 AGAR DE TELLURITE OU AGAR DE BAIRD PARKER ................................................................................................... 81 TEST PYR .................................................................................................................................................................. 81

UNITÉS MÉTRIQUES ............................................................................................................................................. 82

COMPOSITION DES MILIEUX DE CROISSANCE ...................................................................................................... 83


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DIRECTIVES GÉNÉRALES 1. La présence dans le laboratoire est obligatoire. S'il vous plaît, être à l'heure. 2. Des chaussures et vêtements appropriés doivent être portés en tout temps. Attachez les

cheveux longs. 3. Porter une blouse de laboratoire — elles sont plus faciles à stériliser que vos vêtements, si

vous renversez une culture ou un colorant. 4. Laisser vos vêtements d'extérieur, sacs à dos, et toutes autres matières étrangères dans les

casiers à l'extérieur du laboratoire. 5. Soyez prudent avec les bruleurs Bunsen-les tenir éloignés des microscopes, du papier, de

l'éthanol, et porter attention à vos cheveux. Ne laissez jamais la flamme sans surveillance. 6. Toujours placer les pipettes utilisées, les écouvillons, et autres matériels dans les sacs

biohazard fournis afin qu'ils puissent être stérilisés et éliminés de façon appropriée. Ne pas jeter de déchets dans les sacs d'autoclaves.

7. Ne pas manger ou boire dans le laboratoire. 8. Ne jamais se lécher les doigts, ou mettre vos doigts dans votre bouche. 9. Traiter chaque organisme comme un agent pathogène potentiel. 10. Traiter les cultures renversées avec un désinfectant avant de les nettoyer. Couvrir le

déversement avec une serviette en papier. Vaporisez la serviette en papier avec un désinfectant jusqu'à ce que la serviette soit trempée. Laissez reposer pendant 10 minutes. Avec des gants, ramasser les serviettes en papier et les jeter dans le sac à autoclave. Demandez à l'instructeur ou l'A.E. pour de l'aide dès que le déversement se produit.

11. N'oubliez pas de nettoyer l'huile sur les lentilles avant d'entreposer le microscope. 12. Pas de radios, lecteurs MP3, de lecteurs de CD dans le laboratoire. 13. Aucune utilisation des téléphones cellulaires ou des textos en laboratoire. 14. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout accident, même mineur. 15. Au début de chaque période de laboratoire, nettoyer votre banc avec un désinfectant.

Nettoyez encore une fois à la fin du laboratoire. 16. LAVEZ VOS MAINS avant de commencer les exercices de laboratoire. LAVER VOS

MAINS avant de quitter le laboratoire, même si c'est seulement pour une pause. Matériel que vous DEVEZ avoir pour travailler dans le laboratoire de microbiologie : Une blouse de laboratoire Un crayon-feutre à pointe fine permanent, de préférence noir, pour l'étiquetage. Un cahier de notes pour enregistrer vos résultats. N'importe quel type est acceptable. Ne gaspillez pas votre argent. Une clef USB pour sauvegarder vos images Facultatif, mais fortement recommandé : Ne pas porter de lentilles cornéennes dans le laboratoire. Elles peuvent être très dangereuses. Aviser l'instructeur de tout problème médical de sorte que des accommodations appropriées peuvent être prises. Par exemple, les allergies, le diabète, l'hypoglycémie, l'épilepsie, les blessures apparentes, daltonisme, etc. Aviser l'instructeur de tout besoin particulier dont vous pourriez avoir besoin de sorte que les accommodations appropriées peuvent être prises. Par exemple, si vous écrivez vos examens avec SASS.


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BARÈME Quiz 2 points bonis pour 100% sur 4/8 quiz Devoirs 20% Examen de mi-session 30% Examen final pratique 10% Examen final théorique 40%

Quiz: Au début de chaque laboratoire, un quiz de 10 minutes composé d’une à deux questions sera donné. Votre performance sur ceux-ci ne peut pas avoir un impact négatif sur votre note finale. Toutefois, si vous obtenez 100% sur au moins 4 des 8 quiz vous serez accordé 2 points boni sur votre note finale. Devoirs : Ce cours comprend 4 devoirs sur la théorie des expériences réalisées et l'analyse des résultats obtenus. Ceux-ci peuvent être présentés individuellement ou en groupes de deux (vous et votre partenaire). Une pénalité de 10%/jour sera imposée sur les devoirs en retard. (Les week-ends sont considérés comme un seul jour) Les devoirs devront être remis à la date indiquée (voir l’horaire à la page 6) avant de quitter le laboratoire pour la journée. Examen de mi-session: Un examen de mi-session sera donné à la date indiquée à l’horaire à la page 6. Cet examen comportera 30 questions à courtes réponses et à choix multiples et sera donné sur une période de 2h. Vous aurez droit à une seule feuille de triche recto (8 1/2 X 11 po), du papier brouillon, et les calculatrices pour cet examen. Examen final pratique : Pour cet examen, vous devrez vous présenter sur une base individuelle au labo pour une période de 2.5h afin d’exécuter des techniques couramment utilisés durant la session. Les tâches à exécuter incluront la préparation d’une coloration de Gram suivi de l'identification d'un inconnu bactérien, un striage pour colonies simples, un compte viable et un compte direct. Cet examen est à livre ouvert. Vous avez droit à toute ressource imprimée. Examen final: Un examen final, qui est cumulatif, comportera 40 questions à courtes réponses et à choix de réponses. Cet examen sera donné sur une période de 3h. Vous aurez droit à une seule feuille de triche recto (8 1/2 X 11 po), du papier brouillon, et les calculatrices.


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HORAIRE

Date Dates de remises

Labo 1 12 sept.

Labo 2 19 sept. Devoir 1

Labo 3 26 sept.

Labo 4 3 oct. Devoir 2

Action de Grace 8 – 13 oct. PAS DE LABO

Mi-session 16 oct.

Semaine d’étude 22 - 28 oct.

Labo 5 31 oct.

Labo 6 7 nov. Devoir 3

Labo 7 14 nov.

Labo 8 21 nov.

Examen Pratique 28 nov. Devoir 4

Examen final théorique Période d’examens finaux


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LABO NO 1 DILUTIONS ET CONCENTRATIONS Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration. La concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une solution. Pour travailler avec des concentrations, vous devez comprendre la distinction entre le soluté, le solvant et la solution. Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution, la concentration est une propriété variable. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment concentrée est une solution. Une variété de différentes façons existent pour calculer et exprimer les concentrations des solutions. Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les composés chimiques réagissent entre eux (moles). Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront présentés. Elles incluent le pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) le poids/volume et les rapports. Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs façons d’établir la concentration d’une solution. Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes qui doivent être présentes dans la solution ou vous pouvez préparer une solution en diluant une solution préexistante. POURCENTAGE L’utilisation des pourcentages est une façon commune d’exprimer la concentration d’une solution. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100. Les pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une façon, que vous connaissez, sans doute, d’exprimer les concentrations est le pourcentage par volume. Une autre façon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre façon est un hybride appelé le pourcentage par poids/volume. Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en mélangeant deux liquides.

Par exemple, l’alcool à friction est habituellement 70 % par volume d’alcool isopropyl. Ceci veut dire que 100 mL de la solution contient 70 mL d’alcool isopropyl. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou 1000 mL) de cette solution contient 700 mL d’alcool isopropyl et assez d’eau pour compléter le volume à un total de 1 litre ou 1000 mL.

Pourcentage par volume = volume du soluté volume de la solution x 100


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Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le poids du soluté/poids de la solution.

Pourcentage par poids = Poids du soluté Poids de la solution x 100

À titre d’exemple, considérons une solution de 12% NaCl par poids. Une telle solution aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100 grammes de solution. Pour préparer une telle solution, vous pourriez peser 12 grammes de NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes d’eau, afin que la masse totale de la solution soit de 100 grammes. Puisque les masses sont conservées, les masses des composantes de la solution s’additionneront à la masse totale de la solution.

12 % NaCl solution = 12 g NaCl 100 g solution

12 g NaCl (12 g NaCl + 88 g eau) = 12% NaCl solution

Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution, vous devez diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage. Le pourcentage en poids/volume est une variante qui exprime la quantité de soluté en grammes, mais mesure la quantité de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle contient 5 g de NaCl pour chaque 100 mL de solution.

