Etude d'un traitement combiné bio-physico-chimique...

ETUDE EXPERIMENTALE

Thèse S.GENDRAULT 2004

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ETUDE EXPERIMENTALE

ETUDE EXPERIMENTALE Etude du support d’adsorption :Ecorce de pin


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I. Etude du support d’adsorption : l’écorce de pin « Pinus

pinaster »

I.1 Origine et répartition Le pin maritime (Pinus pinaster) se rencontre près des côtes atlantiques et méditerranéennes, en

Espagne, en Italie, au Maroc mais plus particulièrement au Portugal dans les régions du centre et du

nord, et sur côtes atlantiques du sud ouest de la France. La Figure 1 représente l’occupation de Pinus

pinaster en Europe et Afrique du Nord.

Figure 1 : Distribution de Pinus pinaster en Europe et en Afrique du Nord (Ratola, 2002)

Au Portugal, le pin maritime représente 31% des espèces rencontrées en forêt ; mais aujourd’hui le

nombre de pins maritime décroît régulièrement en faveur de l’eucalyptus. La Figure 2 représente la

répartition des espèces peuplant les forêts portugaises.

Figure 2: Répartition des espèces forestière du Portugal (Inventaire National des forets – 3ème édition, 1998)

Pinus pinea (parasol)

2%Chêne liège

23%Chêne faginé

ou rouvre4%

Eucalyptus21%

Chataigner1%

Chêne vert14%

Pinus pinaster (maritime)

31%

Autres feuillus3% Autres

résineux1%



80

En France, le pin maritime également appelé pin des Landes, est implanté dans la région du sud-

ouest depuis l’antiquité ; il fut cultivé de manière intensive à partir du XIXème siècle afin d’enrayer le

phénomène d’ensablement de la côte landaise et d’assainir les zones marécageuses. Aujourd’hui, il

recouvre près d’un million d’hectares et constitue l’une des essences forestières les plus importantes

de France.

Pinus pinaster est un résineux de 20 à 30 mètres de haut, au tronc flexueux, à la cime peu compacte

et à l’écorce brun-rouge (figure 3).

Figure 3 : Ecorce de pin Pinus pinaster

Au Portugal le pin maritime, dit « pinheiro bravo », représente la principale source de matière

première pour les scieries, qui représente près de 70% de la production totale de bois. (Ratola, 2002).

Le Portugal produirait chaque année 6 millions de mètres cube de bois de pin (Ratola,2002). En

considérant que 1 m3 de bois sec produit 100 kilos d’écorce, 600 000 tonnes d’écorce pourraient être

disponibles annuellement (Fradinho et al., 2002). Ainsi, l’écorce en tant que matériau abondant et

gratuit (déchet de l’industrie du bois) représenterait une source valorisable intéressante.

I.2 Chimie générale des écorces

Les écorces sont, en général, constituées d’une fine couche intérieure (phloem) et d’une couche

externe (rytidom) séparées par une couche intermédiaire (periderm). L’épaisseur de l’écorce varie en

fonction de l’espèce de l’arbre et de son âge. Les parois cellulaires qui constituent le phloem sont

principalement riches en amidon, en acides gras et en tanins. Les résines circulent quant à elles, à

l’intérieur de minuscules canaux. Le periderm est composé de trois couches dont l’épaisseur varie

avec l’espèce.

La liste des composés rencontrés dans l’écorce est très longue ; on peut cependant citer les

principales familles de composés qui sont : les hydrates de carbone (cellulose, hemicellulose), les



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pectines, les lignines, la subérine, les terpènes (flavonoïdes, salicines, tanins, stilbènes et autres), et

des poly-flavonoïdes.

La composition des lignines des écorces de conifères reste mal connu à cause de la difficulté qu’il

existe à isoler celles-ci sans contamination par des impuretés phénoliques. Cependant quelques

études suggèrent des structures particulières et indiquent que les lignines de l’écorce sont bien

différentes des lignines du bois ; elles contiennent notamment plus d’acides dicarboxyliques et moins

d’acide 3-4-dimetoxibenzoïque, éther diaril et dimères biphényl.

D’autre part, des acides dicarboxyliques ainsi que des acides gras libres (acide béenique, acide

lignocérique, et phérulique) ont été identifiés comme constituants des cires d’écorce, ainsi que de

petites quantités d’acides gras insaturés et des résines acides.

La subérine de l’écorce serait un complexe formé principalement par des hydroxyacides gras. Des

acides phénoliques sont également présents dans cette composition. Certains hydroxyacides gras

seraient unis entre eux par une liaison ester.

D’après ce qu’on connaît sur la chimie de l’écorce, on peut considérer que l’écorce pourrait être

utilisée comme matrice « échangeur d’ions ». Le contenu important de groupes fonctionnels,

principalement la présence de groupes hydroxyles, carboxyliques et phénoliques, rend l’écorce

intéressante pour des fixations ioniques.

I.3 Caractéristiques physico- chimiques de l’écorce de pin

Différentes études menées dans divers domaines (Ramirez Lopez, 2001 ; Vazquez et al 1994 ; …)sur

l’écorce de pin ont permis de mettre en évidence les caractéristiques physico-chimiques générales de

l’écorce de pin Pinus pinaster. Des analyses supplémentaires ont été réalisées dans le cadre de notre

étude.

L’écorce de pin utilisée dans cette étude provient d’une scierie du nord du Portugal. Elle nous a été

livrée sous forme brute, n’ayant subi aucun traitement préalable (morceaux d’environ 10 cm de long

sur 4 cm de large).



82

I.3.1 Caractéristiques physiques

La surface spécifique de notre matériau, le volume de pore et la taille des pores ont été déterminés à

l’Institut de Recherche en Catalyse (CNRS, Villeurbanne) selon les méthodes BET, Single Point, t.Plot

et BJH.

I.3.1.1 Principe de la méthode BET

Les surfaces spécifiques du matériau ont principalement été obtenues par application de la théorie de

Brunauer, Emmett et Teller (BET) aux isothermes d’adsorption d’azote à 77°K. La théorie repose sur

l’hypothèes d’une adsorption multimoléculaire due à des liaisons faibles du type Van der Waals.

L’énergie d’adsorption d’une molécule sur la surface est différente de celle d’une molécule située sur

la deuxième couche. Le calcul permet d’établir l’équation BET de l’isotherme d’adsorption :

00

0

.1

.1

)1( PP

CVC

CVPPVP

P

mm

−+=

−

où :

V : volume de gaz adsorbé à la pression relative P/P0

Vm : volume de gaz nécessaire pour couvrir la surface d’une monocouche

C : facteur proportionnel à la différence entre l’énergie d’adsorption de la première couche et

l’énergie de liquéfaction

Pour obtenir la surface spécifique, on porte )1(

0

0

PPVP

P

− en fonction de P/P0. La courbe théorique est

une droite de pente CV

C

m .1−

et d’ordonnée à l’origine CVm .

1.

En pratique la courbe est linéaire que pour l’intervalle de pression relative P/P0 compris entre 0,05 et

0,35. La surface spécifique est calculée à partir de la valeur Vm déduite de la transformée linéaire

BET.

I.3.1.2 Principales caractéristiques

La masse volumique apparente (ρapp), la masse volumique réelle (ρre) ainsi que l’indice de vide (ε0) ont

été déterminés sur la poudre d’écorce de pin de diamètre d inférieur à 200 µm.



83

La masse volumique apparente (ρapp) de la poudre d’écorce a été déterminée par remplissage d’un

récipient de volume connu (Vt) avec le matériau en question, tassé de la même manière que pour les

expériences en colonnes.

La masse volumique réelle (ρre) a été déterminée après remplissage d’eau des lits d’écorce de pin

ainsi formés. Le volume d’eau utilisé était le volume de vide (Vv) accessible à l’eau, on a :

vtre VV

m−

=ρ et t

app Vm

=ρ

Avec :

m : masse de l’échantillon dans le récipient (kg)

Vt : volume total du récipient (m3)

Vv : volume de vide (m3)

ρre : masse volumique réelle (kg/m3)

ρapp : masse volumique apparente (kg/m3)

La porosité totale (ε) adimensionnelle est donnée par l’équation :

t

v

VV

=ε

Les principales caractéristiques physiques de notre écorce sont présentées dans le Tableau 1.

Tableau 1 : Caractéristiques physiques de l’écorce de pin (d<200 µm)

PARAMETRE ECORCE Pinus pinaster

Masse volumique apparente ρapp 416 kg/ m3

Masse volumique réelle ρre 559 kg/m3

Indice de vide ε 0,59

Surface spécifique 1,3 à 7,7 m2/g (BET et Single point)

Surface des micropores

(préciser taille)

4,0 m2/g (t.Plot)

5,6 m2/g (BJH adsorption)

4,0 m2/g (BJH desorption)

Volume total des pores < 982,8 Å 0,006 cm3/g (Single point)

Volume des micropores 0,0015 (BJH)

Diamètre moyen des pores 32 Å



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Une analyse BET a également été réalisée en parallèle sur l’écorce en poudre stérilisée (voir

procédure de stérilisation I.7) et non stérilisée. Les résultats présentés au Tableau 2, montrent que la

stérilisation ne modifie pas significativement la surface spécifique du matériau.

Tableau 2 : Analyse de la surface spécifique de l’écorce de pin (BET sur écorce broyée à d<200 µm)

Ecorce stérilisée Ecorce non sterilisée

1,31 ± 0,2 m2/g 1,48 ± 0,2 m2/g

I.3.2 Caractéristiques chimiques

L’analyse chimique élémentaire de l’écorce de pin (Tableau 3) a montré que la fraction organique

représentait 99% de la masse sèche et que l’azote, le potassium, le phosphore et le magnésium

étaient présents à de très faibles concentrations, pouvant rendre nécessaire, lors l’usage de l’écorce

comme biofiltre, une éventuelle addition de nutriments pour une bonne activité bactérienne.

Il est également important de noter qu’à 20°C, pour un ratio liquide / solide de 10 à 20 mL.g-1, le pH

d’une suspension aqueuse d’écorce de pin en poudre est acide (4,5 à 5 unités de pH). On peut donc

se poser la question de la survie des bactéries choisies dans le cadre de notre étude (Pseudomonas

ADP sp.) lorsqu’elles seront mises a contact de ce matériau.

Tableau 3 : Analyse élémentaire de l’écorce de pin

PARAMETRE ECORCE Pinus pinaster

Fraction organique 99,03 % ± 0,08 %

Fraction minérale 0,80 % ± 0,08 %

pH (20°C ; L/S=10-20)) 4,5 - 5

Carbone (g/kg) 400

Azote (g/kg) 2,3

Phosphore (g/kg) 0,30 (P) ; 0,69 (P2O5)

C/N/P 100/0,6/0,07

Potassium (g/kg) 0,50 (K) ; 0,60 (K2O)

Magnésium (mg/kg) 62

Calcium (g/kg) 0,37

Sodium(mg/kg) 0,29

Fer (mg/kg) 7,78

Cuivre (mg/kg) 1,3



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La caractérisation de la matière organique (MO) de l’écorce de pin (Tableau 4) montre que le

constituant majeur est d’origine ligneuse (environ 50% de la MO). L’écorce possède ainsi une grande

stabilité biologique. Celle-ci peut être exprimée par le paramètre Tr (sadef.fr 2003) défini comme suit :

MSoMM

MSoLignined

MSoSoestderVandefractionc

MSooseHemicellulb

MSoMOaTr +++−=

avec :

MO : % matière organique

MSo : %matière organique soluble

MM : % matière minérale

(a, b, c et d sont des coefficients)

On note également que la matière organique soluble représente environ 15% de la matière organique.

Si cette matière organique soluble n’est pas toxique pour les micro-organismes et si elle est

suffisamment biodégradable, on peut imaginer qu’elle pourra être utilisée comme source de carbone

par les bactéries utilisées dans notre procédé combiné de biofiltration.

Tableau 4 : Caractérisation de la matière organique

% de la matière organique

Matière organique soluble 14,9

Matière Hémicellulosiqiue 1,1

Matière ligneuse 54,8

Matière cellulosique 29,2

Stabilité biologique (Tr) 126 (Sadef.fr 2003)

I.3.3 Analyse Infra Rouge des fonctions de surface

Une analyse par spectrométrie IR a été réalisée à l’Unité de Recherche en Génie Civil (URGC, INSA

de Lyon) afin d’identifier les principales fonctions chimiques présentes à la surface du matériau

« Ecorce de pin ». La connaissance des fonctions de surface a permis d’émettre des hypothèses

quant aux types de liaisons susceptibles de s’établir lors des phénomènes d’adsorption ou absorption

de l’atrazine sur le support d’écorce de pin.



86

I.3.3.1 Principe de l’analyse Infra Rouge

La spectrométrie infra-rouge est une méthode d’analyse non destructive, basée sur l’étude de

l’absorption par l’échantillon des radiations électromagnétiques de longueurs d’ondes λ comprises

entre 1 et 1000 µm, soit un nombre d’onde ν=1/λ compris entre 1 et 10-3 m-1. La partie la plus riche en

informations et la plus accessible d’un point de vue expérimental est celle du moyen infra-rouge

(λ compris entre 2,5 et 25 µm soit ν compris entre 0,04 et 0,4 µm-1 ). Les absorptions dans ce

domaine forment une sorte d’empreinte spectrale des composés caractéristiques des liaisons

interatomiques qui les composent.

I.3.3.2 Protocole expérimental

L’analyse IR s’effectue sur des pastilles de KBr fabriquées en respectant les proportions suivantes :

300 mg de KBr et 5 mg de matériau broyé finement. La masse de mélange prélevée pour faire la

pastille est de 30 mg. L’analyse est répétée 5 fois pour un nombre d’onde variant entre 400 et

4000 cm-1. Le spectre obtenu résulte de la moyenne de ces 5 balayages.

L’appareil utilisé est un Perkin Elmer de type dispersif (Spectrum One, FTIR Spectrometer) Les

spectres ont été traités avec le logiciel Spectrum.

Le spectre d’adsorption Infra Rouge obtenu pour l’analyse de l’écorce de pin en poudre (fraction

d<200 µm) est présenté en ANNEXE 1.

I.3.3.3 Interprétation du spectre IR

L’analyse du spectre IR montre la présence de nombreuses fonctions cycliques et aromatiques (C=C)

ainsi que des liaisons C=O, due sans doute à la présence de terpènes, flavonoïdes, résines acides et

tannins.

Le pic à 3435 cm-1 révèle clairement la présence de fonctions alcools (liaisons C-OH éventuellement

phénoliques et/ou de fonctions amines primaires ou secondaires.

Au pH imposé par l’écorce de pin (4-5) en suspension aqueuse, l’atrazine n’est pas sous une forme

ionisée ; une interaction ionique entre l’atrazine et l’écorce est, par conséquent, peu envisageable.

Les interactions les plus probables entre l’atrazine et l’écorce seraient une interaction hydrophobe

entre le cycle aromatique de l’atrazine et les composés organiques de l’écorce de pin, ainsi que des

liaisons hydrogène dues à la présence de fonctions -OH et -NH en surface de l’écorce et dans la

molécule d’atrazine. Des interactions de Van Der Waals résultant de forces électrostatiques peuvent

également s’établir entre l’atrazine et l’écorce de pin.

Aucune fonction acide n’a été mise en évidence à la surface de l’écorce de pin par spectrométrie IR.



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I.4 Observations de la structure l’écorce de pin au MEB

La microstructure de l’écorce de pin en poudre a été caractérisée par observation au Microscope

Electronique à Balayage Jeol 840 LGS au Centre d’Etudes et de Caractérisations Micro-structurales

de l’INSA de Lyon. Ces observations ont permis de comparer les structures des particules d’écorce

selon leur granulométrire et de les comparer à celle du charbon actif en poudre.

La préparation des échantillons a été réalisée par séchage (chauffage à 80°C) des matériaux à

étudier, puis métallisation à l’or dans un pulvérisateur cathodique BLAZERS SCD 040.

Les clichés obtenus (ANNEXE 2) par observation au MEB des particules d’écorce de pin et de

charbon actif montrent que la structure de surface de ces deux matériaux est ressemblante,

présentant une structure en nid d’abeille (Figure 1). Cependant, le charbon actif semble présenter une

surface plus régulière que l’écorce de pin. L’observation des structures longitudinales des particules

d’écorce et de charbon actif montre également que le charbon actif présente un réseau de canaux

profonds et organisés (le diamètre des pores est d’environ 15 µm) alors que l’écorce est beaucoup

moins organisée et présente de plus gros pores, d’environ 50 µm de diamètre (Figures 2 et 3).

Lorsque l’écorce est broyée à 200 µm, la structure longitudinale des particules est détruite et les

canaux internes ne sont plus visibles ; seule une structure en feuillets superposés est encore

observable.

Le charbon semble ainsi présenter une structure poreuse beaucoup plus importante que l’écorce de

pin.

I.5 Préparation de l’écorce en vue des études d’adsorption

Les morceaux d’écorce brute ont été broyés dans un broyeur à lame (Retsch SM 2000/1430 UPM) sur

une grille de 2 mm. La poudre d’écorce a ensuite été séparée en différentes fractions

granulométriques sur des tamis de 200 µm, 400 µm, 700 µm et 2 mm. L’écorce en poudre a été

séchée dans une étuve à 80°C pendant 24 h avant chaque utilisation puis conservée si nécessaire

dans un récipient hermétique.



88

Figure 4 : Ecorce brute de pin Pinus Pinaster

I.6 Préparation d’un extrait aqueux d’écorce de pin

L’utilisation d’extrait d’écorce de pin nous a permis de réaliser des expériences en milieu liquide, tout

en gardant des conditions chimiques similaires aux conditions imposées par la présence de l’écorce

elle-même (pH acide et présence des composés hydrosolubles de l’écorce). L’utilisation d’extrait a

ainsi permis d’étudier la croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader

l’atrazine dans ces conditions tout en s’affranchissant des autres processus liés à la présence de

particules dans le milieu tels que les phénomènes d’adsorption.

L’extrait d’écorce de pin a été obtenu en mettant au contact de la poudre d’écorce (d<200 µm) avec

de l’eau déminéralisée, à un ratio liquide / solide de 20 mL.g-1 pendant 48h, sous une agitation orbitale

de 120 rpm. L’extrait est filtré sur une membrane de nitrate de cellulose (0,45 µm) puis conservé à

5°C.

I.7 Méthode de stérilisation

Dans un premier temps, l’étude de la croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à

dégrader l’atrazine dans les conditions imposées par l’écorce de pin a été menée en milieu stérile

nécessitant la stérilisation soit de l’écorce elle-même soit de l’extrait utilisé dans les expériences en

milieu liquide.

L’écorce en poudre a été stérilisée par deux autoclavages successifs à 120°C pendant 20 minutes,

espacés chacun de 20 heures, directement dans les flacons utilisés pour l’expérimentation. Cette



89

méthode a été inspirée d’une étude réalisée sur les méthodes de stérilisation des sols (Wolf et al.

1989).

L’extrait aqueux d’écorce de pin a, quant à lui, été stérilisé par filtration à 0,2 µm sur des membranes

de nitrate de cellulose.

MATERIEL ET METHODES Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin


90

II. Adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin

II.1. Matériel et Méthodes

II.1.1 Etude de l’adsorption en batch

II.1.1.1 L’atrazine : caractéristiques générales et méthodes d’analyses

II.1.1.1.1 Caractéristiques physico-chimiques

La formule développée (Figure 5) ainsi que les principales caractéristiques physico-chimiques de

l’atrazine sont présentées dans le Tableau 5.

N

N

N

Cl

NN

HH (2-chloro-4-ethylamino-6isopropylamino-1,3,5triazine)

Figure 5 : Formule développée de l’atrazine

Tableau 5 : Propriétés physico-chimiques de l’atrazine (source : Dialogweb.com)

Formule brute C8H14ClN5

Aspect Cristallin solide, incolore

Masse molaire 215,69 g.mol-1

Masse volumique 1,2 g/cm3 à 20°C

pKa* 1,64

Solubilité dans eau 30 mg.L-1 à 20°C ; 70 mg.L-1 à 25°C

Solubilité dans méthanol 15000 mg/l à 20°C

Pression de vapeur 3.85 x 10-5 Pa à 25°C

Point de fusion 175,8 °C

Point d’ébullition 205,0 °C / 101 kPa

Stabilité Relativement stable à pH neutre, légèrement acide ou basique.

Rapidement hydrolysé à pH très acide ou très basique et à 70°C à pH

7.

DT50 9,5 j. (pH 1), 86 j. (pH 5), 5,0 j. (pH 13)

Kow 398

Coefficient de partition log P : 2,5 log Kow : 2,6

Moment dipolaire 4,63 Debye (Weber 1967)

* pKa de la forme protonée



91

On retiendra essentiellement de ces caractéristiques que l’atrazine est une base faible (pKa de la

forme protonée 1,64), et qu’elle n’est donc pas ionisée à des pH aux alentours de 4-5 souvent

imposés par la présence de l’écorce de pin dans un milieu liquide aqueux.

On note également la faible hydrosolubilité de l’atrazine qui nous a conduits à utiliser des solutions

mères à 2000 mg.L-1 préparées dans le méthanol et diluées dans l’eau au moment des essais pour

obtenir les concentrations initiales souhaitées. La présence résiduelle de méthanol agissant comme

cosolvant dans les solutions aqueuses ainsi préparées a permis de travailler à des concentrations en

atrazine allant jusque 50 mg.L-1.

L’effet du méthanol résiduel sur l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a été testé (Figure 6).

Figure 6 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en présence de MeOH (A) ou sans MeOH (B) ; diamètre des particules d’écorce :d<200 µm ; ratio L/S=20 ; température 20°C ; temps de

contact 24h.

On remarque que la présence de méthanol (0,1 à 2,5 % dans les essais) a un effet négatif sur

l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin, la présence de méthanol augmentant l’affinité de

l’atrazine pour la solution. D’autre part, l’incidence de la présence du méthanol en solution sur la

croissance des micro-organismes et leur capacité à biodégrader l’atrazine a fait l’objet d’une étude

particulière (voir § III.1.4.1) ; cette étude montre que le méthanol présent à de telle concentration dans

le milieu n’avait pas d’effet ni sur la croissance ni sur l’activité de Pseudomonas ADP sp., utilisé dans

notre bio-procédé. Cet effet est cependant négligeable aux faibles concentrations (C<0,1 mg.L-1) ce

qui correspond au domaine de concentrations privilégié de notre étude. Nous avons donc choisi, pour

des raisons pratiques, de travailler avec ces solutions mères préparées dans le méthanol.

y = 0,1845x + 0,0031

y = 0,3036x + 0,0038

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Ceq (mg/l)

q (m

g/g)

A- Sol. mère / MeOH

B- Atrazine dans Eau



92

II.1.1.1.2 Méthodes d’analyse

(a) Chromatographie Liquide Haute Pression

L’atrazine a été dosée par chromatographie liquide en mode isocratique grâce à une HPLC Waters

Module I Plus équipée d’une colonne RP-18 Supelcosil (prévue pour la séparation des pesticides

organochlorés) et d’un détecteur UV réglé à 220 nm. La phase mobile, constituée d’un mélange

d’acétonitrile / Eau ultra Pure (50 :50, vol :vol), a été utilisée à un débit de 1 mL.min-1.

L’eau Ultra Pure est préparée grâce à un appareil Millipore MilliQ Gradient. Les phases mobiles ont

été dégazées à l’hélium pendant toute la durée des analyses (20 mL.min-1).

Dans ces conditions opératoires, le temps de rétention de l’atrazine est d’environ 7,3 minutes et la

limite de détection de 0,03 mg.L-1.

Les chromatogrammes ont été traités à l’aide du logiciel d’integration APEX.

(b) Dosage par Immuno-essai

Le dosage de l’atrazine à de faibles concentrations, de l’ordre de quelques µg.L-1, a été réalisé avec le

kit Atrazine Hach (Atrazine Reagent Set, ref. 27627-10) commercialisé par Hach Cie et utilisé comme

méthode semi-quantitative. La gamme de concentrations à utiliser pour ce kit est de 0,1 µg.L-1 à

3 µg.L-1. Cette méthode a été utilisée dans les expériences en colonnes (V.1.2). L’emploi de ce kit a

permis de travailler à des concentrations correspondant à une pollution réelle (de quelques µg.L-1

d’atrazine).

