Manuel MARK, Institut d’Embryologie

Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et CellulaireHôpital Universitaire de Strasbourg

INTERACTIONS GÉNÉTIQUES ET

ÉPIGÉNÉTIQUES DES SUBSTANCES

TÉRATOGÈNES

Différenciation

D’après Niemann et coll., 2008, Reproduction 135: 151

MECANISME D’ACTION DES MOLECULES TERATOGENES

Renouvellement

Stress oxydatif : altérations moléculaires multiples (ADN, ARN, protéines, lipides )Ex: thalidomide…

Liaison directe à l’ADN: tératogènes génotoxiques

Modification d’une voie de signalisation Ex: ligands de récepteurs nucléaires: rétinoïdes, œstrogènes de synthèse, certains polluants environnementaux

Altération de l’épigénome- Méthylation de l’ADNEx: arsenic - Modifications post-traductionnelles des histones Directe : acide valproïqueIndirecte: acide rétinoïque

C. soucheC. souche

C. C. «« ddééterminterminééeses »»

C. C. terminalementterminalementdiffdifféérencirenciéées es

Parman et al., (1999) Nat. Med. 5: 582; Hansen et coll, 2002, J Pharmacol Exp Ther. 300:768; Knobloch et Rüther, 2008, Cell Cycle 7: 1121

La thalidomide induit la formation de radicaux libres qui perturberaient l’équilibre complexe des facteurs paracrines / de transcription impliqués dans la différenciation du membre

exacerbation de l’apoptose

EMBRYOPATHIE A LA THALIDOMIDE

Anion superoxyde

Peroxyde d’hydrogène

Radical hydroxyl

Le stress oxydatif est évoquécomme mécanisme d’action de nombreux tératogènes…incluant les rétinoïdes

Hansen, 2006,Birth Defects Research 78:293

- Codent pour des facteurs de transcription- 39 gènes chez les mammifères, regroupés en 4 complexes - Domaines d’expression colinéairesétagés le long de l ’axe antéro-postérieur(AP)- Mutations se traduisent par des transformations homéotiques = remplacement d ’une structure donnée par une autre normalement localisée à un endroit différent le long de l ’axe AP- Déterminent l’identité des régions corporels le long de l’axe AP

LE DIETHYLSTILBESTROL POURRAIT EXERCER SES EFFETS TÉRATOGÈNES EN ALTÉRANT L’EXPRESSION DES GÈNES HOX

GENES HOX

LE DIETHYLSTILBESTROL POURRAIT EXERCER SES EFFETS TÉRATOGÈNES EN ALTÉRANT L’EXPRESSION DES GÈNES HOX

L’administration de DES à la souris induit une postériorisation des domaines des gènes Hox qui sont normalement exprimés de façon étagée le long du canal de Müller (Ma et Coll., 1998 Dev. Biol.197: 141; Gaurang et coll.,2006 , Endocrine Rev. 27:331)

17β œstradiol

DES

ERα

Epigénome = ensemble des états de la chromatine permettant de moduler l’expression des gènes. Il repose sur 3 piliers : - La méthylation de l’ADN- Les modifications post-traductionnelles des histones(acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination, polyADP-ribosylation)- Les variants d’histones

TERATOGENES AGISSANT SUR L’EPIGENOME

2 molécules d’ADN identiques…

mais des marques épigénétiques différentes

LES EFFETS TÉRATOGÈNES DE L’ARSENIC, À L’INSTAR DE SES EFFETS CARCINOGÈNES/ ANTI-CANCEREUX , SEMBLENT DUS À UNE ALTÉRATION DE LA

MÉTHYLATION DE L’ADN

L’exposition à l’arsenic est associée à une hypométhylation globale de l’ADN et àune hyperméthylation de gènes spécifiques (revue dans Baccarelli et Bollati, 2009,Current Opinion in Pediatrics. 21:243)

Compaction des nucléosomes

Répression de la transcription

Smith's Recognizable Patterns of Human Malformation 5th edition, 1997

Le syndrome d’exposition à l’acide valproïque associe des anomales craniofaciales mineures et ,le cas échéant, des anomalies viscérales sévères (spina bifida ++)Di Liberti et coll., 1984, Am J Med Genet 19:473

L’ACIDE VALPROÏQUE EST TERATOGENE PAR INHIBITION DES DESACETYLASES D’HISTONES

L’ACIDE VALPROÏQUE EST TERATOGENE PAR INHIBITION DES DESACETYLASES D’HISTONES

Chromatine « fermée » Chromatine « ouverte »

Transcription du gèneEx: p21

Désacétylation des histones(répression de la transcription)

Acétylation des histones(activation de la transcription)

- L’acide valproïque est un inhibiteur des désacétylases d’histones (HDACi) (Phiel et coll, 2001 J Biol Chem, 276: 36734),

- La TSA (trichostatine), le prototype des HDACi, et l’acide valproïque induisent les mêmes malformations au cours du développement chez la souris (Menegola et al. 2005. BirthDefects Res.Dev Reprod Toxicol 74: 392).