Pourcentage par poids/volume = Poids du soluté (en g) Volume de solution (en mL) x 100

Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en pourcentages.


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MOLARITÉ Une autre façon d’exprimer une concentration s’appelle la molarité. La molarité c’est le nombre de moles de soluté dissout dans un litre de solution. Les unités sont donc moles par litre, plus précisément, c’est les moles de soluté par litre de solution.

Molarité = moles de soluté litre de solution

Plutôt d’écrire moles par litre, l’abréviation “M” est utilisée pour ces unités. Alors, quand vous voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). Vous devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. "Moles" est une mesure de la quantité que vous avez d’une composante; "molarité" mesure la concentration de la composante. Alors quand on vous donne un problème, qui stipule que la concentration d’une solution est 0.1 M, ceci veut dire qu’elle possède 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que c’est 0.1 mole. POIDS/VOLUME Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Contrairement au pourcentage, la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. Plus communément, ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. Par exemple, par 1 mL ou 1 µL ou 1 L, etc. Essentiellement, ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une quantité donnée de la solution. Par exemple, une solution qui est à une concentration de 1mg/mL contient 1mg de soluté dans 1 mL de solution. LES RAPPORTS Toutes les façons décrites ci-dessus pour exprimer les concentrations se font en fonction du volume de la solution qui est la somme du volume du soluté et du solvant. Une manière courante que plusieurs microbiologistes et chimistes utilisent pour d’exprimer les concentrations est les rapports. Dans ce cas-ci, la relation entre le soluté et le solvant est exprimée indépendamment de la solution. Par exemple, nous pourrions dire que le rapport entre un soluté est un solvant est de 2 pour 1 avec la notation 2 :1. Ceci indique que pour deux parties du soluté il y a une partie du solvant. Donc, trois parties totales de solution!


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LES DILUTIONS La formulation des dilutions est essentielle dans tous les domaines des sciences ainsi que dans la vie de tous les jours. Les dilutions servent à réduire de façon précise la concentration d'éléments, soit chimiques ou vivants, se retrouvant en solution. Par exemple, si vous désirez réduire la concentration de matières grasses dans du lait de 3.5% à 0.35%, vous devrez effectuer une dilution de facteur 10. La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La concentration, le facteur de dilution, et la dilution. Le facteur de dilution représente le multiple par lequel une concentration initiale doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale. Par exemple, si une solution contient 30 grammes de caféine par 1 L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à 0.3 Gramme/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100; le facteur de dilution. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution. Le facteur de dilution = Concentration initiale Concentration finale La dilution représente la fraction du composé étant examiné. Par exemple, dans le problème précédent, une dilution de 1/100 a été effectuée. La dilution est exprimée comme une fraction de 1 sur le facteur de dilution. Afin de correctement préparer des dilutions, vous devez apprendre à utiliser les pipettes de façon appropriée. Voici quelques directives générales : Choisir la pipette dont la capacité se rapproche le plus du volume désirez. Par exemple, pour mesurer 0.1mL il est préférable d’utiliser une pipette de 1.0 mL plutôt qu’une de 10mL. Minimiser le nombre de pipettages afin de minimiser les chances de faire des erreurs. Par exemple, si vous désirez distribuer 1 mL dans dix éprouvettes il est préférable de pipetter 10mL une fois et de distribuer 1 mL dix fois plutôt que de pipetter 1 mL dix fois et de distribuer 10 fois. Changer de pipette pour chaque solution ou dilution différente.


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Faire des transferts en série : quand vous faites des transferts en série telle que pour les dilutions en série, il est nécessaire d’utiliser plusieurs pipettes. Utiliser les directives suivantes : Passé d’une concentration plus élevée à une solution de concentration plus faible : Pipetter le volume désiré de la source puis livré à la nouvelle éprouvette (« A » dans l’image ci-dessous). Rincer la pipette de haut en bas plusieurs fois (dans « A » dans l’image ci-dessous). Changer de pipette puis pipetter le volume désiré de cette éprouvette (« A ») puis livré dans la prochaine éprouvette (« B »). Répéter cette procédure de « A » à « B » avec une nouvelle pipette pour chaque dilution. Passer d’une concentration moindre à une solution de concentration plus élevée : dans ce cas-ci le pipetage et plus facile. Utiliser tout simplement la même pipette pour le transfert du volume voulu d’une solution de concentration moindre à une solution de concentration plus élevée. Aucun équilibrage ou de rinçage n’est requis dans ce cas-ci. Calcul des dilutions en série Les dilutions sont essentiellement des fractions et suivent donc les mêmes principes arithmétiques. Ceci étant dit, la dilution (ou la fraction) indique quelle fraction du total est représentée par le composé étant dilué. Ex. Vous désirez diluer une solution par un facteur de 4. Pour ce faire, la fraction est donc 1/4; c.-à-d. qu’un quart du volume total doit être représenté par la chose étant dilué. Donc, deux fractions qui sont égales, par exemple 2/4 et 4/8 représentent les mêmes dilutions et facteurs de dilutions.

A B C

Sour

ce A B C

Sour

ce

Livrer puis rincer la pipette dans cette éprouvette avant de changer de pipette et de faire la prise du volume désiré de cette nouvelle solution.


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Préparation des dilutions : Les choses que vous devez déterminer avant de préparer une dilution sont : quel est le volume total final que je désire, quel est le facteur de dilution désiré et quelle est la concentration finale que je désire (si celle-ci est connue). Par exemple, je désire avoir un volume final de 50 mL et un facteur de dilution de 4X. La fraction désirez est donc 1/4 où le dénominateur représente le total. Puisque je désire un volume final de 50 mL, 1/4 du 50 doit être le composé étant dilué; donc 12.5. Ce que ceci signifie est que 1/4 = 12.5/50. Donc pour préparer cette dilution vous ajouteriez 12.5 mL de la solution à être dilué dans (50 mL -12.5 mL = 37.5 mL) de solvant. Si vous connaissez la concentration finale que vous désirez, vous pouvez utiliser la formule suivante pour déterminer quel volume de la solution mère de diluer : Les dilutions en séries sont toutes simplement des dilutions séquentielles où la solution mère utilisée pour chaque dilution représente la dilution précédente. La dilution finale pour la série est le produit de chacune des dilutions individuelles.

Dil. finale = Dil.1 X Dil. 2 X Dil. 3 etc.

Concentration que vous voulez Concentration que vous avez

X Volume final désiré = Volume de la solution mère à ajouter au mélange


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Horaire

13h-14h Cours 14h – 15h30 Exercice 1.0 15h30 – 17h Exercice 1.1 17h – 18h30 Exercice 1.2 EXERCICE 1.0 : GÉNÉRER UNE COURBE ÉTALON ET DÉTERMINER UNE CONCENTRATION INCONNUE DE BLEU DE MÉTHYLÈNE (Groupes de 2) Matériel Solution de bleu de méthylène (0.26% m/v; M. M. : 320g/mole) Solution de bleu de méthylène de concentration inconnue 100 mL d'eau Éprouvettes Méthode 1. À partir de la solution mère de bleu de méthylène, préparer 5 mL d’une solution de bleu de

méthylène à une concentration finale de 0.4 mM. Étiqueter cette éprouvette No1. Assurez-vous de prendre en note comment cette solution a été préparée.

2. Ajouter à une éprouvette, étiquetée No2, 1.2 mL d’eau et 4.8 mL de la solution No1. 3. Ajouter à une éprouvette, étiquetée No3, 3.0 mL d’eau et 2.5 mL de la solution No2. 4. Ajouter à une éprouvette, étiquetée No4, 1.5 mL d’eau et 2.0 mL de la solution No3. 5. Ajouter à une éprouvette, étiquetée No5, 0.5 mL d’eau et 0.8 mL de la solution No4. 6. Ajouter à une éprouvette, étiquetée No6, 1.0 mL d’eau et 1.5 mL de la solution No5. 7. À partir de la solution mère de bleu de méthylène de concentration inconnue, préparer des

dilutions dans un volume final de 5mL de 1/4.5 et de 1/8. Étiqueter ces éprouvettes INC 1 et INC 2 respectivement. Assurez-vous de prendre en note comment ces dilutions ont été préparées.