Le principe du dosage en kit consiste en une réaction antigène-anticorps ; le dosage est réalisé dans

des cuves de 1 mL recouvertes d’anticorps spécifiques à l’atrazine. La concentration en atrazine est

déterminée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 450 nm. La concentration en atrazine

est inversement proportionnelle à l’intensité de la couleur développée.

Protocole de dosage immuno-essai : La solution à doser (0,5 mL) est introduite dans une cuve, contenant les anticorps « anti-atrazine »

fixés sur ses parois. Une solution d’enzyme conjuguée (0,5 mL) est additionnée et le tout est

vigoureusement agité pendant 30 secondes. La réaction s’effectue pendant 20 minutes puis le

contenu de la cuve est jeté et la cuve est rincée 4 fois à l’eau déminéralisée.

Une solution permettant le développement de la couleur est placée dans la cuve (0,5 mL), agitée puis

la réaction se fait pendant 10 minutes. Enfin, 0,5 mL de solution d’arrêt permettant de bloquer la

réaction colorimétrique sont additionnés avant lecture au spectrophotomètre à 450 nm.

Des étalons fournis avec le kit (concentrations 0,1 µg.L-1 ; 0,5 µg.L-1 ; 3 µg.L-1) ont été utilisés afin de

tracer la courbe de calibration.



93

(c) Suivi des essais avec des molécules marquées au 14C

Des études d’adsorption à faibles concentrations en atrazine ont pu être réalisées grâce à l’utilisation

d’atrazine marquée [U-ring-14C]-atrazine commercialisée par Sigma Aldrich (pureté 98,6% ; activité

26,4 mCi.mmol-1).

Suivie de la radioactivité en solution Le suivi de la radioactivité dans la phase liquide des essais d’adsorption a été réalisé par prélèvement

de 0,1 à 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring-14C]-atrazine. 7 mL de

liquide à scintillation sont additionnés au prélèvement puis le mélange est analysé au compteur à

scintillation.

II.1.1.2 Cinétique d’adsorption

L’étude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a, dans un premier temps, été réalisée en

batch. Les cinétiques d’adsorption ont ainsi été déterminées à 20°C en milieu dispersé en mettant en

contact l’atrazine en solution aqueuse avec une quantité connue d’écorce de pin en poudre dans des

tubes en verre de contenance 20 mL (ratio liquide/solide = 10 mL.g-1 ; 1g d’écorce stérile (d<200 µm)

dans 10 mL d’eau déminéralisée stérile), le tout en conditions stériles afin de s’affranchir de tout effet

biologique et à l’abri de la lumière. Les tubes ont été placés sur un agitateur par retournement

(10 rotation/minute). Les cinétiques d’adsorption ont été étudiées à différentes concentrations initiales

en atrazine : 0,5 mg.L-1, 1,4 mg.L-1, 2,7 mg.L-1, 10,7 mg.L-1 et 15 mg.L-1. L’atrazine a été additionnée

aux essais à partir d’une solution mère de 200 mg.L-1 de méthanol.

Figure 7 : Essais de cinétique d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en milieu dispersé

L’adsorption de l’atrazine a été suivie en sacrifiant des tubes aux temps : 0, 10 minutes, 45 minutes,

2 heures, 6, 22, 32 et 46 heures. Le surnageant (1 mL) prélevé a été filtré sur des membranes de

0,45 µm en acétate de cellulose avant d’être analysé par l’HPLC. Chaque essai a été réalisé en



94

triplicats et des blancs sans écorce et/ou sans atrazine ont permis d’identifier les éventuelles pertes

ou transformations de l’atrazine, et d’identifier les pics provenant du relargage des composés solubles

de l’écorce dans l’eau.

II.1.1.3 Isothermes d’adsorption

Des isothermes d’adsorption ont été réalisées dans les mêmes conditions de température et

d’agitation que celles citées ci-dessus (II.1.1.2). Un temps d’agitation de 24h, correspondant à

l’équilibre apparent déterminé grâce aux études cinétiques, a été respecté. Les essais d’adsorption de

l’atrazine ont ensuite été réalisés avec différentes granulométries d’écorce de pin : d< 200µm,

200<d<500 µm, 500<d<2000 µm, à différents ratios L/S : L/S =10, 20, 40, 100 et 1000 mL/g.

L’effet du pH a également fait l’objet d’une étude particulière (l’adsorption à pH 7 et pH 4 a été

étudiée).

Les isothermes d’adsorption ont été tracées pour différentes gammes de concentrations en atrazine.

Pour les concentrations les plus faibles (de l’ordre de quelques µg.L-1) l’atrazine radioactive [U-ring-14C]-atrazine a été utilisée. Les isothermes d’adsorption ont ainsi pu être tracées pour des

concentrations initiales en atrazine comprises entre 2,6 µg.L-1et 20 mg.L-1.

Les essais ont été réalisés triplicats.

II.1.1.4 Extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin

Des expériences d’extraction de l’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin ont été menées à plusieurs

reprises. Différentes méthodes ont été choisies mais malheureusement aucune d’entre elles n’a pu

répondre à nos attentes, le pourcentage d’atrazine extraite étant à chaque fois trop faible pour pouvoir

être pris en considération.

Les techniques d’extraction testées ont été les suivantes :

- Extraction SDE (Simultaneous Distillation Extraction) : Les solvants testés ont été le dichlorométhane et le chloroforme.

- Extraction au soxhlet : Les solvants testés ont été le dichlorométhane et le chloroforme.

- Extraction en milieu aqueux : Extractions à froid (20°C) avec une solution aqueuse de HCl (pH 2) et une solution aqueuse de NaCl

2M (pH 4).



95

II.1.2 Etude de l’adsorption en colonne

II.1.2.1 Courbes d’élution d’un soluté

La courbe obtenue par l’analyse de la solution en sortie de colonne est appelée « courbe d’élution ».

Lorsque l’injection de la solution contenant le traceur (ou tout autre soluté) est effectuée en créneau,

la caractéristique de la courbe d’élution peut se présenter de différentes manières (Figure 8).

Figure 8 : Différentes courbes d’élution rencontrées suite à une injection en créneau (1 à 3). C et V expriment respectivement la concentration en soluté et le volume de solution cumulé récolté en sortie de colonne ; Vo représente le volume d’eau total contenu dans la colonne, C0 est la concentration entrante

de soluté

- 1 : Courbe d’élution symétrique ; son sommet correspond au temps de séjour moyen.

Elle représente une fonction de distribution de type gaussien, qui signifie que

l’écoulement se déroule dans une structure homogène sans zone morte ni chemin

préférentiel. L’élargissement de la courbe par rapport au créneau résulte de la

dispersion axiale et radiale du soluté.

- 2 : Courbe asymétrique dans laquelle le front compressif (montée) est plus rapide que

le front diffusif (descente). Cet effet est lié à la présence de zones mortes ou

stagnantes, où l’échange entre les molécules entrantes et les molécules sortantes est

très lent.

- 3 : la présence de deux pics résulte de l’existence de chemins préférentiels.

Co

C(t) Co

V

C/Co

V/Vo

C/Co

V/Vo

C/Co

V/Vo

Injection

3

1

2



96

L’expression de ces courbes en concentration relative (C/Co) par rapport au volume relatif (V/Vo) ou

au temps t permet de s’affranchir de certaines variations dans les conditions opératoires (variation de

la concentration en entrée, de la vitesse d’écoulement, etc.) et permet de comparer les différentes

courbes d’élution entre elles. La représentation d’une courbe d’élution exprimée en concentration

relative en fonction du temps ou du volume relatif est appelée « courbe de distribution des temps de

séjour » (DTS).

L’analyse de la courbe d’élution fournit un certain nombre de paramètres caractéristiques, comme le

bilan de masse BM et le facteur de retard R.

Le bilan de masse s’exprime comme suit :

tBM

∆= 0µ

où ∆t est le temps d’injection du soluté (correspondant à 1 V0 dans le cas du traceur).

µ0 exprime l’aire sous la courbe d’élution et est calculée par :

dtC

tC∫∞

=0 0

0)(µ

La valeur de BM permet de décrire le comportement du soluté:

• Si BM = 1, toute la masse de soluté injectée en entrée est récupérée en sortie. Les

interactions pouvant se produire au cours de l’écoulement sont entièrement réversibles et le

soluté est dit « conservatif ».

• Si BM<1, une partie de la masse injectée est perdue suite à des réactions ou des interactions

irréversibles (volatilisation, précipitation, adsorption, dégradation biologique ou chimique,…).

Le facteur de retard permet d’évaluer le retard d’un soluté réactif au cours de son transfert par rapport

au transfert d’un soluté non réactif. Il est défini par le quotient entre les deux temps de séjour :

théoriques

solutés

tt

R =

avec

qLt théoriques

ε.=



97

où ,

- L : Longueur de la colonne (m)

- ε : Teneur en eau dans la colonne (-)

- q : Vitesse de Darcy en entrée de colonne (m.s-1)

Le facteur de retard R est un indicateur des interactions éventuelles existantes :

o Si R = 1, il n’existe aucune interaction entre le soluté et la matrice.

o Si R < 1, l’avancement du soluté est plus rapide que celui des molécules

d’eau. Ceci peut être dû à l’exclusion anionique.

o Si R > 1, le soluté est soumis à des interactions avec la matrice au cours de

son transfert, et est donc élué en retard par rapport aux molécules non

réactives de la solution.

II.1.2.2 Caractérisation de l’écoulement à l’aide de traceurs

Le traçage est une procédure expérimentale qui permet de rendre observable le déplacement réel de

l’eau, dans un milieu poreux, suivant une ou des trajectoires définies, entre un point d’origine et un ou

plusieurs points de détection, au moyen de traceurs artificiels.

II.1.2.2.1 Choix du traceur

Un traceur idéal a, en tout point, un comportement identique à celui de l’eau ou du liquide qui s’écoule

à travers du milieu poreux. C’est donc une substance non réactive. En pratique, on utilise souvent des

traceurs anioniques. Parmi ceux-ci on peut citer les sels de bromure, les chlorures ou certains

colorants.

II.1.2.2.2 Suivi du traceur en sortie de colonne

Après saturation de la colonne en eau, un volume de 1V0 de la solution de KCl (1g.L-1) est injecté en

créneau grâce à une vanne d’entrée, à l’intérieur de la colonne. La concentration en KCl est suivie en

sortie de colonne par conductimétrie. Une cellule de conductivité (XE100 Radiometer) reliée à un

analyseur CONSORT C832 permet de suivre la conductivité en continu par intégration sur ordinateur

des données toutes les 45 secondes. La solution circulante est envoyée avec un débit de 1 mL.min-1.

La courbe d’élution est exprimée en C/Co en fonction de V/Vo.



98

II.1.2.3 Méthodes expérimentales d’adsorption en colonne

II.1.2.3.1 Préparation des colonnes

Les colonnes utilisées sont des colonnes en verre de chromatographie (fournisseur Amersham

Biosciences) de dimensions L = 400 mm de hauteur et 25 mm de diamètre interne. Les colonnes sont

équipées de deux pistons dont l’extrémité qui est mise en contact avec le milieu poreux est protégée

par une grille plastique (maille de 1 mm2) recouvert d’une membrane en nylon (diamètre des pores

10 µm). L’étanchéité est assurée grâce à des joints caoutchouc. Les tubulures utilisées sont en

polyéthylène. La Figure 9 représente le détail des colonnes utilisées.

Figure 9 : Schéma d’une colonne

Les colonnes sont remplies avec environ 10 g de milieu poreux (écorce de pin en poudre ou charbon

actif dans certains cas). Le remplissage est fractionné, c’est à dire que tous les 2 g, une pression est

appliquée sur le matériau afin d’homogénéiser le tassement. Le milieu est ensuite pressé entre les

deux pistons (la hauteur de la colonne contenant le support d’adsorption représente environ 7 cm).

Colonne de verre(Dint 26mm, L 400 mm)

Joint caoutchouc

Grille protectrice

Membrane nylon

Tube PTFE



99

Les colonnes sont dans un premier temps saturées en eau par circulation en flux ascendant d’eau

déminéralisée stérile pendant 12 h environ jusqu’à obtenir un poids constant des colonnes.

Un traçage au KCl est ensuite effectué (comme décrit ci-dessus II.1.2.2.2) ; il permet de rendre

compte du comportement hydrodynamique des colonnes. Lorsque aucune irrégularité ne survient (le

pic d’élution est symétrique), les essais d’adsorption peuvent commencer. Si la courbe d’élution du

traceur présente une asymétrie, la colonne est vidée, remplie de nouveau et testée de nouveau.

Chaque colonne mise en place est caractérisée par un certain nombre de paramètres cités dans le

tableau ci-dessous (Tableau 6)

Tableau 6 : Caractéristiques d’une colonne

Paramètres colonne Symbole Unité

Diamètre interne d cm

Section S cm2

Hauteur du lit L cm

Masse de milieu poreux m g

Volume du lit Vt cm3

Volume de pore Ve ou V0 cm3

Indice de vide e (Ve/Vs) -

Contenu en eau mobile ou porosité totale ε (Ve/Vt) -

Flux D cm3.h-1

Vitesse de Darcy q (D/S) cm.h-1

Vitesse de pore V (q/ ε) cm.h-1

Le volume d’air Va est considéré comme nul, et le degré de saturation s=1.

L’écorce de pin utilisée en colonne est constituée de particules de diamètre inférieur à 200 µm.

Pour certains essais l’écorce de pin stérilisée a été utilisée afin de tester l’influence de la stérilisation

sur l’adsorption de l’atrazine. La stérilisation de l’écorce de pin a été réalisée comme précisé au § I.7.

L’hydrodynamique de l’écorce de pin et du charbon actif a également été comparée.

Les particules de charbon actif utilisé (Darco G-60 fourni par Aldrich) possèdent un diamètre inférieur

à 200 µm.



100

II.1.2.3.2 Suivi du COD, du pH et de la conductivité en sortie de colonne

Lors de la circulation de l’eau à travers la colonne, certains composés organiques de l’écorce de pin

sont solubilisés dans la solution circulante ; une analyse du carbone organique dissous (COD) en

sortie de colonne permet d’évaluer la quantité de carbone relarguée au cours du temps. D’autre part,

lors de la solubilisation des composés de l’écorce en solution, le pH de l’eau ainsi que la conductivité

varient avec le volume de solution filtrée. Un système d’électrodes, positionné en sortie de colonne,

permet de suivre en ligne l’évolution du pH et de la conductivité en fonction du volume passé à travers

la colonne.

Le pH et la conductivité sont suivis simultanément par un appareil CONSORT C832 relié à une

électrode pHC3001 et une cellule de conductivité XE100 Radiometer. Chaque électrode est plongée

dans une cellule à débordement de 1mL, traversée par la solution en sortie de colonne. L’installation

est représentée Figure 10. Le Multianalyser CONSORT C832 est relié à un ordinateur à partir duquel

sont enregistrées les données toutes les 45 secondes.

Pour l’analyse du COD, les échantillons collectés ont été filtrés sur une membrane filtrante de

0,45 µm ; le carbone inorganique a été éliminé par acidification à l’acide phosphorique puis purgé par

barbotage à l’hélium. Les échantillons collectés ont été analysés au COT mètre O.I. Analytical 1020A

selon la norme européenne EN 1484.



101

Aquisition informatique

Cond.

Multianalyser CONSORT C832 - pH - Conductivité

pH

Pompe Peristaltique

Eau déminéralisée ou

Solution d’atrazine

10 g écorce de pin

Flux : 1 ml/min

Collecteur de fractions

COTMètre

Conditions stériles

HPLC

Figure 10 : Dispositif expérimental pour l’étude de l’adsorption en colonne

II.1.2.3.3 Adsorption de l’atrazine en colonne

Les essais d’adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin ont été réalisés à une concentration

entrante d’environ 0,2 mg.L-1, dans un premier temps. La capacité d’adsorption de l’atrazine a été

testée avec l’écorce préalablement stérilisée (Cf. I.7) ou non stérilisée ; une colonne de charbon actif

a également été préparée.

Les colonnes sont préparées et remplies comme décrit ci-dessus (II.1.2.3.1) ; après saturation en eau,

le comportement hydrodynamique des colonnes est contrôlé par un traçage au KCl (II.1.2.2.2). Un

biocide (NaN3 200 mg.L-1) est additionné à la solution entrante d’atrazine afin d’assurer des conditions

abiotiques et ainsi s’affranchir de tout phénomène biologique pouvant entraîner une dégradation

partielle du pesticide. L’installation est représentée Figure 10.

La solution est injectée dans les colonnes en flux ascendant à des débits de 1 mL.min-1 ou

0,3 mL.min-1. Les échantillons sont prélevés à intervalle de temps régulier par un collecteur de

fractions directement placé en sortie de colonne. Les échantillons sont ensuite analysés par HPLC

permettant de détecter une concentration minimale en atrazine de 0,03 mg.L-l.

RESULTATS ET DISCUSSION Etude de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin


102

II.2 Résultats et discussion

II.2.1 Etude de l’adsorption en batch

II.2.1.1 Cinétiques d’adsorption

Les études de cinétique d’adsorption ont été réalisées pour des concentrations initiales en atrazine

(Ci) comprises entre 0,5 mg.L-1 et 15 mg.L-1, dans des tubes en verre soumis à une agitation par

retournement pendant environ 50 heures, selon le protocole (II.1.1.2).

Les cinétiques ont permis de fixer le temps d’équilibre apparent d’adsorption de l’atrazine sur le

support d’écorce de pin. Les résultats sont présentés ci-dessous.

0,0

5,0

10,0

15,0

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=15 ppm

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=1,4 ppm

0,0

0,7

1,4

2,1

2,8

0 10 20 30 40Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=2,7 mg/l

0,0

4,0

8,0

12,0

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=10,7 ppm

0,0

0,2

0,4

0,6

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l

-1)

Ci=0,5 mg/l

0,0

2,0

4,0

6,0

0 10 20 30 40

Temps (h)

Atr

azin

e ad

sorb

ée (m

g.l-1

)

Ci=5 mg/l

Figure 11 : Cinétique de l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d<200 µm) à différentes

concentrations initiales ; 20 ± 2°C ; L/S = 20 mL.mg-1

La Figure 11 montre que l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en poudre (d < 200 µm), a lieu

principalement lors des premières minutes de contact. Quelle que soit la concentration initiale en

atrazine, le pourcentage d’adsorption excède toujours les 92%. Au bout de 24 h de mise en contact de

l’atrazine et de l’écorce de pin en poudre, l’équilibre apparent est atteint ; c’est le temps que nous



103

avons choisi d’utiliser pour réaliser tous les essais ultérieurs d’adsorption en batch de l’atrazine sur

l’écorce.

II.2.1.2 Isothermes d’adsorption

Les isothermes d’adsorption ont été tracées afin de comparer la capacité de l’écorce à adsorber le

polluant atrazine dans différentes conditions expérimentales. Ainsi, les essais d’adsorption ont été

réalisés pour différents ratios liquide/solide, différentes granulométries de particules d’écorce, à

différents pH et dans une gamme de concentrations en atrazine relativement étendue : de quelques

µg.L-1 à plusieurs dizaines de mg.L1.

II.2.1.2.1 Influence de la granulométrie de l’écorce de pin sur l’adsorption de l’atrazine

Afin de sélectionner les meilleures conditions d’adsorption de l’atrazine pour notre procédé de

traitement, des études sur l’influence de la granulométrie de l’écorce sur sa capacité d’adsorption ont

été menées selon le protocole décrit au § II.1.1.3, pour 3 diamètres différents de particules d’écorce :

d<200 µm ; 200 µm < d < 500 µm ; 500 µm<d< 2000 µm. Les résultats des essais d’adsorption sont

présentés Figure 12.

Figure 12 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée en poudre de différentes granulométries (d<200 µm ; 200 µm < d < 500 µm ; 500 µm< d < 2000 µm ; mélange de particules

d<2000 µm) ; 20 ± 2°C ; pH 4,5 ; Temps de contact 24h

L’application du modèle de Freundlich permet d’obtenir les constantes caractéristiques de l’adsorption

Kf et n. Les paramètres du modèle de Freundlich obtenus pour les différentes tailles de particules

d’écorce de pin sont présentés Tableau 7. Les valeurs de la constante de Freundlich Kf ((mg. g-

1)(L.mg-1)1/n) montrent la faible capacité d’adsorption de l’écorce de pin vis à vis de l’atrazine avec des

valeurs de Kf inférieures à 0,155 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n. D’autre part, les coefficients n très proche de 1,

montrent que les isothermes sont quasiment linéaires.

y = 0,064x + 0,0017R2 = 0,985

y = 0,0818x + 0,0037R2 = 0,9984

y = 0,0848x + 0,0079R2 = 0,9958

y = 0,1478x + 0,0077R2 = 0,978

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Ceq (mg.l-1)

q (m

g.g-

1)

d<200 µm

200 µm<d<500 µm

500 µm<d<2000 µm

mélange d<2000 µm



104

Campos et al. (2000) obtiennent à titre d’exemple, pour l’adsorption d’atrazine sur un charbon actif en

poudre des constantes de Freundlich de l’ordre de 50 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n (n=0,44).

Tableau 7 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de l’atrazine sur des particules d’écorce de pin autoclavée de différentes granulométries

Avec Kf en (mg. g-1)(L.mg-1)1/n

L’écorce de pin présente une meilleure capacité d’adsorption de l’atrazine pour la granulométrie la

plus petite (diamètre des particules inférieur à 200 µm). Ce résultat est logique puisque, lorsque la

surface de contact augmente, la capacité d’adsorption augmente aussi. On note également que le

mélange (d<2000 µm, sortie directement du broyeur sans tamisage ultérieur) présente une capacité

d’adsorption proche de celle de la poudre la plus fine avec un Kf de 0,0927 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n.

Lorsque le criblage est réalisé sur le mélange, la fraction inférieure à 200 µm représente la fraction

majoritaire ; ainsi cette fraction fine, qui présente la meilleure capacité d’adsorption, sera retenue pour

toutes les expérimentations ultérieures.

II.2.1.2.2 Influence du pH sur l’adsorption de l’atrazine

L’écorce de pin en poudre présente dans une solution aqueuse impose un pH acide à cette solution

aux alentours de 4-5. L’effet du pH sur l’adsorption de l’atrazine sur les particules d’écorce a été testé

à l’aide de solutions d’atrazine tamponnées à pH 7 et pH 4. Le protocole de ces essais est détaillé au

§ II.1.1.3. La Figure 13 présente les isothermes d’adsorption obtenues à pH 4 et à pH 7.

(µm) Kf n d<200 0,1555 0,964 200<d<500 0,0855 0,968 500<d<2000 0,0657 0,981 Mélange <2000 0,0927 0,937



105

Figure 13 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée (d<200 µm) en

suspension aqueuse tamponnée à pH 4 ou pH 7 ; rapport L/S =40 ; 23 ± 2 °C ; temps de contact 24 h

Tableau 8 : Coefficients du modèle de Freundlich caractérisant les isothermes d’adsorption de l’atrazine (Ci=0,3 à 5,5 mg.L-1) en solution à pH 4 et pH 7 sur des particules d’écorce de pin

Avec Kf en (mg. g-1)(L.mg-1)1/n

Le pH de la solution d’atrazine a une influence sur l’adsorption de celle-ci sur le support d’écorce de

pin. A pH 4 le coefficient d’adsorption de Freundlich Kf atteint 0,243 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n contre

0,171 (mg. g-1)(L.mg-1)1/n à pH 7. L’augmentation de l’affinité de l’atrazine pour l’écorce de pin à pH 4

pourrait s’expliquer par une éventuelle protonation des sites de l’écorce. Le paramètre n très proche

de 1 caractérise la linéarité des isothermes dans cette gamme de concentrations et de pH.

