La recherche d’une flore - Canopé Bordeaux :...

2Chapitre

1. Pré-enrichissement 34

2. Enrichissement sélectif 34

3. Isolement sélectif sur milieu gélosé sélectif et discriminatif 34

4. Test de discrimination rapide : uréase rapide 36

5. Identification biochimique 36

6. Sérotypage 36

7. Envoi au CNR 38

N°1 Recherche de Streptococcus pyogenes dans un prélèvement de gorge 40

N°2 Recherche de staphylocoques à coagulase positive dans un aliment pour bébé à base de poudre de lait 42

N°3 Recherche de Candida albicans dans une crème cosmétique 44

N°1 Sérotypage des Salmonella 45

N°2 Sérogroupage des streptocoques 48

N°3 Tests de pathogénicité de Staphylococcus aureus 49

N°4 Identification de Candida albicans 52

La recherche d’une floreparticulière

Les objectifs du programmeLa mise en œuvre de la démarche prendra appui sur des exemples contextualisés qui seront choisis parmi les thématiques de projet. La dernière étape proposée sera étudiée en lien avec la partie « Analyse immunologique des échantillons biologiques ».

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Chapitre 2 La recherche d'une flore particulière

34 35

Dans le cadre de la recherche des Salmonella dans un aliment, deux isolements sélectifs sur deux milieux gélo-sés différents sont ensuite réalisés à partir du bouillon d’enrichissement sélectif. La norme ISO 6579 impose le milieu XLD (Xylose-Lysine-Désoxycholate) et un autre milieu sélectif : gélose SS (gélose Salmonella Shigella), gélose Hektoen…Tous ces milieux contiennent du désoxycholate comme inhibiteur des bactéries d’origine non intestinale, un ou plusieurs glucides (lactose, saccharose, salicine, xylose), du thiosulfate et du citrate de fer pour la mise en évi-dence du caractère H2S.

Ces milieux sont donc tous : - sélectifs de bactéries d’origine intestinale dont font partie les Salmonella ;

- discriminatifs (mise en évidence de caractères biochi-miques spécifiques aux Salmonella comme la dégrada-tion ou non de tel ou tel glucide, la réduction du thio-sulfate et la production d’H2S).

Après 24 heures d’incubation à 37 °C en aérobiose, on peut y observer des colonies suspectes (document 2 ).

Dans le cadre de la recherche des Salmonella dans un ali-ment, cette étape est réalisée en transférant une aliquote du bouillon de pré-enrichissement dans un bouillon sé-lectif : bouillon au sélénite, bouillon de Rappaport-Vassi-liadis ou bouillon de Müller-Kauffman au tétrathionate.L’objectif de l’étape d’enrichissement sélectif est de fa-voriser la croissance des bactéries du genre Salmonella

tout en inhibant la croissance des autres bactéries. Après incubation (24 h à 37 °C), les Salmonella (si elles sont présentes dans l’aliment) se retrouvent alors majoritaires dans le bouillon utilisé.Un enrichissement sélectif permet une augmentation si-gnificative et spécifique du nombre de micro-organismes recherchés.

Dans le cadre de la recherche des Salmonella dans un ali-ment, cette étape est réalisée en Eau Peptonée Tampon-née (EPT) : c’est un milieu liquide, non sélectif, qui per-met la croissance des bactéries sans exigences nutritives particulières, ce qui est le cas des Salmonella. On réalise une suspension en EPT à partir de la masse (volume) d’aliment exigée par la réglementation. Après incubation (24 h à 37 °C), le nombre de bactéries non exigeantes a augmenté dans le milieu, dont les Salmonella (si elles sont présentes initialement dans l’aliment).

Un pré-enrichissement permet : - une revivification des micro-organismes présents dans l’échantillon et ayant été stressés par des traitements au froid, à la chaleur, par une exposition à des biocides ou par la dessiccation ;

- une augmentation non spécifique du nombre de tous les micro-organismes présents dans la masse (volume) de produit analysé (si cette étape dure suffisamment longtemps pour permettre la multiplication).

L’expression « recherche d’une flore particulière » signifie que l’analyse doit permettre de mettre en évidence dans l’échantillon la présence d’un micro-organisme spéci-échantillon la présence d’un micro-organisme spéci- la présence d’un micro-organisme spéci-fique, le plus souvent pathogène, même s’il n’est présent qu’en très faible quantité ; le résultat de l’analyse est la présence ou l’absence dans l’échantillon du micro-orga-nisme recherché.Les grandes étapes de cette recherche sont illustrées par

la recherche de Salmonella dans un aliment (norme ISO 6579) (document 1 ). L’ensemble de ces étapes se justifie notamment par le fait que : - le nombre de Salmonella (micro-organisme pathogène strict) est en général faible dans l’aliment ;

- les critères microbiologiques pour sa recherche dans les aliments sont « absence dans x g » (avec x = 25 le plus souvent).

1. PRÉ-ENRICHISSEMENT

2. ENRICHISSEMENT SÉLECTIF

3. ISOLEMENT SÉLECTIF SUR MILIEU GÉLOSÉ SÉLECTIF ET DISCRIMINATIF

La recherche d'une flore particulière

34 35

1 La recherche de Salmonella dans un aliment

37 °C - 18 h

Ensemencement d'une galerie d'identification.

Repérage des colonies suspectes. Réalisation éventuelle d’un test uréase rapide.Isolement sur gélose ordinaire de 5 colonies suspectes si possible.

37 °C - 24 h

2 des boîtes à 37 °C et 2 autres à 42 °C - 24 h

0,1 mL du bouillon de préenrichissement dans 10 mL de bouillon de Rappaport-Vassiliadis.

Pour chaque bouillon d'enrichissement, isolement sur :

• 2 géloses XLD obligatoirement et• 2 géloses Hektoen par exemple

(ou autre milieu, 2 boîtes par milieu ).

37 °C - 24 h

1 mL du bouillon de préenrichissement dans 10 mL de bouillon de Müller-Kauffman.

41,5 °C - 24 h

37 °C - 24 h

eau f OMA OMB

O 6,7,8 O 8 H c

Un test de mise en évidence de la présence de Salmonella peut être utilisé à ce stade.Le travail ne sera poursuivi qu'en cas de positivité.

Identification.Si Salmonella est identifiée : sérogroupage.

Prise d'essai de 25 g (ou x mL/g) placée dans 225 mL (9x mL)d'eau peptonée tamponnée (préenrichissement ).

Pré-enrichissement

Enrichissement sélectif

Isolement sur milieu sélectif

Repiquage des colonies suspectes et test discriminatif

Identification biochimique

Sérotypage

2 Aspect de colonies sur les milieux Hektoen et XLD

Gélose Hektoen Colonies de Salmonella et d'E. coli

Le principe de lecture est fondé sur la fermentation éventuelle des trois glucides présents dans le milieu (lactose, saccharose, salicine). Les micro-organismes qui fermentent au moins l’un d’entre eux forment des colonies de couleur « saumon », les autres donnant des colonies bleues ou vertes (voire incolores). En présence de thiosulfate de sodium, les micro-organismes producteurs de sulfure d’hydrogène donnent, avec le citrate ferrique, des colonies à centre noir.Les Salmonella donnent des colonies incolores à vertes (glucides -) à centre noir (H2S +).Les E. coli donnent des colonies « saumon » (glucides +, H2S -).