HAT

HDAC

LES MECANISMES CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DE LA

TÉRATOGENÈSE

PAR CARENCE ET EXCES EN ACIDE RETINOÏQUE (AR)

NADRALDH1

à 4 NADH

Membrane cellulaire

RAL

ADHRoDHNAD NADH

Activation de la transcription

NoyauCYP26A1, B

1, C1

ROLRBP

ComplexeRetinol-RBP

d’origine hépatique

SANGL’AR peut aussi agir comme un signal paracrine

ROL AR

ARAR 4-oxoAR 4-hydroxyAR 18-hydroxy

Cytosol

- RAR (α, β, γ) sont des facteurs de transcription inductibles par leurs ligands- In vitro, fonctionnent sous la forme d’hétérodimères RXR:RAR après fixation à des RARE

AR 9AR 9--cis ?cis ?AcAc. . DocosahDocosahééxaxaéénonoïïqueque

AcAc. . ArachidoniqueArachidoniqueAcAc. . phytaniquephytaniqueEcosanoEcosanoïïdesdes

AR toutAR tout--transtransAR 9AR 9--cis?cis?

Hétérodimère RXR:RAR

Histones

ADN

RAR

RXR

PuGPuG TCATCAGGTT

PuGPuG TCATCAGGTT

n = 5

LES RECEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE (RAR)

Clarke et coll, 2004, Expert Reviews in Molecular Medicine 6

- La fixation du ligand sur le RAR induit un changement conformationnel de l’hétérodimère lui permettant: - de se séparer des co-répresseurs- de recruter un complexe de co-activateurs capable d’interactions directes avec la machinerie transcriptionnelle de base et présentant une activitéd’acétylation des histones (= activitéhistone acétyl transférase ou HAT)

LES RECEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE (AR)

En l’absence de ligand, l’apo-hétérodimère liéau RARE recrute des co-répresseurs (SMRTet/ou NCor) et, par leur intermédiaire, des désacétylases d’histones (HDAC)

- Contiennent une séquence de type RARE au

niveau de leurs promoteurs

- Sont régulés par l’AR dans des cellules en culture

ou in vivo

LES GÈNES CIBLES DIRECTS DE L’AR

Liste des 27 gènes qui sont des cibles directes de l’AR(d’après Blomhoff et Blomhoff J. Neurobiol, 2006, 66)

à laquelle il convient de rajouter les Cyp26A1, B1, C1

Certains RAR présentent des profils d’expression spécifiques, mais ceux de RARα et de RXRα sont ubiquitaires tous les tissus en développement sont des cibles potentielles de le carence ou de l’excès d’AR.

Expression de RARγ dans des ébauches pré-cartilagineuses (coupe sagittale d’embryon de souris à E14; IHC).

LES RECEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE (AR)

Colonne vertébrale

Sternum

Trachée

129/Sv129/Sv BalbBalb/c/c

ElectroporationElectroporationdu vecteur dedu vecteur derecombinaisonrecombinaison

souris sauvage souris sauvage BalbBalb/c/cChimChimèèrere

Culture des cellules ESCulture des cellules ES

PrPrééllèèvement de vement de blastocystesblastocystes

RRééimplantationimplantationdes des blastocystesblastocystesin uteroin utero

Injection des cellulesInjection des cellulesES recombinantesES recombinantesdans des dans des blastocystesblastocystesde souris de souris BalbBalb/c/c

CellulesCellulesde la massede la masseinterneinterne

SourisSourisMutanteMutante

hhééttéérozygoterozygote

Evènement de recombinaison homologue

FONCTIONS DES RARs et BASES MOLÉCULAIRES DE LA TÉRATOGENÈSE INDUITE PAR UNE DIMINUTION DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’AR

PHÉNOTYPES DES MUTANTS NULS POUR LES RAR- FONCTIONS DES RARS

En raison d’un phénomène de redondance fonctionnelle, les mutants inactivles mutants inactivéés pour s pour un seul un seul RARRAR::- sont viables; - ne présentent pas (à une exception) les manifestations du syndrome de carence fœtale en vitamine A (SCFA).Les mutants nuls pour 2 Les mutants nuls pour 2 RARRAR::

- meurent à la naissance, parfois in utéro;- présentent toutes les anomalies du SCFA.