Travailler à pH 4 pourrait donc présenter un avantage ; cependant le traitement biologique combiné au

procédé d’adsorption va également imposer des conditions qui dans le cas d’une activité biologique,

pourrait ne pas concorder avec les conditions optimales d’adsorption. L’activité des micro-organismes

utilisés pour notre procédé combiné, sera etudiée à pH 4 lors de l’approche biologique (III.2.2.2).

II.2.1.2.3 Isotherme d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin dans une large gamme de

concentrations

La caractérisation de l’adsorption sur l’écorce a été réalisée pour une gamme de concentrations très

large en atrazine, allant de quelques µg.L-1 a plusieurs mg.L-1, pour différents ratios Liquide/Solide.

Les isothermes d’adsorption à faibles concentrations (jusqu’à 2,6 µg.L-1) en atrazine ont été réalisées

grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive (protocole au § II.1.1.3).

y = 0,233x + 0,0103

y = 0,1677x + 0,0034

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Ceq (mg.L-1)

q (m

g.g

-1)

pH 4

pH 7

pH Kf n 4 0,243 0,969 7 0,171 0,986



106

Les Figure 14 et Figure 15 représentent les isothermes d’adsorption pour deux gammes de

concentrations différentes. Dans les deux cas, la diminution du ratio L/S entraîne la réduction de

l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. Ce résultat indique que la dispersion des particules d’écorce en

suspension est modifiée en fonction du ratio liquide/solide utilisé ; l’agrégation des particules d’écorce

à faible ratio L/S pourrait entraîner la réduction de l’accessibilité des molécules d’atrazine aux sites

d’adsorption de l’écorce.

Figure 14 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine]i= 2,6 à 749 µg.L-1) sur l’écorce de pin en

poudre (d<200 µm) ; ratio L/S = 10, 100 et 1000 ; 20 ± 2°C ; pH 4-5 ; temps de contact 24h

Figure 15 : : Isothermes d’adsorption de l’atrazine ([atrazine]i= 1 à 20 mg.L-1) sur l’écorce de pin en poudre

(d<200 µm) ; ratio L/S = 10, 20 et 100 ; 20 ± 2°C ; pH 4-5 ; temps de contact 24h

y = 0,1478x + 0,0077

y = 0,1861x + 0,0046

y = 0,2723x + 0,0587

0

0,04

0,08

0,12

0,16

0,2

0,24

0,28

0,32

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6

Ceq (mg/l)

q (m

g/g)

L/S=100

L/S=20

L/S=10

y = 0,2087x + 1,8534

y = 0,1214x + 1,4086

y = 0,0227x + 0,2525

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Ceq (µg/l)

q (µ

g/g)

L/S=1000

L/S=100

L/S=10



107

L’adsorption à ratio L/S=10 à faible concentration est réduite comparée à l’adsorption observée à plus

forte concentration. Cette observation peut être expliquée par un phénomène d’agrégation des

particules d’écorce entre elles, ce qui diminuerait la surface totale d’adsorption pour les molécules

d’atrazine.

Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en poudre (d<200 µm) et l’adsorption sur

un charbon actif en poudre de granulométrie comparable, on remarque que la capacité d’adsorption

de l’écorce de pin est très faible par rapport à celle du charbon actif (Figure 16). Cette différence

s’explique entre autres par la porosité des matériaux. Le charbon actif en poudre possède une surface

spécifique environ 100 fois supérieure à celle de l’écorce de pin.

Figure 16 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin (d<200 µm) et sur charbon actif

(d<200 µm) ; ratio L/S=1000 ; 20 ± 2°C ; temps de contact 24h

Dans le cadre d’un procédé physique de décontamination (adsortpion), le charbon actif devra être

préféré à l’écorce de pin. Dans un procédé de décontamination tel que celui étudié ici, combinant

adsorption et biodégradation, la faible capacité d’adsorption de l’écorce peut devenir un avantage,

puisque le polluant restera plus disponible pour les micro-organismes choisis pour ce traitement.

II.2.2 Etude de l’adsorption en colonnes abiotiques

L’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin a été étudiée en colonne de 10 g de matériau sec.

Les essais ont été réalisés en conditions abiotiques selon le protocole décrit au § II.1.2.3.

Dans un premier temps, un traceur (KCl) a permis de vérifier le comportement hydrodynamique de

nos colonnes ; puis le suivi de la solution en sortie de colonne a permis d’évaluer les quantités de

y = 0,3047x + 0,2255

y = 87,59x + 1,3367

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ceq (µg/l)

q (µ

g/g)

Charbon Actif

Ecorce de pin



108

matière organique libérée par l’écorce de pin ; le pH et la conductivité ont également été suivis en

sortie de colonne.

II.2.2.1 Etude hydrodynamique des colonnes

Le comportement hydrodynamique des colonnes d’écorce de pin stérile et des colonnes d’écorce non

stérile a été étudié en parallèle.

La Figure 17 présente les courbes d’élution pour ces deux types de colonnes après injection de 1V0

d’une solution de KCl (1g.L-1). Les caractéristiques des colonnes sont présentées ANNEXE 3.

Figure 17 : Comportement hydrodynamique : Transfert de KCl dans les colonne d’écorce de pin stérile (droite) ou non stérile (gauche) ; Débit de colonne = 1 mL.min-1 ; 22°C

Les comportements hydrodynamiques des colonnes d’écorce de pin stérile ou non stérile sont très

semblables. Dans les deux cas, le point d’inflexion de la courbe ascendante est obtenu après 1V0,

(R=1,002 et 0,96 pour l’écorce stérile et non stérile respectivement) indiquant l’absence de retard

dans l’élution du KCl. Cependant un délai de restitution du KCl est observé (phase descendante)

suggérant la présence de phénomènes de dispersion. Ce retard peut être expliqué par la présence de

zones stagnantes à l’intérieur de la colonne ou la dilution de la solution en sortie de colonne dans les

cellules contenant l’électrode de conductivité (dilution dans 1-2 mL). L’apparition d’un léger plateau

dans le cas de l’écorce non stérile peut s’expliquer par l’existence de chemins préférentiels dans la

colonne.

Dans les deux cas, le KCl injecté est récupéré en sortie à 100% (Bilan massique BM = 0,98) ; le KCl

n’est donc pas retenu sur l’écorce et constitue un bon traceur pour les colonnes d’écorce de pin. Ce

traçage au KCl avant chaque utilisation d’une nouvelle colonne, a permis de mettre en évidence

certains défauts de préparation (zones stagnantes, chemins préférentiels) par la présence

d’irrégularité sur les courbes d’élution. Dans ce cas les colonnes ont été préparées à nouveau.

Ecorce non stérile

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

V/Vo

C/C

o

Ecorce stérile

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8V/Vo

C/C

o

Ecorce non stérile Ecorce stérile



109

II.2.2.2 Suivi du COD, pH et conductivité en sortie de colonne

Le passage de la solution aqueuse polluée à travers la colonne entraîne la solubilisation de certains

composés organiques solubles de l’écorce de pin, ainsi qu’une acidification de la solution. L’évaluation

en sortie de colonne de la concentration en Carbone Organique Dissous (COD) ainsi que des

paramètres pH et conductivité a été mise en œuvre selon le schéma présenté Figure 10 (§ II.1.2.3.2)

pour des colonnes d’écorce de pin stérile et non stérile. Les caractéristiques des colonnes utilisées

pour cette expérience sont présentées en ANNEXE 3.

La Figure 18 montre que la libération de matière organique issue de la solubilisation de composés de

l’écorce de pin est relativement identique pour les colonnes d’écorce stérile et non stérile. La

concentration de carbone organique est très élevée dans les premiers échantillons collectés (2500

mg.L-1 pour l’écorce non stérile et 2300 mg.L-1 pour l’écorce stérile). Rapidement, le COD en sortie de

colonne diminue et atteint 70 mg.L-1 entre 10 et 30 V0 (correspondant à un volume de 200 à 600 mL) ;

puis le COD devient inférieur à 20 mg.L-1 après 35 V0. Cette concentration est assez élevée puisque

proche des limites de rejet d’eaux brutes dans dans le milieu naturel (DCOmax 125 mg.L-1, soit une

concentration en carbone d’environ 30-50 mg.L-1).

La masse de carbone solubilisée représente 3,64% de la masse totale d’écorce stérile et 3,40 %

lorsque l’écorce n’a pas été autoclavée. Ces valeurs sont 3 fois supérieures à celles obtenues lors de

tests de lixiviations en batch à un ratio Liquide/solide de 20 mg.L-1 (COD = 1,16% de la masse totale

de l’écorce 2). Dans les colonnes le ratio L/S est environ de 2 mg.L-1, soit une écorce dix fois plus

concentrée en solution que dans les tests de lixiviation en batch ; ceci explique sans doute la

différence entre COD en colonne et COD en essais batch.

Figure 18 : Suivi du COD en sortie de colonne d’écorce de pin stérile et non stérile traversée par une

solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; Temps de séjour ≅ 20 min

Cette libération de carbone organique dissous est importante puisque dans le cadre du traitement

biologique il sera important de connaître d’une part la toxicité de ces composés organiques solubles

de l’écorce de pin sur les micro-organismes utilisés, et d’autre part, la capacité des micro-organismes

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 10 20 30 40 50

V/Vo

CO

D (m

g/l)

Ecorce stérileEcorce non stérile



110

à utiliser ces composés comme source de carbone. La consommation des composés solubles de

l’écorce de pin par les micro-organismes pourrait alors éviter l’addition lors du traitement d’une source

de carbone additionnelle.

Il est également important de connaître le pH et la conductivité de l’eau en sortie de colonne (Figure

19 et Figure 20).

Figure 19 : Suivi du pH en sortie de colonne (10 g écorce stérile ou d’écorce non stérile) traversée par une

solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min

Figure 20 : Suivi de la conductivité en sortie de colonne (10 g d’écorce stérile ou d’écorce non stérile)

traversée par une solution d’eau déminéralisée ; débit = 1 mL.min-1 ; 22°C ; temps de séjour ≅ 20 min

Le pH de la solution d’eau en sortie de colonne est relativement acide pour les premiers mL élués

(environ 3,9) pour les colonnes d’écorce stérile comme pour l’écorce non stérile. Après circulation

d’environ 5V0, le pH se stabilise à 4,8 et 4,6 pour les colonnes d’écorce non stérile et d’écorce stérile

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

4,7

4,9

5,1

5,3

5,5

0 5 10 15 20 25

V/V0

pH


0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 10 20 30 40

V /V 0

C (µ

S/cm

) E co rce s té rileE co rce non s té r ile



111

respectivement. De la même façon, la conductivité très élevée en début de circulation 350 à

840 µS.cm-1), traduisant la lixiviation de composés ioniques de l’écorce de pin, décroît rapidement et

se stabilise après 30 V0 à une valeur de 20 µS.cm-1 dans les deux colonnes. Une quantité plus

importante de composés ioniques est relarguée par l’écorce de pin non stérilisée (840 µS.cm-1 pour le

premier échantillon prélevé) comparé à l’écorce stérilisée (350 µS.cm-1), indiquant que la stérilisation

stabilise certains composés de l’écorce de pin.

Des essais ultérieurs permettront de dire si Pseudomonas ADP sp. utilisée dans le cadre de notre

procédé combiné, sera capable de survivre et de croître dans ces conditions de pH, et de

conductivité.

II.2.2.3 Adsorption de l’atrazine en colonne d’écorce de pin en conditions abiotiques

L’adsorption de l’atrazine a été testée sur les colonnes d’écorce de pin préalablement stérilisée et non

stérilisée selon le protocole décrit au § II.1.2.3.3. Dans les deux cas la solution d’atrazine circulante

contenait un biocide (azoture de sodium 200 mg.L-1) afin d’assurer des conditions totalement

abiotiques, évitant ainsi l’intervention de phénomènes biologiques indésirables ici. Le schéma du

montage pour ces essais est représenté Figure 10 (p.101). Un essai sur colonne de charbon actif a

également été réalisé en parallèle.

Les caractéristiques des colonnes utilisées pour ces essais sont présentées en ANNEXE 4.

On observe que la saturation en atrazine des colonnes d’écorce non stérile est atteinte pour l’injection

d’un volume de 50 V0 environ, contre 100 V0 dans le cas des colonnes d’écorce préalablement

stérilisée (Figure 21). Dans la colonne de charbon actif, l’atrazine n’est pas détectée en sortie de

colonne après injection d’un volume correspondant à 170 V0 ; encore une fois, ce résultat montre la

bien meilleure capacité d’adsorption du charbon actif par rapport à celle de l’écorce de pin.



112

Figure 21 : Adsorption de l’atrazine sur écorce de pin (stérile ou non stérile) et sur charbon actif en colonne (masse d’adsorbant 10g), circulation en circuit ouvert ; [atrazine]i=0,2 mg.L-1 ; débit = 1 mL.min-1 ;

22°C ; temps de séjour ≅ 20 min

Le calcul de l’aire supérieure de la courbe (méthode des trapèzes) permet d’accéder à la quantité

d’atrazine adsorbée sur l’écorce de pin. Après l’injection de 164 V0, l’équilibre apparent est atteint et

0,031 ou 0,032 mg d’atrazine sont adsorbés par gramme d’écorce non stérile ou stérile

respectivement. Les deux courbes sont à première vue très différentes ; elles laissent penser que les

concentrations en atrazine adsorbée seraient significativement différentes entre l’écorce stérile et

l’écorce non stérile. Pourtant les résultats obtenus sont très similaires (0,031 et 0,032 mg.g-1) ; ceci est

expliqué par le fait que les concentrations C0 et les volumes de pores V0 de chaque colonne ne sont

pas les mêmes (C0=0,23 mg.L-1 et V0=25 ml pour la colonne d’écorce non autoclavée contre

C0=0,20 mg.L-1 et V0=18 ml pour la colonne d’écorce autoclavée). Ainsi, ces résultats montrent que

les capacités d’adsorption de l’écorce stérilisée et l’écorce non stérilisée sont tout à fait similaires.

Si l’on compare l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin en colonne et en essais batch (Figure 22),

on remarque que pour une concentration à l’équilibre de 0,2 mg.L-1 les quantités d’atrazine adsorbées

sur l’écorce (stérile ou non stérile) sont similaires : 0,040 mg par gramme d’écorce stérilisée et

0,037 mg par gramme d’écorce non stérilisée, en batch. En colonne comme en milieu dispersé,

l’adsorption de l’atrazine est très légèrement supérieure sur l’écorce stérilisée que sur l’écorce non

traitée.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

V/Vo

C/C

o

Ecorce non stérile

Ecorce stérile

Charbon Actif



113

Figure 22 : Isothermes d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin autoclavée et non autoclavée (d<200µm); ratio L/S=20 ; 20°C ; temps de contact 24h

Le traitement de l’écorce par 2 autoclavages successifs pourrait améliorer légèrement la capacité de

l’écorce de pin pour l’adsorption de l’atrazine. Le pH dans les essais avec écorce autoclavée et avec

écorce non autoclavée étant identique (pH 4,5), on peut penser que le chauffage de l’écorce à 120°C

pourrait ouvrir certains pores et ainsi offrir à l’écorce une plus grande surface de contact et donc

d’adsorption.

II.2.3 Conclusion

Les expériences ci-dessus ont permis de déterminer un temps d’équilibre apparent d’adsorption de

l’atrazine sur l’écorce de pin de moins de 24 h. Elles ont également permis de faire un choix quant à la

granulométrie de l’écorce à utiliser, pour une adsorption optimale ; désormais l’écorce en poudre fine

(particules de diamètre < 200µm) sera utilisé e pour tout le reste de l’étude.

Les essais ont également montré que l’adsorption était favorisée à des pH acides. En revanche

l’abaissement des ratios L/S, diminue notablement l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin,

suggérant qu’à un faible rapport Liquide/solide, l’adsorption pourrait être diminuée à cause de

l’aggrégation des particules d’écorce entre elles.

Concernant les essais en colonnes, le choix du KCl en tant que traceur s’est révélé être satisfaisant ;

le KCl n’est pas retenu sur les colonnes d’écorce de pin et permet d’étudier le comportement

hydrodynamique des colonnes avant chaque utilisation pour des essais d’adsorption.

y = 0,2052x + 0,0023

y = 0,1449x + 0,0077

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5Ceq (mg/l)

q (m

g/g)

Ecorce autoclavée

Ecorce non autoclavée



114

Les études en colonnes ont montré que la solution en sortie de colonne était acide (pH 4,6 et

conductivité 40 µS.cm-1 après 5V0) ; le pH n’évoluant plus après 5 V0. La question se pose alors quant

à la survie des micro-organismes choisis pour le traitement combiné, dans les colonnes d’écorce de

pin, dans ces conditions de pH.

Les résultats d’adsorption obtenus en colonne montrent que la saturation en atrazine de l’écorce est

atteinte beaucoup plus rapidement dans les colonnes d’écorce non stérilisée que dans les colonnes

d’écorce stérilisée. En revanche, dans les deux cas la quantité d’atrazine adsorbée par gramme

d’écorce est équivalente (environ 0,03 mg.g-1 pour une solution entrante à 0,2 mg.L-1). Ce résultat

concorde avec les résultats obtenus en batch (0,04 mg.g-1 d’écorce stérilisée et 0,037 mg.g-1 d’écorce

non stérilisée). L’écorce préalablement stérilisée présenterait un léger avantage par rapport à l’écorce

brute.

D’autre part, les essais ont permis de mettre en évidence des concentrations en carbone organique

non négligeables en sortie de colonne. Un traitement sur écorce de pin serait donc difficilement

envisageable dans le cadre d’une filière classique mais en revanche exploitable en tant que pré-

traitement ou traitement individuel pour de fortes concentrations en atrazine avant que l’eau polluée

ne subisse une filtration sur charbon actif ou soit envoyée en station d’épuration.

Les essais comparatifs réalisés avec le charbon actif montrent que ce dernier est nettement plus

efficace que l’écorce de pin pour adsorber l’atrazine. Cependant, dans un procédé de

décontamination par biofiltration combinant adsorption et biodégradtion, la faible capacité d’adsorption

de l’écorce peut devenir un avantage, puisque le polluant restera plus facilement disponible pour les

micro-organismes mis en jeu.

MATERIEL ET METHODES Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.


115

III. Biodégradation de l’atrazine en culture pure de Pseudomonas ADP sp.

III.1 Matériel et méthodes

III.1.1 Milieux de culture

Les milieux de culture doivent contenir les nutriments nécessaires au développement et au

métabolisme des micro-organismes choisis. Ils doivent ainsi contenir au moins une source azotée,

une source carbonée, une source de phosphore, ainsi que des micro et macro-nutriments (sels

minéraux dont métalliques), éventuellement des facteurs de croissance. Les milieux de culture

peuvent être solides ou liquides, synthétiques ou complexes, riches ou pauvres.

III.1.1.1 Les milieux liquides

III.1.1.1.1 Milieu minéral MM

La plupart de nos essais ont été réalisés en milieu liquide minéral glucosé (source de carbone et

d’énérgie pour les bactéries), l’atrazine jouant le rôle d’unique source d’azote.

La composition du milieu minéral utilisé était la suivante (Barreiros et al., 2003) :

- Tampon Phosphate 27 mM, pH 7,2

- CaCl2,2H2O 0,2 mM

- NaCl 7,56 mM

- MgCl2,6H2O 0,81mM

- FeCl2,4H2O 5,19 µM

- HCl 1,3 µl.L-1, 25%

- ZnCl2 0,51 µM

- MnCl2,4H2O 0,51 µM

- H3BO3 0,01 mM

- CoCl2,6H2O 0,8 µM

- CuCl2,2H2O 0,1 µM

- NiCl2,6H2O 1 µM

- NaMoO4,2H2O 0,16 µM

Les solutions suivantes ont été préparées autoclavées 20 minutes à 120°C et conservées

séparément :

- Eau déminéralisée

- Solution de CaCl2 (0,2 M)

- Solution de nutriments

- Tampon Phosphate (1,35 M)

Chacune des solutions a été conservée à 4°C, à l’exception du tampon phosphate (1,35 M), conservé

à température ambiante.



116

Composition du tampon Phosphate: KH2PO4 0,37 M

Na2HPO4,2H2O 0,98 M

Le tampon est ajusté à pH 7,2 par addition d’une solution de soude 0,1 M.

III.1.1.1.2 Milieu riche complexe LB

Le milieu LB est constitué de :

Extrait de levure 5g

Tryptone 10g

NaCl 10g

L’ensemble est additionné à 1 L d’eau déminéralisée, agité puis autoclavé à 120°C pendant 20

minutes, puis conservé à température ambiante.

III.1.1.1.3 Extrait aqueux d’écorce de pin

L’extrait aqueux d’écorce de pin a été utilisé dans l’idée de nous fournir des informations sur la

capacité de Pseudomonas sp. ADP à croître et à dégrader l’atrazine dans un milieu contenant les

composés organiques solubles de l’écorce de pin. L’utilisation de ce milieu a permis d’une part de

tester la toxicité éventuelle de ces composés sur Pseudomonas sp. ADP et d’autre part de

déterminer si ces composés pouvaient ou non constituer une source de nutriments pour les micro-

organismes.

L’utilisation de l’extrait d’écorce de pin a ainsi permis de s’affranchir des phénomènes d’adsorption

de l’atrazine à la surface des particules d’écorce qui aurait modifié sa biodisponibilité si les essais

avaient été réalisés en présence d’écorce solide.

La préparation de l’extrait aqueux d’écorce de pin est décrite au paragraphe I.6. Cet extrait

constitue un milieu complexe pauvre car les teneurs en carbone et en azote notamment sont

faibles.

Le Tableau ci-dessous présente la composition des extraits réalisés à partir des deux écorces de

pin utilisées au cours de cette étude.



117

Tableau 9 : Teneurs en COT et azote total des extraits aqueux d’écorce de pin utilisés pour différentes expériences

Ecorce 1 Ecorce 2

Carbone Organique Total 100 ± 10 mg.L-1 580 ± 10 mg.L-1

Azote Total (Kejdhal) 4 ± 0,2 mg.L-1 4 ± 0,2 mg.L-1

Les deux écorces ont été utilisées l’une après l’autre. Toutes les deux provenaient d’une scierie

du nord du Portugal utilisant Pinus pinaster comme matière première.

Lors de son utilisation en culture pure, l’extrait a été stérilisé par filtration sur une membrane de

nitrate de cellulose à 0,2 µm.

III.1.1.2 Les milieux solides

Le milieu solide riche complexe PCA (Plate Count Agar, Merck réf. 1.05463) a été utilisé pour la

croissance des micro-organismes, aussi bien Pseudomonas ADP sp. que pour les micro-

organismes indigènes de l’écorce de pin.

Les étalements sur boite de Pétri contenant un milieu riche ont également permis de vérifier la

contamination ou non de certaines cultures réalisées lors des nombreuses expériences de

croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

Préparation du milieu solide PCA : A 1 L d’eau déminéralisée sont additionnés,

PCA en poudre 22,5 g

Après dissolution, le milieu est autoclavé à 120°C pendant 20 minutes.

Les boites sont coulées à 80°C en conditions stériles, solidifiées puis séchées pendant 2h à 60°C. Les

boites sont ensuite conservées à 4°C.

III.1.2 Préparation et utilisation des cellules congelées

III.1.2.1 Préparation de cellules congelées

La souche Pseudomonas sp. ADP connue pour ces capacités à minéraliser l’atrazine et décrite dans

la littérature pour la première fois par Mandelbaum et al. (1995) (voir Etude Bibliographique § III), est

commercialisée par l’entreprise allemande DSMZ sous le numéro de référence 11735.

Des cultures de Pseudomonas ADP sp. ont été dans un premier temps réalisées par étalement sur

boite de Pétri PCA incubées à 30°C pendant 48h. Les colonies ont ensuite été transférées en milieu



118

liquide MM contenant 20 mg.L-1 d’atrazine, comme seule source d’azote et 1 g.L-1 de glucose comme

source de carbone. Les cultures ont été incubées à 30°C sous agitation orbitale à 150 rpm pendant

20 h.

