La recherche dans la polychondrite atrophiantedes puces à protéines -19 patients atteints de PCA...
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La recherche dans la polychondrite atrophiante Dr Makoto Miyara Département d'Immunologie: Immunochimie et Autoimmunité CIMI INSERM UMR1135 GH Pitié-Salpêtrière Samedi 22 avril 2017
Transcript of La recherche dans la polychondrite atrophiantedes puces à protéines -19 patients atteints de PCA...
La recherche dans la polychondrite
atrophianteatrophiante
Dr Makoto MiyaraDépartement d'Immunologie: Immunochimie et AutoimmunitéCIMI INSERM UMR1135GH Pitié-Salpêtrière
Samedi 22 avril 2017
Biomarqueurs pour le diagnostic de la
polychondrite atrophiante
A. Anticorps
La recherche dans la polychondrite atrophiante
B. Cellules circulantes
Biomarqueurs pour le diagnostic de la
polychondrite atrophiante
A. Anticorps
La recherche dans la polychondrite atrophiante
B. Cellules circulantes
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
• ANCA : anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles
Ann Rheum Dis. 1993 May;52(5):384-5.
Antineutrophil cytoplasmic antibodies in polychondritis.
Papo T, Piette JC, Le Thi Huong Du, Godeau P, Meyer O, Kahn MF, Bourgeois P.
Comment in
Relapsing polychondritis as a secondary phenomenon of primary systemic
vasculitis. [Ann Rheum Dis. 1993]vasculitis. [Ann Rheum Dis. 1993]
PMID: 8323388 [PubMed - indexed for MEDLINE] PMCID: PMC1005055 Free PMC
Article
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
• ANCA : anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles
• Vascularites:
• Granulomatose avec
polyangéite (de
Wegener)
• Polyangéite
microscopiquemicroscopique
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
• Manque de sensibilité
• Manque de spécificité
� Nécessité de nouveaux biomarqueurs
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
• Manque de sensibilité
• Manque de spécificité
� Nécessité de nouveaux biomarqueurs :thèse Chloé Couzin
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Auto-anticorps
• HuProt
• Cambridge Protein
Array (Mike taussig)
• 20000 autoantigens
• S.Cerviciae
• Scanner à fluorescence
Puces à protéines
• Fiable
• Contrôle
• Myosites
• Cirrhose biliaire
primitive
• Lupus
� APPLICATIONS:
� Maladies auto-
immunes
� CANCERS
Anti-Streptavidine-AFAnti-humain IgG
Fonctionnement des puces
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Anticorps
Anti-GSTAuto-Ac du sérum
Protéines
Hu Prot v2
Séries de manipulations
-Echantillons pour le contrôle de validité des puces
-Série 1 : 10 patients PCA + 1 IgIV
-Série 2 : 9 patients PCA + 7 sujets sains
Puces à protéines
Blocage
des puces
Sérum
des patients
et
anti-GST
biotynilé
GST : Glutathion-S-Transférase Auto-anticorps sérique anti-GST biotynilé IgG anti-humain Streptavidine
IgG anti-humain-
Alexa Fluor 546 et
Streptavidine-
Alexa Fluor 635
Zhu et al. 2001
Jeong et al. 2012
Scan par Tecan
LS400
Et analyse par la
logiciel ScanArray
express
Patients
-3 patients contrôles de la validité
des puces à protéines
-19 patients atteints de PCA
Deux types de contrôles
Recrutés dans les services de médecine interne
de l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière.