Gélose XLDColonies de Salmonella et d'E. Coli

Les Salmonella sont xylose +, lactose et saccharose -, LDC + et H2S +.Après avoir utilisé le xylose (acidification initiale peu importante mais suffisante pour induire l’expression de la lysine-décarboxylase = LDC), les Salmonella décarboxylent la lysine en cadavérine (par l’intermédiaire de leur LDC), ce qui provoque une réalcalinisation du milieu. Les colonies de Salmonella qui se développent sont donc de couleur rouge en présence de rouge de phénol (indicateur coloré de pH de couleur rouge à pH neutre ou alcalin).En milieu alcalin, la réduction du thiosulfate en présence de citrate de fer ammoniacal par les Salmonella productrices de sulfure d’hydrogène, se manifeste par un noircissement dû à l’apparition de sulfure de fer au centre des colonies. Les Salmonella donnent donc des colonies rouges à centre noir.L’utilisation du lactose et du saccharose entraîne une production d’acidité importante faisant virer le rouge de phénol à sa couleur jaune. Cette acidité ne peut pas être neutralisée par la production de cadavérine. Les souches lactose +, saccharose +, qu’elles soient LDC + ou LDC- donnent donc des colonies jaunes (Ex : E. Coli).


36 37

En cas d’identification biochimique de Salmonella dans le produit alimentaire contrôlé, un sérotypage doit obli-gatoirement être mis en œuvre afin de connaitre le séro-type auquel appartient cette souche bactérienne (intérêt épidémiologique) (cf. Fiche technique n°1 p. 46).En effet, des travaux récents sur la taxonomie, en parti-culier par hybridation de l’ADN, ont permis de conclure que le genre Salmonella ne comportait que deux espèces, Salmonella enterica et Salmonella bongorii. L’espèce Sal-monella enterica comprend 6 sous-espèces mais la presque totalité des souches responsables de gastro-entérites hu-maines (99,8 %) appartiennent à la sous-espèce dénom-mée enterica (Salmonella enterica subspecie enterica).Les sous-espèces sont subdivisées en près de 2 500 séro-types sur la base de leurs antigènes (Ag) de paroi « O »,

de flagelle « H » et de capsule « Vi » qui sont recherchés à l’aide d’anticorps (Ac) spécifiques. Le sérotype majo-ritaire dans les gastroentérites est Typhimurium (ubiqui-taire), suivi par le sérotype enteritidis (filière œuf ). Ces deux sérotypes représentent 70 % de tous les isolements de Salmonella.Le document 5 présente les principes généraux du sé-rotypage.

Le sérotypage, technique immunologique, permet d’identifier des antigènes microbiens à l’aide d’anticorps spécifiques (immunsérums).Le document 6 p. 38 retrace les étapes de la recherche d’un micro-organisme dans un échantillon polymicro-bien.

Dans le cadre de la recherche de Salmonella dans un pro-duit alimentaire, on met en œuvre à partir de 5 colo-nies suspectes (avec ou sans test de discrimination), la démarche suivante : - ré-isolement sur gélose ordinaire de chacune des 5 co-lonies suspectes dans le but de procéder, après incu-bation, à différents tests ou examens : vérification de

la pureté et des exigences nutritives, étude macros-copique complète, étude microscopique et recherche d’activité enzymatique d’orientation rapide (oxydase) ;

- ensemencement d’une galerie d’identification biochi-mique classique ou miniature API 20E, à partir des colonies obtenues sur gélose ordinaire (document 4 ).

Dans le cadre de la recherche des Salmonella, ce test (fa-cultatif ) permet une discrimination rapide des colonies suspectes.En effet les genres bactériens Proteus-Providencia-Mor-ganella sont des Entérobactéries de la flore digestive nor-male, qui donnent des colonies identiques à celles des Salmonella sur les milieux sélectifs utilisés et qui sont susceptibles d’être présentes dans un produit contaminé par Salmonella. Mais ces genres bactériens présentent une forte activité uréase (uréase dite rapide) alors que les Salmonella sont uréase -. Ce test effectué sur des colonies

suspectes (glucides -, H2S + ou -) permet de faire la dis-tinction. Le document 3 montre les résultats comparés d’un test uréase rapide positif et négatif. Il est à noter que ce test n’est pas demandé dans la norme ISO 6579 pour la recherche des Salmonella dans les aliments.

Un test de discrimination rapide permet de différencier (rapidement) les colonies suspectes des autres colonies sans intérêt particulier, indication précieuse pour savoir s’il est nécessaire de poursuivre l’analyse.

4. TEST DE DISCRIMINATION RAPIDE : URÉASE RAPIDE

5. IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE

6. SÉROTYPAGE

Ces colonies peuvent correspondre à des colonies de Sal-monella si elles présentent les caractères biochimiques suivants : - lactose - / saccharose - / salicine - (sauf Salmonella Ari-zonae qui présente le caractère lactose +) ;

- H2S + (ou plus rarement -) ; - LDC +.

L’étape de l’isolement sélectif permet d’obtenir des colo-nies suspectes ayant des caractères culturaux, macrosco-piques et biochimiques spécifiques de l’espèce recherchée.Voir p. 38 : « Les milieux chromogènes et la recherche de Salmonella ».


36 37

- +

Le test est réalisé à l’aide du milieu urée-tryptophane (aussi appelé urée-indole) ense-mencé richement avec la colonie à tester et incubé 30 min., à 2h, à 37°C.. La coloration rouge traduit une alcalinisation du milieu (visible grâce au rouge de phénol) suite à l’hydrolyse de l’urée et à la formation de carbonate d’ammonium : test uréase positif.Si le milieu reste orangé, il n’y a pas d’alcalinisation : test uréase négatif (cas des colonies de Salmonella).

5 Principes généraux du sérotypage

Lors d’un sérotypage, une souche bactérienne pure préalablement identifiée au niveau de l’espèce par des caractères morphologiques, culturaux et biochimiques, est mise en présence d’anticorps spécifiques. Si la bactérie possède les anti-gènes recherchés, des complexes immuns (complexes Ag-Ac) se forment. On observe alors une agglutination.

Les principaux types d’antigènes recherchés sont :- les antigènes « O » : Ag glucidiques présents au niveau du LPS de la membrane externe de bactéries Gram - comme

E. coli, Salmonella,…- les antigènes « H » : Ag protéiques présents au niveau des flagelles de bactéries mobiles comme E. coli, Salmonella,…- les polyosides « C » présents dans la paroi des Streptocoques (Ag recherchés sous forme soluble après extraction

enzymatique) ;- les antigènes de capsule : Ag « Vi » des Salmonella, Streptococcus pneumoniae.