8. Transférer 0.1 mL de chacune des solutions aux puits appropriés d’une plaque de 96 puits tel qu’indiqué ci-dessous:

9. Obtenir les lectures d’absorbances à 550 nm. Plan de la plaque à 96 puits (une plaque/table) Eau

Blanc Soln. No1

Soln. No2

Soln. No3

Soln. No4

Soln. No5

Soln. No6 INC 1 INC 2 Groupe 1

Eau

Blanc Soln. No1

Soln. No2

Soln. No3

Soln. No4

Soln. No5


Eau

Blanc Soln. No1

Soln. No2

Soln. No3

Soln. No4

Soln. No5


Eau

Blanc Soln. No1

Soln. No2

Soln. No3

Soln. No4

Soln. No5



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DIFFUSION L'environnement interne de tout organisme se compose principalement de solutions à base d'eau. Un grand nombre de solutés peuvent être dissouts dans ces solutions. Puisque le mouvement de composés à travers les membranes cellulaires est fortement influencé par les différences de concentrations et par la perméabilité de la bicouche lipidique, il est important de comprendre comment les différences de concentrations d'un soluté influencent le transport passif membranaire. Les particules en solution sont généralement libres de se déplacer de manière aléatoire dans tout le volume d’une solution. S’il existe une différence dans la concentration d'un soluté entre une région d'une solution et une autre, la substance aura alors tendance de diffuser de l’endroit où il est plus concentré à l'endroit où il est moins concentré jusqu’à ce que la répartition du composé soit uniforme dans tout le volume de la solution. Ainsi la diffusion nette se produit d'une zone de haute concentration à une zone de faible concentration, jusqu'à ce qu'un état d'équilibre soit atteint. La diffusion simple représente donc tout mouvement non assisté de tout composé en descendant le gradient de concentration. Dans le cas des cellules, des solutés qui peuvent facilement traverser la bicouche lipidique (tel que des petites molécules non chargées) sont transportés au travers des membranes cellulaires par diffusion simple. OSMOSE La concentration de l'eau dans une solution est inversement proportionnelle à la concentration de solutés – le plus élevé est la concentration de solutés totaux dans une solution le plus faible est le nombre de molécules d'eau par unité de volume de la solution. Par ce fait, l’eau diffusera de la zone avec la concentration de soluté inférieure à la zone avec la concentration de soluté supérieur. Ainsi, la diffusion de l’eau dans ou hors de la cellule est entraînée par les différences dans la concentration totale des solutés qui ne peuvent pas traverser la membrane plasmique. Ce mouvement de l’eau par diffusion est dit osmose. Si l'eau s’écoule d'une solution à une autre, le volume de la deuxième solution aura tendance à augmenter, tandis que celui de la première diminuera. Dans le cas d’une cellule, ce changement de volume aura pour effet de forcer la membrane de s’étirer afin d’accommoder l’augmentation de volume, causant une augmentation de la pression à l'intérieur de la cellule. La pression osmotique est donc directement liée à la concentration totale de soluté non perméable d'une solution. TONICITÉ Les cellules vivantes ont le potentiel de prendre ou de perdre de l'eau par osmose relativement à l’environnement extracellulaire. Le mouvement net de l’eau dans ou hors de la cellule est entraîné par les différences dans les concentrations des solutés imperméables à la cellule. Ainsi, l'effet qu'une solution extracellulaire a sur le mouvement osmotique de l'eau dans ou hors de la cellule est décrit par la tonicité du fluide extracellulaire. Par exemple, si les concentrations de solutés imperméables dans les fluides intracellulaires et extracellulaires sont les mêmes, aucune osmose nette ne se produira. Dans ce cas la solution extracellulaire est dite isotonique («tension égale»). Si une cellule est placée dans une solution avec une concentration de solutés imperméables supérieure au fluide intracellulaire (par exemple, les cellules du sang humain dans l'eau de mer), l'eau s’écoulera hors de la cellule et dans le fluide extracellulaire, provoquant la


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cellule à se rétrécir et à créner. Dans ce cas, le fluide extracellulaire est dit être hypertonique ("une plus grande tension"). Inversement, si une cellule est placée dans une solution avec une concentration de solutés imperméables inférieure (par exemple, l'eau distillée), l’eau s’écoulera vers l’intérieur de la cellule, ce qui provoque son gonflement jusqu’au point où la cellule peut subir une lyse. Dans cette situation, le fluide extracellulaire est dit être hypotonique. L’OSMOLARITÉ L’osmose est entraînée par des différences dans les rapports entre les solutés et les solvants qui existent à travers une membrane semi-perméable. La concentration totale de soluté d'une solution (et donc la concentration osmotique) peut être quantifiée par l’osmolarité de la solution. L'osmolarité est le rapport du total des moles de particules de soluté par litre de solution. L'unité pour cette mesure de la concentration est osmolaire (OsM), où 1 OsM est égale à une mole totale de particules de soluté par litre de solution. Si la solution contient un soluté unique qui ne peut pas se dissocier, tel que le glucose, l'osmolarité de la solution est égal à la molarité de la solution. Toutefois, si la solution contient un soluté ionique qui peut se dissocier, tel que le NaCl, cela aura une influence considérable sur la concentration osmotique. Par exemple le NaCl se dissocie facilement dans l'eau en Na+ et Cl-. Ainsi, pour chaque mole de NaCl dans une solution, il y aura deux moles de particules de soluté (1 mole de Na+ et une mole de Cl-). Donc l’osmolarité d’une solution qui contient 1 mole de NaCl représenterait une solution de 2 osmoles. L’OSMOLARITÉ Vs LA TONICITÉ Contrairement à l’osmolarité, la tonicité est seulement influencée par les concentrations de solutés imperméables. Par exemple, une solution de glucose de 300 mM, une solution d’urée de 300 mM, et une solution de NaCl de 150 mM ont toutes la même osmolarité; 300mOsM. Mais, si une cellule avec une concentration interne de 300mOsM était placée dans chacune de ces solutions, elle se comporterait de manière très différente. Dans une solution de NaCl de 150 mM, la cellule serait iso-osmotique et isotonique relativement à son environnement. La pression osmotique serait donc égale des deux côtés de la cellule et celle-ci maintiendrait le même volume. Par contre, dans le cas de l’urée, qui est très perméable à travers la plupart des membranes, l’environnement extracellulaire serait iso-osmotique, mais hypotonique relativement à l’intérieur de la cellule. Donc la cellule gonflerait rapidement dût à l’entrée de l'urée et de l'eau.


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EXERCICE 1.1 : DIFFUSION, OSMOSE ET TONICITÉ CHEZ LES GLOBULES ROUGES (Groupes de 2) Matériel Sang de mouton- 3 mL 50% (v/v) Glycérol (MM : 92g/mole) 1 M NaCl (MM : 58g/mole) 50% (m/v) Sucrose (MM : 342g/mole) 100 mL d'eau Éprouvettes Méthode

1. Préparer trois séries de 6 éprouvettes; une série pour chaque soluté. 2. Pour chacune des séries, préparer à partir des solutions mères des solutions d’un volume final

de 2mL qui représentent les concentrations de solutés suivantes : Série 1 : Sucrose: 0.32 M, 0.25 M, 0.15M, 0.08M, 0.04M et 0.0M Série 2: NaCl: 0.16 M, 0.12 M, 0.08M, 0.04M, 0.02M et 0.0M Série 3 : Glycérol : 0.5 M, 0.4 M, 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M et 0.0M

3. Ajouter à chaque éprouvette 0.1 mL de sang de mouton, puis mélanger. 4. Préparer un témoin positif en ajoutant 2 mL d’eau à 0.1mL de sang de mouton, puis mélanger. 5. Attendre pour 15 à 20 minutes. 6. Bien mélanger chaque éprouvette, puis transférer 1 mL des suspensions à des tubes de

microcentrifuges étiquetés. 7. Centrifuger pour 30 secondes à vitesse maximale dans la microcentrifuge. 8. Transférer 0.2mL de chaque tube de microcentrifuge aux puits d’une plaque de 96 puits. 9. Faire la lecture de la plaque à une longueur d’ondes de 540 nm. Calculer le pourcentage d’hémolyse sous chaque condition : % d’hémolyse = 100 X [(Absorbance de l’échantillon) ÷ (Absorbance du témoin positif)]