Patients
Deux types de contrôles
-1 lot d’IgIV Tegeline® LFB-issu d’un pool de
plasma de 20 000 donneurs
-7 Sujets sains Donneurs de sang de l’Etablissement
Français du Sang
IgIV : Immunoglobulines intraveineuse LFB : Laboratoire du Biofractionnement
IVIG PCA
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Auto-anticorps
Etape 1 : Qualité de la manipulation Etape 2 : Validité diagnostique
1er Lupus érythémateux disséminé
Anticorps anti-protéine ribosomale P2
2nd Cirrhose biliaire primitive
Anticorps anti-pyruvate déshydrogénase
Contrôles de la qualité des HuProt™
Gradient de GST
A. 633 nm B. 532 nm
Anticorps anti-pyruvate déshydrogénase
3ème Syndrome anti-synthétases
Anticorps anti-histidyl-tRNA synthétase
Dans la PCA
Auto-anticorps décrits dans la littérature
Patients toutes séries confondues
Sujets sains
IgIV
COMP
HS >2
mais
IS < 2
An
alyse
de
l’exp
ressio
n d
es H
it Sco
res
Healthy-6
Healthy-4
Healthy-1
PCA-19
PCA-15
PCA-18
PCA-16
PCA-12
PCA-17
PCA-11
Healthy-3
PCA-14
Healthy-2
Healthy-5
PCA-13
Healthy-7
PCA-2
PCA-3
PCA-10
PCA-4
PCA-8
PCA-7
PCA-9
PCA-1
PCA-6
PCA-5
IgIV
Po
ur su
pp
rime
r les cib
les p
eu
varia
ble
s
Filtra
tion
pa
r éca
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r-qu
artile
:
54
58
/22
27
2 p
roté
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s retiré
es
An
alyse
de
l’exp
ressio
n d
es H
it Sco
res
Healthy-6
Healthy-4
Healthy-1
PCA-19
PCA-15
PCA-18
PCA-16
PCA-12
PCA-17
PCA-11
Healthy-3
PCA-14
Healthy-2
Healthy-5
PCA-13
Healthy-7
PCA-2
PCA-3
PCA-10
PCA-4
PCA-8
PCA-7
PCA-9
PCA-1
PCA-6
PCA-5
IgIV
Sé
gré
ga
tion
selo
n le
jou
r
de
réa
lisatio
n d
e la
ma
nip
ula
tion
An
aly
ser sé
pa
rém
en
t
les d
eu
x sé
ries
de
ma
nip
ula
tion
s
IS > 2 n=17
≥ 2 patients n=677
HS > 2 n= 1566
Sélection des cibles protéiques
Filtre écart inter-quartile :
2 protéines retirées / 17
Analyse de l’expression des Hit Scores
15 cibles protéiques permettent de ségréger les sujets sains et les patients
Trois combinaisons d’auto-anticorps
Analyse de l’expression des Hit Scores
IS > 2 n=17
≥ 2 patients n=677
HS > 2 n= 1566
Sélection des cibles protéiques
Filtre écart inter-quartile :
2 protéines retirées / 17
Analyse de l’expression des Hit Scores
15 cibles protéiques permettent de ségréger les sujets sains et les patients
Trois combinaisons d’auto-anticorps
Analyse de l’expression des Hit Scores
Analyse de l’expression des Hit Scores
Trois combinaisons d’auto-anticorps
Trois combinaisons d’auto-anticorps
Analyse de l’expression des Hit Scores
Trois combinaisons d’auto-anticorps
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupes de patients
Individus
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
Groupes de patients
Individus
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy 1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
Groupes de patients
Individus
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy 1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
Groupes de patients
Individus
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
Groupes de patients
IndividusPCA -11 -19
PCA-12 -13 -14 -
15-16 -17 -18p
47 [44-49] 47 [36-70] n.s.
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.Durée moyenne d'évolution de la
Age moyen (années)
Patients PCA
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy 1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2
et 3
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.
37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.
Femme 1 2
Homme 1 5
Durée moyenne de conservation des
prélèvement (mois)
Durée moyenne d'évolution de la
maladie (années)
Sexe
Groupes de patients
IndividusPCA -11 -19
PCA-12 -13 -14 -
15-16 -17 -18p
47 [44-49] 47 [36-70] n.s.
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.Durée moyenne d'évolution de la
Age moyen (années)
Patients PCA
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.
37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.
Femme 1 2
Homme 1 5
Durée moyenne de conservation des
prélèvement (mois)
Durée moyenne d'évolution de la
maladie (années)
Sexe
Groupes de patients
IndividusPCA -11 -19
PCA-12 -13 -14 -
15-16 -17 -18p
47 [44-49] 47 [36-70] n.s.