Aα/Aβ, Aα/AγAα/Aβ, Aα/AγAα/AγAα/Aγ

Anomalies du tractus génital• Agénésie des oviductes et de l'utérus• Agénésie du vagin• Agénésie du canal déférent• Agénésie des vésicules séminales

Aα/Aβ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/Aβ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/Aβ, Aα/Aγ

Anomalies de voies d'éjection du cœurs• Tronc commun aortico-pulmonaire• Communication interventriculaire• Anomalies des grosses artères

Aα/AγHypoplasie du myocarde

Aα/AβAα/AβAα/Aβ

Anomalies du système respiratoire• Agénésie ou hypoplasie des poumons• Absence du septum trachéo-œsophagien• Hernie diaphragmatique

Double mutants nuls pour des

RARs présentantdes

anomalies semblables

Anomaliesdu syndrome de carence foetale

en vitamine A

Aα/Aβ, Aα/AγHypoplasie du rein

Aα/Aβ, Aα/AγAα/Aβ, Aβ/Aγ

Anomalies urétrales• Agénésie• Ectopie

Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ, Aα/Aβ, Aβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ

Anomalies occulaires• Colobome de la rétine• Colobome du nerf optique• PHPV• Absence du vitré définitif• Paupières non fusionnées• Hypoplasie du sac conjonctival• Stroma cornéen anormal• Absence de chambre antérieure• Fibres cristalliniennes anormales• Raccourcissement de la rétine ventrale

Mutants nuls pour lesRARs présentant des anomalies semblables

Anomaliesdu syndrome de carence foetale

en vitamine A

LES INACTIVATIONS SIMULTANEES DE 2 RAR REPRODUISENT L’ENSEMBLE DES ANOMALIES DU SYNDROME DE CARENCE FŒTALE EN VIT.A (SCFA)

Lohnes et coll, et Mendelsohn et coll, 1994, Development

Ces anomalies ne sont pas des manifestations du SCFA, mais sont ~ reproduites chez desembryons: - traités par des antagonistes des RAR- déficients en RALDH2 ou RALDH3Elles traduisent donc une carence fonctionnelle en AR

CCL1: L’AR EST INDISPENSABLEÀ L’ORGANOGENÈSE/HISTOGENESE DE NOMBREUSES STRUCTURES

Exencéphalie + fissure médiane de la face (mutant RARα/RARγ)

Agénésie du radius (mutant RARa/RARg)

LES INACTIVATIONS SIMULTANEES DE 2 RAR

PRODUISENT DES ANOMALIES NOUVELLES

En plus de son rôle dans la morphogenèse et

la différenciations cellulaire,l’AR à intervient dans la détermination de

l’identité cellulaire le longde l’axe antéro-postérieur

WT RARα/RARβ

Modification de l’expression de Hoxd4

Transformation homéotique de l’axis (C2) en atlas (C1)

CCL2: L’AR CONTRÔLE L’EXPRESSION DE CERTAINS GENES HOX

Les foetus doublement nuls pour Les foetus doublement nuls pour RARRARαα et et RARRARββ ou pour ou pour RARRARαα et et RARRARγγ reproduisent les anomalies reproduisent les anomalies observobservéées chez le poulet suite es chez le poulet suite ààll’’ablation de la crête neurale ablation de la crête neurale crâniennecrânienne

-- Absence du septumAbsence du septumaorticoaortico--pulmonairepulmonaire-- Malposition des troncs Malposition des troncs artartéériels criels cééphaliquesphaliques

(Larsen, 1995)

AgAgéénnéésies des os du crânesies des os du crâne

« It is possible that a major mechanism of isotretinoin teratogenesis is a deleteriouseffect on cephalic neural-crest cell activity that results in the observed craniofacial, cardiac, and thymic malformations » (Lammer, 1985)

CCL 3: L’AR EST INDISPENSABLE A L’ONTOGENESE DES DERIVES DE LA CRETE NEURALE CRANIENNE

RARα/RARβ et RARα/RARγ

RAR (α, β et γ)AR tout-trans

FXRAcides biliaires

LXR (α et β)hydroxycholésterols25-époxycholésterol

PPAR (α, β and γ)prostaglandin J2écosanoïdesacides gras désaturés

VDR1-25 di(OH)2 vitamin D3

TR (α et β)hormone thyroidienne (T3)

PXRpregnanes

CARandrostanes

OrphansCOUP-TF (α, β et γ)

NGF1-B...