Les cultures ont ensuite été centrifugées à 7000 rpm pendant 20 minutes à 8°C et le culot de cellules

resuspendu dans un tampon phosphate (54 mM, pH 7,2) ; cette opération a été répétée afin

d’effectuer un deuxième lavage. Le culot obtenu après deux lavages a été resuspendu dans un

volume (V/V) de quelques mL d’un mélange de glycérol (40%) et de milieu LB (2 x concentré).

La solution concentrée en cellules a été aliquotée (500 µl) dans des tubes cryogéniques et congelée à

–20°C.

Les stocks de cellules directement utilisés pour les expériences (inoculation à partir de cellules

congelées) ont été préparés de la même manière mais les cellules ont été ressuspendues dans un

milieu constitué de 50% de milieu minéral (MM) et 50% de glycérol (40%).

Avant chaque utilisation d’un stock de cellules congelées, un comptage est réalisé juste après

décongélation pour quantifier le nombre d’unités cellulaires présentes dans un stock. Ces comptages

sont réalisés par dilution du stock de 10-4 à 10-9 et étalement sur boite de gélose PCA.

Ainsi, la concentration en cellules étant connue dans les stocks congelés, l’inoculation de

Pseudomonas sp. ADP dans les essais a pu être relativement maîtrisée (nombre de CFU/mL connu)

et contrôlée par mesure de densité optique des cultures liquides autour d’une valeur initiale d’environ

0,05.

III.1.2.2 Utilisation de stocks congelés ou de précultures

• Essais menés à partir de précultures

Les essais en cultures pures ont été, en général, réalisés à partir de précultures cellulaires, elles-

même obtenues à partir des stocks de cellules congelées.

Les précultures de Pseudomonas sp. ADP ont été réalisées par inoculation d’environ 108 CFU/mL

(provenant d’un stock congelé) dans un milieu MM contenant une source de carbone (glucose, 1 g.L-1

et une source d’azote (atrazine 20 mg.L-1, ou sulfate d’ammonium, 1 g.L-1)). Les stocks de cellules

congelées contenaient dans des proportions 50/50, un mélange de milieu MM (milieu minéral) et du

glycérol (40%). Du glycérol résiduel est donc présent dans les culture (environ à 8%). Cependant,

cette source de carbone est mal utilisée par Pseudomonas ADP sp. comme le montre la Figure 23 ci-

dessous, réalisée par mesure de l’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. Le glucose est quant

à lui facilement biodégradé par Pseudomonas ADP sp.



119

Figure 23 : Utilisation du glycérol ou du glucose comme source de carbone par Pseudomonas ADP sp. Suivi de la respiration de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence d’atrazine (30 mg.L-

1) comme source d’azote et 1g.L-1 de glucose ou glycérol comme source de carbone ; 30°C ; agiation 150 rpm

Les cultures de 50 mL ont été agitées (150 rpm) en Erlenmeyers de 250 mL dans une chambre

thermostatée à 30°C pendant 20h. Les essais ont été inoculés à partir de ces précultures lorsque les

micro-organismes étaient en phase exponentielle de croissance (environ 20 h pour Pseudomonas

ADP sp. en milieu MM-Glucose). La DO initiale dans chaque essai était d’environ 0,05.

• Essais menés directement à partir de cellules congelées La densité de cellules dans les précultures réalisées en présence d’atrazine (20 mg.L-1) étant très

limitée (DO en fin de croissance aux alentours de 0,18 dans les conditions optimales de croissance),

l’inoculation des essais impliquait l’introduction d’importants volumes de préculture (environ 10% du

volume initial), introduisant par là même une quantité de nutriments (notamment azotés) non

négligeable et non souhaités dans beaucoup d’essais. Une autre solution envisagée était de

centrifuger les précultures, puis d’effectuer un lavage des cellules au tampon phosphate pour les

débarrasser de leurs nutriments avant de les inoculer dans chaque essai, ce qui nécessitait la

préparation d’importants volumes de préculture à centrifuger avec parfois des moyens non adaptés à

ces quantités (volume maximum des tubes à centrifugation disponibles : 30mL).

Le choix d’utiliser directement les stocks de cellules congelées pour inoculer les essais, bien que non

« conventionnel », a permis dans tous les cas de réaliser des études comparatives. L’utilisation de

cellules congelées nous permettait ainsi de connaître parfaitement le nombre de cellules inoculées

tout en nous affranchissant des problèmes posés par la présence non souhaitée de traces d’atrazine

ou autre source de nutriments dans le cas de l’utilisation de préculture.

L’incertitude liée à l’effet de la congélation et de la conservation des cellules congelées sur leur survie

et leur physiologie demeure en l’absence de précultures permettant de contrôler la revitalisation des

cellules. Cependant, la comparaison d’essais de minéralisation de l’atrazine effectués à partir de

0

200400600800

1000

12001400

1600

0 10 20 30 40 50

Temps (h)

DB

O (m

g.L-1

)

Glucose (1g/L)

Glycérol (1g/L)



120

précultures ou de stocks de cellules congelées a montré que cet effet pouvait être négligé (Figure 24).

Une phase de latence d’une dizaine d’heures environ par rapport à l’utilisation de précultures est

observée, correspondant à la phase de revitalisation des cellules congelées.

Figure 24 : Comparaison de la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. inoculé à environ 106 cfu/mL à partir d’une préculture ou de cellules congelées, en milieu minéral MM (glucose 1g.L-1 ; 14C-

atrazine 20 mg.L-1), 20°C.

III.1.3 Suivi de la croissance des micro-organismes et de l’activité respiratoire

III.1.3.1 Suivi de la croissance cellulaire

Selon les expérimentations menées, la croissance cellulaire à été suivie soit :

- par lecture de la densité optique à 600 nm.

- par comptage sur boite de Pétri

- par dosage des protéines

III.1.3.1.1 Mesure de turbidité

La croissance cellulaire a été suivie dans certains essais par mesure de la turbidité des cultures à

600 nm sur un spectrophotomètre UV-Visible Milton Roy Spectronic 401 multi-cuvettes.

Des aliquotes de 1 mL de culture ont été utilisés.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

Préculture

Cellules congelées



121

III.1.3.1.2 Dénombrement sur boite de Pétri

Le suivi de croissance bactérienne pour les essais contenant de l’écorce de pin en poudre a été

réalisé par étalement sur boite de Pétri PCA (Cf. III.1.1.2) des suspensions décantées (non

centrifugées) et diluées entre 10-4 et 10-9. Les boites ont été incubées à 30°C pendant plusieurs jours.

Le dénombrement est effectué par comptage à l’œil nu des colonies formées.

III.1.3.1.3 Dosage des protéines par la méthode de Folin- Lowry :

La culture à doser (1 mL contenant 0 à 100 µg de protéines) est chauffée à 90°C en présence d’une

solution de NaOH (0,2 N) pendant 2 h. La solution traitée est centrifugée à 10000 rpm pendant

15 minutes afin d’éliminer les fractions cellulaires non hydrolysées.

La réaction colorimétrique se fait par mélange de :

- 1 mL de réactif cuprique (EDTA cuivré 0,25 g.L-1, NaCO3 20 g.L-1, NaOH 0,1 N)

- 0,1 mL de réactif de Folin

- 0,2 mL de surnageant

Le réactif de Folin (solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) est

réduit, passant de la couleur du jaune au bleu, par les ions Cu+ (réactif cuprique).

La coloration se développe pendant 30 minutes à l’obscurité à température ambiante.

L’absorbance est mesurée à 660 nm contre un blanc sans protéine réalisé de la même manière que

l’échantillon à doser.

Une courbe de calibration est effectuée à partir de l’albumine sérique de bœuf entre 0 et 100 µg.

III.1.3.1.4 Dosage des protéines par la méthode Bradford :

L’échantillon à doser (100 µl) contenant 0 à 20 µg de protéines est mélangé à 2 mL de réactif de

Bradford. La coloration se développe en 2 minutes. L’absorbance à 595 nm est lue contre un blanc

sans protéines. La teneur en protéines de l’échantillon est déterminée grâce à une courbe

d’étalonnage réalisée avec de l’albumine sérique de bœuf.

Le réactif de Bradford est composé de :

- Bleu de Coomassie 100 mg

- Ethanol 95% 50 mL

- Acide O-phosphorique 100 mL

- Eau distillée q.s.p. 1000mL

Le réactif est stable pendant 15 jours à température ambiante.



122

III.1.3.2 Suivi de l’activité respiratoire (ou Demande Biochimique en Oxygène DBO)

La respiration des micro-organismes, témoignant d’une activité biologique aérobie, a été mesurée

dans des flacons de 500 mL équipés de têtes Oxitop® (commercialisés par WTW) permettant la

mesure directe de la pression à l’intérieur des flacons.

III.1.3.2.1 Principe de la mesure

Dans des flacons hermétiques (Figure 25), le CO2 expiré par les micro-organismes résultant de la

consommation d’oxygène pour l’oxydation de la matière organique du milieu est dissous dans la

soude, placée sous forme de pastilles solides dans un piège en caoutchouc au-dessus de la solution.

La quantité de soude placée dans la trappe doit être suffisante par rapport à la quantité de matière

organique présente dans les flacons et potentiellement biodégradable.

Dans ces conditions, la consommation d’oxygène et la dissolution du CO2 expiré crée une dépression

dans le flacon mesuré par des détecteurs de pression présents dans les têtes Oxitop® ; cette

dépression est ensuite exprimée en consommation de O2 en mg.L-1 ou mg.g-1 de carbone organique.

La réaction de dissolution du CO2 dans la soude (NaOH) est la suivante :

OHCONaNaOHCO 2322 2 +→+

La mesure de variation de pression et la consommation d’oxygène sont reliées par la loi des gaz

parfaits.

Ce système nécessite une approximation préalable de la DBO, calculée à partir de la DBO théorique

dite DthO normalisée (OCDE-301-AnnexeIV) dont la formule suit :

[ ]Mr

ONaPSNClHCDthO −+++−−+=

)2/1()2/5(3)3(5,0216

Pour une molécule considérée, chaque lettre représente le nombre d’atomes (correspondant au

symbole chimique) contenu dans celle-ci, et Mr son poids moléculaire.

Pour le glucose (C6H12O6), on trouve par exemple une DthO de 1,07 g de O2.g -1 de glucose.

La connaissance de la DthO, de la température d’incubation et de la pression atmosphérique permet

d’évaluer le volume d’échantillon à introduire dans les flacons pour avoir un volume d’air suffisant à la

respiration des micro-organismes pour un intervalle de temps déterminé.



123

III.1.3.2.2 Protocole expérimental

Les essais de respirométrie ont été réalisés dans des flacons stériles de 500 mL contenant 20 ou

50 mL de milieu de culture selon les cas. Les flacons ont été agités à 150 rpm sur une table orbitale

placée à 30 °C à l’obscurité pendant toute la durée de l’incubation. Les essais ont été inoculés à partir

de stock de cellules congelées (environ 106 cfu.mL-1).

Les essais ont été réalisés en triplicats. Des témoins abiotiques ont été traités de la même manière

mais sans inoculation. Des témoins « vides » (flacons vides) ont permis d’enregistrer les variations

éventuelles de pression ou de température au cours du temps.

Grâce au boîtier Oxitop®, les données ont été récupérées soit à la fin des essais soit au fur et à

mesure de la mesure grâce au logiciel OC Achat (commercialisé avec le matériel Oxitop par WTW).

Les données ont ensuite été traitées sur Excel. La Figure 25 représente le matériel Oxitop® utilisé lors

de ces essais de respirométrie.

Figure 25 : Flacon de DBO équipé de tête Oxitop® utilisé lors des études de respirométrie

III.1.3.3 Détermination du taux de croissance maximal

Le taux de croissance des bactéries µmax est calculé dans la phase exponentielle de croissance.

Ainsi, µmax est exprimé selon la relation suivante, lorsque S supporte la croissance (source de

carbone) :

tµeXX .max.0=

linéarisé en tµXX .lnln max0 +=

avec X, la concentration cellulaire au temps t et X0 la concentration cellulaire au temps t=0.

La vitesse de consommation du substrat S est exprimée selon l’équation :



124

dtdX

YdtdS

⋅=−1

où : S : Concentration en substrat (atrazine) au temps t (nS.V-1)

µm : Taux de croissance maximale (T-1)

Y : Taux de conversion biomasse/substrat (Nbre Cell. M-1)

X0: Concentration cellulaire à t=0 (nCell.V-1)

L’intégration de cette équation entre t0 et t donne :

)(100 XX

YSS −=−

soit

)1(00 −−= tµme

YX

SS

avec tµeXX .max.0=

Ainsi, seulement si l’atrazine est support de croissance de Pseudomonas ADP sp. nous pourrons

déterminer des vitesses de croissance en fonction du taux de conversion Y.

III.1.4 Suivi de la biodégradation de l’atrazine

III.1.4.1 Biodégradation primaire de l’atrazine

La biodégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC des échantillons liquides,

après filtration à 0,45 µm sur membranes de nitrate de cellulose.

Le protocole pour l’analyse HPLC de l’atrazine est décrit au § (a). Les analyses HPLC en détection

UV nous ont permis de quantifier l’atrazine à des concentrations supérieures à 0,03 mg.L-1.

Au-dessous de cette concentration, l’utilisation d’atrazine uniformément marquée [U-ring-14C]-atrazine

a été requise.

Les composés intermédiaires de dégradation de l’atrazine n’ayant pas été pas détectés grâce à cette

méthode, l’analyse HPLC (dans le cas de l’utilisation d’atrazine froide) a simplement permis d’étudier

la disparition de l’atrazine du milieu ; ainsi, l’information donnée par ces analyses ne renseigne pas

sur la minéralisation mais seulement sur la dégradation primaire de l’atrazine.



125

L’atrazine a été ajoutée au milieu de culture à partir d’une solution mère concentrée (2000 mg.L-1)

préparée dans le méthanol, en suivant une procédure inspirée des protocoles utilisés par

Mandelbaum et al. (1993, 1995). Dans les essais, le méthanol est ainsi présent entre 1 et 2,5 % dans

le milieu de culture.

La Figure 26 montre que dans ces conditions (semblables à celles des futurs essais en milieu minéral,

glucose 1g.L-1 et atrazine quelques dizaines de mg.L-1), l’addition d’atrazine à partir d’une solution

mère concentrée préparée dans le méthanol n’a pas d’effet sur la croissance de Pseudomonas ADP

sp.

Figure 26 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM-glucosé à 1 g.L-1) avec atrazine (30 mg.L-1) additionnée au milieu à partir d’une solution mère concentrée dans le méthanol ou dissoute

directement en poudre dans le milieu MM ; 30°C ; agitation 150 rpm

En revanche, nous n’avons pas identifié si le méthanol était utilisé par Pseudomonas ADP sp. en tant

que source de carbone (aucune référence trouvée dans la littérature).

D’autre part, les résultats présentés au § III.1.2.2 montrent que le glycérol est très mal assimilé par

Pseudomonas ADP sp. et que par conséquent l’utilisation de cellules congelées contenant 20% de

glycérol ne contribue pas à alimenter les cultures en source de carbone utilisable par Pseudomonas

ADP sp.

III.1.4.2 Minéralisation de l’atrazine

L’étude de la minéralisation de l’atrazine a été réalisée grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive par

suivi du 14CO2 formé.

La [U-ring-14C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol- 1 a été

utilisée pour réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L-1 et

44,2 µg.L-1.

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 10 20 30 40 50 60

Temps (h)

DO 60

0nm

Atrazine sans MeOH

Atrazine dans MeOH



126

III.1.4.2.1 Préparation des solutions mères d’atrazine marquée

Pour les séries à 20 mg.L-1, une solution mère à 2 g.L-1 a été préparée dans le méthanol à partir d’un

mélange d’atrazine froide et d’atrazine radioactive. L’activité spécifique de la solution mère était de

2 µCi.mL-1. L’activité initiale dans chaque essai à 20 mg.L-1 était de 1 µCi par fiole (biomètre).

Pour les séries à 44,2 µg.L-1, une solution mère à 4,4 mg.L-1 a été préparée dans le méthanol à partir

d’atrazine radioactive uniquement. L’activité spécifique de la solution mère était de 0,5 µCi.mL-1.

L’activité initiale dans chaque essai à 44,2 µg.L-1 était de 0,25 µCi par fiole (biomètre).

III.1.4.2.2 Principe des essais de minéralisation

Le dispositif expérimental des essais de minéralisation en biomètres est présenté sur la photo ci-

dessous (Figure 27).

Figure 27 : Photo d’un biomètre pour l’étude de la minéralisation de l’atrazine

Le CO2 résultant de la respiration des micro-organismes est dissous dans la soude (1M) présente

dans un piège placée au-dessous des bouchons de chaque biomètre.

Suivi de la minéralisation. Quantification du 14CO2

La minéralisation de l’atrazine a été suivie par quantification du 14CO2 dissous dans la soude placée

dans les biomètres utilisés pour les expériences de minéralisation en milieu dispersé aussi appelé

« Essai en Batch » (Figure 28).



127

Figure 28 : Représentation schématique d’un biomètre utilisé dans les essais de minéralisation en « Batch »

La soude (1 M) contenue dans les pièges à CO2 (0,5 mL) a été prélevée régulièrement au cours du

temps et remplacée par de la soude fraîche (deux fois par jour en début d’expériences puis tous les 2

ou 3 jours ensuite). Les 0,5 mL de soude sont placés dans une fiole à scintillation dans laquelle 7 mL

de liquide scintillant sont ensuite ajoutés ; après une heure, le mélange est analysé au compteur à

scintillation TRI-CARB 2100TR Packard Liquid Scintillation Analyser (le délai de 1 heure permet

d’éviter la scintillation de la soude (environ 120 dpm)).

Les résultats donnés en dpm (désintégration par minute) sont finalement traduits en % de

minéralisation par rapport à la radioactivité initialement présente dans les biomètres.

Suivie de la radioactivité en solution Le suivi de la radioactivité dans la phase liquide des essais de minéralisation a été réalisé par

prélèvement de 1 mL de solution contenant initialement une quantité connue de [U-ring-14C]-atrazine.

7 mL de liquide à scintillation sont additionnés au prélèvement puis le mélange est analysé au

compteur de la même façon que précédemment.

III.1.4.2.3 Protocole expérimental

Les essais ont été réalisés en biomètre en milieu minéral stérile MM (50 mL/biomètre). Pseudomonas

ADP sp. a été inoculé au milieu à partir de précultures réalisées comme expliqué au chapitre III.1.2.2

pour obtenir une DO initiale d’environ 0,05. Les biomètres ont été incubés à 20 ± 2 °C sous une

agitation douce (barreau magnétique). Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées

(20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1). L’atrazine était la seule source d’azote. Le glucose additionné au milieu à

une concentration de 1 g.L-1 était la source de carbone.

La minéralisation de l’atrazine a été suivie pendant environ 300 heures (avec renouvellement de l’air à

chaque prélèvement des pièges à soude, soit tous les 2-3 jours au maximum).

Des témoins abiotiques non inoculés avec Pseudomonas ADP sp. ont permis de suivre la

minéralisation de l’atrazine en milieu abiotique et de vérifier la non contamination des milieux utilisés.

Barreau aimenté

Trappe NaOH (1 M) 0,5 ml Piège à C02 – NaOH (1 M) 0,5 mL

Milieu liquide



128

Les essais et les blancs ont été réalisés en triplicats.

III.1.5 Influence de paramètres physico-chimiques

L’étude de l’influence de certains paramètres sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et sur sa

capacité à dégrader l’atrazine a permis de fixer certaines limites expérimentales. Les paramètres

comme la température, le pH ainsi que l’apport de nutriments ont été testés en culture pure de

Pseudomonas ADP sp.

III.1.5.1 Influence des sources de carbone

Pseudomonas ADP sp. est décrite dans la littérature comme une souche capable de minéraliser

l’atrazine en tant que source d’azote (Mandelbaum et al., 1995) ; l’atrazine n’est donc pas utilisée

comme source de carbone. L’addition d’une source de carbone a donc été requise dans les différents

essais afin de subvenir au besoin des bactéries. Le glucose a été choisi comme source de carbone

facilement biodégradable. Mandelbaum et al. (1995) montre que le citrate constitue également une

source facilement assimilée par Pseudomonas ADP sp.

III.1.5.2 Influence de la température et du pH

Des essais de croissance bactérienne et de dégradation de l’atrazine ont été menés à des

températures allant de 12°C, qui pourrait correspondre à la température d’une eau naturelle à traiter, à

30°C correspondant à la température optimale de croissance des bactéries mésophiles.

L’influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à dégrader l’atrazine a

été étudié en parallèle.

Protocole expérimental pour les essais à différentes températures La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) en présence

de 50 mg.L-1 d’atrazine (addition d’atrazine dans le milieu à partir d’une solution mère d’atrazine à

2000 mg.L-1) en tant que seule source d’azote. La source de carbone était le glucose à 1 g.L-1.

Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO600 de 0,05 à partir d’une préculture réalisée à 30°C en

milieu MM pendant 20 h (III.1.2.2) et incubés à 30°C, 20°C ou 12°C, sous une agitation de 150 rpm.

La croissance a été évaluée par lecture de DO600 et les protéines du milieu ont été quantifiées par la

méthode de Bradford (III.1.3.1).

Les essais ont été réalisés en triplicats.



129

Protocole expérimental pour les essais à différents pH De la même manière que les essais précédents, des essais à différents pH ont été réalisés dans un

milieu MM (50 mL) contenant 20 mg.L-1 d’atrazine comme seule source d’azote et 1 g.L-1 de glucose

comme seule source de carbone. Ces essais ont été inoculés à partir de cellules congelées de

Pseudomonas ADP sp. (environ 106 cfu.mL-1, DO initiale environ 0,05) et incubés à 30°C sous

agitation orbitale (150 rpm).

Les 4 pH suivants ont été testés : 3,5 ; 4,4 ; 5,2 ; 7,0.


Le milieu MM non tamponéa été ajusté au pH désiré à l’aide d’une solution de KH2PO4 (50 g.L-1).

Après stérilisation du milieu MM par autoclavage, le pH a été vérifié avant d’utiliser le milieu dans les

essais. Le pH a également été contrôlé en fin d’expérience.

La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par prélèvements entre le temps 0 et 60 heures et

analyse des échantillons par HPLC (§ II.1.1.1.2(a)).

III.1.5.3 Influence d’une source additionnelle d’azote

III.1.5.3.1 Croissance bactérienne et dégradation primaire de l’atrazine

La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en milieu minéral MM (§ III.1.1.1.1) contenant

environ 50 mg.L-1 d’atrazine en présence ou non d’une source additionnelle d’azote ((NH4)2SO4,

1 g.L -1). La source de carbone était le glucose à 1g.L-1.

Les essais de 20 mL ont été inoculés à une DO600 de 0,05 à partir de cellules congelées de

Pseudomonas ADP sp. (environ 106 cfu.mL-1).

Les essais ont été réalisés en triplicats, incubés à 30°C sous agitation (150 rpm).

La coissance a été suivie par mesure de densité optique à 600 nm, pendant 60 heures.

La biodégradation primaire de l’atrazine a été quantifiée par analyse HPLC des échantillons prélevés

entre t0 et 60 heures.

III.1.5.3.2 Minéralisation de l’atrazine

Ces expériences à l’atrazine marquée ont été réalisées au CEA (Commissariat à l’Energie Atomique)

de Grenoble, au laboratoire DBMS/BBSI.

Le suivi de la production du 14CO2 a permis de quantifier la minéralisation de l’atrazine selon le

protocole décrit en III.1.4.2.2



130

La minéralisation de l’atrazine a été suivie en MM (Glucose 1 g.L-1 comme source de carbone) en

présence ou non d’une source additionnelle d’azote (Sulfate d’ammonium, 1 g.L-1).

Les essais de 50 mL ont été inoculés à une DO600 de 0,05 correspondant environ à 106 cfu/mL.

III.1.5.4 Influence des composés solubles de l’écorce de pin

Le traitement combiné envisagé est principalement dépendant de la capacité de Pseudomonas ADP

sp. à survivre et à se développer en présence de l’écorce de pin choisie comme support de biofiltre.