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.Durée moyenne d'évolution de la
Age moyen (années)
Patients PCA
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy 1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.
37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.
Femme 1 2
Homme 1 5
Durée moyenne de conservation des
prélèvement (mois)
Durée moyenne d'évolution de la
maladie (années)
Sexe
Groupes de patients
IndividusPCA -11 -19
PCA-12 -13 -14 -
15-16 -17 -18p
47 [44-49] 47 [36-70] n.s.
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.Durée moyenne d'évolution de la
Age moyen (années)
Patients PCA
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy 1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2
et 3
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.
37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.
Femme 1 2
Homme 1 5
Durée moyenne de conservation des
prélèvement (mois)
Durée moyenne d'évolution de la
maladie (années)
Sexe
Groupes de patients
IndividusPCA -11 -19
PCA-12 -13 -14 -
15-16 -17 -18p
47 [44-49] 47 [36-70] n.s.
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.Durée moyenne d'évolution de la
Age moyen (années)
Patients PCA
Analyse de l’expression des Hit Scores
Groupe 1
PCA-14,-15,-16,-18,-12,-
13,-17
Healthy 1, 4, 5, 6, 7
Groupe 2
PCA-19-11, healthy 2 et 3
7,3 [<1-15] 8,9 [1-30] n.s.
37 [5-69] 13,3 [1-70] n.s.
Femme 1 2
Homme 1 5
Durée moyenne de conservation des
prélèvement (mois)
Durée moyenne d'évolution de la
maladie (années)
Sexe
Pas de corrélation clinico-biologique
ABI3
RAB11FIP1
MAGI1
CCDC97
TXLNB
UCN3
PRH1
Lien fort
Lien moyen
Lien faible
Sélection des cibles pour le diagnostic
Analyse de l’expression des Hit Scores
SH3BP2
RDH16
CAST
DAB1
UBA2
HS1BP3
DTNBP1
LSP1
ABI3H
ea
lth
y-6
He
alt
hy
-4
He
alt
hy
-1
PC
A-1
9
PC
A-1
5
PC
A-1
8
PC
A-1
6
PC
A-1
2
PC
A-1
7
PC
A-1
1
He
alt
hy
-3
PC
A-1
4
He
alt
hy
-2
He
alt
hy
-5
PC
A-1
3
He
alt
hy
-7
Lien faible
Lien moyen
ABI3
RAB11FIP1
MAGI1
CCDC97
TXLNB
UCN3
PRH1
Lien fort
Lien faible
Sélection des cibles pour le diagnostic
Analyse de l’expression des Hit Scores
4 cibles présentes /7
Sensibilité 78%
Spécificité 100%SH3BP2
RDH16
CAST
DAB1
UBA2
HS1BP3
DTNBP1
LSP1
ABI3
He
alt
hy
-6
He
alt
hy
-4
He
alt
hy
-1
PC
A-1
9
PC
A-1
5
PC
A-1
8
PC
A-1
6
PC
A-1
2
PC
A-1
7
PC
A-1
1
He
alt
hy
-3
PC
A-1
4
He
alt
hy
-2
He
alt
hy
-5
PC
A-1
3
He
alt
hy
-7
Lien faible
Lien moyen
ABI3
RAB11FIP1
MAGI1
CCDC97
TXLNB
UCN3
PRH1
Lien fort
Lien faible
Sélection des cibles pour le diagnostic
Analyse de l’expression des Hit Scores
3 cibles présentes/6
VPP 83%
VPN 80%SH3BP2
RDH16
CAST
DAB1
UBA2
HS1BP3
DTNBP1
LSP1
ABI3
He
alt
hy
-6
He
alt
hy
-4
He
alt
hy
-1
PC
A-1
9
PC
A-1
5
PC
A-1
8
PC
A-1
6
PC
A-1
2
PC
A-1
7
PC
A-1
1
He
alt
hy
-3
PC
A-1
4
He
alt
hy
-2
He
alt
hy
-5
PC
A-1
3
He
alt
hy
-7
Lien faible
VPP : Valeur Prédictive Positive VPN : Valeur Prédictive Négative
LSP1 Membrane
cellulaire