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CROISSANCE MICROBIENNE EN LABORATOIRE Dans leurs milieux naturels, non seulement le nombre de microorganismes est-il relativement bas, mais en outre plusieurs espèces cohabitent habituellement au même endroit. Par exemple, le bout de vos doigts est probablement recouvert d’au moins dix différentes espèces microbiennes à des niveaux relativement bas (entre quelques centaines à quelques milliers). De plus, les conditions optimales requises pour la croissance d'une espèce microbienne donnée (par exemple les exigences d'alimentation, de température, de pH, etc.) sont extrêmement diverses. En tenant compte de ces caractéristiques, les microbiologistes ont développé plusieurs stratégies aptes à permettre l'étude des microorganismes. MILIEUX MICROBIOLOGIQUES Il est habituellement peu pratique d'étudier un microorganisme dans son environnement naturel. Par exemple, il serait impensable d’examiner l'effet d'un antibiotique nouvellement développé sur la croissance d'un pathogène bactérien chez l’être humain. En outre, l'effet sur l’espèce bactérienne visée serait difficile à interpréter compte tenu de l'hétérogénéité des populations bactériennes présentes. Par conséquent, des méthodes ont été établies pour croitre les bactéries en laboratoire en utilisant une variété de milieux de croissances, synthétiques ou non. Les milieux de croissances sont disponibles sous forme liquide, semi-solide ou solide. Des milieux de culture semi-solides et solides sont obtenus en ajoutant au milieu de croissances liquides des agents de solidification. L'agent de solidification le plus commun est l’Agar, un polysaccharide dérivé d’une algue. L’Agar possède plusieurs propriétés avantageuses : 1) il est facilement liquéfiable par ébullition et il sa forme liquide est maintenue à des températures aussi basses que 45°C, 2) l'Agar se solidifie à des températures en dessous de 45°C et enfin, 3) la plupart des bactéries ne le digèrent pas. Un autre agent de solidification est la gélatine. Son utilisation est moins commune puisque plusieurs espèces bactériennes la digèrent. Les milieux de culture liquides sont souvent appelés « bouillons de culture ». Les milieux solides peuvent être soit sous la forme de géloses ou de pentes. Tous les milieux de culture doivent inclure les substances nutritives nécessaires pour la croissance bactérienne. D'autres conditions, telles la température et la présence ou l'absence d'oxygène, sont contrôlées par des équipements spéciaux, comme un incubateur. Ces conditions permettent aux microbiologistes de croitre et de maintenir des grands nombres de bactéries, requis pour des études expérimentales.


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INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES : ÉTALEMENT L’étalement est une des méthodes les plus communes pour l’inoculation de milieu solide avec des liquides. Il permet de répandre les bactéries de façon égale sur la surface d’une gélose. L’instrument utilisé est un étaleur de verre communément appelé « bâton de hockey ». Notez que l’étaleur doit être stérilisé préalablement avant chaque utilisation.

o STÉRILISATION DE L’ÉTALEUR

Afin de stériliser l’étaleur, ce dernier est trempé dans l’éthanol, allumé, puis on laisse bruler l’éthanol. Ne pas garder l’étaleur dans la flamme, car il deviendra trop chaud! On permet ensuite à l’étaleur de refroidir, puis il est utilisé pour étaler l’échantillon de bactéries sur la surface de la gélose.

Bâton de hockey

Éthanol

Tremper l’étaleur dans l’éthanol Allumer l’éthanol Étaler les bactéries Permettre à l’éthanol

de bruler


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EXERCICE 1.2 : COMPTE VIABLE D’UN ÉCHANTILLON DE SOL (Groupes de 2) Matériel 1g de terre Flacon avec 100 mL d'eau stérile 100 mL d'eau stérile 3 éprouvettes stériles 3 géloses TSA 3 géloses d'Agar de Sabouraud avec dextrose qui contient 100 µg/mL de chloramphénicol 3 géloses d’Agar de glycérol avec extrait de levure Méthode 1. Transférez 1g de terre au flacon qui contient 100 mL d'eau stérile. (Ceci représente une

dilution de 10-2) Agiter sur la plateforme agitatrice pour 10 minutes. 2. Laisser la terre sédimenter pendant 10 minutes. 3. Préparer des dilutions dans de l’eau de 10-3, 10-4 et 10-5 dans un volume final de 10mL. (voir

la figure ci-dessous) 4. Étaler 0.1 mL de chacune des trois dilutions les plus élevées sur 3 géloses TSA étiquetées de

façon appropriée. 5. Étaler 0.1 mL de chacune des trois dilutions les plus élevées sur 3 géloses d'Agar de

Sabouraud avec dextrose étiqueté de façon appropriée. 6. Étaler 0.1 mL de chacune des trois dilutions les plus élevées sur 3 géloses d’Agar de glycérol

avec extrait de levure étiquetée de façon appropriée. 7. Incuber les géloses inversées à la température de la pièce jusqu’à la semaine prochaine.

1g de terre +

100 mL d’eau

Dilution 10-2

10-3 10-4 10-5

0.1ml 0.1ml 0.1ml


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LABO NO 2

Horaire

13h - 14h Exercice 2.0 : Préparation des réactions de PCR 14h – 15h Cours 15h – 16h Exercice 2.1 16h – 16h30 Exercice 2.0 : Préparation du gel d’agarose 16h30 – 17h30 Exercice 2.3 – 2.4 17h30 – 18h Exercice 2.0 : Chargement et migration des gels d’agarose 18h – 18h30 Exercice 2.5 LES COLIFORMES Coliformes totaux : des petits bacilles de la famille des Enterobacteriacae qui fermentent le lactose à 37oC avec formation d’acide et de gaz en 48 heures. Elles incluent des bactéries résidentes de l’intestin des mammifères et de l’environnement tel qu’Escherichia coli, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Citrobacter sp., Serratia sp., Shigella sp., et Proteus sp. Coliformes fécaux (Escherichia coli): seule bactérie coliforme qui n'est pas retrouvée naturellement hors de l’environnement intestinal. Sa présence est donc une excellente indication de contamination fécale. Mais, leurs viabilités réduites en dehors de son environnement naturel font qu’un test négatif n’est pas nécessairement indicateur d’une absence de contamination fécale. TECHNIQUE MOLÉCULAIRE POUR ÉVALUER LA PRÉSENCE DE MICROBES Une alternative aux comptes viables est d’utiliser des techniques de biologie moléculaire afin de déterminer la présence de microorganismes. Une de ces techniques est la PCR. EXERCICE 2.0 : DÉTECTION DE COLIFORMES PAR PCR (Groupes de 2) Matériel Cocktail de PCR : Tampon Taq (2X), 5.0mM MgSO4, 400µM dNTP, 4µM de chacune des amorces contre LacZ (Garder sur glace) Dilution de 10-5 dans de la saline d’un bouillon d’E.coli Tubes de PCR à paroi minces Tubes de microcentrifuge Saline Eau stérile Amorces : LacZfor : GTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGG LacZrev : CTGTAGCGGCTGATGTTGAACTGGA


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Méthode (PCR) 1. Préparer en utilsant de la saline comme diluant des dilutions de 10-1 et 10-3 de la suspension

d’E.coli fournit. 2. Transférer 1 mL de chacun de vos échantillons (échantillons non-dilué, 10-1 et 10-3 ) à des

tubes de microcentrifuge étiquetés. Assurez-vous de garder le restant pour des expériences ultérieures.