Technique sur lame (agglutination qualitative directe)À réaliser avec gants et lunettes de protection, dans un environnement non aseptique (pas de flamme stérilisante). En plus des essais, il faut prévoir un témoin de non autoagglutination de la souche en eau distillée.

1. Identifier la lame en y marquant la spécificité des Ac utilisés.

.

2. Homogénéiser le flacon contenant les Ac (sérum) et déposer une goutte sur la lame.

3. Y dissocier totalement une fraction de colonie prélevée avec du matériel à usage unique.

Si l’agglutination est fine et régulière, conclure à la présence de l’antigène X recherché.

X

X

X

X

3 Test uréase rapide

4 Résultat d’une galerie API 20E ensemencée avec Salmonella spp


38 39

Dans le cadre de la recherche des Salmonella dans un aliment, la souche bactérienne identifiée comme une Salmonella doit être envoyée dans un centre de référence ; en France, le Centre national de référence (CNR) des Salmonella, situé dans l’Unité des bactéries pathogènes entériques à l’Institut Pasteur, participe à la surveillance des salmonelloses. Chaque année, le CNR expertise de 8 000 à 10 000 souches de Salmo-nella provenant d’environ 1 500 laboratoires français (laboratoires d’analyses de biologie médicale et labo-ratoires de centres hospitaliers). Il a un rôle de premier plan en cas d’épidémie, en alertant la Direction géné-épidémie, en alertant la Direction géné-géné-éné-rale de la santé et l’Institut de veille sanitaire dès qu’un nombre important de cas est signalé et en participant à l’enquête épidémiologique.

Les milieux chromogènes et la recherche de SalmonellaActuellement sont développés des milieux chromogènes (SMID, Ram-bach, Compass) basés sur la détermination d’activité(s) enzymatique(s) particulière(s) et notamment des estérases, qui entrainent l’hydrolyse d’un substrat chromogène présent dans le milieu. Le substrat chromogène hydro-lysé donne aux colonies de Salmonella une couleur caractéristique.Des milieux chromogènes sont développés pour la recherche de nombreux micro-organismes spécifiés comme par exemple :- milieu TBX agar pour la recherche ou le dénombrement de E. coli, bacté-rie ß-glucuronidase positive qui donne des colonies bleues (cf. chapitre 3, activité 2 ;

- milieu CHROMagarTM Listeria pour la recherche ou le dénombrement de Listeria monocytogenes. Les colonies de Listeria monocytogenes se recon-naissent à leur couleur bleu et sont entourées d’un halo blanc (ce halo est lié à l’activité d’une phospholipase impliquée dans le processus infectieux des souches de Listeria pathogène).

Colonies de Salmonella (rose fuschia) etd’E. coli (bleues) sur gélose Rambach

7. ENVOI AU CNR 6 Les étapes de la recherche d'un micro-organisme dans un échantillon polymicrobien


38 39

La recherche des Salmonella par PCR quantitative

La PCR (Polymerase chain reaction) (cf. thème 6) est une technologie qui permet d’amplifier spécifiquement un segment d’ADN via l’hybridation d’amorces spécifiques : à partir d’un exemplaire de ce segment, on obtient après n cycles, 2n exemplaires tous identiques entre eux et identiques au segment initial. L’amplification permet alors de détecter la présence de ce segment dans un échantillon à analyser. De plus, si ce segment est spécifique d’une bactérie donnée, sa présence permet de conclure à la présence de la bactérie.

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

Séparation par dénaturation thermique (95 °C) des deux brins de la molécule d’ADN initiale. En jaune : segment spécifique à amplifier.

Hybridation des amorces spécifiques.

Élongation des amorces par une ADN polymérase ther-morésistante. À l’issue d’un cycle on obtient 2 copies du segment spécifique.

Lors d’une PCR quantitative, en plus de révéler la présence du segment d’ADN spécifique, on peut le quantifier dans l’échantillon. On peut en effet suivre en continu l’amplification spécifique du segment d’ADN en détectant la fluorescence émise par un agent intercalant, le SybrGreen, fortement fluorescent lorsqu’il est intercalé dans une double hélice d’ADN.Lors de l’amplification, il va s’insérer dans les produits de PCR (amplicons = segments d’ADN obtenus in vitro). L’accroissement de la fluorescence sera proportionnel à l’intégration du Sybr-Green donc à l’amplification du segment d’ADN spécifique.

Un seuil de fluorescence est défini et le nombre de cycles de PCR nécessaire pour l’atteindre est mesuré. On appelle Ct ou cycle thres-hold, le cycle où l’intensité de fluorescence émise dépasse le bruit de fond (= ligne de base).Si un segment d’ADN spécifique est présent, l’intensité de la fluorescence émise dépassera forcément le bruit de fond. Plus le nombre de segments présents dans l’échantillon est grand, plus le Ct est atteint rapidement. Le Ct permet de déterminer la quantité de segments d’ADN spécifiques présents dans l’échan-tillon.

Cette technologie est beaucoup plus rapide que l’analyse microbiologique classique. On peut par exemple obtenir un résultat en 18 heures pour la recherche de Salmonella dans un lait au lieu de 4 à 5 jours par la méthode classique.

3’

3’3’

5’

5’5’

Phase plateau

Phase d’initiation

Phase exponentielle

Nombre de cycles PCR

Inte

nsité

du

sign

al fl

uore

scen

t ém

is

Ligne de baseLigne seuil

Ct (cycle seuil)0 5 10 15 20 25 30 35 40 5045

SybrGreen

émission de fluorescence


40 41

PRÉSENTATIONLes streptocoques hémolytiques du Groupe A (SGA) correspondent à l’espèce Streptococcus pyogenes. Ce sont des bactéries exigeantes en facteurs de croissance, hémolytiques, anaérobies aérotolérantes, catalase -.Les SGA sont responsables d’environ 20 % des angines. Avant l’avènement des antibiotiques, ces angines à SGA étaient à l’origine de complications graves (glomérulonéphrite aiguë, rhumatisme articulaire aigu). C’est la raison pour laquelle la mise en place de procédures de bon usage des antibiotiques impose de traiter systématiquement les angines à SGA par

antibiothérapie adaptée et donc de savoir les reconnaître.Le diagnostic microbiologique classique d’une angine est effectué à partir d’un prélèvement de gorge réalisé par écouvillonnage des amygdales.

QUESTIONS1. Le technicien décide de réaliser un frottis à partir de

l’écouvillonnat et de le colorer par la coloration de Gram. Le résultat de son observation est présenté sur la photographie 1 .1.1. Expliquer le principe de la coloration de Gram à

l’aide du document 2 .