L’écorce de pin contenant une grande variété de composés organiques, la toxicité de ces derniers vis

à vis de la souche bactérienne choisie pour ce traitement a dû être testée. Ainsi, l’activité respiratoire

de Pseudomonas ADP sp., sa capacité à croître et à dégrader l’atrazine en présence des composés

solubles de l’écorce de pin ont été étudiées dans les essais décrits ci-dessous.

Ces essais ont été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin, préparé comme décrit au § I.6 et

stérilisé selon le protocole présenté au § I.7.

Tous les essais réalisés en triplicats, ont été inoculés à partir de cellules congelées de Pseudomonas

ADP sp.

III.1.5.4.1 Influence sur l’Activité Respiratoire de Pseudomonas ADP sp.

Dans une première série d’essais, la respiration de Pseudomonas ADP sp. a été suivie en extrait

aqueux d’écorce de pin (20 mL) en présence ou non de sels minéraux additionnels contenus dans le

milieu MM utilisé dans les essais précédents. Aucune source de carbone additionnelle n’a été ajouté à

l’extrait d’écorce, les composés organiques solubles de l’écorce de pin représentant la seule source

de carbone pour Pseudomonas ADP sp. (COTextrait = 100 mg.L-1).

En parallèle à ces essais, des témoins réalisés en MM, ont servi de référence. Dans les témoins en

MM, le glucose a été additionné à 0,25 ou 1 g.L-1 comme seule source de carbone, correspondant

respectivement à 100 mg.L-1et 400 mg.L-1de carbone.

Dans tous les essais (MM et extrait), (NH4)2SO4 1 g.L-1 est ajouté comme source d’azote.

Le protocole opératoire pour ces essais de respirométrie est décrit au § III.1.3.2.2.

Dans une seconde série d’essais, l’influence de l’addition d’une source de carbone à l’extrait aqueux

d’écorce de pin a été testée selon le même protocole (§ III.1.3.2.2). Les flacons DBO ont été préparés

avec 50 mL de milieu. La source d’azote était l’atrazine (30 mg.L-1). Le glucose a été apporté à l’extrait

comme source additionnelle de carbone à différentes concentrations : 0 mg.L-1 ; 0,25 mg.L-1 ;

0,5 mg.L-1 et 1 mg.L-1.

Des blancs non inoculés ont également été suivis. Tous les essais ont été incubés en chambre

thermostatée à 30°C.



131

III.1.5.4.2 Influence sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. et la biodégradation de l’atrazine

La croissance de Pseudomonas ADP sp. a été suivie à 30°C (agitation 150 rpm) dans des

Erlenmeyers de 100 mL, dans les milieux suivants (20 mL de milieu):

- Extrait d’écorce de pin seul

- Extrait d’écorce de pin ± une source additionnelle d’azote ((NH4)2SO4 1 g.L-1 ± glucose

(1 g.L-1) ± atrazine (50 mg.L-1).

Des témoins ont été menés en parallèle en milieu minéral (MM). Des blancs non inoculés ont

également été suivis. La croissance a été suivie par mesure de la DO à 600 nm selon le protocole

décrit au § III.1.3.1.1.

La biodégradation primaire de l’atrazine a été suivie par HPLC selon le protocole décrit au § III.1.4.1.

RESULTATS ET DISCUSSION Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.


132

III.2 Résultats et dissussion

III.2.1 Introduction

Pseudomonas ADP sp. a été retenue pour ses capacités à minéraliser l’atrazine grâce à la présence

de gènes localisés sur le plasmide pADP-1 (Martinez et al., 2001) et choisie pour participer à

l’élimination de ce polluant dans le cadre de notre procédé de traitement combiné.

Dans un premier temps, quelques paramètres physico-chimiques ont été testés sur cette souche afin

de mieux connaître son comportement dans différents environnements et notamment de répondre aux

questions suivantes : Jusqu’à quelle température peut-on observer la croissance de cette bactérie et

l’activité de minéralisation de l’atrazine ? Pseudomonas ADP sp. est-elle capable de survivre dans un

milieu acide (pH 4-5) imposé par la présence d’écorce de pin en poudre en solution ? Quelle est

l’influence de la présence d’une source d’azote dans le milieu, autre que celle de l’atrazine ?

D’autre part, une partie de ce chapitre a été consacrée à l’étude de l’influence des composés

organiques solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp. La toxicité de ces composés ainsi

que la capacité de Pseudomonas ADP sp. à les consommer en tant que source nutritive d’azote ou de

carbone ont été étudiées.

III.2.2 Influence de paramètres physico-chimiques

III.2.2.1 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différentes températures

Dans un souci de réduction des coûts de traitement, l’utilisation de l’eau à décontaminer à

température ambiante présenterait un avantage certain. Les micro-organismes étant sensibles à la

température et leur genre Pseudomonas étant, dans leur grande majorité, connu pour posséder une

activité optimale entre 20 et 42°C (bactéries mésophiles) (voir § III.1.5.2), l’étude qui suit a eu pour but

de répondre à la question suivante : A basses températures (10°-15°C), pouvant correspondre aux

températures de l’eau à traiter, Pseudomonas ADP sp. peut-elle croître et conserver sa capacité à

consommer l’atrazine ?

Trois températures ont été testées : 12°C, 20°C et 30°C. Le protocole de ces expériences a été décrit

au § III.1.5.2. La croissance et la biodégradation primaire de l’atrazine ont été suivies en milieu

minéral MM avec l’atrazine (environ 50 mg.L-1) comme seule source d’azote.

Figure 29 présente le suivi de la croissance bactérienne et la dégradation primaire de l’atrazine par

Pseudomonas ADP sp. aux trois températures étudiées.



133

Les résultats montrent que croissance et biodégradation évoluent en fonction de la température. On

note bien que l’activité de Pseudomonas ADP sp. est optimale à 30°C. A 20°C, la croissance est

légèrement ralentie et la biodégradation de l’atrazine est très légèrement affectée (Tableau 11).

A une température de 12°C Pseudomonas ADP sp. est capable de survivre, de croître et dégrader

l’atrazine, mais de manière plus lente qu’aux hautes températures.

L’expression des taux de croissance µm. (Cf. § III.1.3.3) en fonction de la température (Tableau 10)

traduit l’effet de la température sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. Entre 12 et 30°C, le taux

de croissance µm évolue linéairement avec la température selon l’équation suivante (µ est estimé sur

les 20 premières heures de croissance) :

µm = 0,0015 θ + 0,0302

où θ est la température en °C et µm le taux de croissance en h-1 (Tableau 10).

La vitesse de dégradation de l’atrazine, quant à elle, n’évolue pas linéairement avec la température et

donc pas non plus avec le taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. : croissance et biodéradation

de l’atrazine en tant que source d’azote ne seraient pas corrélées chez Pseudomonas ADP sp.

On remarque ainsi (Tableau 11) que les quantités d’atrazine dégradées en fonction du temps sont

similaires à 20 ou à 30°C ; à t=12h, 91 à 98% de l’atrazine initialement présente dans le milieu ont été

dégradés contre 70% seulement à 12°C. L’activité de biodégradation de l’atrazine est clairement

ralentie à cette température.

Figure 29 : Influence de la température sur la croissance (A) de Pseudomonas ADP sp. et sa capacité à dégrader l’atrazine (B) en milieu minéral (MM), avec atrazine (environ 50 mg.L-1) comme seule source

d’azote et glucose (1 g.L-1) comme source de carbone ; agitation orbitale (150 rpm) ; pH 7

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0 20 40 60 80 100 120

Temps ( h)

12°C20°C30°C

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120

T emp s ( h)

12°C20°C30°C

A B



134

Tableau 10 : Taux de croissance µm de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures en fonction de la température

T 12°C 20°C 30°C

µm (h-1) 0,0482 0,0602 0,0752

Tableau 11 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 12 heures en fonction de la température

T 12°C 20°C 30°C

Atz dégradée

t=12h 70% 93% 98%

Ces résultats montrent que le procédé pourrait être appliqué sans réchauffement de l’eau à traiter.

Cependant, l’augmentation de la température accélérant le taux de biodégradation, une analyse du

rapport Energie/Efficacité/Coût serait nécessaire pour déterminer la température optimale pour ce

traitement.

III.2.2.2 Croissance et biodégradation de l’atrazine à différents pH

La croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à dégrader l’atrazine ont été testées à

différents pH, en particulier dans la gamme de pH 4-5 correspondant aux pH imposés par l’écorce de

pin en poudre en suspension dans l’eau. La survie des bactéries dans ces conditions de pH est

essentielle dans le cadre du traitement combiné. En effet, de ces résultats dépendent la faisabilité du

procédé.

Le protocole expérimental est décrit au § III.1.5.2 et la Figure 30 présente les résultats obtenus pour

les 4 pH testés.

Figure 30 : Influence du pH sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. (A) et sa capacité à dégrader l’atrazine (B) en milie minéral (MM) ; atrazine comme seule source d’azote (environ 15 mg.L-1) ; glucose

(1g mg.L-1) ; 30°C ; agitation orbitale (150 rpm)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0 10 20 30 40 50 60

T emp s ( h)

pH 3,5pH 4,4pH 5,2pH 7

02468

101214161820

0 10 20 30 40 50 60

T emp s ( h)

pH 3,5pH 4,4pH 5,2pH 7



135

Le Tableau 12 présente les taux de croissance µm de Pseudomonas ADP sp aux différents pH

étudiés (calculé sur les 20 premières heures). Tandis que la meilleure croissance est logiquement

obtenue à pH 7, on observe une croissance intéressante entre pH 5,2 et 4,4 avec des taux de

croissance 0,0381 h-1 à ces deux pH. A pH 3,5 le taux de croissance est très faible ; Pseudomonas

ADP sp. semble ne pas survivre dans ces conditions et par conséquent aucune dégradation de

l’atrazine n’est observée. De plus, on remarque que µ n’est pas proportionnel au pH comme c’était le

cas pour les températures. Malheureusement, aucune valeurs de µ n’a pu être trouvée pour

Pseudomonas ADP sp. dans la littérature.

La biodégradation primaire de l’atrazine à lieu majoritairement au cours des dix premières heures

d’incubation. Si l’activité de consommation de l’atrazine est maximale à pH 7 et 5,2 (Tableau 13, 96 à

99 % d’atrazine initialement présente sont dégradés en 10 heures), elle est également observée, de

manière légèrement retardée à pH 4,4 (82% de l’atrazine initialement apportée est dégradée en 10h).

Tableau 12 : Taux de croissance de Pseudomonas ADP sp. calculés sur les 20 premières heures et vitesse de biodégradation de l’atrazine calculée s sur les 10 premières heures en fonction du pH

pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7

µ (h-1) 0,0199 0,0381 0,0381 0,0387

Tableau 13 : Pourcentage d’atrazine dégradée en 10h en fonction du pH

pH 3,5 pH 4,4 pH 5,2 pH 7

Atrazine dégradée

T=10h

1% 82% 99% 96%

Dans l’hypothèse où l’écorce ne serait pas toxique pour Pseudomonas ADP sp., ces résultats

indiquent que ces bactéries seraient en mesure de survivre dans les conditions de pH imposées par

l’écorce de pin et qu’un traitement visant à tamponner le milieu pourrait ainsi être évité.

III.2.2.3 Influence d’une source additionnelle d’azote

Lors d’une pollution d’eaux de surface ou d’eaux souterraines par l’atrazine, la concentration en

pesticide ne représentant souvent que quelques micro-grammes par litre, le problème se pose quant à

la survie de Pseudomonas ADP sp. lorsque l’atrazine est la seule source d’azote. L’activité

métabolique des bactéries étant essentiellement liée à leur croissance, des expériences ont été

menées afin de tester l’influence qu’aurait l’addition d’une source d’azote (en plus de l’atrazine) sur la



136

capacité de Pseudomonas ADP sp. à dégrader le pesticide. Ces expériences ont été réalisées à des

concentrations en atrazine d’environ 50 mg.L-1 (bien supérieures aux taux de pollution observés dans

la nature et obtenues avec du méthanol comme cosolvant) afin d’obtenir des taux significatifs de

croissance et de permettre le suivi de la concentration en atrazine par analyse HPLC.

III.2.2.3.1 Influence sur la dégradation primaire de l’atrazine

La dégradation primaire de l’atrazine a été suivie par analyse HPLC. Il s’agit en réalité du suivi de la

disparition de l’atrazine du milieu, les métabolites intermédiaires n’étant pas mis en évidence. La

croissance de Pseudomonas ADP sp. a également été suivie en parallèle à la biodégradation de

l’atrazine. Le protocole expérimental pour ces essais est présenté au § III.1.5.3.

La Figure 31 montre très clairement que l’apport d’une source supplémentaire d’azote (sulfate

d’ammonium 1 g.L-1) a un effet positif sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral.

Les taux de croissance estimés dans les différents milieux varient entre 0,0119 h-1 dans le milieu ne

contenant que l’atrazine comme source d’azote (50 mg.L-1 environ, équivalent à 16 mg.L-1 d’azote) et

0,0665 h-1 pour un milieu contenant ou non de l’atrazine dans lequel le sulfate d’ammonium est

apporté à 1g.L-1 (équivalent à 200 mg.L-1 d’azote).

Figure 31 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et dégradation primaire de l’atrazine présente ou non (50 mg.L-1) en milieu minéral (MM) en présence ou non d’une source additionelle d’azote (sulfate

d’ammonium 1 g.L-1) ; Glucose (1 g.L-1) ; 30°C ; agitation orbitale 150 rpm

La Figure 31 montre également que lorsque du sulfate d’ammonium est apporté (1g.L-1), la croissance

est identique en milieu minéral glucosé en présence ou non d’atrazine (µ=0,0665 h-1 et 0,0624 h-1

5

10

15

20

25

30

35

0 10 20 30 40 50 60Temps ( h)

mg

Prot

.L-1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Atr

azin

ez (m

g.L

-1)

MM + Sulf. Am.

MM + Atrazine + Sulf. Am.

MM + Atrazine



137

respectivement) traduisant la non toxicité de l’atrazine, à une concentration de 50 mg.L-1 environ, vis à

vis de Pseudomonas ADP sp.

La croissance est très réduite lorsque l’atrazine est la seule source d’azote présente dans le milieu ; la

vitesse de dégradation ne semble pas en être pour autant affectée ce qui voudrait dire que croissance

et dégradation du substrat atrazine ne seraient pas directement corrélés. C’est également ce

qu’observent Mandelbaum et al. (1995) (voir étude Bibliographique § III.4).

En effet, les vitesses de dégradation de l’atrazine sont tout à fait comparables que ce soit en présence

ou non d’une source additionnelle d’azote comme le sulfate d’ammonium (3,73 et 3,84 mg.h-1

respectivement). Au bout de 13 heures d’incubation, plus de 95% de l’atrazine présente initialement

dans le milieu sont dégradés dans les deux cas.

Ces résultats montrent que la dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par la présence

d’une source additionnelle d’azote dans le milieu mais ne permettent en aucun cas de conclure sur sa

minéralisation.

Pour cette raison, des études de minéralisation ont été menées avec de l’atrazine radioactive.

III.2.2.3.2 Influence sur la minéralisation de l’atrazine

Les expériences de minéralisation ont été conduites selon le protocole décrit au § III.1.5.3.2 en milieu

minéral (MM) enrichi au glucose ou en milieu complexe riche LB en présence d’atrazine marquée

(concentration initiale 20 mg.L-1) . La minéralisation a été suivie par mesure de la production de 14CO2

selon le protocole détaillé au § III.1.4.2.3.

Le sulfate d’ammonium (1g.L-1) a été utilisé comme source additionnelle d’azote dans le milieu MM.

Les résultats présentés à la Figure 32 montrent qu’aucune minéralisation de l’atrazine n’a lieu en

milieu riche (LB) ; le milieu LB contient une quantité importante de nutriments azotés et carbonés

facilement disponibles pour les bactéries ; l’atrazine est « laissée » de côté en faveur des autres

substrats du milieu nutritif.

80% de l’atrazine sont minéralisés en milieu minéral glucosé (MM-Glc), en l’espace de 25h, lorsque

aucune source d’azote est ajoutée au milieu, contre 20% seulement lorsque le sulfate d’ammonium

est présent dans le milieu à 1g L-1.



138

Figure 32 : Minéralisation de l’atrazine (concentration initiale environ 20 mg.L-1) par Pseudomonas ADP sp. en milieu riche (LB) ou en milieu minéral (MM ; glucose 1 g.L-1) contenant ou non une source

additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1) ; 30°C ; Agitation 150 rpm ; 14C-atrazine à 1 µCi/fiole

Si la dégradation primaire de l’atrazine n’est pas affectée par la présence d’une source additionnelle

d’azote dans le milieu, la minéralisation est quant à elle largement réduite, laissant penser que des

métabolites intermédiaires doivent être accumulés. Ce résultat montre également que croissance et

minéralisation ne sont pas couplées puisque l’apport d’azote augmente la croissance mais diminue la

minéralisation. Ce résultat est en accord avec les observations faites par Mandelbaum et al. (1995) :

Biodégradation et croissance ne seraient pas directement corrélées, Pseudomonas ADP sp. étant

capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa croissance.

Ceci implique que le traitement devra se faire sans addition d’azote. Les expériences menées en

extrait aqueux d’écorce de pin décrites ci-après ont pour objectif d’évaluer l’influence des composés

azotés libérés par l’écorce de pin (environ 4 mg.L-1 pour un ratio L/S=20) sur la minéralisation de

l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

III.2.3 Influence des composés solubles de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp.

Cette étude a permis de déterminer si les composés organiques solubles de l’écorce de pin,

solubilisés lorsque la poudre est en suspension dans l’eau, étaient ou non toxiques pour la souche

Pseudomonas ADP sp. choisie. De ce résultat dépendait la faisabilité du traitement ; c’est donc un

point essentiel de cette étude que nous abordons dans ce chapitre. Les essais concernant l’influence

des composés solubles de l’écorce sur Pseudomonas ADP sp. ont été réalisés en extrait aqueux

d’écorce de pin (Cf. §I.6), nous permettant ainsi de suivre des croissances bactérienne par densité

optique et de suivre la dégradation de l’atrazine, en s’affranchissant des phénomènes d’adsorption qui

seraient intervenus si nous avions utilisé un milieu contenant l’écorce elle-même.

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80Temps ( h)

% A

traz

ine

min

eral

isée

MM

MM + Sulf. Am.

LB



139

Différents tests ont été mis en oeuvre : des essais de respirométrie ont permis d’étudier dans un

premier temps la toxicité des composés de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp.; d’autre part la

croissance (par mesure de DO) et la biodégradation de l’atrazine (analyse HPLC) ont été suivis en

extrait d’écorce de pin ; l’influence de l’addition d’une source supplémentaire de carbone à l’extrait

d’écorce de pin a également fait l’objet d’une étude particulière.

III.2.3.1 Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin

L’extrait aqueux d’écorce de pin utilisé dans ces essais contenait une quantité d’environ 100 mg.L-1 de

carbone organique dissous (COD) et environ 4 mg.L-1 d’azote, potentiellement utilisables pour les

bactéries (Cf. § Tableau 9, p.117).

Le suivi en parallèle de l’activité respiratoire en milieu minéral (MM-Glc) glucosé à 1 ou 0,25 g.L-1 et

sulfate d’ammonium 1 g.L-1 et en extrait d’écorce de pin, a permis d’étudier la toxicité des composés

de l’écorce vis à vis de Pseudomonas ADP sp. (Cf. protocole expérimental au § III.1.5.4.2). D’autre

part, aucune source de carbone n’ayant été ici additionnée à l’extrait d’écorce, ces essais ont permis

de tester la capacité de Pseudomonas ADP sp. à utiliser les composés organiques solubles de

l’écorce de pin comme source de carbone.

La Figure 33 montre que pour une même concentration initiale en carbone organique dissous dans

l’extrait et en milieu minéral (COD 100 mg.L-1 en MM-Glucosé à 0,25 g.L-1 ou en extrait) l’activité

respiratoire de Pseudomonas ADP sp. est relativement équivalente en milieu minéral (MM) et en

extrait aqueux d’écorce de pin ; on note cependant une croissance très légèrement meilleure en MM.

Cette différence peut être expliquée soit par une faible toxicité des composés solubles de l’écorce de

pin vis à vis de Pseudomonas ADP sp., soit plus probablement par une plus faible biodégradabilité de

ces composés.

Figure 33 : Activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) en présence de 1 ou 0,25 g.L-1 de glucose comme source de carbone, 1 g.L-1 de sulfate d’ammonium ; en extrait aqueux

d’écorce de pin (sulfate d’ammonium 1 g.L-1 comme source d’azote) en présence ou non de sels minéraux ; 30°C ; agitation 150 rpm

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 10 20 30 40 50temps (h)

DB

O (m

g.L-

1)

MM + Glc (1 g/l) + N (1 g/l)

MM + Glc (0.25g/l) + N (1g/l)

Extrait + N (1g/l)

Extrait + N (1g/l) + sels



140

Lorsque le glucose est apporté à 1 g.L-1 (correspondant à une concentration en COD de 400 mg.L-1)

la respiration est logiquement supérieure à celle observée avec une concentration plus faible en

glucose. L’apport de nutriments minéraux à l’extrait n’améliore pas l’activité bactérienne par rapport à

l’extrait seul, ce qui permet de conclure que les nutriments minéraux essentiels doivent être présents

en quantité suffisante dans l’extrait pour les bactéries.

Ainsi, les composés solubles de l’écorce de pin ne semblent pas présenter de toxicité vis à vis de

Pseudomonas ADP sp. De plus, ces composés peuvent être utilisés par Pseudomonas ADP sp.

comme source de carbone, permettant ainsi d’éviter l’addition d’une source additionnelle de carbone

lors du traitement combiné.

Ces résultats encouragent ainsi l’idée de faisabilité du traitement combiné sur écorce de pin.

III.2.3.2 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait d’écocre de pin

La croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin a été suivie en présence

ou non de sources additionnelles de carbone (glucose 1 g.L-1) et/ou d’azote (sulfate d’ammonium

1 g.L-1) et comparée à la croissance en milieu minéral (MM) enrichi en glucose (1 g.L-1) et en sulfate

d’ammonium (1 g.L-1).

Le protocole de ces essais est détaillé au § III.1.5.4.2.

La Figure 34 montre tout d’abord que la croissance de Pseudomonas ADP sp. est faible

lorsqu’aucune source complémentaire de carbone ou d’azote n’est ajoutée à l’extrait aqueux d’écorce

de pin. La présence d’une source additionnelle d’azote stimule considérablement la croissance

indiquant d’une part que la quantité d’azote contenue dans l’extrait (environ 4mg.L-1, avec C/N = 50/1)

est insuffisante pour permettre un bon développement des bactéries, et confirmant d’autre part, que

Pseudomonas ADP sp. utilise les composés organiques solubles de l’écorce de pin comme source de

carbone.



141

Figure 34 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait stérile d’écorce de pin ou en milieu minéral (MM) contenant ou non une source additionnelle de carbone (glucose 1g.L-1 noté Glc) et/ou une source

d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm

L’addition de glucose (1 g.L-1) à l’extrait induit une inhibition de la croissance de Pseudomonas ADP

sp., en présence ou non d’une source complémentaire d’azote (respectivement C/N=100/200 avec

une source additionnelle d’azote et C/N=100/0,8 sans source additionnelle d’azote) Dans les essais

contenant du glucose, des agrégats sont formés laissant penser que les cellules se regroupent pour

constituer une forme défensive, ce qui pourrait indiquer que la présence de glucose additionnel n’est

pas favorable à leur croissance. Cette hypothèse est confirmée par les essais menés en extrait

aqueux d’écorce de pin contenant différentes concentration de glucose (Figure 35).

D’autre part, la Figure 34 montre également que la croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait

est retardée par rapport à la croissance observée en milieu minéral (MM glucosé et azoté)

correspondant à une phase d’adaptation des micro-organismes d’environ 40h au milieu contenant les

composés organiques solubles de l’écorce de pin.