3. Préparer un quatrième tube de microcentrifuge qui contient 1 mL du témoin positif. 4. Centrifuger les tubes de microcentrifuge à vitesse maximale pour 5 minutes. 5. Déverser le surnageant, puis ajouter 50µL d’eau stérile. 6. Mélanger vigoureusement au vortex pendant 20 sec.. 7. Bouillir pour 5 minutes. Placez sur glace pour 1 minute. 8. Centrifugé à vitesse maximale pour 5 minutes. Vous utiliserez le surnageant pour votre

analyse par PCR. 9. Transférer 25µL de chacun de vos échantillons à des tubes de PCR étiquetés. 10. Ajouter 25µL du cocktail de PCR à chacun des tubes de PCR. 11. Amener vos tubes de PCR à l’avant. Les aides enseignants ajouterons 0.5 µL de polymérase

Taq à chaque tube et ferrons la PCR. 12. Vos réactions vous seront retournées une fois la PCR terminée. Conditions d’amplifications par PCR: 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer. 35 cycles de 30sec, 94oC dénaturation; 1 minute à 68oC appariement et extension. 1 cycle de 5min, 72oC. Refroidir à 4oC, indéfinie. MIGRATION SUR GEL D’AGAROSE (Groupes de 4) L’électrophorèse sur gel d’agarose implique la séparation de molécules d’ADN d’après leurs tailles et leurs conformations. La migration électrophorétique d’un fragment d’ADN dans l’agarose est inversement proportionnelle au logarithme de sa taille. Suite à l’électrophorèse, les gels sont visualisés sous des ultras violets et photographiés avec une caméra numérique. L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité (et la longueur) de l’ADN linéaire. Le bromure d’éthidium, qui est utilisé comme colorant des gels d’agarose afin de pouvoir observer l’ADN sous lumière UV, est un agent cancérigène potentiel. Toujours porter des gants pour manipuler tout ce qui en contient. La source de lumière UV est aussi très dangereuse pour la peau et surtout pour vos yeux, assurez-vous donc de bien vous protéger (gants, sarrau) lorsque vous observez vos gels d’agarose. Matériel Appareil d’électrophorèse Agarose Tampon de chargement 5X Tampon TBE 10X Réactions de PCR


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Méthode (Électrophorèse) 1. Préparer dans votre cylindre gradué 200mL de tampon TBE à une concentration finale de

1X. Assurez-vous de bien mélanger. 2. Mélanger la quantité appropriée d’agarose pour obtenir une concentration finale de 1.0% m/v

dans 25mL de tampon TBE de 1X. 3. Pour dissoudre l’agarose, chauffé aux micro-ondes (25-45 secs.). Recouvrir le flacon d’une

pellicule de plastique afin de minimiser l’évaporation). Lorsque l’agarose sera complètement dissout, laissez refroidir jusqu’à 50-60oC (à peu près 5 minutes).

4. Ajoutez 50 µL d’une solution mère de bromure d’éthidium à 1mg/mL (ATTENTION! CANCÉRIGÈNE!) et bien mélanger.

5. Versez l’agarose dans le support à gel. Après avoir versé le gel, placer le peigne de 10 puits (Capacité du puits est approx. 12µL). Refermez le couvercle de l’appareil et laissez solidifier le gel pour au moins 15-20 minutes.

6. Une fois le gel solidifié, retirez les barrages noirs puis versez une quantité suffisante du tampon TBE 1X dans l’appareil pour recouvrir le gel d’environ 0.5cm.

7. Soigneusement, enlevez le peigne. 8. Obtenir vos réactions de PCR. Ajouter 10 µL du tampon de chargement d’ADN à chaque

réaction. 9. Charger 10μL de chacune de vos réactions. 10. Faire l’électrophorèse à 100V. 11. Après l’électrophorèse, examiner votre gel aux ultras violets et prendre une photo pour votre

analyse. LES COMPTES LES PLUS PROBABLES

Une variante des comptes viables dépend de la probabilité pour déterminer le nombre de bactéries dans un échantillon. Comme les comptes viables, cette méthode nécessite la croissance dans un milieu approprié. Mais, contrairement aux comptes viables, la détection est fondée sur la présence ou l’absence de croissance ou la production d’un produit ultime.

Afin de comprendre la théorie du nombre le plus probable (NPP), pensez à des dilutions en série de facteurs 10 desquelles des échantillons de 1mL sont inoculés dans différents tubes qui contiennent un milieu donné.

Après l’incubation, les bouillons sont observés pour la présence ou l’absence de croissance. Théoriquement, si au moins un organisme était présent dans n’importe lequel des inocula, une croissance visible devrait être observée pour ce tube. Si le bouillon inoculé à partir de la dilution 10-3 démontre de la croissance, mais que le bouillon inoculé à partir de la dilution 10-4 n’en démontre pas, il est donc possible de dire qu’il y avait plus de 1X103 organismes par mL dans l’échantillon original, mais moins que 1X104 par mL.

Les bactéries ne sont que rarement, ou même jamais, distribuées de façon uniforme dans un échantillon. Par exemple, si un échantillon de 10mL contient un total de 300 organismes, pas toutes les aliquotes de 1 mL contiendront 30 organismes; certains contiendront plus ou moins de 30 organismes, mais en moyenne tous les dix aliquotes dans l’échantillon entier de 10mL sera 30. Ceci est tout aussi vrai pour n’importe lesquelles des dilutions desquelles des inocula sont pris.

Pour augmenter la précision statistique de ce type de test, plus d’un bouillon est inoculé pour chaque dilution. Le NPP standard utilise un minimum de 3 dilutions et 3, 5 ou 10 tubes par dilution. Après l’incubation, le patron de tubes positifs et négatifs est noté.


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Dans l’exemple suivant, des jeux de 3 tubes de bouillons sont inoculés avec 1 mL à partir de chacune des dilutions de facteur 10 qui ont été faites avec une suspension de terre à 1 g de terre/100mL.

Après l’incubation, le nombre de tubes qui démontrent de la croissance est enregistrée et exprimé en tant que le nombre de tubes positif sur le nombre total de tubes pour cette dilution. Par exemple, pour la dilution 10-3, le résultat serait exprimé comme 2/3. À un certain point, les dilutions sont si élevées, qu’aucun organisme ne se retrouvait dans l’inoculum de tous les tubes pour ces dilutions. Dans ce cas-ci, le résultat serait exprimé comme 0/3. Détermination du NPP Lorsque plus de trois dilutions sont utilisées dans une série de dilutions décimales, utiliser les résultats à partir de seulement trois d'entre elles pour déterminer le NPP. Pour sélectionner les trois dilutions à utiliser afin de déterminer l'indice NPP, déterminez la plus haute dilution (l'échantillon le plus dilué) qui donne des résultats positifs dans les trois échantillons testés (donc 3/3) et pour lesquels il n'existe pas de dilution plus faible (échantillon moins dilué) donnant des résultats négatifs. Utiliser les résultats pour cet ensemble de dilutions et les deux prochaines dilutions supérieures pour déterminer l'indice NPP à partir du tableau sur la page suivante. (Voir les exemples "a" et "b" ci-dessous) Si aucune des dilutions données n’a toute des tubes positifs, alors sélectionnez les trois plus faibles dilutions pour lesquelles la dilution du milieu contient le plus grand nombre de tubes positifs, comme dans l'exemple « c » et « d ». Si après avis suivi cette règle, il y a une série qui possède des résultats positifs dans une dilution plus élevée que les trois choisies, ajouter le résultat à la dilution la plus élevée comme dans l’exemple « e ».

Exemple 100 10-1 10-2 10-3 Combinaison de positifs Indice NPP/ mL a 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9.3 b 3/3 2/3 1/3 0/3 3-2-1 15 c 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 3.0 d 1/3 1/3 2/3 0/3 1-2-0 11 e 1/3 2/3 0/3 1/3 1-2-1 15

Ayant déterminé l'indice NPP, diviser ce nombre par la dilution centrale de la série. Par exemple dans l'exemple "a", vous obtiendrez 9.3/10-2 = 9.3 X 102.

1g de terre +

100 mL d’eau

Dilution 10-2

Inoculum : 1mL de 10-2 0.1mL de 10-2 1mL de 10-4 0.1mL de 10-4 1mL de 10-6 Résultats : +++ +++ + - + + - - - - -


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Tubes Pos. NPP/g (mL)

Tubes Pos. NPP/g (mL)

0.10 0.01 0.001 0.10 0.01 0.001 0 0 0 1100


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EXERCICE 2.1 : NPP DE COLIFORMES DANS VOTRE ENVIRONNEMENT (Groupes de 2) Principe : Le test présomptif est spécifique pour la détection des bactéries coliformes. Des aliquotes d’eau mesurée à tester sont ajoutés à un bouillon de fermentation du lactose contenant une fiole inversée de collecte de gaz (Tube Durham). Puisque ces bactéries sont capables d'utiliser le lactose comme source de carbone (d'autres organismes entériques ne le sont pas), leur détection est facilitée par l'utilisation de ce milieu. Les tubes de chaque groupe sont ensuite inoculés avec le volume désigné de l'échantillon testé. Le développement de gaz dans l'un des tubes est une présomption de la présence de bactéries coliformes dans l'échantillon. Le test présomptif permet également au microbiologiste d’estimer le nombre d’organismes présents au moyen du test du nombre le plus probable (NPP). Le NPP est estimé en déterminant le nombre de tubes dans chaque groupe qui montre de l'acide et du gaz suite à la période d'incubation. Bouillon lauryl-tryptose. Ce milieu contient des peptones comme source de carbone et d'azote ainsi que d'autres nutriments. En outre, ce milieu contient du lactose comme un glucide fermentescible et du lauryl sulfate de sodium qui inhibe la croissance des organismes autres que les coliformes. Une fiole inversée est incluse pour détecter l'accumulation de gaz. Un test positif, l'accumulation de gaz après une période d'incubation de 48 heures à 37 °C indique la présence présumée de coliformes. Matériel Suspensions non-dilué et dilué d’E.coli 3 Éprouvettes stériles 9 bouillons de 5mL de lauryl-tryptose Eau stérile Méthode 1. Faire un compte NPP tel qu’indiqué ci-dessous dans 3 jeux de 3 tubes qui contiennent 5mL

de bouillon lauryl-tryptose. 2. Incuber à la température de la pièce jusqu’à la prochaine session de labo.