2 La coloration de Gram : différenciation des bactéries selon la nature de leur paroi

Les étapes de la coloration de gram

violet de gentiane (30 sec) rinçage à l’eau

lugol (1 min) rinçage à l’eau

décoloration à l’alcool rinçage à l’eau

safranine (30 sec) rinçage à l’eau séchage

Gram + violet Gram - rose

Paroi des Gram+Acidestéichoïques

Acidelipotéichoïque

Paroi

Membraneplasmique

PhospholipidesProtéineintrinsèque

Peptidoglycane

Paroi des Gram -

Lipopolysaccharide Polysaccharide

Lipide A

Lipoprotéine de Braun

Peptidoglycane

Protéine intrinsèque

Membrane plasmique

Espace périplasmique

Membrane externe

Porine

Paroi

Protéine intrinsèque

Phospholipides

1 Bactéries observées à la coloration de Gram (x1000)

ACTIVITÉ 1 RECHERCHE DE STREPTOCOCCUS PYOGENES DANS UN PRÉLÈVEMENT DE GORGE


40 41

1.2. Faire une description la plus complète possible des bactéries observées.

2. L’écouvillonnat est ensuite mis en culture sur gélose Columbia au sang + ANC (acide nalidixique et colistine, antibiotiques surtout actifs sur les bactéries Gram -). La photographie 3 montre l’aspect des colonies observées après 24 heures d’incubation à 37 °C en atmosphère enrichie en CO2.2.1. Justifiez le choix de la gélose Columbia au sang +

ANC pour réaliser cette mise en culture.2.2. Pourquoi l’incubation est-elle réalisée dans une

enceinte enrichie en CO2 ?2.3. Faire une description macroscopique la plus

complète possible du résultat obtenu après culture.2.4. Ces colonies peuvent-elles correspondre à des

colonies de Streptococcus pyogenes ? Justifier.

3. Le technicien réalise une recherche de catalase sur les colonies suspectes.La catalase catalyse la réaction de décomposition de H2O2 en H2O + ½ O2. Pour rechercher sa présence, le technicien prélève une colonie suspecte avec une anse stérilisée et met en contact les bactéries avec de l’eau oxygénée (H2O2).3.1. Comment lit-on un résultat catalase + ?3.2. Le sang frais est pourvu d’une activité catalase.

Quelle précaution doit prendre le technicien lors de la réalisation de ce test pour éviter la présence de faux résultats positifs ?

3.3. Les bactéries du genre Streptococcus tolèrent le dioxygène mais l’eau oxygénée, espèce réactive de l’oxygène, leur est nuisible. Expliquer l’avantage de cultiver les Streptococcus sur gélose au sang frais lorsque les conditions de culture sont réalisées en aérobiose.

4. Le technicien réalise ensuite un sérogroupage sur les colonies suspectes (voir fiche technique 2 p. 48). Le document 4 présente le résultat obtenu.4.1. Quelle structure est recherchée ici ? Où est-elle

localisée dans la bactérie ? Sa recherche nécessite l’utilisation d’une enzyme d’extraction. Pourquoi ?

4.2. Faire des schémas de principe permettant d’expliquer les résultats observés dans le test A et dans le test B.

4.3. Interpréter les résultats obtenus. Conclure.

3 Colonies observées après 24 h d’incubation

4 Résultat du sérogroupage


42 43

PRÉSENTATIONLa réalisation de cette activité ne peut se faire qu’après une lecture approfondie de la fiche technique 3 p. 49 (Les tests de pathogénicité de Staphylococcus aureus).En bactériologie alimentaire, la recherche des Staphylococcus aureus est fondée sur la mise en évidence de colonies caractéristiques sur milieu spécifique, avec présence d’une enzyme particulière, la coagulase libre. Des staphylocoques autres que Staphylococcus aureus peuvent posséder cette enzyme ; aussi nous parlons maintenant de recherche de staphylocoques à coagulase positive.La recherche de la coagulase libre n’est donc pas totalement spécifique de Staphylococcus aureus. L’identification d’espèce ne peut être déterminée avec certitude que par la combinaison de plusieurs tests (coagulase libre, protéine A, récepteur au fibrinogène, thermonucléase) ou bien à l’aide d’une galerie d’identification.

Une entreprise spécialisée dans la production d’aliments pour bébé à base de poudre de lait met en œuvre la recherche de staphylocoques à coagulase positive selon la norme ISO6888-1 (organigramme 1 ).Les limites microbiologiques concernant les aliments pour bébé à base de poudre de lait sont les suivantes : « absence de Staphylococcus coagulase positive dans 1 g ». En cas de dépassement des critères microbiologiques, on doit envisager une amélioration de l’hygiène de production (notamment au niveau du personnel) et/ou de la sélection des matières premières (le lait peut être contaminé par des Staphylococcus aureus présents dans la mamelle et sur la peau des vaches infectées).

1 Recherche de staphylocoques à coagulase positive selon la norme ISO 6888-1

ACTIVITÉ 2 RECHERCHE DE STAPHYLOCOQUES À COAGULASE POSITIVE DANS UN ALIMENT POUR BÉBÉ À BASE DE POUDRE DE LAIT


42 43

2 Culture sur gélose Baird-Parker 3 La gélose Baird-Parker

La gélose Baird-Parker avec jaune d’œuf au tellurite de potassium est un milieu sélectif utilisé pour la recherche et le dénombrement de Staphylococcus aureus et pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive. La croissance des staphylocoques est favorisée par le pyruvate de sodium.La microflore secondaire est inhibée en présence de chlorure de lithium, de tellurite de potassium (ajouté extemporanément), ainsi que par la forte concentration en glycine. L’addition de sulfaméthazine après autoclavage assure l’inhibition de la presque totalité des Proteus et en conséquence limite fortement l’envahissement du milieu par ces micro-organismes.La présence de tellurite permet d’observer des colonies noires pour les micro-organismes capables de le réduire en tellure.L’enrichissement au jaune d’œuf aide à l’identification en démontrant l’action de la lécithinase (halo d’opacification suite à la précipitation du diacylglycérol) et la lipoprotéase (halo d’éclaircissement suite à la disparition des lipoprotéines).

Les colonies caractéristiques de Staphylococcus aureus sont noires ou grises, brillantes et convexes (1 à 1,5 mm de diamètre après 24 h d’incubation et 1,5 à 2,5 mm de diamètre après 48 h d’incubation) et entourées d’une zone claire. Après 24 h d’incubation, un halo opaque peut apparaître dans cette zone claire, immédiatement au contact des colonies.Les colonies non caractéristiques sont semblables en apparence, mais sont dépourvues de zone claire. Les colonies non caractéristiques sont souvent constituées de souches de staphylocoques à coagulase positive contaminant les produits laitiers.

4 Recherche de thermonucléase

Puits + milieu cœur-cervelle stérile

Puits essai

5 Test de coagglutination

Témoin de spécificité Essai

QUESTIONS1. Donner le rôle de la première étape de la norme.2. La photographie 2 montre le résultat de la culture

obtenue sur la gélose Baird-Parker (document 3 ) après 24 h d’incubation à 37 °C.2.1. Réaliser l’examen macroscopique de la gélose

Baird-Parker.2.2. Quelles sont les caractères biochimiques mis en

évidence ?2.3. Les colonies observées sont-elles considérées

comme caractéristiques ? Justifier.3. À l’issue de cette observation, le technicien décide de

poursuivre l’analyse. Comment va-t-il procéder ?4. Toutes les colonies caractéristiques repiquées en

bouillon cœur-cervelle ont donné un résultat « positif » pour la recherche de la coagulase libre. Comment se traduit un résultat « positif » pour cette recherche ?

