Impact de la variabilité génétique du blé sur son allergenicité : apport de l'allergénomique et de la

quantification par MRM

Roberta Lupi, Hélène Rogniaux, Sandra Denery-Papini, Colette Larré 29/10/2015

.02 Roberta Lupi/ Graines 2015 26/03/ 2015

Qu’est-ce qu’une allergie alimentaire?

Réponse anormale du système immunitaire d’un individu à l’ingestion d’une molécule (allergène)

Sensibilisation

Déclenchement aliment

intestin

IgE

mastocyte

histamine

Réaction immunitaire en 2 phases

Manifestations immédiates et différées

.03 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/2015

1-4% de la population mondiale (3-4% France) Différences en fonction de l’âge 2-8% enfants (5-7% - 15 ans, France) 1-2% adultes

Top 14 des allergènes en EU

Prévalence des allergies alimentaires

Wheat

.04 Roberta Lupi/Graines 2015

29/10/ 2015

26/03/ 2015

Prévalence des allergies au blé • Allergie alimentaire

Enfants : 0,2 à 0,5% de la population (Revue Zuidmeer 2008 - TPO)

Adultes : 0,2% de la population au Japon (Morita 2012 – SPT, IgE)

Adultes : 7,5% des réactions sévères aux aliments (Réseau Allergo-Vigilance – E Beaudouin et DA Moneret-Vautrin 2014)

• Allergie respiratoire : 15 % des professionnels

Le blé : un aliment mais aussi un allergène Fait partie des trois céréales les plus cultivées et consommées dans le monde Production mondiale : 650 Mt

Gluten : propriétés viscoélastiques

Protéines solubles (20%) Albumines/Globulines

.05 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

Genre Triticum

Blé dur Triticum turgidum durum AA BB

= 5% du blé cultivé 14% de protéines

Blé tendre

Triticum aestivum AA BB DD = 95% du blé cultivé

11% protéines

Les blés cultivés

Autres blés (Surfaces très restreintes) • Triticum monococcum AA (Engrain= petit épeautre) • Triticum turgidum AA BB (Blé khorazan = kamut®, Farro) • Triticum spelta AA BB DD (épeautre) • …

.06 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

Variabilité de la réponse allergique

Fraction Soluble T. aestivum T. durum

R. Lupi et al. / Journal of Cereal Science 60 (2014) 179-186

R. Lupi et al. / Journal of Cereal Science 60 (2014) 179-186

Lupi et al J of Cereal Science (2014)

Différences entre variétés

.07 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

Complexité de la fraction A/G

Identification des allergènes du blé:

l’approche "allergénomique"

Immunoblots avec des sérums de patients

1 2 3 4 7 6

14 15 13

39 37 42

43 44 45

33

Globulin; 7

AAIs; 0 enolase; 2

serpin; 5

TPIsomerase; 2

G3P deshydroge

nase; 4

Engrain, A

Globulin; 15

AAIs; 3

enolase; 4

serpin; 4

TPIsomerase; 4

G3P deshydroge

nase; 0

BobWhite, ABD Svevo, AB

Globulin; 11

AAIs; 2

enolase; 1

serpin; 3

TPIsomerase; 0

G3P deshydroge

nase; 4

Variabilité génétique des protéines fixant les IgE

Lupi et al, J of Proteomics (2013); Larré et al, J of Proteomics (2011)

.08 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

• Détection et quantification par les IgE (Pb sérum)

• Dosage de certains allergènes par des techniques immunochimiques (ELISA), peu d’anticorps spécifiques disponibles.

• Dosage par LC-HPLC développé pour un seul allergène actuellement (Prandi et al, 2014)

Dosage des allergènes du blé

OBJECTIF

Etat de l’art

Mise en place d’une méthode de quantification relative, ciblée, par spectrométrie de masse MS/MS

(méthode de pseudoMRM : Multiple Reaction Monitoring)

.09 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

Matériel et démarche

T. monococcum T. durum T. aestivum

AA AABB AABBDD

Genesi, Masaccio Pitagora, Casanova, Kamut Engrain, DV92

Analyse du protéome de la fraction A/G Identification des allergènes

Choix des protéines cibles

Peptides protéotypiques + transitions

Choix des peptides et des transitions

Analyse quantitative par MRM

Rogniaux et al., Proteomics 2015, 15, 1736–1745

Quantification of 12 allergens in 7 genotypes

T. monococcum T. durum T. aestivum

AA AABB AABBDD

Genesi, Masaccio Pitagora, Casanova, Kamut Engrain, DV92

Rogniaux et al., Proteomics 2015, 15, 1736–1745

.011 Roberta Lupi/Protéome Vert 26/03/ 2015

Instrument LTQ-Orbitrap VELOS Traitement de données avec Skyline

Pitagora (T durum) Genesi (T. Aestivum)

Méthode ciblée

Ions de transitions 1 ion pour la quantification (CV<10%) 2 ions pour qualifier la transition

Quantification par intégration des pics

6 1.4

.012 Roberta Lupi/Protéome Vert 29/10/ 2015

Hexa Di Tetra

Di

Hexa

Tetra

Quantification of 12 allergens in 7 genotypes

.013 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

• Quantification simultanée de douze allergènes du blé • Mise en évidence d’une variabilité de l’allergénicité intra et inter espèce composition en allergènes quantité relative • Caractérisation de la composition en allergènes par variété • Lien entre réponses allergiques observées entre les génotypes et la

distribution en allergène.

Conclusions

• Utilisation au cours des étapes de sélection ( faible quantité de blé requise) • Méthode de détection d’allergènes spécifiques dans des aliments avec une

limite : Cas particulier : AAI 0,19 orthologues contenant le peptide ciblé présents dans l’orge

• Evolution possible vers de la quantification absolue • Complémentaires de dosages ELISA en l’absence d’anticorps spécifiques

Perspectives

.014 Roberta Lupi/Graines 2015 29/10/ 2015

Remerciements

Collaborations externes INRA UMR 1095 GDEC/UBP Clermont (G. Branlard) Università degli Studi della Tuscia, DAFNE, Italy ( S. Masci) Department of Biotechnology,Università degli Studi di Verona, Italy (C. Rizzi) Servizio di Allergologia ed Immunologia Clinica, 33100 Udine, Italy (M. De Carli) Service d'Allergologie, CH Jean Monnet, 88021 Epinal (D.A. Moneret-Vautrin, E. Beaudouin) Unité Allergologie Générale CHU – ANGERS, (M. Drouet)

BIBS

Hélène Rogniaux Virginie Lollier Marija Pavlovic Marion Hamon Mathilde Joint Audrey Geairon

Colette Larré Sandra Denery Olivier Tranquet Mathilde Claude Maxime Perot Laure Castan Florence Pineau Gilbert Deshayes Chantal Brossard Marie Bodinier Gregory Bouchaud Valérie Echasserieau

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