L’activité respiratoire de Pseudomonas ADP sp. a été suivie pour des concentrations en glucose

comprises entre 0 et 1 g.L-1 (Figure 35).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 50 100 150 200

Temps (h)

DO

600

nm

MM + N + Glc

Extract + N

Extract

Extract + Glc + N

Extract + Glc



142

Figure 35 : Activité respiratoire (exprimée en mg de O2.L-1) de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin contenant (0,25 mg.L-1 ; 0,5 mg.L-1 ou 1 mg.L-1) ou non du glucose ; 30°C ; agitation 150

rpm.

La présence d’une source additionnelle de carbone (glucose) dans l’extrait d’écorce de pin a un effet

inhibiteur sur la respiration de Pseudomonas ADP sp. La Figure 35 montre que la respiration est

meilleure lorsque aucune source de carbone n’est ajoutée à l’extrait. Dans ces conditions, le rapport

C/N est de 100/4 et correspond aux exigences nutritives classiques pour les bactéries. Pour des

concentrations en glucose supérieures à 0,25 mg.L-1 (C/N>250/4), la formation d’agrégats bruns

(1 mm de diamètre environ) a été observée comme précédemment, laissant penser à une forme

défensive des cellules.

Des essais de croissance ont également été menés en présence d’atrazine (50 mg.L-1) en tant que

source d’azote. La Figure 36 présente les résultats de ces essais et montre à nouveau que la

croissance en extrait (comme en MM) est très limitée lorsque aucune source d’azote supplémentaire

n’est apportée au milieu. L’apport d’atrazine dans l’extrait (50 mg.L-1) comme seule source

additionnelle d’azote stimule légèrement la croissance de Pseudomonas ADP sp. par rapport aux

conditions en extrait seul. Lorsque du sulfate d’ammonium est additionné à l’extrait (1g.L-1), le

développement de Pseudomonas ADP sp. se trouve très nettement stimulé que ce soit en présence

d’atrazine ou non, indiquant que l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin ne présente pas de

toxicité vis à vis de Pseudomonas ADP sp.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 20 40 60 80 100 120 140

Temps (h)

DB

O (m

g.L-1

) Sans glucose

Glucose 0,25 g/l

Glucose 0,5 g/l

Glucose 1g/l

Blanc stérile



143

Figure 36 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 1 g.L-1) en présence d’atrazine (50 mg.L-1) avec

ou sans sulfate d’ammonium (1 g.L-1 noté N) ; 30°C ; agitation 150 rpm

La Figure 36 montre également que la dégradation primaire de l’atrazine en extrait seul et en extrait

contenant une source additionnelle d’azote (sulfate d’ammonium 1 g.L-1) est équivalente : environ

40 % de l’atrazine initialement apportée au milieu est dégradée en 12 heures) alors que la croissance

est meilleure lorsqu’une source d’azote est ajoutée à l’extrait (µmax=0,0547 h-1 en extrait azoté contre

0,0296 h-1 en extrait seul). Cette observation confirme à nouveau que croissance et activité de

biodégradation de l’atrazine ne seraient pas directement corrélées comme cela a déjà été discuté au

§ III.2.2.3.2 p.137. D’autres auteurs (Mandelbaum et al., 1995) ont également montré que

Pseudomonas ADP sp. est capable de minéraliser l’atrazine dans des conditions non favorables à sa

croissance. Pseudomonas ADP sp. continue de métaboliser l’atrazine au delà de ses besoins en

azote. Ceci serait lié au fait que les enzymes responsables du métabolisme de l’atrazine sont

présentes dans le cytoplasme ou le periplasme des cellules bactériennes.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30 40 50 60

Temps (h)

DO

600n

m

Extrait + N

Extrait + Atrazine + N

Extrait + Atrazine

Extrait

MM-Glc + Atrazine

0

10

20

30

40

50

60

0 10 20 30 40 50 60

Temps (h)

Atr

azin

e en

sol

utio

n (m

g.L-1

)

Extrait

Extract + N

Témoin Stérile Extrait

Biodégradation

Croissance



144

L’addition d’une source d’azote au milieu, bien que profitable à la croissance des bactéries, ne stimule

donc pas pour autant la biodégradation de l’atrazine. D’autre part, les essais précédents réalisés en

milieu minéral glucosé (MM-Glc) ont montré que l’addition d’une source d’azote diminuait

considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp.

Ainsi, nous avons écarté l’idée d’ajouter une source additionnelle d’azote pour les essais suivants, ne

conservant comme seule source d’azote que l’atrazine et les quelques traces d’azote contenu dans

l’extrait aqueux d’écorce de pin ou les particules d’écorce de pin elles-mêmes.

Concernant les essais de minéralisation, la Figure 37 montre les résultats obtenus en extrait stérile

d’écorce de pin et en milieu minéral MM glucosé (protocole expérimental décrit au § V.1.1.1).

Figure 37 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou en milieu minéral MM (glucose 0,25 g.L-1) ; concentration initiale en atrazine 20 mg.L-1 ; 22°C ;

agitation lente

La minéralisation est similaire en extrait et en milieu minéral glucosé, pour une quantité de carbone

équivalente dans les deux milieux (100 mg.L-1), à une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L-1

(correspondant à un rapport C/N de l’ordre de 100/5-9). Une nouvelle fois ces résultats montrent que

la présence des composés organiques de l’écorce de pin ne sont pas néfastes pour Pseudomonas

ADP sp. vis à vis de la minéralisation de l’atrazine.

III.3 Conclusions

Les principales conclusions concernant la biodégradation de l’atrazine en culture pure de

Pseudomonas ADP sp. sont les suivantes :

- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et dégrader l’atrazine de façon

significative à une température de 12°C et à des pH acides compris entre 4,4 et 7.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

MM-Glc + AtrazineExtrait + Atrazine



145

- L’addition d’une source d’azote au milieu, en plus de l’atrazine, stimule la croissance

des bactéries mais diminue considérablement le taux de minéralisation de l’atrazine,

elle-même consommée en tant que source d’azote par Pseudomonas ADP sp., sans

pour autant affecter le taux de dégradation primaire de l’atrazine.

- Pseudomonas ADP sp. est capable de croître et de dégrader l’atrazine en extrait

aqueux d’écorce de pin contenant les composés organiques solubles de l’écorce de

pin. Les taux de minéralisation observés en extrait aqueux d’écorce de pin et en

milieu minéral glucosé (MM-Glc 0,25 g.L-1) sont similaires. Les composés organiques

de l’écorce de pin peuvent être consommés par Pseudomonas ADP sp. en tant que

source de carbone (concentration en carbone dans l’extrait 100 mg.L-1 ). Ils sont par

conséquent biodégradables et non toxiques vis à vis de Pseudomonas ADP sp.

- L’addition de glucose à l’extrait aqueux d’écorce de pin provoque une inhibition de la

croissance de Pseudomonas ADP sp.

En terme d’application, ces résultats suggèrent que :

- La biodégradation de l’atrazine pourrait être efficace sans l’ajout d’une source

supplémentaire de carbone comme le glucose. Pseudomonas ADP sp. pourrait ainsi

dégrader en parallèle l’atrazine (source d’azote) et les composés organiques solubles

issus de l’écorce de pin (source de carbone).

- La faible concentration en azote contenue dans l’écorce de pin pourrait stimuler

l’utilisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en tant que source d’azote.

L’addition d’une source d’azote supplémentaire induirait une réduction du taux de

minéralisation de l’atrazine.

- La biodégradation de l’atrazine pouvant avoir lieu à des pH acides imposés par la

présence des composés organiques de l’écorce (pH 4,4), le traitement pourrait être

conduit sans addition de tampon. D’autre part, la biodégration ayant été observée à

12°C, le réchauffement de l’eau à traiter ne serait pas indispensable. Ainsi, des

conditions de traitement relativement « rustiques » pourraient être envisagées.

Cependant, le contrôle du pH et de la température dans les zones optimales

permettrait bien évidemment d’optimiser l’efficacité du procédé.

MATERIEL ET METHODES Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce


146

IV. Caractérisation et rôle de la microflore Indigène de l’écorce de pin

La capacité de Pseudomonas ADP sp. à coexister, à croître et à dégrader l’atrazine en présence de la

microflore indigène de l’écorce de pin est un aspect important de la faisabilité du procédé combiné

envisagé.

Quelle influence cette microflore indigène a-t-elle sur la souche bactérienne Pseudomonas ADP sp. ?

Sont-elles en compétition ?

D’autre part, la microflore de l’écorce de pin peut-elle également intervenir dans le processus de

dégradation de l’atrazine ? Les expériences décrites ci-dessous ont été conduites pour répondre à ces

questions.

IV.1 Matériel et méthodes

IV.1.1 Isolement et identification des micro-organismes de l’écorce de pin

L’isolement des principaux micro-organismes extraits de l’écorce de pin a permis d’identifier

qualitativement les espèces revivifiables prédominantes et de tester, en cultures pures ou en

consortium, leur capacité à croître dans un milieu contenant de l’atrazine et à la dégrader.

L’isolement de la flore indigène de l’écorce de pin a été réalisé à partir de la poudre d’écorce

(particules d’écorce d<200 µm). Deux grammes d’écorce en poudre ont été placés dans des

Erlenmeyers préalablement stérilisés contenant 20 mL de milieu riche LB, puis placés à 30°C sous

agitation (150 rpm) pendant 72 heures. L’isolement des souches a été réalisé par étalement des

surnageants dilués en cascade à 10-4, 10-6, 10-7 et 10-8, sur boites de Pétri contenant un milieu solide

riche PCA. Les boites de gélose ont été incubées dans une étuve thermostatée à 30°C pendant

plusieurs jours. Tous les essais ont été réalisés en triplicats.

Les colonies ont été différenciées selon leur forme, leur aspect et leur couleur. Chacune des

différentes colonies de morphologie différente a ensuite été purifiée par deux étalements successifs

sur un milieu PCA.

Une observation au microscope optique ainsi qu’une coloration Gram (coloration au Cristal violet,

Lugol et Safranine) ont été réalisées sur chacune des souches isolées afin de déterminer la forme des

cellules et leur appartenance à une classe de micro-organismes.

Les micro-organismes isolés ont été congelés suivant le même protocole que pour Pseudomonas

ADP sp.(cf. § III.1.2.1).



147

Il ne fait pas de doute que la totalité des micro-organismes présents dans l’écorce n’a pas été isolée

par cette technique de revitalisation. Il est connu que dans les sols, cette approche ne touche que

quelques % des cellules (Giacomazzi, 2002). Cependant, on peut penser que les micro-organismes

mis en évidence selon l’isolement effectué ci-dessus représentent les espèces indigènes majoritaires

de l’écorce de pin.

IV.1.2 Capacité de la flore indigène à dégrader l’atrazine

Les quatre isolats obtenus à partir de l’isolement des micro-organismes de l’écorce de pin sont notés

CP1 à CP4.

IV.1.2.1 Biodégradation de l’atrazine en consortium ou en cultures pures

La biodégradation de l’atrazine par le consortium, contenant les 4 souches isolées (CP1, CP2, CP3,

CP4) de l’écorce de pin, ou par des cultures pures de chacune des souches, a été testée en milieu

liquide LB et en extrait aqueux d’écorce de pin. Le milieu riche LB a été utilisé afin d’obtenir une

bonne croissance des micro-organismes présents, et donc une forte activité métabolique ; l’extrait

aqueux d’écorce de pin a quant à lui permis de simuler les conditions du milieu d’origine des différents

micro-organismes isolés.

Comme précédemment, la croissance des micro-organismes a été suivie par mesure de DO600

(III.1.3.1.1); la dégradation de l’atrazine du milieu a été analysée par HPLC (II.1.1.1.2(a)) sur les

prélèvements effectués entre le temps 0 à 200 heures environ.

Les essais ont été réalisés en Erlenmeyers dans 20 mL de milieu (LB ou extrait aqueux d’écorce de

pin) à 30°C sous agitation (150 rpm). Les fioles ont été inoculées à partir des stocks de cellules

congelées avec environ 106 cfu.mL-1de chacune des 4 souches isolées.

L’atrazine a été ajoutée aux essais à environ 50 mg.L-1.


IV.1.2.2 Minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin

L’utilisation d’atrazine marquée uniformément au 14C a permis d’étudier la minéralisation de l’atrazine

par la flore indigène de l’écorce de pin en présence même d’écorce de pin en poudre dans un milieu

minéral (MM).

Les expériences ont été réalisées en biomètre en présence de 50 mL de MM stérile contenant 2,5 g

(ratio L/S =20 mL.g-1) d’écorce de pin en poudre non stérile (d>200nm). C’est donc l’écorce de pin qui

ici, apporte les micro-organismes indigènes au milieu. Deux concentrations initiales en atrazine ont



148

été testées : 44 µg.L-1et 20 mg.L-1. Les biomètres ont été placés à 20 ± 2°C et agités doucement avec

un barreau magnétique.

Les témoins abiotiques ont été préparés à partir de 2,5 g d’écorce préalablement stérilisée (§ I.7) et

50 ml de milieu MM stérile.

La minéralisation a été suivie par quantification du 14CO2 formé selon le protocole décrit au

§ III.1.4.2.3.

IV.1.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp.

Le travail qui suit a consisté à étudier la croissance de Pseudomonas ADP sp. ainsi que sa capacité à

biodégrader et à minéraliser l’atrazine en présence de la microflore de l’écorce de pin. Les essais ont

été réalisés en extrait aqueux d’écorce de pin dans un premier temps puis en présence d’écorce en

poudre.

IV.1.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp.

Pseudomonas ADP sp. a été cultivé dans des Erlenmeyers de 250 mL contenant 50 mL d’extrait

aqueux d’écorce de pin stérile, ou non stérile, ou 50 mL de milieu minéral stérile (MM) contenant de

l’écorce de pin en poudre (diamètre<200 µm) préalablement stérilisée (§ I.7) ou non à un ratio

liquide/solide de 10 mL.g-1. Pseudomonas ADP sp. a été inoculé entre 0,5.108 et 1.108 cfu.mL-1 dans

chaque Erlenmeyer

Dans chacun des essais, 30 mg.L-1 d’atrazine ont été additionnés au milieu en tant que source

d’azote. Les composés solubles de l’écorce de pin constituaient la seule source de carbone pour les

micro-organismes en culture.

Les cultures ont été incubés à 30°C sous d’agitation (150 rpm).

Le suivi de la croissance de Pseudomonas ADP sp. a été réalisé par comptage sur boite de Pétri PCA

(III.1.3.1) lorsque l’écorce était présente dans les erlens et par mesure de densité optique en milieu

liquide d’extrait d’écorce de pin.


IV.1.3.2 Biodégradation de l’atrazine

IV.1.3.2.1 Suivi de la dégradation primaire de l’atrazine en extrait aqueux d’écorce de pin

La dégradation de l’atrazine a été suivie sur 5 jours par analyse HPLC des prélèvements de 1 mL

effectués périodiquement (II.1.1.1.2(a)). Cette étude n’a été réalisée que dans l’extrait aqueux



149

d’écorce de pin puisqu’en présence de particules d’écorce l’adsorption ne peut pas être distinguée de

la biodégradation.

IV.1.3.2.2 Suivi de la minéralisation de l’atrazine

La minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore indigène de

l’écorce de pin a été étudiée en milieu minéral (MM) en présence d’écorce de pin en poudre (non

stérile, ratio L/S=20 mL.g-1). Pour ces expériences, l’atrazine était la seule source additionnelle

d’azote. Deux concentrations initiales en atrazine ont été testées : 44,2 µg.L-1 (correspondant à une

pollution probable) et 20 mg.L-1 (concentration en azote permettant un développement microbien

important). Les composés solubles de l’écorce de pin étaient la seule source de carbone (COT

initial = 580 mg.L-1) (Tableau 9, p.117). Les composés solubles de l’écorce de pin apportaient au

milieu une concentration en azote d’environ 4 mg.L-1. Pseudomonas ADP sp. a été inoculé à partir de

précultures à une DO initiale de 0,05. Les essais ont été réalisés à 20 ± 2°C dans des biomètres et

agités doucement à l’aide de barreaux magnétiques.

Les témoins contenant l’écorce stérilisée (débarrassée de sa microflore) ont été inoculés de la même

façon que précédemment (préculture de Pseudomonas ADP sp.) et incubés dans les mêmes

conditions.

La minéralisation a également été suivie dans des témoins non inoculés par Pseudomonas ADP sp.

RESULTATS ET DISCUSSION Caractérisation et rôle de la microflore de l’écorce


150

IV.2 Résultats et discussion

IV.2.1 Isolement de la microflore de l’écorce de pin

L’isolement de colonies issues de l’écorce de pin réalisé selon le protocole présenté au § IV.1.1 a

permis de mettre en évidence 4 isolats majoritaires nommés CP1, CP2, CP3 et CP4.

Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de ces isolats sont résumées dans le Tableau

14.

Tableau 14 : Description des colonies de micro-organismes isolés de l’écorce de pin sur boite de Pétri

Colonie Taille Forme Contour Epaisseur Aspect Couleur Gram Filament

CP1 2-3 mm circulaire régulier plat opaque

incrusté

dans l’agar

blanc + oui

CP2 7 mm circulaire

ou ovale

régulier plat lisse

muqueux

translucide

beige Coque - non

CP3 2-3 circulaire régulier plat translucide

brillant

lisse

beige Bacile - non

CP4 2-3 circulaire régulier plat translucide

brillant

lisse

jaune Coque + non

Chacun des 4 isolats mis en évidence par cette méthode présente une morphologie particulière

(couleur, forme, taille, présence de filament…) ce qui a permis de les identifier assez facilement sur

boite de Pétri et de les distinguer de Pseudomonas ADP sp.

Si CP1, CP3 et CP4 présentent l’aspect de bactéries, l’observation de CP2 au microscope optique se

rapproche d’une structure de levure de part sa taille et sa forme (Coque 10 à 20 µm). Suite à cet

isolement, des stocks de cellules congelées de chacun des isolats ont été préparés et conservés pour

être utilisés, de la même façon que Pseudomonas ADP sp., lors des études qui suivent.



151

IV.2.2 Capacité de la flore indigène de l’écorce à biodégrader l’atrazine

L’objectif de cette étude est de déterminer si la flore indigène de l’écorce de pin joue ou non un rôle

significatif dans la biodégradation de l’atrazine. Chaque isolat (CP1 à CP4) a donc été testé pour ses

capacités à dégrader l’atrazine en culture pure et en consortium, en milieu complexe riche (LB) et en

extrait aqueux d’écorce de pin.

IV.2.2.1 Biodégradation primaire de l’atrazine

Les essais de biodégradation de l’atrazine ont été conduits en milieu riche LB et en extrait aqueux

d’écorce de pin selon le protocole décrit au § IV.1.2.1., en présence d’atrazine (concentration initiale

d’environ 50 mg.L-1) comme source d’azote ; aucune source de carbone n’a été ajoutée à l’extrait

d’écorce de pin.

La Figure 38 montre que, l’atrazine est biodégradée par le consortium (CP1, CP2, CP3 et CP4 à

environ 106 cfu.mL-1 chacun) en milieu complexe riche LB. Aucune biodégradation de l’atrazine n’est

en revanche observée dans l’extrait aqueux d’écocre de pin. De plus, la croissance du consortium en

milieu LB est nettement supérieure à celle observée en extrait d’écorce de pin où elle est quasiment

nulle. Ce phénomène peut être lié à une carence en azote dans l’extrait aqueux d’écorce de pin

(l’atrazine, 50 mg.L-1 environ, représente la seule source d’azote pour les bactéries, équivalent à

environ 17 mg.L-1 d’azote). Les micro-organismes de l’écorce peuvent également être inaptes à

consommer les composés organiques dissous de l’écorce de pin ou incapables de cométaboliser

l’atrazine en présence de ces composés organiques.

Figure 38 : Croissance du consortium isolé à partir de l’écorce de pin et biodégradation de l’atrazine en milieu LB ou en extrait aqueux d’écorce de pin inoculé avec environ 106 cfu.mL-1 de chaque isolat (CP1 à

CP4) ; atrazine comme source d’azote (55 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm

0

10

20

30

40

50

60

70

0 100 200 300

Temps (h)

Témoin stérile

Extrait + Atrazine

LB + Atrazine

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

0 100 200 300

Temps (h)

Extrait + AtrazineLB + Atrazine

Croissance Biodégradation



152

Afin d’identifier les micro-organismes de la flore indigène de l’écorce de pin responsables de la

dégradation de l’atrazine en milieu LB, les mêmes expériences ont été répétées en culture pure de

chaque isolat.

La Figure 39 présente les résultats de biodégradation de l’atrazine obtenus en cultures pures.

Figure 39 : Biodégradation de l’atrazine en milieu LB par les micro-organismes isolés de l’écorce de pin (inoculé avec environ 106 cfu.mL-1 de CP1, CP2, CP3 ou CP4) ; atrazine comme source d’azote (environ 55

mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm

Alors que les isolats CP3 et CP4 ne semblent pas présenter d’activité de dégradation significative de

l’atrazine, les isolats CP1 et surtout CP2, quant à eux, présentent une activité significative. En

présence de l’isolat CP1, environ 50% de l’atrazine présente initialement dans le milieu sont dégradés

en 310 heures, contre 83% dans ce même intervalle de temps en présence de l’isolat CP2,

correspondant à la dégradation observée avec le consortium. L’isolat CP2, et dans une moindre

mesure CP1, seraient donc responsables de la biodégradation de l’atrazine observée en présence du

consortium en milieu LB.

Ces résultats sont à analyser avec précaution puisqu’il s’agit ici de biodégradation primaire de

l’atrazine et non pas de minéralisation.

IV.2.2.2 Minéralisation de l’atrazine

La capacité de la microflore indigène de l’écorce de pin à minéraliser l’atrazine a été étudiée grâce à

l’utilisation d’atrazine marquée au 14C par suivi du dégagement de 14CO2 dans des biomètres, selon le

protocole présenté au § IV.1.2.2.

Ces expériences ont été réalisées en présence même de particules d’écorce (d<200 µm) non

stérilisée, et contenant par conséquent la microflore naturelle de l’écorce, immergées dans un milieu

minéral stérile MM à un ratio Liquide/Solide de 20 mL.g-1.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

Atr

azin

e (m

g.L-1

)

CP4CP3CP1CP2



153

Deux concentrations initiales d’atrazine ont été testées : la première, 20 mg.L-1 a permis d’apporter

une source d’azote significative pour la croissance des micro-organismes (aucune autre source

d’azote n’a été additionnée au milieu). La seconde concentration en atrazine testée de 44,2 µg.L-1

pourrait correspondre à une probable pollution des milieux naturels à l’atrazine.

Les résultats de ces essais pour les deux concentrations en atrazine testées sont présentés Figure

40.

Figure 40 : Minéralisation de l’atrazine en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin stériles ou non stériles (d<200 µm) à un ratio L/S=20 ; [atrazine]i=20 mg.L-1 ou 44,2 µg.L-1 comme seule

source d’azote ; 20 ± 2 °C ; agitation lente

L’activité de minéralisation de l’atrazine par la flore indigène de l’écorce de pin n’est pas négligeable

puisqu’après environ 320 heures d’incubation des particules d’écorce non stériles en milieu minéral, 9

à 16% de l’atrazine présente initialement dans le milieu sont minéralisés sous forme de CO2. A faible

concentration en atrazine (44,2 µg.L-1), le pourcentage d’atrazine minéralisée est légèrement

supérieur à celui observé à forte concentration (20 mg.L-1).

Lors du traitement combiné envisagé, la microflore de l’écorce de pin pourra soit contribuer en même

temps que Pseudomonas ADP sp. à la dégradation de l’atrazine, apportant un effet cumulatif

bénéfique, soit entrer en compétition avec Pseudomonas ADP sp. pour les nutriments présents dans

le milieu, et notamment l’atrazine, provoquant un effet négatif sur l’activité de Pseudomonas ADP sp.

et donc sur l’efficacité du traitement mis en place.