5. Conclure sur l’aliment pour bébé analysé.6. Pour savoir si les Staphylococcus coagulase positive

sont des Staphylococcus aureus, le technicien décide de réaliser des tests complémentaires.6.1. Une recherche de thermonucléase à l’aide d’une

gélose à l’ADN + bleu de toluidine. Après lecture des résultats (photographie 4 ), le technicien conclut à la présence d’une thermonucléase.6.1.1. Qu’a-t-il déposé dans le puits essai ?6.1.2. Peut-on émettre un doute sur la conclusion

rendue par le technicien ?6.2. Test de coagglutination : le kit utilisé propose des particules de latex vierges, des particules de latex sensi-bilisées à la fois par du fibrinogène, des IgG de lapin et des Ac anticapsulaires. Le document 5 montre le résultat obtenu sur une colonie caractéristique.

6.2.1. Faire le schéma légendé d’une co-aggluti-nation positive pour la présence simultanée sur la bactérie de protéine A et de récepteur au fibrinogène.

6.2.2. Donner la composition et le rôle du témoin de spécificité.

6.2.3. Conclure sur les résultats obtenus.6.3. Conclure sur la présence (ou l’absence) de

Staphylococcus aureus. Justifier.


44 45

chloramphénicol à partir de la culture obtenue en bouillon trypticase-soja.3.1. En analysant la composition de ce milieu

(tableau 1 ), justifier son caractère sélectif et non discriminatif (non différentiel).

3.2. Décrire les colonies observées (photographie 2 ) après 48 h d’incubation à 30 °C. Leur aspect macroscopique est-il concordant avec la composition du milieu ? Justifier la réponse.

4. Le technicien décide d’identifier le micro-organisme par un test microscopique. Il réalise, à partir des colonies obtenues sur gélose Sabouraud, une suspension à peine laiteuse en eau stérile, en dépose une goutte sur milieu RAT (riz-agar-tween) et la recouvre d’une lamelle stérilisée. Après incubation (48 h à 30 °C), il

observe au microscope, sous la lamelle, les structures présentées sur la photographie 3 .4.1. Comment s’appelle le test ayant permis d’obtenir

cette observation microscopique ?4.2. Légender l’observation microscopique proposée.4.3. La structure a est une forme de résistance.

Montrer que les conditions de culture mises en œuvre vont permettre son apparition.

4.4. Conclure.5. Le technicien aurait pu effectuer un test de blastèse et

observer des tubes germinatifs. Donner un avantage et un inconvénient du test de blastèse, par rapport au test réalisé à la question précédente.

6. Conclure sur la crème cosmétique analysée.

PRÉSENTATIONLa réalisation de cette activité ne peut se faire qu’après lecture approfondie de la fiche technique 4 p. 52 « Identification de Candida albicans ».La réglementation ne prévoit pas d’autorisation préalable à la mise sur le marché des produits cosmétiques mais impose aux producteurs de garantir l’innocuité de leur produit. Afin de répondre à cette exigence, une entreprise produisant des produits cosmétiques met en œuvre le contrôle microbiologique de ses matières premières et de ses produits finis. Ces analyses comprennent :

- le dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (FMAT) ;

- la recherche et l’identification de micro-organismes spécifiés dans les produits finis au cas où la recherche de la FMAT donne un résultat non satisfaisant.

Suite au résultat du dénombrement de la FMAT d’une crème cosmétique, le laboratoire contrôle-qualité de l’entreprise décide de rechercher la présence de Candida albicans selon la norme NF EN ISO 18416 (septembre 2009). Le critère microbiologique de cette recherche pour ce type de crème est : « absence dans 0,5 g de produit ». La méthode décrite dans la présente norme repose d’abord sur la mise en culture de Candida albicans dans un milieu liquide non sélectif et enrichi (bouillon trypticase-soja) puis sur l’isolement du micro-organisme recherché sur un milieu gélosé sélectif.

QUESTIONS1. Quel est le but de la première étape de cette norme ?2. Proposer un protocole permettant de réaliser la

première étape de cette norme en fonction du critère microbiologique associé à cette recherche.

3. Le technicien du service contrôle-qualité de l’entre-prise réalise un isolement sur gélose Sabouraud +

1 Gélose Sabouraud + chloramphénicol

Peptone pepsique de viande 10,0 g

Glucose 20,0 g

Chloramphénicol (antibiotique) 0,5 g

Agar agar bactériologique 15,0 g

pH du milieu prêt-à-l’emploi à 25°C 5,7 ± 0,2

2 Colonies sur gélose Sabouraud + chloramphénicol

3 Observation microscopique

①②

ACTIVITÉ 3 RECHERCHE DE CANDIDA ALBICANS DANS UNE CRÈME COSMÉTIQUE


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FICHE TECHNIQUE 1SÉROTYPAGE DES SALMONELLA

Actuellement, on distingue deux espèces de Salmonella : Salmonella enterica (la plus courante) et S. bongori. L’espèce Salmonella enterica comprend six sous-espèces : S. enterica enterica (la plus courante), salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica. Chaque sous-espèce comprend plusieurs sérotypes. Par exemple, le nom complet de la bactérie connue sous le nom de Salmonella Typhi est Salmonella enterica subsp enterica sérotype Typhi.Les sérotypes de Salmonella (environ 2500) ont été classés par Kauffman-White.

Formules antigéniques des sérotypes de Salmonella les plus fréquents en France Extrait du tableau de Kauffmann White

Mélange O Groupe(fréquence en France) Nom usuel Antigènes O

Antigènes HPhase 1 Phase 2

OMA B (54,3 %)

Paratyphi BWien StanleyDuisburgSaintpaulReadingChesterDerbyAgonaTyphimurium BrandenburgHeildelbergCoelnEssen

1, 4, [5]1, 121,4, 12, 272

1,4, [5], 12, 27 1,4, 12, 27

1,4, [5], 12, 271,4, [5], 121,4, [5], 121,4, [5], 12

1,4, 121,4, [5], 121,4, [5], 12

1,4, 124, [5], 12

4, 12

bbdd

e, he, he, hf, g

f, g, si

i, vry

g, m

1, 2l, w1, 2

e, n, z151, 21, 5

e, n, x[1, 2]

-1, 2

e, n, z151, 21, 2

-

OMB

C (17,5 %)C1

Paratyphi CCholeraesuisIsangiLivingstoneEimsbuttelMontevideoOranienburgThompsonInfantis

6, 7 [Vi]6, 76, 76, 7

6, 7, 146, 76, 76, 76, 7

ccddd

g, m, sm, t

kr

1, 51, 51, 5l, wl, w

--

1, 51, 5

C2

MuenchenManhattanNewportBlockleyLichtfildBovismorbificans

6, 86, 86, 86, 86, 86, 8

dd

e, hk

l, vr

1, 21, 51, 21, 51, 21, 5

OMA D (17,3 %)

TyphiEnteretidisDublinGallinarum (volailles)Panama Strasbourg

9, 12 [Vi]1, 9, 121, 9, 121, 9, 121, 9, 12[9], 46

dg, mg, p

-l, vd

----

1, 5 1, 7

OMAE (7 %)

E1

MuensterAnatumMeleagridisLondonGive

3, 103, 103, 103, 10

3, 10, [15]

e, he, he, hl, vl, v

1, 51, 6l, w1, 61, 7

E4 Senftenberg 1, 3, 19 g, [s], t -

OMB G (2 %) KedougouWorthington

1, 13, 231, 13, 23

iz

l, w1, 5

OMA A (0,26 %) Paratyphi A (Afrique, Asie) 1, 2, 12 a -1 Facteurs entre crochets : peuvent être absents sans que le sérotype soit changé.2 Facteurs O soulignés : liés à une conversion phagique (lysogénique).