MAGI1 Membrane
cellulaire
Expression patients > sujets sains
Description des deux combinaisons candidates
Feng et al. 2014
Hwang et al. 2015
ABI3Cytoplasmique
LSP1 Membrane
cellulaire
MAGI1 Membrane
cellulaire
Expression patients > sujets sains
Description des deux combinaisons candidates
ABI3Cytoplasmique
et nucléaire
Latini et al. 2011
ABI3Cytoplasmique
LSP1 Membrane
cellulaire
MAGI1 Membrane
cellulaire
Expression patients > sujets sains
Description des deux combinaisons candidates
ABI3Cytoplasmique
et nucléaire
DTNBP1 Cytoplasme
CCDC97 Cytoplasme
TXLNB Cytoplasme
Uniprot
ABI3
Expression patients > sujets sains
Cytoplasmique
LSP1 Membrane
cellulaire
MAGI1 Membrane
cellulaire
Description des deux combinaisons candidates
ABI3Cytoplasmique
et nucléaire
DTNBP1 Cytoplasme
CCDC97 Cytoplasme
TXLNB Cytoplasme
RAB11FIP1Membrane du
réticulum
endoplasmique
Uniprot
ABI3Cytoplasmique
LSP1 Membrane
cellulaire
MAGI1 Membrane
cellulaire
Expression patients > sujets sains
Description des deux combinaisons candidates
ABI3Cytoplasmique
et nucléaire
DTNBP1 Cytoplasme
CCDC97 Cytoplasme
TXLNB Cytoplasme
RAB11FIP1Membrane du
réticulum
endoplasmique
Pas d’auto-anticorps
décrits dans la littérature
Auto-anticorps
décrits dans la littératureCAST Cytoplasme
UBA2Cytoplasmique et
nucléaire
Expression sujets sains > patients
Description des deux combinaisons candidates
UBA2 : Cible dans la
dermatomyosite auto-
immune
CAST : Cible dans la
polyarthrite rhumatoïde
Tarricone et al. 2012
Mimori et al. 1995
SH3BP2 Cytoplasme
Expression sujets sains > patients
CAST Cytoplasme
UBA2Cytoplasmique et
nucléaire
Description des deux combinaisons candidates
Pas d’auto-anticorps
décrits dans la littératureHS1BP3 Réticulum
endoplasmique
RDH16Réticulum
endoplasmique
SH3BP2 Cytoplasme
DAB1 Cytoplasme
Ueki et al. 2001
Uniprot
Combinaison plus exprimée chez les patients
- Protéines non liées avec les structures du cartilage
- Pour la première fois décrites dans la polychondrite chronique atrophiante
- Pas d’auto-anticorps connus contre ces protéines
Deux combinaisons d’auto-anticorps
Combinaison plus exprimée chez les sujets sains
- Présence d’auto-anticorps dans la population générale
- Auto-anticorps pour la première fois décrites chez des sujets sains
Identification pendant la phase de Training
Deux groupes
de protéines candidates
Conclusions / Perspectives
A confirmer par une phase de Test
avec une plus grande cohorte
en incluant : des patients avec d’autres maladies auto-immune
par une technique ELISA par exemple
Song et al. 2010
Identification pendant la phase de Training
Deux groupes
de protéines candidates
Conclusions / Perspectives
A confirmer par une phase de Test
avec une plus grande cohorte
en incluant : des patients avec d’autres maladies auto-immune
par une technique ELISA par exemple
Song et al. 2010
Conclusions
• Combinaison de cibles
• Vérifications
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Auto-anticorps
