Optimisation de la méthode de détection FISH
Transcript of Optimisation de la méthode de détection FISH
Optimisation de la méthode de détection FISH
Cédric Longin, Claudine Degueurce, Frédérique Juillat,
Sandrine Rousseaux, Michèle Guilloux-Bénatier, Hervé Alexandre
Institut Universitaire de la Vigne et du Vin (Dijon)
SITEVI, Montpellier, 2017
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Projet National GNBrett
Axe 1
Biodiversité et
métabolisme
- Résistance au SO2
- Etude de l’état Viable Non
Cultivable (VNC)
Axe 2
Confrontation et amélioration
des méthodes de détection en
laboratoire
- Comparaison de kits qPCR
- Optimisation FISH-CMF
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OBJECTIFS
Cellules en suspension Brettanomyces bruxellensis En vin rouge
Sonde couplée à un fluorochrome
Oligonucléotides : Spécifiques des régions variables
de l’ARN ribosomal 26S de Brettanomyces
Cellules fluorescentes
MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF
Perméabilisation Fixation
Hybridation
Principe de la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH)
6
- Teneur en ribosome cellulaire - Accessibilité du site cible de la sonde - Température d’hybridation (Röder et al., 2007)
- Perméabilité de la paroi cellulaire
MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF
Comment optimiser la méthode ?
Principe de la technique FISH
Perméabilisation au PBS-Triton dans le protocole actuel Vin rouge : polyphénols adsorbés au niveau de la paroi cellulaire.
Test éthanol comme désorbant
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
PBS 20% 30% 40%
Ab
sorb
ance
à 2
80
nm
Concentration en éthanol (%)
Lavage 1 Lavage 2 Lavage 3
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
0
1
2
3
4
5
6
PBS 20% 30% 40%
Log
cellu
les/
mL
Concentration en éthanol (%)
Lavage 1 Lavage 2 Lavage 3
*
Meilleure désorption avec la concentration [C3] (v/v)
Aucun impact sur la perte cellulaire
Désorption des polyphénols et impact sur la population levurienne
[C1] [C2] [C3]
MATÉRIELS ET MÉTHODES – OPTIMISATION FISH-CMF
Ancien protocole FISH-CMF (Serpaggi et al., 2010)
Perméabilisation Fixation (24h)
Hybridation (16h) Lavage (30min) Lecture (≈ 48 h)
Réduction du temps d’analyse
Nouveau protocole FISH-CMF Perméabilisation/fixation (30 min)
Hybridation ( 16h) Lavage (30min) Lecture (≈ 18 h)
S. cerevisiae (Sc) non marquées
Sc marquées
B. bruxellensis (Bb) non marquées
Bb marquées
Discrimination spécifique des cellules de B. bruxellensis (>95%)
Marquage aspécifique de cellules de S. cerevisiae inférieur à 5%
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Protocole optimisé FISH-CMF : spécificité
¾ Sc + ¼ Bb ½ Sc + ½ Bb ¼ Sc + ¾ Bb
En mélange les cellules de B. bruxellensis sont marquées spécifiquement
Présence de S. cerevisiae n’influence pas le marquage spécifique
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Protocole optimisé FISH-CMF : spécificité
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
y = 0,9896x + 0,1209 R² = 0,9895
0
1
2
3
4
5
6
7
0 1 2 3 4 5 6 7
Mili
eu
ITV
lo
g U
FC/m
L
CMF (log cellules/mL)
Protocole optimisé FISH-CMF : limite de quantification
Limite de quantification : 102 cellules/mL
Amplification des cellules mortes par qPCR (Willenburg et Divol, 2012)
Cible = ADN
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Quantification des cellules mortes par FISH-CMF : Stabilité des ARNr ?
Culture B.b
SO2 actif (2 mg.L-1)
= dose létale
+
FDA : Pas de viabilité Milieu sélectif : pas de cultivabilité
16 h après traitement SO2 6 j après traitement SO2
Stabilité des ARNr dans le temps ?
Réalisation du protocole FISH optimisé
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Confirmation de la stabilité des ARN :
Marquage B. bruxellensis avec le protocole FISH optimisé
Culture B.b
+ RNAse Réalisation du protocole FISH optimisé
- RT-PCR (McKillip et al., 1998, Hierro et al., 2006)
- Northern blot (McKillip et al., 1998,
- FISH (Rathnayaka et Rakshit, 2010)
RÉSULTATS– OPTIMISATION FISH-CMF
Marquage B. bruxellensis avec le protocole FISH optimisé + RNAse
+ SO2 actif (2 mg.L-1)
= dose létale
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Spécifique
Rapide : 48h 18h
Sensible (de 102 à 107 cellules/mL)
Méthode compétitive (peu coûteuse ≈ 6€)
Mais surestimation…
Double marquage FISH/viabilité des cellules de Brettanomyces
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Merci de votre attention
Pr Hervé ALEXANDRE Directeur de l’équipe VAlMiS
Dr Michèle GUILLOUX-BENATIER
Clément PETITGONNET Frédérique JULLIAT
Dr Cédric LONGIN