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Après identification du genre Salmonella par galerie biochimique, on procède au sérotypage afin d’affiner l’identification de la souche. Les antigènes recherchés sont les suivants :

- antigène O de paroi, de nature glucidique, qui appartient au LPS (lipopolysaccharide) de la membrane externe des bactéries Gram -. La recherche des antigènes O permet dans un premier temps de caractériser des groupes au sein du genre Salmonella. Par exemple, tous les sérotypes du groupe B possèdent l’Ag O:4.

- antigène H de flagelle (souches mobiles), de nature protéique. Chez un même sérotype, cet antigène peut exister sous deux formes différentes, forme de phase 1 et forme de phase 2. Généralement, dans une même colonie, certaines bactéries ont des antigènes H de phase 1, tandis que d’autres ont des antigènes H de phase 2.

- antigène Vi de microcapsule, de nature glucidique, qui re-couvre le plus souvent l’antigène O mais qui ne concerne que trois sérotypes : Salmonella Typhi, S. Paratyphi C et S. Dublin.

Antigène O (LPS de la membrane externe)

Antigène Vi (capsule)

Antigène H (flagelle)

Le sérotypage des Salmonella est réalisé grâce à une technique d’agglutination active directe sur lame, mettant en jeu les bactéries à tester avec différents antisérums. Il nécessite :• une culture pure de la souche de Salmonella sur gélose non sélective (la gélose Kligler-Hajna permet une bonne

expression des antigènes recherchés) ;• des antisérums spécifiques (obtenus par immunisation d’animaux) :

- sérum anti-Vi, - sérums anti-O qui correspondent à des mélanges d’anticorps spécifiques :

· OMA permet de rechercher les antigènes O des groupes A (O:2), B (O:4), D (O:9), E (O:3), L (O:21), · OMB permet de rechercher les antigènes O des groupes C (O:8), F (O:11), G (O:13), H (O:6,14), · OMC permet de rechercher les antigènes O des groupes I (O:16), J (O:17), K (O:18), L (O:21), M (O:28), N

(O:30), O (O:35), P (O:38), - sérums anti-O mono, di ou trivalents, - sérums anti-H polyvalents ou monovalents.

TECHNIQUE DU SÉROTYPAGEAprès avoir vérifié l’identité biochimique de la souche et sa non auto-agglutination dans l’eau physiologique :• déposer une goutte d’antisérum sur une plaque ou lame de verre parfaitement propre ;• émulsionner, à la pipette ou à l’aide d’un agitateur jetable, un peu de culture bactérienne (prélevée sur milieu gélosé)

de façon à obtenir un trouble homogène dans la goutte ;• agiter la lame par mouvements lents et circulaires ;• observer l’apparition d’agglutinats (s’aider éventuellement d’un fond noir pour une meilleure visualisation des agglu-

tinats) : - fins, granulaires et difficiles à dissocier dans le cas des antigènes O et Vi, - floconneux, faciles à dissocier dans le cas des antigènes H.


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CONDUITE DU SÉROTYPAGE DES SALMONELLA

1. Vérifier que la souche n’est pas auto-agglutinable : tester la souche en eau physiologique.

Rechercher l’antigène de capsule (Vi) : la souche avec l’antisérum anti Vi.

2. Déterminer le groupe auquel appartient la souche étudiée : rechercher les Ag O en testant d’abord les antisérums anti O mélanges « OM ».

OMA + Le groupe est A, B, D, E ou L.

OMB + Le groupe est C, F, G ou H.

OMA - et OMB -

groupe B Anti O 4,5 groupe D Anti O 9 groupe E Anti O 3,10,15 groupe A Anti O1,2

groupe C Anti O 6,7,8

3. Déterminer le sérotype au sein du groupe Rechercher les Ag H en utilisant les antisérums les mieux adaptés au groupe, en suivant également l’ordre de fréquence des sérotypes et en commençant par la phase 1.

=> tester les antisérums mono, di ou trivalents en les essayant dans l’ordre de fréquence des groupes (voir tableau de Kauffmann-White).

Si agglutination : - orienter vers S. typhi, S. paratyphi C ou S. dublin ; - éliminer l’Ag Vi en chauffant une partie de la culture 10 min à 100°C ; - recommencer le sérogroupage.

Réaliser un nouvel isolement et recommencer.

+ -

4. Envoyer au centre de référence des Salmonella (Institut Pasteur) pour confirmation du sérotype.

tester la souche avec


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FICHE TECHNIQUE 2SÉROGROUPAGE DES STREPTOCOQUES

1. PRINCIPEDans la classification de Lancefield, les streptocoques (genre Streptococcus et genre Enterococcus) sont classés en groupes selon la nature de leur polyoside C, antigène pariétal. On distingue ainsi les groupes A (dans lequel on retrouve notamment Streptococcus pyogenes), B, C, E, F, G, H, K, L, M, O, P, R, S, T, V.Certains Streptococcus ne possèdent pas ce polyoside C : ce sont les streptocoques non groupables, dont fait partie notamment Streptococcus pneumoniae. Ce dernier possède néanmoins une capsule dont l’antigène peut être mis en évidence.

Le sérogroupage des streptocoques repose sur l’identification antigénique du polyoside C par agglutination sur lame en présence de particules de latex sensibilisées avec des anticorps spécifiques de chaque groupe : antiA, antiB, antiC, antiD, antiF et antiG (groupes les plus fréquents, correspondant essentiellement à des streptocoques β- hémolytiques c’est-à-dire entrainant une hémolyse totale sur gélose au sang).

Le polyoside C est souvent recouvert de protéines, ce qui le rend inaccessible aux anticorps. Il faut donc auparavant extraire le polyoside C pour obtenir une solution antigénique. On réalise alors une réaction d’agglutination passive réverse (Ag soluble, Ac rendu artificiellement particulaire).


2. TECHNIQUE 1. Procéder d’abord à l’extraction du polyoside C (voir la notice du kit utilisé).À partir d’un isolement (le plus souvent présenté sur gélose au sang), prélever deux à trois colonies correspondant à des coques Gram +, catalase - (caractères correspondant à la famille des Streptococcaceae) et les émulsionner dans x mL d’enzyme d’extraction. Incuber 10 à 15 min à 37 °C.