RXR α, β, γ

LES PHENOTYPES DES MUTANTS NULS POUR LES RXR: FONCTIONS DES RXR

SCFA

RARγ

RARβ

RARα

viables

RXRγRXRβRXRαSCFA

Récepteur

inactivé

LES HETERODIMERES RXRα : RAR (α, β et γ ) REPRESENTENT LES UNITES FONCTIONNELLES DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’AR IN VIVO AU

COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE

DIMINUTION DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’ARET PATHOLOGIES HUMAINES

Carence alimentaire en vitamine ASyndrome d’alcool fœtal

Exposition à des polluants (nitrophène, TCDD)

Hypothesis: “Mutation of genes controlling

tissue specific vitamin A disposition predispose the developing embryo

of vitamin A deficient mothers to congenitalabnormalities of the eye”.

India Project (extrait de la page Web, 2004)

CARENCE ALIMENTAIRE EN VITAMINE A

Malformations oculaires (= les plus fréquentes desanomalies induites par la carence fœtale en vitamine A chez le rongeur de laboratoire)

CARENCE ALIMENTAIRE EN VITAMINE AA

B

RBP +/-RBP -/-

Ces 2 fœtus sont issu de la même mère porteuse d’une inactivation du gène codant pour la RBP et carencée en vitamine ALe fœtus B, porteur homozygote d’une mutation nulle présente un syndrome polymalformatif

(le fœtus A est normal)(D’après Quadro et coll., 2005 ,Endocrinology 146: 4479)

L’inactivation du gène codant pour la RBP, sans conséquence en cas d’alimentation équilibrée, favorise la survenue de malformations embryonnaires en cas de carence maternelleen vitamine A

rétinol (vitamine A)

rétinaldéhyde(rétinal)

acide rétinoïque

alcool déhydrogénasesAdh1- Adh2- Adh4- Adh7- Adh8Rodh1- Rodh2- Rodh3- Rodh4

aldéhyde déshydrogénases(Raldh1- Raldh2- Raldh3-Raldh4)

CH2OH

COOH

CHO

Ethanol

ETAT DE CARENCE EN AR ET SYNDROME D’ALCOOL FŒTAL

Cellules apoptotiques à l’apex du bourgeon de membre(Johnson et coll., 2007, Birth Defects Research 79:631)

Contrôle Traité AR

Traité éthanol Traité éthanol et AR

L’administration simultanée de faibles doses d’AR peut empêcher l’exacerbation de l’apoptoseinduite par l’éthanol(ici dans le bourgeon de membre).

ETAT DE CARENCE EN AR ET SYNDROME D’ALCOOL FŒTAL

Fissures médianes de la face et agénésiedu corps calleux (= holoprosencéphalie, HPE) - sont présent chez tous les mutants doublement nuls RARα/RARγ- sont précédés d’une mort cellulaire importante dans la masse fronto-nasale (Lohnes et coll., 1994, Development 120:2723. )

WT RARα/RARγ

L’HPE est une manifestation du syndrome d’alcool fœtal chez l’Homme(Revue: Cohen et Shiota, 2002, American Journal of Medical Genetics 109:1)

ETAT DE CARENCE EN AR ET SYNDROME D’ALCOOL FŒTAL

Agénésie du poumon gauche Agénésie du diaphragme

VOIE DE SIGNALISATION DE L’AR ET POLLUANTS I. NITROPHÈNE

Le nitrophène régule négativement la voie de signalisation de l’AR (Chen et coll. Biol Neonate, 2003, 83:157).

RARα /RARβ RARα /RARβ

AR

DEVELOPEMENT EMBRYONNAIREANORMAL =

Syndrome de carence foetale en vitamine A

CARENCE

EXCES

LES MECANISMES CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DE LA TÉRATOGENÈSE

PAR EXCES D’ACIDE RETINOÏQUE (AR)

DEVELOPEMENT EMBRYONNAIREANORMAL =

Embryopathie par excès d’AR

Les mutants nuls pour RARγ sont résistants au syndrome de régression caudale induit par un excès d’acide rétinoïque d’origine exogène.