• Vérifications
� 10 puces (financement Fondation Arthritis
Courtin)
� Recrutement de patients
• ELISA
• Tester les cibles identifiées par une autre technique : Genalyte
Biomarqueurs pour le diagnostic de la polychondrite atrophiante
Auto-anticorps
Biomarqueurs pour le diagnostic de la
polychondrite atrophiante
A. Anticorps
La recherche dans la polychondrite atrophiante
B. Cellules circulantes
IgM
IgD
CD
19
CD20
in CD45+ in B cells
Switchés
Non switchés
Lymphocytes B: identification des sous-populations
IgD
CD
24
CD38
CD
27
CD38
CD20
in IgMD+ B cells in IgMD+CD27- B cells
Marginal-zone Bm2
Transitionnels
Naïfs
Projet CyTOF®
Cytométrie de masse
Cellules circulantes
Cytométrie de masse
Delphine Sterlin – Laetitia Claër
Réunion de labo 4 décembre 2015
Principe du CyTOF®
Cellules circulantes
D’après Bendall et al, Trends in Immunology 2012
Principe du CyTOF®
Cellules circulantes
D’après Bendall et al, Trends in Immunology 2012
CyTOF® vs cytométrie en flux
Cellules circulantes
D’après Bendall et al, Trends in Immunology 2012
CyTOF® => Analyse multiparamétrique
Cellules circulantes
viSNE
Cellules circulantes
6 Patients, 5 sujets sainsLymphocytes B
ViSNE CD19+ à partir des fichiers downsamplés
13 000 evts/ech
Iterations : 1000
Perplexity : 50
Cytométrie de masse
Lymphocytes B
tSNE
tSN
E
CD38
HD001 HD002 HD003 HD004 HD005
Cytométrie de masse
tSNEHD001 HD002 HD003 HD004 HD005
PCA014 PCA011 PCA012 PCA019 PCA003 PCA009
Lymphocytes B
CD
38
CD10
2,05% 1,13% 2,32% 3,31% 2,25%
0,13% 0,08% 0,71% 0,08% 0,01% 0,45%
HD001 HD002 HD003 HD004 HD005
Cytométrie de masse
0,13% 0,08% 0,71% 0,08% 0,01%
PCA014 PCA011 PCA012 PCA019 PCA003 PCA009
PC
A
HD
0
1
2
3
4 **
%C
D10+
CD
38h
i
p = 0,008
Lymphocytes B transitionnels
CD38hi CD10+
Lymphocytes T CD4
ViSNE CD3+ à partir des fichiers downsamplés
100 000 evts/ech
Iterations : 2000
Perplexity : 30
ViSNE Lymphocytes T CD4+ à partir du Visne CD3+
36 101 evts/ech
Iterations : 2000
Perplexity : 30 Th17
Cytométrie de masse
FoxP3+FoxP3+
4) Lymphocytes T CD4
a – Th17
tSN
E
CD161
tSNE
Cytométrie de masse
tSNE
HD001 HD002 HD003 HD004 HD005
PCA014 PCA011 PCA012 PCA019 PCA003 PCA009
4) Lymphocytes T CD4
a – Th17
PC
A
HD
0
5
10
15
20**
%C
D161+
CC
R6+
** p < 0,05
Cytométrie de masse
CD
16
1
CCR6
15,87%7,52%9,47%10,06%5,55%15,91%
3,06% 3,50% 2,25% 2,45% 3,11%
PCA014 PCA011
HD001 HD002 HD003
PCA012
HD004 HD005
PCA019 PCA003 PCA009
PC
A
La recherche dans la polychondrite atrophiante
A suivre….
• Diagnostic/anticorps: panels d’anticorps
�A évaluer
• Cellules circulantes/ Cytof:
�mise au point de la technologie : OKmise au point de la technologie : OK
� Des différences dans les lymphocytes B et les TH17
• La suite?
– GWAS: analyse du génome
– Mécanisme de la maladie (lien SMD/PCA)
• Dr Alexis Mathian
• Pr Jean-Charles Piette
• Pr Guy Gorochov
• Pr Zahir Amoura• Pr Zahir Amoura
• Chloé Couzin
• Delphine Sterlin
• Laetitia Claër