2. Faire un témoin de réactivité des latex sensibilisés (latex recouvert d’Ac spécifiques) en utilisant le mélange de polyosides C donné avec le kit.

Interprétation des témoins : dans le contexte opératoire utilisé, un réseau d’agglutination se forme bien entre les particules de latex sensibilisées et le polyoside C correspondant ; les témoins sont validés.

Anti A

Anti D

Anti B

Anti F

Anti C

Anti G

3. Effectuer le groupage sur lame en mettant en contact une goutte de l’extrait préparé avec une goutte de chaque latex correspondant aux groupes suspectés. Si l’agglutination est fine et régulière, conclure à la présence du polyoside C (antigène recherché) du groupe correspondant.

Exemple : agglutination avec les particules de latex anti B => présence du polyoside C de type B => streptocoque du groupe B.

Anti A

Anti D

Anti B

Anti F

Anti C

Anti G

Pas d'agglutination

Agglutination

Polyoside C d'une spécificité donnée

Enzyme d’extraction

Latex

Bactérie

Solution antigéniquecontenant le polyoside C

Ac spécifique d'un polyoside C

Forte agglutination entre le mélange de polyosides C et chaque latex sensibilisé.


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FICHE TECHNIQUE 3TESTS DE PATHOGÉNICITÉ DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Il s’agit ici de confirmer l’identification de l’espèce Staphylococcus aureus.

1. RECHERCHE DE STRUCTURES DE SURFACE PAR RÉACTION DE COAGGLUTINATION DIRECTE

Ces recherches sont réalisées sur des colonies obtenues sur milieux sélectifs (gélose de Chapman ou de Baird-Parker) et présentant les caractères biochimiques permettant de suspecter l’espèce Staphylococcus aureus. Elles s’effectuent à l’aide de « kits » qui mettent en jeu des réactions d’agglutination sur lame pour rechercher différentes molécules de surface spécifiques de Staphylococcus aureus.

paroi

capsule

cytoplasme

antigène de capsule

récepteur au fibrinogène

protéine A

Les molécules recherchées individuellement ou simultanément sont le récepteur au fibrinogène, la protéine A et les antigènes de capsule (celle-ci recouvre les autres structures). La présence de l’une ou l’autre de ces molécules permet de confirmer l’espèce Staphylococcus aureus.

Molécule recherchée Réactif et complexe d’agglutination formé avec Staphylococcus aureus

Récepteur au fibrinogène (RF)= coagulase liée= clumping factor

Globule rouge (ou latex) sensibilisé par du fibrinogène

Staphylococcus aureus porteur de récepteurs au

fibrinogène

Agglutinat formé

Protéine A capable de se fixer au fragment constant (Fc) des immunoglobulines G (IgG) humaine et de lapin

Latex sensibilisé par des IgG de lapin (présentant leur fragment Fc vers l’extérieur)

Staphylococcus aureus porteur de protéine A

Agglutinat formé

Antigènes capsulaires de surface de S. aureus

Latex sensibilisé par des anticorps spécifiques des Ag

de capsule

Staphylococcus aureus porteur d’antigène capsulaire

Agglutinat formé


Pas d'agglutination

Agglutination


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RÉALISATION DU TEST

Sur une lame (ou cartonnette présente dans le kit) : - témoin : déposer une goutte de réactif non sensibilisé « contrôle négatif » et y dissocier une colonie suspecte ; - essai : déposer une goutte de réactif sensibilisé et y dissocier une colonie suspecte.

Agiter par inclinaison.

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS OBTENUS

• Validation du témoin : absence d’agglutination avec le « contrôle néga-tif » ; ce contrôle correspond à un témoin de spécificité permettant de s’assurer que la souche n’agglutine pas de façon non spécifique les hématies ou les particules de latex vierges.

• Agglutination avec la souche à tester : présence d’au moins une mo-lécule caractéristique de l’espèce (en fonction des kits utilisés et des souches).

Conclusion : la souche est S. aureus

EssaiTémoin de spécificité

2. RECHERCHE DE LA STAPHYLOCOAGULASE (COAGULASE LIBRE)

PRINCIPE

La coagulase libre est une enzyme produite et sécrétée dans le milieu de culture par Staphylococcus aureus. La présence de coagulase libre dans le milieu de culture provoque une coagulation du plasma de lapin, ce qui se traduit par une prise en masse (coagulum) de ce dernier.MODE OPÉRATOIRE

• À partir d’une colonie suspectée d’appartenir à l’espèce Staphylococcus aureus, réaliser une subculture en bouillon pour staphylocoagulase ou en bouillon cœur-cervelle (milieux adaptés à la production de la coagulase libre).

• Incuber 18 h à 37 °C.• Mélanger dans un tube à hémolyse 0,5 mL de plasma de lapin reconstitué et 0,5 mL de la subculture.• Incuber le mélange à 37 °C pendant 30 min à 24 h.LECTURE

• Prise en masse du plasma de lapin => coagulation de ce plasma par une coagu-lase libre (+).

• Pas de prise en masse du plasma de lapin => absence de coagulase libre (-).Les souches de Staphylococcus aureus provoquent la coagulation du plasma en un temps variant d’une demi-heure à 24 h. La prise en masse du plasma est généralement totale, au point que le tube peut être retourné. Un caillot moins compact visible avant la 24e heure doit être considéré comme positif.

3. RECHERCHE DE LA THERMONUCLÉASE (ADNase THERMORÉSISTANTE)

PRINCIPE

La thermonucléase est une ADNase thermorésistante (résistant à un traitement de 15 min à 100 °C), spécifique de l’espèce Staphylococcus aureus.MODE OPÉRATOIRE

• Chauffer 15 min à 100 °C la culture de la souche à analyser, réalisée en bouillon cœur-cervelle ; ce chauffage entraîne la mort des bactéries (formes végétatives bactériennes thermosensibles) mais pas l’inactivation de la thermonucléase (enzyme thermorésistante).

• Remplir un puits creusé dans une gélose à l’ADN et au bleu de toluidine avec la suspension bactérienne ainsi chauffée.• Incuber au moins 4 h à 37 °C.TÉMOINS DE VALIDATION À RÉALISER EN PARALLÈLE

Ensemencer des puits creusés dans une gélose à l’ADN + bleu de toluidine avec : - du bouillon cœur-cervelle stérile, pour vérifier l’absence d’interférence du bouillon avec la gélose ; - la culture bactérienne à analyser non chauffée pour la recherche d’une ADNase.

On peut aussi prévoir un témoin permettant de vérifier l’efficacité du traitement thermique. Ensemencer pour cela un puits avec la culture en bouillon cœur-cervelle chauffé d’une souche possédant une ADNase non thermorésistante.

- +


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LECTURE

La présence de bleu de toluidine permet de savoir si l’ADN a été dégradé.Le bleu de toluidine est un colorant basique ; il se fixe sur les structures acides comme les acides nucléiques ou les nucléotides. Suite à cette fixation, il peut donner des colorations orthochromatique (coloration bleue) ou métachromatique (coloration rose). La coloration métachromatique est liée à une forte densité de charges négatives. Le bleu de toluidine donne alors :

- une coloration orthochromatique bleue en présence d’ADN ; - une coloration métachromatique rose en présence de nucléotides, produits de dégradation de l’ADN.