Échantillon Volume d’inoculum Vol. du milieu 3 tubes Non-dilué (fournit) 1.0 mL 5 mL

10-1 1.0 mL 5 mL 10-3 1.0 mL 5 mL


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EXERCICE 2.2 : COMPTES BACTÉRIENS DANS LE SOL (Groupes de 2) La semaine passée vous avez fait des comptes viables d’un échantillon de sol. Parmi les différents microorganismes dans le sol, les bactéries sont les organismes cultivables les plus nombreux (les virus sont plus nombreux, mais sont difficiles à cultiver, car ils requièrent une hôte appropriée). Les genres prédominants sont Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, et Streptomyces. Arthrobacter et les Streptomyces qui sont des actinomycètes qui produisent des cellules semblables aux moisissures. Notez que les résultats que vous obtiendrez seront dépendants du milieu utilisé. Les milieux pour l'isolation des bactéries ne sont habituellement pas idéaux pour la croissance des moisissures, tandis que ceux utilisés pour les moisissures ont souvent des antibiotiques pour inhiber la croissance bactérienne. Matériel Comptes viables du sol sur gélose TSA de la semaine passée Méthode 1. Obtenir vos géloses TSA sur lesquelles vous avez fait les étalements de différentes dilutions

d’un échantillon de sol. 2. Compter le nombre d’UFC observé pour chacune des dilutions. Enregistrer ces nombres dans

votre cahier de laboratoire. 3. Entreposer ces géloses à 4oC jusqu’à la semaine prochaine.

EXERCICE 2.3 : COMPTES DES ACTINOMYCÈTES DANS LE SOL (Groupes de 2) Matériel Comptes viables du sol sur géloses d’Agar de glycérol et d’extrait de levure de la semaine passée Méthode 1. Obtenir vos géloses d’Agar de glycérol et d’extrait de levure sur lesquelles vous avez fait les

étalements de différentes dilutions d’un échantillon de sol. 2. Compter le nombre d’UFC observé pour chacune des dilutions. Enregistrer ces nombres dans

votre cahier de laboratoire.


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LES FUNGI Contrairement aux bactéries, les champignons sont des organismes eucaryotes et ils sont classés en deux groupes principaux; les levures et les moisissures. Ces groupes peuvent facilement être distingués sur la base de l'aspect macroscopique des colonies. Les levures produisent des colonies humides, crémeuses, opaques ou pâteuses, tandis que les moisissures produisent des colonies pelucheuses, cotonneuses, ou poudreuses. Ces microorganismes sont utiles aussi bien que dérisoires pour les êtres humains. Utiles parce qu'ils produisent de nombreux antibiotiques, des produits naturels et sont utilisés dans les procédés industriels de fermentation. Ils peuvent être nocifs, car ils peuvent provoquer des maladies humaines, produire des substances toxiques ainsi qu’être dérisoires pour les récoltes agricoles. Il est donc très important d'étudier les espèces de moisissures. La branche de la science qui traite de l'étude des espèces des moisissures est appelée mycologie. Contrairement aux comptes bactériens, les comptes viables des fungi sont estimés à partir de géloses qui ont entre 10-50 UFC. EXERCICE 2.4 : COMPTES DES FUNGI DANS LE SOL (Groupes de 2) Matériel Comptes viables du sol sur géloses d'Agar de Sabouraud avec dextrose de la semaine passé Méthode 1. Obtenir vos géloses d’Agar de Sabouraud avec dextrose sur lesquelles vous avez fait les

étalements de différentes dilutions d’un échantillon de sol. 2. Compter le nombre d’UFC observé pour chacune des dilutions. Enregistrer ces nombres dans

votre cahier de laboratoire.


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INOCULATION DES MILIEUX SOLIDES: STRIES POUR COLONIES SIMPLES Faire des stries pour colonies simples est une méthode plus élaborée de stries utilisée pour générer des cultures pures où seulement qu’un organisme est présent. Il existe plusieurs méthodes différentes pour générer des cultures pures. Ces méthodes reposent généralement sur le principe de dilutions pour isoler l'organisme désiré de tous les autres. Prenons par exemple une population de millions d'individus à partir de laquelle vous ne voudriez en choisir qu'un seul. Si vous pouviez diviser la population de telle façon à ce qu'il y ait dans un secteur que quelques individus, il vous serait plus facile de choisir et d’isoler l'individu qui vous intéresse. Comme mentionnée ci-dessus, la dilution d’une culture hétérogène de départ génère habituellement des cultures pures. Les stries pour colonies simples permettent d’accomplir cela. Les stries peuvent être faites à partir de milieu solide ou liquide, contrairement aux étalements qui sont toujours faits à partir d’un milieu liquide. L’instrument utilisé dans ce cas-ci est la boucle d’inoculation, qui est essentiellement un fil de fer utilisé pour faire la prise de bactéries. Ne pas confondre cet instrument avec l’aiguille d’inoculation qui possède une extrémité droite plutôt qu’une boucle. Avant d’utiliser la boucle, celle-ci doit être stérilisée. Pour ce faire, placer la boucle dans la flamme du bruleur Bunsen jusqu’à ce qu’elle devienne rouge. Permettre à la boucle de refroidir pour une minute avant de l’utiliser. NE PAS LA DÉPOSER SUR LA TABLE. Une fois refroidie, ramassé des bactéries de la culture sur gélose fournie. Attention de ne pas en ramasser trop.


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La procédure est essentiellement comme suit : initialement, des bactéries sont ramassées d’un bouillon ou d’un milieu solide avec la boucle d’inoculation. Les bactéries sont ensuite striées sur une région de la gélose, ainsi les diluants. La boucle et ensuite stériliser encore une fois puis utilisée pour strier une nouvelle région de la gélose en ramassant des bactéries de la strie originale, la diluant donc encore plus. (Voir la figure ci-dessous). Notez : vous devez stériliser la boucle entre chaque série de stries et vous ne devez pas retourner à la source.


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EXERCICE 2.5 : STRIES POUR COLONIES SIMPLES (Individuellement) Matériel Géloses de comptes viables du sol 2 géloses TSA Méthode 1. Chaque personne doit faire une isolation pour colonies simple à partir d’une colonie

bactérienne et d’une colonie des actinomycètes. 2. À l’aide de la boucle d’inoculation stérile, ramasser un peu d’une colonie de vos comptes

viables du sol et strier la gélose TSA comme illustrée dans le premier panneau de la figure sur la page précédente. STÉRILISER VOTRE BOUCLE après cette série de stries initiale.

3. Faire une deuxième série de stries avec la boucle stérile telle qu’illustrée. 4. Répéter autant de fois que possible en vous assurant de stériliser la boucle entre chaque série

de stries pour isoler des colonies simples. 5. Sur une nouvelle gélose, répéter la procédure pour l’isolation de colonies simples à partir

d’une colonie d’actinomycètes. 6. Placer les deux isolations pour colonies simples à l’endroit désigné pour qu’elles soient

incubées à la température de la pièce.


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LABO NO 3

Horaire

13h - 14h Cours 14h – 14h30 Exercice 3.0 14h30 – 15h Exercice 3.1 15h – 15h30 Exercice 3.2 15h30 – 17h Exercice 3.3 EXERCICE 3.0 : NPP DE COLIFORMES DANS VOTRE ENVIRONNEMENT (Groupes de 2) Matériel Bouillons NPP de la semaine passée Méthode 1. Examiner vos bouillons pour la présence ou l’absence de croissance et de gaz. 2. Remplir le tableau ci-dessous pour indiquer vos résultats.