Ainsi, dans le paragraphe qui suit, des expériences mettent en évidence l’effet de cette microflore

indigène de l’écorce de pin vis à vis de la croissance de Pseudomonas ADP sp. et de sa capacité à

minéraliser l’atrazine.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 100 200 300 400Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

Ecorce non stérile + Atz 44 µg/L

Ecorce non stérile + Atz 20 mg/L

Témoin stérile (Atz 44 µg/L)

Témoin stérile (Atz 20 mg/L)



154

IV.2.3 Influence de la microflore de l’écorce de pin sur Pseudomonas ADP sp

Quelle est l’influence de la microflore de l’écorce de pin sur le développement de Pseudomonas ADP

sp. utilisée dans le cadre du traitement combiné et sur sa capacité à dégrader l’atrazine ? Des essais

ont été réalisés afin de quantifier cet effet, afin de déterminer si une stérilisation de l’écorce serait

nécessaire avant son utilisation en tant que support de la biofiltration, lors du traitement combiné

étudié ici.

IV.2.3.1 Croissance de Pseudomonas ADP sp. et biodégradation de l’atrazine en présence de la microflore de l’écorce de pin

L’influence de la microflore de l’écorce de pin sur la croissance de Pseudomonas ADP sp. a été

étudiée en extrait aqueux d’écorce de pin non stérile, contenant naturellement une partie de la flore

indigène de l’écorce, et en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce non stériles

(d<200 µm). Des témoins stériles (extrait stérile et MM + particules d’écorce stériles) ont été suivis en

parallèle. Le protocole de cette étude figure au § IV.1.3.1.

La Figure 41 compare l’évolution de la croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu MM en

présence de particules d’écorce de pin stériles ou non.

Figure 41 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin (ratio L/S=10), en présence d’atrazine (30 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm. En foncé : Pseudomonas ADP sp. est inoculé avec l’écorce stérile ; en clair : Pseudomonas ADP sp. est inoculé

avec l’écorce non stérile

On constate dans les deux cas une diminution de la concentration en cellules de Pseudomonas ADP

sp. au cours des deux premiers jours, traduisant probablement une adsorption des cellules sur les

particules solides. La croissance de Pseudomonas ADP sp. est ensuite faible et s’avère en outre

réduite par la présence de la flore indigène de l’écorce. Le comptage des cellules n’inclut pas ici les

cellules adsorbées sur l’écorce mais uniquement les cellules présentes dans le milieu liquide.

0

50

100

150

200

0 1 2 3 7Jour

cell.

106 /m

l




155

Cependant, nous avons considéré que les cellules présentes en milieu aqueux et celle adsorbées

étaient proportionnellement réparties dans les deux phases et que par conséquent, l’évolution de la

densité de cellules dans le liquide était représentative de la croissance globale de Pseudomonas ADP

sp.

En extrait aqueux d’écorce de pin (Figure 42), la présence de la micro-flore de l’écorce n’affecte pas la

croissance de Pseudomonas ADP sp. La croissance est en effet équivalente en extrait stérile et en

extrait non stérilisé contenant la microflore de l’écorce de pin.

Figure 42 : Croissance de Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux d’écorce de pin stérile ou non stérile en présence d’atrazine (environ 50 mg.L-1) ; 30°C ; agitation 150 rpm

Concernant l’influence de la flore de l’écorce sur la biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas

ADP sp., la Figure 43 montre que la dégradation de l’atrazine semble être légèrement réduite en

extrait non stérile d’écorce de pin mais seulement après 40 heures d’incubation, par comparaison à la

dégradation en extrait stérile. Après 120 heures d’incubation, environ 66% de l’atrazine initialement

présente sont dégradés dans l’extrait d’écorce de pin non stérile contre environ 80% dans l’extrait

stérile, alors qu’après 45h la biodégradation est similaire (65% environ).

Ce phénomène pourrait suggérer l’existence d’une compétition pour les nutriments du milieu

(carbone, azote ou minéraux) entre Pseudomonas ADP sp. et les micro-organismes indigènes de

l’écorce de pin présents dans l’extrait. Cependant, ce résultat est incertain car il ne repose que sur un

point de la courbe.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 20 40 60 80 100 120

Temps (h)

DO

600n

m

Pseudo en Extrait stérile

Pseudo en Extrait non stérile

Témoin - Extrait stérile

Témoin - Extrait non stérile



156

Figure 43 : Biodégradation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en extrait aqueux stérile et non stérile d’écorce de pin ; [atrazine ]i= 30 mg.L-1 ; 30°C ; agitation 150 rpm

La microflore indigène de l’écorce de pin aurait globalement un effet légèrement négatif à la fois sur la

croissance de Pseudomonas ADP sp., en présence de particules d’écorce de pin, et sur sa capacité à

biodégrader l’atrazine. Cette observation suggère l’existence d’une légère compétition entre les micro-

organismes de l’écorce et Pseudomonas ADP sp. pour la consommation des nutriments du milieu,

mais l’incidence en est très faible.

IV.2.3.2 Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en présence de la microflore de l’écorce

Les essais ont été réalisés en biomètres par suivi du 14CO2 en milieu minéral (MM) contenant des

particules d’écorce stériles et non stériles, selon le protocole décrit au § IV.1.3.2.2 à deux

concentrations initiales en atrazine (20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1).

Pour les deux concentrations initiales en atrazine testées, la Figure 44 montre que la microflore de

l’écorce seule (MM + écorce non stérile non inoculée par Pseudomonas ADP sp.) est capable de

minéraliser jusqu’à 16% de l’atrazine. Le témoin stérile (MM + Ecorce stérile) ne présente aucune

activité de minéralisation.

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

Temps (j)

% A

traz

ine

dégr

adée

Pseudo en Extrait stérile

Pseudo en Extrait non stérile



157

Figure 44 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. présente à une concentration initiale de 20 mg.L-1 (A) ou 44,2 µg.L-1 (B) en milieu minéral (MM) contenant des particules d’écorce de pin stériles ou

non stériles (L/S=20) ; 20 ± 2 °C ; agitation lente

Lorsque l’atrazine est présente dans le milieu à forte concentration (20 mg.L-1, Figure 44-A), le taux de

minéralisation atteint 52% en présence des particules d’écorce non stériles contre 35% seulement

avec l’écorce stérile, indiquant que la présence de la flore indigène de l’écorce aurait un effet positif

sur la minéralisation de l’atrazine.

A faible concentration en atrazine (44,2 µg.L-1, Figure 44-B) le phénomène inverse est observé : la

microflore de l’écorce de pin induit une légère inhibition de la minéralisation de l’atrazine par

Pseudomonas ADP sp. : 45% de l’atrazine sont minéralisés en présence d’écorce non stérile contre

50% environ en présence d’écorce stérile. Ce résultat indique que la microflore de l’écorce de pin et

Pseudomonas ADP sp. sont en compétition pour l’utilisation des nutriments et/ou des sources de

A

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée

Ecorce non stérile + Pseudo

Ecorce stérile + Pseudo

Témoin Ecorce non stérile

Témoin Ecorce stérile

B

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

% A

traz

ine

min

éral

isée Ecorce stérile + Pseudo

Ecorce non stérile + Pseudo

Témoin Ecorce non stérile

Témoin Ecorce stérile



158

carbone du milieu ; cette compétition induit un effet de réduction du taux d’atrazine dégradée par

Pseudomonas ADP sp.

A faible concentration, on peut penser que l’adsorption sur les particules d’écorce doit probablement

avoir lieu principalement en surface des particules, laissant ainsi l’atrazine facilement disponible pour

Pseudomonas ADP sp. A forte concentration, l’atrazine pourrait diffuser plus profondément dans les

particules d’écorce, le gradient de concentration étant plus élevé, diminuant la disponibilité de

l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence de la microflore à l’intérieur de la structure

même des particules d’écorce pourrait justifier du fort taux de minéralisation observé dans ces

conditions.

En présence de la flore indigène de l’écorce de pin, les vitesses initiales de minéralisation de l’atrazine

sur les 48 premières heures, atteignent 0,218 mg.L-1.h-1 et 4,02.10-4 mg.L-1.h-1 respectivement pour

des concentrations initiales en atrazine de 20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1. Les résultats sont résumés dans le

Tableau 15. Ces données suggèrent une cinétique initiale d’ordre 1 par rapport à l’atrazine avec une

constante de vitesse k de l’ordre de 1.10-2 h-1.

Tableau 15 : Vitesse initiale de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. calculée sur les 48 premières heures, en présence d’écorce de pin stérile ou non (en mg.L-1.h-1)

[Atrazine]i Pseudo. + écorce stérile Pseudo. + écorce non stérile

20 mg.L-1 0,133 0,218

44,2 µg.L-1 4,54. 10-4 4,02.10-4

IV.3 Conclusion

• Quatre isolats appartenant à la flore indigène de l’écorce de pin ont été obtenus. Ces isolats

représentent les micro-organismes probablement majoritaires de l’écorce de pin et cultivables

dans les conditions utilisées mais ne sont pas pour autant les seuls micro-organismes

constituants cette microflore de l’écorce. Les essais réalisés ont montré une certaine capacité

de la flore indigène de l’écorce à dégrader l’atrazine en consortium. Les isolats CP2 et dans

une moindre mesure CP1 semblent être responsables de cette activité de dégradation de

l’atrazine.

D’autre part, la flore indigène de l’écorce de pin a été caractérisée comme ayant une activité

non négligeable de minéralisation de l’atrazine (entre 9% et 16% de minéralisation) présente

dans le milieu à forte (20 mg.L-1) ou faible (44,2 µg.L-1) concentration initiale.

• La présence de la microflore de l’écorce aurait un effet légèrement inhibiteur sur la croissance

de Pseudomonas ADP sp. Cependant les essais de biodégradation montrent qu’en présence



159

de cette microflore, le taux de minéralisation de l’atrazine (essais inoculés avec Pseudomonas

ADP sp.) est augmenté par rapport au taux de minéralisation observé en milieu contenant des

particules d’écorce stériles lorsque l’atrazine était présente initialement dans le milieu à une

forte concentration ([atrazine]i= 20 mg.L-1).

A faible concentration ([atrazine]i= 44,2 µg.L-1), la présence de la microflore de l’écorce n’a

qu’un effet très limité sur la minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. Le taux de

minéralisation est très légèrement réduit par la présence de la microflore de l’écorce

suggérant que les micro-organismes présents dans le milieu (Pseudomonas ADP sp. et la

microflore de l’écorce) sont en compétition pour les nutriments et/ou source de carbone du

milieu. Cette compétition induirait un très léger effet négatif sur l’efficacité de l’élimination de


MATERIEL ET METHODES Etude du traitement combiné


160

V. Etude du traitement combiné

L’étude de faisabilité du traitement combiné (adsorption/biodégradation) a été abordée sous deux

angles différents :

- Des essais en batch ont permis un suivi précis du devenir de l’atrazine au cours du

traitement grâce à l’utilisation d’atrazine radioactive.

- Des essais en colonne ont permis de comparer l’intérêt d’utiliser Pseudomonas ADP

sp. par rapport à un traitement physique simple d’adsorption.

En accord avec les résultats obtenus aussi bien dans les études d’adsorption que lors de l’approche

biologique, des choix ont été faits quant à l’orientation du traitement et la nécessité d’apporter ou non

certains éléments pouvant améliorer l’efficacité du traitement.

V.1 Matériel et méthodes

V.1.1 Essais en batch

Dans les essais en milieu dispersé, dits « Essais en Batch », le devenir de l’atrazine a pu être suivi

grâce à l’utilisation de [U-ring-14C]-atrazine.

Ces expériences ont été menées à l’Unité de Microbiologie et de Génétique de l’INSA de Lyon (UMR

5122 CNRS) et à l’Unité Environnement et Grandes Cultures de l’INRA de Versailles-Grignon.

V.1.1.1 Protocole expérimental

Les essais ont été réalisés dans des biomètres (voir schéma Figure 28 p.127) contenant 50 mL de

milieu minéral liquide (MM) et 2,5 g d’écorce de pin stérile ou non stérile (ratio L/S=20 mg.g-1), incubés

à 20 ± 2°C sous agitation lente à l’aide d’un barreau magnétique, pendant environ 350 heures (15

jours).

Des essais sans écorce, réalisés en parallèle en extrait aqueux d’écorce de pin et en milieu minéral

glucosé (MM + glucose 1,25 g.L-1, 50 ml), ont permis de mettre en évidence l’influence de la présence

de l’écorce de pin dans le milieu, sur la capacité de Pseudomonas ADP sp. à minéraliser l’atrazine.

La [U-ring-14C]-atrazine commercialisée par Sigma, d’activité spécifique de 24,6 mCi.mmol- 1 a été

utilisée pour réaliser plusieurs séries d’expériences à des concentrations initiales de 20 mg.L-1 et

44,2 µg.L-1. La préparation des solutions mères d’atrazine est détaillée au § III.1.4.2.1 (p.126).



161

Pseudomonas ADP sp. a été inoculé a partir de cellules provenant de précultures et réalisées selon le

protocole décrit au § III.1.2.2 (p.118) ; la DO initiale dans chaque biomètre atteignant une valeur

d’environ 0,05.


La minéralisation a été suivie par comptage de la radioactivité dans les pièges à soude selon la

méthode décrite en III.1.4.2.2.

Les essais ont été réalisés en 2 phases :

- Dans un premier temps, la minéralisation de l’atrazine a été suivie sur 15 jours (1ère

Phase) par dosage du 14CO2 .

- Dans une deuxième phase, des extractions et combustions ont permis d’établir un

bilan carbone. Puis, l’évolution à long terme de l’atrazine résiduelle a été suivie sur

7 mois dans 2 conditions différentes : 1) en milieu dispersé et 2) en microcosmes.

Lors de cette deuxième phase, les 3 replicats ont été utilisés à des fins différentes :

o Les réplicats A ont subi extractions et combustions pour établir un bilan

carbone en quantifiant la radioactivité résiduelle dans chacun des

compartiments au terme des 15 premiers jours.

o Les réplicats B sont restés incubés en milieu dispersé (L/S=20 mg.L-1)

pendant 7 mois. Le devenir à long terme de l’atrazine résiduelle a pu être

suivi par dosage régulier du 14CO2. Au terme des 7 mois un bilan carbone a

été établi grace à des extractions et combustions permettant de quantifier la

radioactivité dans les différents compartiments.

o Les réplicats C ont subi le même sort que les réplicats B pendant 7 mois ,

mais cette fois en microcosmes.

La Figure 45 résume l’utilisation des différents réplicats lors de l’étude en batch du traitement

combiné.



162

Figure 45 : Utilisation des différents réplicats pour l’étude en batch du traitement combiné

V.1.1.2 Distribution de la radioactivité dans les essais en batch

Un bilan complet de la distribution de la radioactivité été réalisé par mesure de celle-ci en fin

d’expérimentation dans les différents compartiments du biomètre :

- Atrazine ou métabolites en solution aqueuse (Phase liquide)

- 14CO2 piégé dans la soude, issu de la minéralisation de l’atrazine (Phase gazeuse)

- Atrazine ou résidus adsorbés sur l’écorce de pin ou les cellules (extractibles et non

extractibles) (Phase solide).

Poursuite de l’incubation et collecte de l’écorce à 7 mois

Essais en triplicat

- Suivi de la minéralisation sur 15 jours (14CO2) - Radioactivité en solution au bout de 15 jours

Si essais reproductibles

A CB

A B C

Extractions et

Combustion

Suivi minéralisation sur 7 mois en

Milieu dispersé L/S=20

Extraction à 7 mois

Combustions à 7

mois

Suivi minéralisation sur 7 mois en Microcosmes

Extraction à 7 mois

Combustions à 7 mois

Suivi du devenir à long terme de l’écorce de pin issue du traitement

Collecte de l’écorce

1ère Phase

2ème Phase



163

La Figure 46 représente la distribution possible de la radioactivité dans les différents compartiments

du milieu lors des essais en batch, ainsi que les méthodes de suivi de celle-ci pour chacun des

compartiments.

Figure 46 : Distribution de la radioactivité dans les essais batch – Méthodes de suivi de la radioactivité dans les différents compartiments

V.1.1.2.1 Radioactivité en solution

Au bout de 350 heures d’incubation des biomètres, 1 mL de solution est prélevé, centrifugé

(7000 rpm, 20 min) pour éliminer les cellules ou débris cellulaires ainsi que les particules d’écorce en

poudre, puis analysé au compteur à scintillation (ajout de 7 mL de liquide à scintillation) afin de

quantifier la radioactivité résiduelle en solution.

D’autres échantillons (1 ml) ont été prélevés et analysés à l’aide d’une HPLC (Waters 600 E) équipée

d’un module Waters 996 à photodiode et d’un auto-injecteur 717 Plus Autosampler. La colonne

utilisée était une Cartridge Nova Pack 60A C18 (dimension 4 µm, 4.6 x 20). La radioactivité est

détectée à l’aide d’un détecteur Radiomatic Flo-one Packard. Ces analyses ont permis d’étudier la

répartition de la radioactivité des composés en solution (atrazine ou métabolites intermédiaires).

Devenir de l'atrazine*

En phase gazeuse CO2

En solutionAtrazine

Métabolites de dégradation

Résidus extractibles Résidus liés

En phase solide Atrazine ou métabolites adsorbés

Autres résidus et cellule

Analyse du 14CO2 dissous dans

NaOH

Compteur à scintillation

Prélèvement de 1 ml de solution

ExtractionsCaCl2 MeOH

Combustion de

l’écorce

A*

Loc

alis

atio

n M

étho

de

Mat

érie

l

Oxidizer



164

L’analyse HPLC a permis de détecter les métabolites suivants :

- OHA : 2-hydroxy-atrazine

- OHDEA : Deséthyl-2-hydroxy-atrazine

- OHDIA : Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine

- DEA : Deséthyl-atrazine

- DIA : Desisopropyl-atrazine

- DEDIA : deséthyl-desisopropyl-atrazine

- A : atrazine

Les éluants utilisés étaient:

- A : Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 95/5 avec Dodécylsulfate de sodium (SDS) 1,44g.L-1 - B : Méthanol pour analyse /Eau Ultra Pure / HCl 0,5 M, 90/5/5 avec SDS 1,44g.L-1

La durée d’une analyse était de 45 min réalisée selon la table d’élution suivante (Tableau 16), avec un

rinçage de 15 minutes (éluant A) entre deux injections.

Tableau 16 : Table d’élution pour analyse HPLC de l’atrazine et des métabolites de dégradation

Temps (min) Débit (ml.min-1) %A %B

0 1 100 0

1 1 62 38

8 1 60 40

10 1 40 60

30 1 0 100

35 1 100 0

L’identification de l’atrazine et de ses métabolites a été plutôt qualitative que quantitative du fait des

concentrations très faibles de chacun des composés en solution en fin d’incubation.

V.1.1.2.2 Radioactivité associée à l’écorce

A la fin de la première phase de l’étude (350 h, voir Figure 45), l’écorce de pin de l’un des triplicats (A)

est récupérée par centrifugation de l’ensemble de la suspension (10000 rpm, 20 min), puis deux

extractions successives sont effectuées avec 10 mL d’une solution de CaCl2 (0,1 M) puis 10 mL de

méthanol pur sur la totalité de l’écorce (2,5 g). Les solutions sont analysées au compteur à scintillation

afin d’évaluer le pourcentage de résidus extractibles.



165

Après ces extractions, les résidus liés non extractibles ont été quantifiés après séchage de l’écorce de

pin de chacun des biomètres (80°C pendant 12h), par combustion d’une aliquote représentative

d’environ 150 mg d’écorce dans un Oxidizer Packard modèle A307.

Les échantillons d’écorce sont placés dans un cône en papier avec une pointe de cellulose en poudre

pour faciliter la combustion ; le tout est recouvert d’un second cône en papier et placé sur une

résistance chauffante dans l’Oxidizer.

La combustion est effectuée durant 2 minutes sous courant d’oxygène dans un four à 800°C. Les

combustions ont été réalisées en triplicats.

Le 14CO2 libéré par la combustion de l’écorce contenant les résidus liés radioactifs est retenu dans

une colonne contenant un adsorbant chimique (Carbosorb) puis élué au liquide à scintillation dans

une fiole à scintillation. La radioactivité est directement quantifiée au compteur à scintillation.

L’étalonnage de l’appareil est réalisé à l’aide d’une solution radioactive d’atrazine de concentration

connue. Un volume précis (10µL) de solution est déposé sur la poudre de cellulose dans un cône en

papier, puis brûlé dans l’Oxidizer pendant 2 minutes. L’étalonnage est réalisé en triplicats.

V.1.1.3 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement combiné

Le devenir de l’écorce issue de la première phase des essais en batch (contenant des traces

d’atrazine résiduelle et/ou de métabolites, ainsi que divers résidus et des micro-organismes) a été

suivi sur 7 mois. En effet, l’écorce après traitement devient un sous produit du traitement et il convient

de caractériser son évolution en vu d’une valorisation éventuelle.

L’évolution du « déchet-écorce » a été étudiée sur l’écorce débarrassée ou non de la plupart du milieu

liquide dans lequel elle se trouvait (essais en microcosme et essais en milieu liquide, ratio

L/S=20 mL.g-1). Pour cela, les réplicats B et C ont été utilisés (voir Figure 45).

La minéralisation de l’atrazine ou de ses résidus a été suivie par capture du CO2 dans les pièges à

soude. Après 7 mois d’incubation à température ambiante, des extractions et combustions selon les

protocoles décrits ci-dessus ont permis de quantifier respectivement les résidus d’atrazine non liés et

les résidus liés. L’analyse des solutions dans le cas des essais en milieu liquide (L/S 20 mL.g-1) a

permis d’établir un bilan de la radioactivité et d’étudier l’évolution du « Déchet-Ecorce ».



166

V.1.2 Essais en colonnes

Les essais en colonnes représentent la mise en œuvre du traitement combiné sous forme d’une

« Biofiltration ».

La biofiltration est réalisée par circulation de la solution polluée en atrazine à travers le filtre d’écorce

de pin en poudre dans lequel Pseudomonas ADP sp. a été inoculée et s’est développée sous forme

d’un biofilm.

Dans un premier temps, la capacité de Pseudomonas ADP sp. à former un biofilm à la surface de

l’écorce de pin a été étudiée.

Dans un deuxième temps, la circulation d’une solution polluée en atrazine dans différentes conditions

(flux, différents âges de biofilm, conditions biotiques ou abiotiques, concentrations initiales en atrazine

différentes) a été mise en œuvre.

V.1.2.1 Choix des paramètres

Les colonnes ont été préparées comme présenté au § II.1.2.3.1 avec 10 g d’écorce de pin (particules

d<200 µm) préalablement stérilisée ou non (hauteur du lit environ 7 cm ; diamètre de colonne 2,5 cm)

et ont subi les prétraitements décrits au § II.1.2.2 II.1.2.2.2 (saturation en eau, vérification de

l’homogénéité de la colonne par injection de KCl), avant inoculation de Pseudomonas ADP sp. et

circulation en circuit ouvert (pas de recirculation) de la solution polluée en atrazine (voir procédé ci-

après).

Différents paramètres ont été testés lors des essais de biofiltration :

- Si l’on se réfère à l’étude bibliographique (II.6.3.4) on peut noter qu’à priori, plus la

vitesse de circulation du fluide à travers le support d’adsorption sera faible (dans

une certaine limite permettant d’assurer une oxygénation correcte), meilleur sera le

développement du biofilm. En revanche, les faibles vitesses vont favoriser la

formation d’un biofilm fermé donc peu accessible aux nutriments et à l’oxygène

nécessaire pour la survie des bactéries en question.

Le temps de séjour de l’atrazine dans la colonne doit également être suffisamment

long pour pouvoir permettre la biodégradation. Un compromis doit donc être trouvé et

pour cette raison, deux vitesses de circulation de la solution à traiter à travers les

colonnes ont été testées : 1 mL.min-1 et 0,3 mL-1, correspondant à des temps de

séjour d’environ 20 et 67 minutes respectivement dans la colonne utilisée en circuit

ouvert.

D’autre part, toujours en référence à l’étude bibliographique, l’écorce de pin en

poudre, avec un masse volumique de 450 kg.m3 environ (équivalent à un compost)

constitue un bon support de biofiltration. Un indice de vide (ε) compris entre 0,6 et 0,7



167

est conseillé pour les biofiltre (Martin et al., 1993). De plus, une capacité en eau

comprise entre 40 et 80% (massique) est convenable quand le support est saturé

(Ottengraf 1986 ; Devinny 1999) ; c’est le cas pour l’écorce de pin en poudre.