La lecture des résultats se fait en regardant la couleur autour des puits : - couleur bleu autour du puits = ADN non dégradé ; - couleur rose autour du puits = ADN dégradé en nucléotides.

Exemple1 Puits témoin, contenant du bouillon cœur-cervelle stérile.

2 Puits témoin contenant une souche possédant une ADNase thermosensible, chauffée 15 minutes à 100°C.

3 Puits témoin, contenant la souche à étudier en bouillon cœur- cervelle non chauffée.

4 Puits essai, contenant la souche à étudier en bouillon cœur-cervelle chauffé à 100 °C pendant 15 minutes.

Si le contour du puits 1 devient rose, le test est à recommencer. Si le contour du puits 2 reste bleu, c’est que le chauffage est efficace ; le test peut continuer.Si le contour du puits 3 devient rose et que celui du puits 4 reste bleu, la souche possède une ADNase non thermostable.Si les contours des puits 3 et 4 sont roses, la souche possède une ADNase thermostable.

1

4

2

3

1

4

2

3

ADN nondégradé

ADNdégradé


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FICHE TECHNIQUE 4IDENTIFICATION DE CANDIDA ALBICANS

L’identification des levures est basée sur des caractères morphologiques (état frais ou frottis coloré au bleu de méthylène) et sur des caractères biochimiques, notamment fermentation de glucides (zymogramme) et assimilation de différentes sources de carbone (auxanogramme).Candida albicans est une levure commensale du tube digestif humain. Elle fait partie des levures les plus pathogènes pour l’homme (pathogène opportuniste). Elle est responsable d’atteintes cutanées, de lésions des muqueuses (muguet buccal, troubles intestinaux, mycoses vaginales), de septicémies. Des tests ont été mis en place pour identifier spécifiquement Candida albicans ; ce sont les tests de blastèse et de chlamydosporulation.

1. RÉALISATION D’UN AUXANOGRAMME

PRINCIPE

Un auxanogramme permet d’étudier la capacité d’un micro-organisme (bactérie ou levure) à synthétiser tous ses constituants carbonés à partir d’une source de carbone unique. On étudie pour cela la croissance du micro-organisme dans un milieu synthétique, initialement dépourvu de source de carbone assimilable et auquel on ajoute une seule source de carbone connue (glucide en général). Cette assimilation, visualisée par une croissance, est étudiée en aérobiose (voie oxydative).RÉALISATION

• Imbiber des disques avec chacune des solutions de glucide stériles à tester. Laisser sécher.• Couler la gélose pour auxanogramme dans une grande boîte de Petri stérile. Laisser prendre en masse.• Préparer une suspension de levure à 1 unité Mac Farland. La diluer au 1/100e en eau physiologique.• Ensemencer par inondation la surface de la gélose (gélose relativement molle ne supportant pas l’ensemencement par

écouvillonnage). Laisser sécher environ 15 min.• Déposer les disques sur la gélose ainsi ensemencée.• Incuber 48 h à 30 °C.LECTURE

• Si le disque contenant la source de carbone est entouré d’un halo de culture : la levure utilise le glucide comme seule source de carbone en présence des facteurs de croissance du milieu.

• Si le disque contenant la source de carbone n’est pas entouré d’un halo de culture : la levure n’utilise pas le glucide comme seule source de carbone en présence des facteurs de croissance du milieu.

RECHERCHE EFFECTUÉE EN GALERIE MINIATURISÉE API 20C AUX

La galerie API 20 C AUX est constituée de vingt cupules dont dix-neuf contiennent des substrats carbonés déshydratés qui permettent d’effectuer dix-neuf tests d’assimilation. Les cupules sont inoculées avec un milieu minimum semi-gélosé et les levures poussent seulement si elles sont capables d’utiliser le substrat carboné correspondant.La lecture de ces réactions se fait par comparaison au témoin de croissance (cupule 0) et l’identification est obtenue à l’aide du catalogue analytique ou d’un logiciel d’identification.

En comparaison au témoin de croissance (cupule 0), on peut voir que : - la levure cultive dans la cupule glucose ; elle assimile donc le glu-

cose comme seule source de carbone ; - la levure ne cultive pas dans les cupules glycérol, 2cétogluconate

et arabinose ; elle n’est donc pas capable d’assimiler ces sources de carbone.

Colonies autour de la source de carbone


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2. TEST DE BLASTÈSE (RECHERCHE DE TUBES GERMINATIFS)

RÉALISATION

• À partir d’une culture pure sur milieu gélosé de la levure à étudier, préparer une suspension d’opacité à peine visible dans 0,5 mL de milieu pour blastèse.

• Bien agiter la suspension, puis incuber à 37 °C, 3 à 4 h au maximum.

LECTURE

Observer à l’état frais la présence (ou l’absence) de tubes germinatifs, filaments plus ou moins longs dont la base large ne présente aucun étranglement (contrairement au pseudomycélium).• Si des tubes germinatifs sont observés, on peut affirmer que la le-

vure appartient à l’espèce C. albicans et l’identification s’arrête là.• Sinon, conclure que la levure n’appartient pas à l’espèce C. albi-

cans.Cependant, 2 % des souches de C. albicans ne forment pas de tubes germinatifs. C’est pourquoi, en cas de test de blastèse négatif, on réalise un deuxième test spécifique de C. albicans, le test de chlamydosporulation (recherche de chlamydospores).

3. TEST DE CHLAMYDOSPORULATIONDans certaines conditions de croissance défavorables (milieu pauvre en nutriments et supplémenté de détergent, microaérophilie), seule l’espèce Candida albicans est capable de former des chlamydospores, spores de multiplication végétative avec une épaisse paroi.

RÉALISATION

• Ensemencer le milieu RAT (Riz-Agar-Tween) ou PCB (Pomme de terre-Carotte-Bile) à l’aide d’une goutte de suspension prépa-rée avec la souche à analyser.

• Recouvrir d’une lamelle stérilisée à la flamme.• Incuber 48 h à une température comprise entre 28 et 30 °C.

LECTURE

Observer directement les boîtes au microscope, à l’objectif x40.

• Présence de formes levures uniquement, sans pseudomycé-lium, ni blastospores, ni chlamydospores : conclure à une levure n’appartenant pas au genre Candida.

• Présence de formes levures avec pseudomycélium et blastospores, sans chlamydospores : conclure à une levure appartenant au genre Candida (mais pas à l’espèce C. albicans).

• Présence de formes levures avec pseudomycélium, blastospores et chlamydospores : conclure à une levure appartenant à l’espèce C. albicans.

Présence de tubes germinatifs espèce Candida albicans

Une goutte de la suspension à peine laiteuse de levure en eau distillée.

Gélose RAT ou PCB

Recouvrir d’une lamelle stérilisée à la flamme.

Aspect d’une culture de Candida albicans lors d’un test de chlamy-dosporulation

La recherche d’une flore - Canopé Bordeaux :...

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