Dilution Croissance : Tube 1 2 3


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Y

Y

COMPTES DIRECTS (Lame d'hématimètre) Comme le nom l’indique, un compte direct implique l’énumération directe du nombre de microorganismes présents dans un échantillon, sans avoir à les faire croitre a priori. Il est important de noter qu'un compte direct ne permet pas de distinguer les microorganismes vivants de ceux qui sont morts. Cette méthode implique l’utilisation d’une lame spéciale, lame d'hématimètre, qui possède une cellule de comptage avec un volume fixe et connu. Une lame d'hématimètre standard possède deux cellules de comptage identiques burinées dans le verre, qui sont constituées de neuf carrés aux dimensions de 1 mm2 chacun (1 mm X 1 mm; voir la figure). Lorsque la lame d'hématimètre est recouverte d'une lamelle, l'espace libre disponible est d’une profondeur de 0.1 mm. Le volume de chaque carré est donc de 0.1 mm3 ou 10-4 cm3. Une fois que l'échantillon à dénombrer est appliqué, les cellules sont visualisées et énumérées. Les cellules dans chacun de trois carrés de tailles moyennes sont comptées. La moyenne est ensuite calculée et le nombre total de cellules dans l'échantillon original est déterminé. Exemple de calcul: Si l'on compte 10, 14 et 6 cellules dans trois carrés indépendants, l'on a une moyenne de 10 bactéries par carré. Ce nombre équivaut à avoir 10 bactéries/0.1 mm3 ou 10 bactéries/0.0001 cm3 ou 10 bactéries/0.0001 mL La concentration de bactéries dans l'échantillon examiné est donc de 1 X 105/mL. Hématimètre


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EXERCICE 3.1 : COMPTE DIRECT D’UNE SUSPENSION DE LEVURE (Groupes de 2) Matériel Suspension de levure Lame d'hématimètre Eau stérile Tubes Pipettes Pasteurs/micropipette Méthode 1. Préparer les dilutions suivantes dans de l’eau de la suspension de levure : 10-1, 10-2, et 10-3.

Assurez-vous de bien mélanger la suspension avant de faire vos prélèvements. 2. Remplir la cellule de comptage de la lame d'hématimètre avec un échantillon de la dilution la

plus élevée (voir l’image ci-dessous ou demander à un aide enseignant de vous le démontrer). Assurez-vous de bien mélanger la suspension avant de faire vos prélèvements.

3. Compter le nombre de cellules dans chacun de trois carrés de la taille indiquée par un « Y » dans l’image sur la page précédente.

4. Si le nombre de cellules est trop petit, recommencer avec la dilution précédente. Si le nombre de cellules est trop élevé, préparer une dilution plus élevée d’un facteur de 10.

5. Inscrire les informations suivantes dans votre cahier de labo : Nombre de cellules comptées par carré, dimension du carré choisi, dilution utilisée.


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VISUALISER LES MICROORGANISMES La microbiologie c'est l'étude de très petits organismes, micro-organismes, qui ne peuvent pas être observés à l’œil nu. Afin de les observer et d’étudier leurs caractéristiques morphologiques, il est donc nécessaire d’examiner des amas de cellules - visualisation macroscopique de colonies ou de visualiser des cellules individuelles à l'aide d'un microscope. Il y a plusieurs groupes d'organismes qui entrent dans cette catégorie, y compris les bactéries, les algues, les champignons et les protistes. Dans ce groupe, il y a plusieurs espèces intéressantes pour les humains en raison de leur capacité à causer des maladies ou leur utilisation dans l'industrie alimentaire. L'accent au cours du semestre sera sur les bactéries. VISUALISATION MACROSCOPIQUE – MORPHOLOGIES COLONIALES L’identification préliminaire des microorganismes peut être fondée sur la morphologie coloniale. Chaque colonie simple représente une population de cellules bactériennes originaire d'une seule et unique cellule qui, après de multiples cycles de division cellulaire, a généré une colonie de cellules s’empilant les unes sur les autres selon une forme caractéristique au type bactérien (tout comme un amas de bananes a une apparence différente d’un amas de pommes de terre). La morphologie d'une colonie bactérienne est une fonction de plusieurs facteurs telle que la forme de la cellule, sa taille et sa physiologie. Il est aussi important de noter que les colonies d'un type bactérien donné ont souvent des couleurs, des textures et des odeurs distinctes. Référez-vous à la figure ci-dessous pour distinguer les morphologies des colonies observées. EXERCICE 3.2 : MORPHOLOGIES COLONIALES (Groupes de 2) Matériel Comptes viables du sol sur géloses TSA de la semaine passée Méthode 1. Obtenir vos géloses de TSA sur lesquelles vous avez fait les étalements de différentes

dilutions de sol. 2. Examiner les différentes morphologies coloniales observées. 3. Inscrire dans votre cahier de laboratoire les différents nombres de bactéries appartenant à

chaque morphologie distincte observée.

Élévation

Convexe Bombé Élevée Bossue Cratère

Forme

Circulaire Irrégulière Filamenteuse Rhizoïde


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VISUALISATION MICROSCOPIQUE Les microscopes optiques utilisés dans ce laboratoire sont binoculaires et ont des lentilles oculaires avec un grossissement de 10X. En plus de cet agrandissement, il y a aussi quatre lentilles d'objectifs différents que vous pouvez choisir - 4X, 10X, 40X et 100x. Le grossissement de l'objet étant visionné est le produit de l'objectif d'oculaire multiplié par l'objectif de la lentille utilisée. Par exemple, lorsque vous regardez un objet avec la lentille de l'objectif 4X, l'objet est amplifié un total de 40X. L'objectif le plus élevé pour les microscopes est 100X, qui a un grossissement de 1000X. Avec cet objectif, il est nécessaire de placer une goutte d'huile sur le dessus de la lame et d'immerger la lentille. La lentille à immersion d'huile (100X) est spécialement scellée et C'EST LE SEUL L'OBJECTIF QUI DOIT ÊTRE PLACÉ DANS L'HUILE! L'importance d'une manipulation et d'une utilisation appropriée du microscope est indispensable. Il est essentiel que vous nettoyiez les microscopes avant et après utilisation. Utilisez un nouveau KimWipe pour essuyer délicatement les lentilles oculaires, puis essuyez les lentilles 10X, 40X, et 100X. S'il y a un excès d'huile sur le microscope, assurez-vous de l'enlever. Si vous avez du mal à enlever l'huile, utilisé le nettoyant pour microscope fourni. Visualiser un spécimen 1. Utilisez le bouton de réglage macrométrique (1) pour déplacer la platine à son plus bas

niveau. 2. Nettoyez toutes les lentilles de l'objectif. 3. Avant l'utilisation, nettoyer le dessus et le dessous des lames avec des KimWipes. 4. Ajuster le condenseur (2) à son plus haut niveau. Allumez la lampe. 5. Tournez les objectifs jusqu'à ce que l'objectif 10X clique en place. 6. Placer la lame sur la platine de sorte qu'elle soit maintenue dans le dispositif de serrage du

porte-lame. La lame doit reposer à plat sur la platine. En utilisant les boutons de déplacement de la lame (3), ajuster la position de la lame de sorte a ce que le spécimen soit dans le centre exact de la lumière passant à travers du condenseur.

7. Tout en regardant à travers les oculaires (PAS À L'ÉCRAN DE L'ORDINATEUR), ajuster la largeur entre les oculaires jusqu'à ce qu'un seul champ circulaire soit visible simultanément avec les deux yeux. L'intensité lumineuse est un aspect essentiel de la microscopie.

8. Pour une visualisation optimale, la lumière doit être adaptée à chaque grossissement. Toujours ajuster la lumière tout en regardant à travers des oculaires. a. Initialement, réglez l'intensité lumineuse (4) à un niveau faible/moyen. La zone de

visualisation entière (champ) doit être remplie de lumière. La zone éclairée peut devenir plus petite en faisant la mise au point ou en changeant le grossissement.

b. Trouver le mince levier noir de l'iris du diaphragme (5) sous la platine. Régler ce levier pour un niveau d'éclairage moyen/ bas. L'iris du diaphragme devra être ajusté avec des grossissements plus élevés.

9. À faible puissance (10X), LENTEMENT faire la mise au point avec le bouton de réglage macrométrique jusqu'à ce que le spécimen soit en vue. Ajustez la lumière selon les besoins.