Conception

E0 E9 E18

ARAR(100mg/kg)

Observation des squelettes

LES EFFETS TERATOGENES DE L’AR SONT RELAYES PAR LES RARS

Iulianella et coll. Dev. Biol. 1999, 205:33.

WT + RA RARγ-KO + RA

Les mutants nuls pour RARγ sont résistants au syndrome de régression caudale induit par un excès d’acide rétinoïque d’origine endogène

Syrénomélie chez un mutant porteur d’allèles nuls pour CYP26A1. Cette anomalie est absente chez les doubles mutants nuls à la fois pour CYP26A1 et RARγ(Abu-abed et coll, 2003, Development 130, 1449)

LES EFFETS TERATOGENES DE L’AR SONT RELAYES PAR LES RARS

CYP26A1-/-

CYP26A1-/-et RARγ-/-

Les mutants nuls pour RXRα sont résistants aux anomalies des membres induites par un excès d’acide rétinoïque d’origine exogène (Sucov et coll 1995 Development. 121:3997)

LES EFFETS TERATOGENES DE L’AR SONT RELAYES PAR LES RARS

- Les rétinoïdes synthétiques incapables de se lier aux RAR ne sont pas tératogènes.- Les retinoïdes synthétiques spécifiques d’une isoforme de RAR donnéinduisent des malformation distinctes.

LacZ

Lignée de souris rapportrice sensible à l’AR

RARE HSP

Véhicule Agoniste de RARα Agoniste de RARγ

Matt et coll., 2003, Development, 130:2083

L’AR 9-Cis EST UN TERATOGENE SANS ACTION PHYSIOLOGIQUE

- est le ligand canonique des RXR- n’est pas détecté in vivo dans des conditions physiologiques - est détecté in vivo après administration d’une dose pharmacologique d’AR tout-trans/13-cis - sa fixation sur le RXR potentialise l’activation de la transcription relayée par les hétérodimères RAR : RXR in vitro - joue un rôle important dans l’embryopathie à l’AR

L’isotrétinoïne est isomérisée in vivo en AR tout-trans et en AR 9-cis

(Larsen, 1993)

(Sulick et coll., 1988, Development 103)

L’AR 9-Cis EST UN TERATOGENE SANSACTION PHYSIOLOGIQUE

Souris gestante à E 8.0

Hypoplasie et fusion et des 2 premiersarcs pharyngiens (Webster et coll., 1986)

Pas Pas dd’’ARAR

+ + ARAR

AR

CULTURES D’EMBRYONS EN PRESENCE DE RETINOIDES SYNTHETIQUESSPECIFIQUES DES RAR OU DES RXR

E 8.0: stade 2/3 somites Equivalent E 9.5: stade ~34 somites

Agonistes spécifiques de RAR ou de RXR

culture durant 48 hr

Agoniste de RARβ àune concentration

non-tératogène

Agoniste pan-RXR: non-tératogenequelqu’en soit

la concentration

Les 2 agonistes combinés:fusion des 2 arcs

branchiaux

- L’agoniste des RXR n’est, par lui même, jamais tératogène- L’agoniste de RAR et celui de RXR exercent des effets tératogènes synergiques sur le développement des arcs branchiaux

Coupes histologiquessériées du pharynx

A1A2

A 3

Syrénomélie chez un mutant nul pour CYP26A1. (Abu-Abed et coll, 2001, Genes Dev. 2001 15: 226 )

LES RAMBAS SONT POTENTIELLEMENT TERATOGENES

Parce qu’ils augmentent les concentrations d’AR endogène les inhibiteurs des CYP26 (RAMBA: Retinoic Acid MetabolismBlocking Agents ) sont vraisemblablement tératogènes

PESTICIDES ORGANOCHLORES DOUES DE PROPRIETES RA-MIMETIQUES IN VITRO

Lemaire et coll., 2005, Toxicol Appl Pharmacol. 202:38Kamata et coll., 2008, Toxicol In Vitro. 22:1050

Norbert B. GhyselinckChristine DennefeldHugues JacobsNicolas MattOlivia Wendling

Norbert B. GhyselinckChristine DennefeldHugues JacobsNicolas MattOlivia Wendling