10. Faire la mise au point avec le bouton de réglage micrométrique et en ajustant la lumière. 11. Avant de passer à l'objectif suivant, déplacer la lame de sorte a ce que le spécimen désiré se

trouve dans le centre du champ.


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1 2

3

4 5

Utilisation de l'huile d'immersion à 100X Huile d'immersion est utilisé avec l'objectif 100X, car elle augmente la résolution. L'huile doit entrer en contact à la fois avec la lentille de l'objectif 100X et la lame. 1. Assurez-vous que le spécimen soit dans le CENTRE EXACT du champ de vision de

l'objectif 40X. 2. Faites pivoter l'objectif 40X, mais ne cliquez pas encore l'objectif 100X en place. 3. Mettez une petite goutte d'huile d'immersion sur la lame directement sur la lumière. 4. Tournez la tourelle jusqu'à ce que l'objectif à immersion d'huile 100X soit cliqué en place. 5. NE PAS UTILISER LE BOUTON DE RÉGLAGE MACROMÉTRIQUE LORS DE

LA MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 100X! SEULEMENT UTILISER LE BOUTON DE RÉGLAGE MICROMÉTRIQUE!

6. Ajustez la lumière pour une visualisation optimale.

Tiré de: http://coolessay.org/docs/index-32428.htmL


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Problèmes courants Le champ est sombre Est-ce que la lumière est allumée? L'objectif est-il bien cliqué en place? Le diaphragme est-il ouvert? Est-ce que la lame est à plat sur la platine? Vous n'êtes pas sûr si vous visualisez de la saleté sur la lentille de l'objectif ou le spécimen. Utilisez les boutons de la platine pour légèrement déplacer la lame tout en regardant à travers les oculaires. Si ce que vous visualisez ne bouge pas, c'est probablement de la poussière ou de la saleté sur l'objectif. Si cela bouge, c'est sur la platine. Tourner l'oculaire doucement entre vos doigts. Si ce que vous visualisez a tourné, c'est probablement de la saleté sur l'oculaire. Vous ne pouvez pas trouver le spécimen. Est-ce que le spécimen est directement sur la lumière? Est-ce que la lame est sécurisée et à plat sur la platine? Avez-vous commencé avec un objectif de faible grossissement et fait la mise au point avec cet objectif en premier? Avez-vous réglé la lumière? Est-ce que vous tournez les boutons de réglage trop rapidement? Travaillez lentement, de sorte que vous ne manquez pas l'échantillon. Rappelez-vous, les bactéries ressemblent à de très petits points à faible grossissement. Vous éprouvez des difficultés à faire la mise au point. Toujours commencer par la mise au point ici d'abord. Faire la mise au point LENTEMENT! Il est très facile d'aller au-delà du spécimen si les boutons de réglage sont tournés trop rapidement. Assurez-vous de regarder dans l'oculaire (PAS À L'ÉCRAN DE L'ORDINATEUR) pendant que vous faites la mise au point les boutons de réglage ou que vous changez l'intensité lumineuse. Ajustez la lumière. Vous perdez l'échantillon lors du passage de l'objectif 40X à l'objectif à l'huile immersion. Est-ce que le spécimen est dans le centre exact du champ avant de passer à l'objectif 100X? Est-ce que l'objectif 100X est propre? Avez-vous réglé la lumière? Avez-vous fait la mise au point de l'image avec le réglage micrométrique?


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EXERCICE 3.3 : VISUALISATION MICROSCOPIQUE DES BACTÉRIES - COLORATIONS SIMPLES (Groupes de 2) Les cellules microbiennes sont incolores et donc difficiles à visualiser. Donc, plusieurs méthodes de colorations ont été développées pour visualiser et classifier les microorganismes. Les types de colorations sont généralement classifiés comme simples ou différentiels. Dans le cas des colorations simples, un seul colorant non spécifique et non discriminatoire, tel que le bleu de méthylène, est utilisé afin d’examiner les morphologies et les agrégations cellulaires bactériennes au microscope. (Voir la figure sur la page 42) Matériel Stries pour colonies simples de la semaine passée Lames Colorants Méthode 1. Préparer des frottis des colonies bactériennes et d’actinomycètes. 2. Utiliser une boucle d’ensemencement stérile pour transférer une goutte d'eau sur une lame de

microscope. Ensuite, utiliser une boucle d'inoculation stérile pour transférer des bactéries (TRÈS PEU) d'une colonie choisie à la goutte d’eau sur la lame de microscope.

3. Suspendre les bactéries dans la goutte d’eau et étaler sur une petite surface de la lame. 4. Laisser les frottis s’assécher complètement à l’air sur votre table de travail. 5. Fixer vos frottis bactériens en les passants rapidement dans la flamme du brûleur Bunsen.

Ne chauffez pas trop vos lames!! Les bactéries brûlées ne se colorent pas bien.


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6. Assembler votre station de coloration comme suit : Tapis de papier absorbant (côté plastique en dessous) Contenant pour la coloration (« Gladware »)

7. Déposer vos lames au-dessus des ouvertures du contenant « Gladware ». Ajouter une goutte de bleu de méthylène.

8. Laisser le colorant sur les frottis pour approximativement 30 secondes. 9. Rincer l’excédent du colorant avec de l'eau distillée. 10. Assécher en tamponnant la lame entre les couches de papier absorbant. 11. Examiner au microscope et faire la prise de photos numériques. Sauvegardé. Jetez vos solutions des colorations dans les tonneaux fournis à cet effet.

NE PAS DÉVERSER LES COLORANTS DANS LES ÉVIERS


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MORPHOLOGIES CELLULAIRES BACTÉRIENNES

Neisseria

Micrococci Micrococci


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LABO NO 4

Horaire 13h - 14h Cours 14h – 15h Exercice 4.0 15h – 16h Exercice 4.1 16h – 16h15 Exercice 4.2 VISUALISATION MICROSCOPIQUE - COLORATION DE GRAM Précédemment, vous avez fait des colorations simples qui vous ont permis de comparer les tailles, les formes et les agrégations cellulaires. Plusieurs autres méthodes de colorations ont été développées qui se disent différentielles. Ces méthodes colorent les bactéries de façon différentielle en fonction de différentes propriétés de la cellule. Le docteur Christian Gram a développé une technique de coloration différentielle, la coloration de Gram. La coloration de Gram permet non seulement d'observer la forme et la taille des bactéries, mais aussi de les classifier dans un de deux groupes : Gram positif ou Gram négatif.

La technique de coloration de Gram utilise quatre composés chimiques: Le violet de cristal, un colorant primaire qui teint bleu toutes les cellules sans distinction, l’iode de Gram, qui s’associe avec le colorant primaire agissant comme un mordant, l’éthanol, qui cause la déshydratation des parois cellulaires et le Safran, un colorant qui teint rouge toutes les cellules sans distinction. L’ajout séquentiel de ces 4 composés aura pour effet de colorer en mauve (Gram positif) ou en rouge (Gram négatif) les bactéries, selon leur espèce.

Le potentiel différentiel de la coloration de Gram est une fonction de la composition des parois cellulaires des bactéries. Typiquement, les bactéries Gram positives possèdent des parois cellulaires très épaisses, composées de 10-20 couches de peptidoglycanes. Les bactéries Gram négatives ont plutôt des parois cellulaires relativement minces constituées de 1-3 couches de peptidoglycanes qui sont recouvertes d’une couche de lipides. L’étape critique dans la technique de la coloration de Gram, qui lui confère ses propriétés discriminatoires, est le rinçage à l'éthanol. Dans le cas d’organismes Gram positifs, la paroi des cellules est très facilement déshydratée en raison de l’absence de lipides : ces cellules ont donc tendance à conserver le complexe d'iode de Gram/violet de cristal. Par contre, la paroi des organismes Gram négatifs n’est pas facilement déshydratée par l'éthanol en raison de la couche de lipides, ce qui lui permet de conserver une grande perméabilité. Ainsi, le traitement à l'éthanol réussit à laver efficacement les complexes d'iode de Gram/violet de cristal, rendant les cellules incolores. Ces cellules apparaissent donc rouges.


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EXERCICE 4.0: COLORATION DE GRAM (Groupes de 2) Matériel Lames de microscope Bouillon de S. aureus et d’E. coli Colorants Méthode 1. Préparer des fr

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