- Différentes concentrations initiales en atrazine de la solution à traiter ont été

testées. Des essais à 0,2 mg.L-1 ont été suivis par analyse HPLC (au dessus de la

limite de détection de 0,03 mg.L-1). Cette concentration correspond bien sûr à une

pollution massive, et nous a permis de tester l’efficacité de la biofiltration dans des

conditions extrêmes. D’autres essais ont été réalisés à une concentration initiale de

2,34 µg.L-1, correspondant à une pollution courante d’eaux naturelles, et suivis par

dosages immuno-essai (II.1.1.1.2(b)) couvrant une gamme de concentrations de 0,1 à

3 µg.L-1. Ces essais ont été en nombre limités à cause du coût de ces analyses.

- Les essais en colonnes ont été effectués à une température de 20 ± 2°C,

correspondant à une température ambiante moyenne ; les essais de biodégradation

de l’atrazine en milieu liquide ayant prouvé que Pseudomonas ADP sp. était capable

de minéraliser l’atrazine jusqu’à 12°C.

- Afin de se rapprocher de conditions réelles de traitement d’eaux naturelles polluées,

la solution d’atrazine à traiter à été préparée dans l’eau du robinet, qui apporte aux

micro-organismes des nutriments divers.

- Les essais ont été réalisés avec de l’écorce de pin préalablement stérilisée ou non

afin d’évaluer l’influence de l’activité de la flore indigène de l’écorce de pin sur

l’efficacité du procédé de biofiltration.

V.1.2.2 Inoculation et caractérisation du biofilm et de l’hydrodynamique des colonnes

V.1.2.2.1 Observation au MEB des micro-organismes sur l’écorce de pin

L’étude du développement d’un biofilm sur les particules d’écorce dans les colonnes a été réalisée de

façon qualitative, par observation au Microscope Electronique à Balayage selon les méthodes décrites

ci-dessous.

Les observations au MEB ont été réalisées au Centre Technologique des Microstructures de

l’Université Claude Bernard – Lyon 1. Ces observations ont permis de déterminer un temps idéal de

mise en contact avec les bactéries, pour l’obtention de la fixation des cellules ou la formation d’un

biofilm à sa surface. L’effet de la flore indigène de l’écorce de pin sur le développement d’un biofilm de

Pseudomonas ADP sp. a également pu être observé qualitativement par cette technique.



168

(a) Inoculation des colonnes

Une culture de Pseudomonas ADP sp. en phase exponentielle de croissance, cultivée 20h à 30°C en

milieu minéral (MM) additionné de 1g.L-1 de glucose et 1g.L-1 de sulfate d’ammonium, est injectée en

circuit fermé à travers les colonnes d’écorce stérilisées ou non, pendant 2 ou 6 jours. Des nutriments

et cellules fraîches issues de cultures quotidiennes sont additionnés tous les jours à la culture initiale.

A la fin de la circulation, les colonnes sont rincées à l’eau du robinet (stérile) avec un volume de 50Vo

(débit 1 mL.min-1).

(b) Traitement des échantillons pour observation au MEB

Les lits d’écorce de pin contenus dans les colonnes sont alors récupérés et des prélèvements de

quelques milligrammes d’écorce sont réalisés au niveau de l’entrée et du centre de la colonne (photos

Figure 47).

Figure 47 : Lits d’écorce de pin issus des colonnes après inoculation de Pseudomonas ADP sp. pendant 2 ou 6 jours ; prélèvements pour analyses au MEB

Les prélèvements d’écorce sont ensuite traités pour l’observation au MEB selon le protocole décrit ci-

dessous.

La préparation des échantillons pour l’observation de cellules à la surface d’un support demande un

travail particulier différent ce celui effectué pour l’observation de la structure du support brut. Elle se

déroule en 4 étapes principales :

• Fixation des cellules sur le support : l’échantillon solide à observer est plongé pendant

60 minutes dans une solution (50/50, V/V) glutaraldéhyde 4% / tampon (cacodylate de sodium 0,2

M, pH 7).

• Rinçage : l’échantillon est ensuite rincé dans 3 bains successifs de 10 minutes, dans une solution

de tampon de cacodylate 0,2 M.



169

• Post-fixation : le tampon de rinçage est remplacé par une solution de tétroxyde d’osmium

tamponnée (OsO4 1% final dans une solution de cacodylate de sodium 0,1 M final). La post-

fixation s’effectue pendant 30 minutes, puis l’échantillon est rincé à l’eau distillée.

• Déshydratation progressive : l’échantillon est déshydraté après fixation, dans des bains

successifs d’éthanol à 30%, 50%, 70%, 80% et 95%, de 10 minutes chacun. Puis 3 bains de

10 minutes dans l’éthanol 100% sont réalisés. La déshydratation est finalement terminée par 1

bain de 10 minutes dans un mélange éthanol 100% / HMDS (50/50 ; V/V), et 3 bains de 10

minutes dans le HMDS (hexaméthyldisilazane) pur. Le dernier bain de HMDS est évaporé sous

hôte.

L’échantillon sec est ensuite déposé sur un porte objet et métallisé à l’or-palladium à l’aide d’un

pulvérisateur cathodique Hummer II Technics.

L’observation des échantillons a ensuite été réalisée au microscope électronique à balayage S800

Hitachi, 15 kV.

V.1.2.2.2 Influence des micro-organismes sur le comportement hydrodynamique des colonnes

D’autre part, l’influence du développement bactérien dans les colonnes sur l’hydrodynamique du

système a été étudiée à l’aide du traceur KCl comme décrit au chapitre (II.1.2.2.2). Ces tests

hydrodynamiques ont été réalisés avant et après inoculation de Pseudomonas ADP sp. (2 ou 6 jours)

à travers les colonnes d’écorce de pin (préalablement stérilisée ou non).

La Figure 48 résume le protocole utilisé pour ces expériences :

1. Une injection de KCl est réalisée avant inoculation de Pseudomonas ADP sp., pour

caractériser le comportement hydrodynamique initial de chaque colonne.

2. Une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée en circuit fermée comme décrit plus haut

pendant 2 ou 6 jours.

3. Une nouvelle injection de KCl après inoculation (2 ou 6 jours) de Pseudomonas ADP sp. dans

les colonnes d’écorce de pin permet de conclure sur l’influence du biofilm sur le

comportement hydrodynamique des colonnes.



170

Figure 48 : Montage expérimental : Hydrodynamique des colonnes avant et après inoculation avec Pseudomonas ADP sp.

V.1.2.3 Protocole expérimental des essais de biofiltration

La durée de développement du biofilm a été fixée à 6 jours grâce aux expériences précédentes et

deux vitesses de circulation de la solution à travers les colonnes ont été testées : 1 mL.min-1 et

0,3 mL.min-1. Des colonnes d’écorce de pin stérilisée et non stérilisée ont été testées en parallèle afin

d’évaluer l’influence de la flore indigène sur l’efficacité du traitement.

Cellule de conductivité

Pompe peristaltique

Flux ascendant 1 ml/min

2

1-3

Pseudomonas ADP sp. Culture en MM

(1g/l sulfate d’ammonium; 1g/l glucose) Aération par

barbotage

C

Analyseur CONSORT C832

Ordinateur

Traitement des données

2

Solution KCl (1g/l)

1-3



171

Protocole expériental (voir Figure 48) :

1. Les colonnes d’écorce de pin sont saturées en eau par circulation ascendante en circuit fermé

d’eau du robinet stérile.

2. Un traçage au KCl est réalisé afin de caractériser l’écoulement des solutions à travers les

colonnes.

3. Après rinçage à l’eau du robinet stérile, une culture de Pseudomonas ADP sp. est circulée

(débit = 1 mL.min-1) pendant 6 jours avec apport régulier de nutriments et de cellules fraîches,

en circuit fermé, avec aération de la culture par barbotage. Des échantillons sont prélevés

régulièrement afin de suivre l’évolution de la teneur en carbone (analyse COT) de la culture

cellulaire (la consommation de carbone étant signe d’activité biologique).

4. Un volume de 50 volumes de pore (V0) d’eau du robinet stérile est ensuite circulée afin

d’éliminer les nutriments et notamment l’azote apporté par la culture de Pseudomonas ADP

sp.

5. La solution polluée en atrazine est injectée (flux = 1 ou 0,3 mL.min-1 environ) à travers la

colonne jusqu’à obtention d’un plateau de concentration en atrazine en sortie de colonne.

6. L’effluent est collecté en sortie de colonne par un collecteur de fractions et les fractions sont

analysées par HPLC (essais avec [atrazine]i= 200 µg.L-1) ou par test immuno-essai (essais

avec [atrazine]i= 2,34 µg.L-1).

Les expériences en colonnes sont réalisées en chambre thermostatée à 20 ± 2 °C.

Aucun réplicat n’a pu être réalisé, le nombre de colonnes disponibles étant limité à 4 et la durée des

expériences étant de 15 jours environ.

La Figure 48 représente le montage utilisé pour les essais de biofiltration en colonne.



172

Figure 49 : Montage expérimental pour les essais en colonne de traitement combiné d’une solution polluée à l’atrazine après inoculation des colonnes avec Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours.

Pompe peristaltique

Flux ascendant 1ml/min – 0,3 ml/min

3

5

Pseudomonas ADP sp. Culture en MM

Aération par barbotage

6j

3

C/Co

V/Vo

HPLC

Collecteur de fractions

Sol. Atrazine 200µg.L-1 – 2,3 µg.L-1 5

Immuno-essais

H2O 2-4

6

RESULTATS ET DISCUSSION Etude du traitement combiné


173

V.2 Résultats et discussion

V.2.1 Etude du traitement combiné en batch

Cette étude à permis d’évaluer l’efficacité du traitement combiné en essais batch par quantification de

la minéralisation de l’atrazine en biomètre en présence de Pseudomonas ADP sp. inoculé dans un

milieu contenant de l’écorce de pin en poudre, débarrassée ou non de sa microflore indigène.

D’autre part, en fin d’expérience, la répartition de la radioactivité dans les différents compartiments

(gaz, liquide, solide) a été étudiée.

Enfin, une étude à long terme sur 7 mois a permis de déterminer le comportement du « déchet-

écorce » à l’issue du traitement et notamment son évolution quant au devenir de la radioactivité

résiduelle présente dans l’écorce après traitement.

V.2.1.1 Minéralisation de l’atrazine en présence d’écorce de pin

Des essais ont été menés en parallèle, en milieu minéral MM contenant ou non de l’écorce de pin

stérile ou non stérile), afin de quantifier l’effet de la présence d’écorce de pin sur la minéralisation de

l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. à faible (44,2 µg.L-1) et à forte (20 mg.L-1) concentration initiale

en atrazine.

Les essais ont été réalisés à température ambiante (20 ± 2°C) dans des biomètres équipés d’un piège

à soude, selon le protocole présenté au § V.1.1.1.

Les Figure 50 et Figure 51 présentent les résultats de minéralisation aux deux concentrations initiales

en atrazine testées.

Ces figures reprennent quelques courbes présentées dans les paragraphes précédents ; elles sont à

nouveau présentées ici pour permettre d’établir un bilan global comparatif sur la minéralisation de


Le Tableau 17 résume les résultats de ces expériences, après incubation de Pseudomonas ADP sp.

pendant 320h dans les différents milieux étudiés.



174

Figure 50 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose 1,25 g.L-1), en présence ou non d’écorce en poudre (d<200 µm) stérile ou non stérile (ratio L/S =20) ou en

extrait aqueux stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau aimenté ; Concentration initiale en atrazine 44,2 µg.L-1. Les témoins ne reçoivent pas Pseudomonas ADP sp.

Figure 51 : Minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. en milieu minéral (MM- Glucose 1,25 g.L-1), en présence ou non d’écorce en poudre (d<200 µm) stérile ou non stérile (ratio L/S =20) ou en

extrait aqueux stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau aimenté ; Concentration initiale en atrazine 20 mg.L-1. Les témoins ne reçoivent pas Pseudomonas ADP sp.

En absence de particules solides d’écorce de pin, on constate que la minéralisation de l’atrazine

atteint environ 70% en milieu minéral ou en extrait aqueux stérile d’écorce de pin, aussi bien à forte

(20 mg.L-1) qu’à faible (44,2 µg.L-1) concentration en atrazine, avec des vitesses initiales moyennes

[Atrazine ]i=44,2 µg/L

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350Temps (h)

% A

trazi

ne m

iner

alis

ée

MM

Extrait Aqueux d'Ecorce

MM + Ecorce stérile

MM + Ecorce non stérile

Témoin st. MM + Ecorce non stérile

Témoin st. MM + Ecorce stérile

[Atrazine]i=20 mg/L

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250 300 350

Temps (h)

% A

traz

ine

min

eral

isée

Extrait Aqueux d'Ecorce

MM

MM + Ecorce non stérile

MM + Ecorce stérile

Témoin st. Ecorce non stérile

Témoin st. Ecorce stérile



175

dégradation de l’ordre de 0,54 mg.L-1.h-1 et 1,3 µg.L-1.h-1 respectivement sur les 24 premières heures

d’incubation. Il existe donc une relation proportionnelle entre concentration initiale en atrazine et

vitesse moyenne de minéralisation dans les deux milieux liquides.

La présence des composés solubles de l’écorce de pin (extrait aqueux d’écorce de pin) n’entraîne

aucun retard de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. que ce soit à faible ou à forte

concentration initiale en atrazine.

La présence de particules d’écorce de pin stérile dans le milieu réduit le taux de minéralisation

d’environ 30% et 50% (respectivement à faible et forte concentration initiale en atrazine) indiquant que

l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce la rend moins disponible pour Pseudomonas ADP sp., et que ce

phénomène a une incidence relative d’autant plus grande que la concentration initiale en atrazine est

élevée (peut être à cause de la diffusion intraparticulaire de l’atrazine).

Pour une concentration initiale en atrazine de 44,2 µg.L-1, 50,5 ± 4,0 % de l’atrazine est minéralisée en

présence d’écorce de pin stérile contre 47,1 ± 1,9 % en présence d’écorce contenant sa microflore

indigène. Cette différence n’est pas significative au regard des déviations standard sur les résultats

(Figure 51).

A forte concentration initiale, 36,5 ± 1,3 % de l’atrazine sont minéralisés en 320h en présence

d’écorce stérile contre 54 ± 0,6 % en présence d’écorce non stérile. La microflore de l’écorce

augmente donc significativement le taux de minéralisation pour de fortes concentrations en atrazine,

contrairement au phénomène observé plus haut (à faible concentration). Dans les deux cas (faible et

forte concentrations initiales en atrazine) la flore indigène de l’écorce de pin présente une activité de

minéralisation significative : 12 à 14% de l’atrazine sont minéralisés par la microflore indigène de

l’écorce seule (Ecorce non stérile + MM) non inoculée par Pseudomonas ADP sp., respectivement à

forte et à faible concentration initiale en atrazine.

On peut penser qu’à faible concentration (44,2 µg.L-1), l’atrazine est adsorbée principalement à la

surface des particules, la laissant accessible à Pseudomonas ADP sp. dont les cellules sont

essentiellement à la surface des grains d’écorce. A plus forte concentration (20 mg.L-1), l’atrazine

pourrait pénétrer plus profondément à l’intérieur des pores de l’écorce de pin par diffusion entraînant

ainsi une diminution de la disponibilité de l’atrazine vis à vis de Pseudomonas ADP sp. La présence

de la microflore indigène dans la porosité intraparticulaire pourrait alors expliquer le taux plus élevé de

minéralisation observé avec l’écorce non stérile par rapport à l’écorce stérile.



176

Tableau 17 : Taux de minéralisation d’atrazine (en %) en 320h d’incubation de Pseudomonas ADP sp. en biomètre à 20 °C avec [atrazine]i= 44,2 µg.L-1 ou 20 mg.L-1 (st.=stérile)

En conclusion, la présence de particules d’écorce dans le milieu réduit notablement le taux de

minéralisation, par effet d’adsorption de l’atrazine sur l’écorce, diminuant la disponibilité de celle-ci

pour Pseudomonas ADP sp. Cependant, à forte concentration en atrazine, la contribution de la flore

indigène, probablement rendue possible par la diffusion intraparticulaire de l’atrazine, compense en

partie la baisse du rendement de minéralisation.

V.2.1.2 Analyses des composés radioactifs en solution en cours d’incubation

La répartition de la radioactivité en solution entre les différents composés (atrazine ou métabolites de

dégradation) a été suivie en cours d’incubation dans les essais en milieu minéral et en extrait aqueux

d’écorce de pin. Le suivi dans les essais contenant l’écorce de pin a malheureusement posé des

problèmes au niveau des analyses HPLC, dus sans doute à une concentration trop élevée des

composés organiques provenant de l’écorce de pin et par conséquent rendant les résultats

inexploitables.

Témoins non inoculés : La Figure 52 montre que dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas ADP sp., seulement 80%

de la radioctivité initialement apportée au milieu sont retrouvés sous forme d’atrazine. Cette

observation indique qu’il existe des réactions ou transformations chimiques spontanées (qui ne sont

pas de la minéralisation) lorsque l’atrazine est additionnée aux milieux aqueux. A faible concentration

initiale, l’atrazine est toujours présente au bout de 312 h dans les essais en milieu minéral. Les

composés intermédiaires de dégradation DEDIA, DIA, OHDEA et OHA sont présents dans de faibles

proportions relativement constantes tout au long des expériences. Dans l’extrait aqueux d’écorce, les

témoins non inoculés contiennent également 80% d’atrazine et les autres constituants sont la DEDIA,

DEA, OHDEA et OHA.

A forte concentration (Figure 53), l’atrazine est dégradée après 192 h d’incubation traduisant une

contamination du témoin en milieu minéral (MM). Le principal métabolite retrouvé est le DIA.

Dans l’extrait, malgré les problèmes techniques survenus au cours des analyses HPLC et nous faisant

perdre les résultats pour les temps 20 et 48h, on peut noter que la radioactivité en solution est

présente sous forme d’atrazine à 80 % jusqu’à la fin de l’incubation. L’atrazine en solution se dissocie

en différents métabolites ; on retrouve ainsi les composés DEDIA, OHDIA, DIA et OHDEA.

[Atrazine]i MM Extrait Ecorce st. Ecorce non st. Tém. Ecorce st. Tém. Ecorce non st.44,2 µg.L-1 70,5 ± 9,0 65,8 ± 7,6 50,5 ± 4,2 47,1 ± 2,0 0,10 ± 0,01 14,4 ± 1,4

20 mg.L-1 72,1 ± 1,3 71,7 ± 0,7 36,5 ± 1,3 54 ± 0,6 0,10 ± 0,01 11,7 ± 3,5



177

Essais inoculés : Dans les essais inoculés (MM et extrait), l’atrazine est totalement dégradée après 48 h d’incubation

quelque soit la concentration initiale d’atrazine testée (Figure 52 et Figure 53). Les métabolites de

dégradation sont principalement présents sous forme de DEDIA et OHA (premiers métabolites de

dégradation de l’atrazine), puis, après 300 h d’incubation l’OHA devient majoritaire dans le milieu MM.

On remarque que certains composés intermédiaires comme la DEDIA sont présents de façon

représentative en solution ; pourtant celui-ci ne figure pas comme métabolite intermédiaire du

mécanisme de minéralisation décrit pas Martinez et al. (2001) (voir Figure 13 du chapitre Etude

Bibliographique). Il en est de même pour les composés tels que l’OHDIA ou la OHDEA. En fait, les

analyses montrent que l’aire des pics correspondants à ces composés reste globalement équivalente

au cours du temps. La distribution augmente donc puisqu’il y a minéralisation de l’atrazine mais les

composés initialement présents dans le milieu comme la DEDIA prennent une proportion en

conséquence plus importante puisqu’ils ne sont pas dégradés. On notera à ce propos qu’aucune

enzyme chez Pseudomonas ADP sp. n’a été décrite comme étant capable de dégrader ces

métabolites.

Figure 52 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=44,2µg.L-1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation

lente au barreau aimenté ; incubation 15 jours

MM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 144 216 312Temps (h)

Autres% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIAND% DEDIA% A

Témoin MM

0%20%40%60%80%

100%

0 20 48 144 216 312Temps (h)

Autres% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIA% DEDIA% A

Témoin Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 20 48 216 312Temps (h)


Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 144 216 312Temps (h)

Autres% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIAND% DEDIA% A



178

Figure 53 : Distribution de la radioactivité en solution dans les essais de minéralisation ([atrazine]i=20 mg.L-1 ) en milieu minéral (MM) et en extrait stérile d’écorce de pin ; 20 ± 2°C ; Agitation lente au barreau

aimenté ; incubation 15 jours

Avec,

- OHA : 2-hydroxy-atrazine

- OHDEA: Deséthyl-2-hydroxy-atrazine

- OHDIA: Desisopropyl-2-hydroxy-atrazine

- DEA: Deséthyl-atrazine

- DIA: Desisopropyl-atrazine

- DEDIA: deséthyl-desisopropyl-atrazine

En conclusion, on note que l’atrazine est transformée même lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas

inoculée et que l’atrazine se trouve en milieu stérile ; l’atrazine dans les témoins stériles ne représente

que 80% de la radioactivité totale.

D’autre part, on retrouve beaucoup plus de métabolites intermédiaires de dégradation à faible

concentration qu’à forte concentration initiale en atrazine.

De plus, la différence principale observée entre la dégradation de l’atrazine en milieu minéral et en

extrait aqueux d’écorce de pin est la présence d’OHDEA comme métabolite de dégradation en milieu

MM, absent dans les essais en extrait d’écorce de pin.

Beaucoup d’intermédiaires de dégradation de l’atrazine sont présents, qui ne figurent pas dans le

schéma de minéralisation de l’atrazine par Pseudomonas ADP sp. décrit par Martinez et al. (2001).

Témoin MM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 192 432Temps (h)

% OHA% OHDEA% DEA% DIA% DEDIA% A

Témoin Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 48 144 432Temps (h)

% OHA% OHDEA% OHDIA% DEA% DIA% DEDIA% A

MM

0%

20%

40%

60%

80%

100%

48 144 192 432Temps (h)


Extrait

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 144 192 432Temps (h)




179

Une étude quantitative serait donc nécessaire pour décrire en détail le mécanisme de dégradation

dans les conditions de notre étude (Milieu minéral ou extrait aqueux d’écorce de pin).

V.2.1.3 Répartition de la radioactivité résiduelle en fin de traitement

Au bout de 15 jours de traitement en biomètre et de suivi de la minéralisation, des extractions au

CaCl2 (0,1 M) et au méthanol ont été réalisées sur les essais contenant l’écorce stérile ou non stérile

afin de quantifier la radioactivité résiduelle (protocole § V.1.1.2). Les résidus radioactifs non

extractibles ont été quantifiés après extraction par combustion de l’écorce et les résidus en solution

ont été analysés par HPLC.

Pour les deux concentrations en atrazine étudiées (44,2 µg.L-1 et 20 mg.L-1) la répartition de la

radioactivité dans les différents compartiments du biomètre (phase gazeuse, phase liquide et phase

solide) est présentée sur les Figure 54 et Figure 55.

Dans les essais « liquides », en milieu minéral (MM) et extrait aqueux d’écorce de pin, la part de

résidus non extractibles représente la radioactivité retrouvée après filtration des solutions et

combustion des filtres supportant les cellules présentes dans les milieux à la fin des expériences

(t = 350 h ou 15 jours).

Les résultats montrent que le bilan de radioactivité totale se clôture à plus de 80% ce qui est un bon

résultat de restitution.

Figure 54 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile (E st.) ou non stérile (E non st.) après

350 h d’incubation à 20 ± 2 °C ; concentration initiale en atrazine = 44,2 µg.L-1 ; agitation lente

[Atrazine]i= 44,2 µg.L-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

MM ExtraitE

E st. E nonst.

Tém. Est.

Tém. Enon st.

Bila

n m

atiè

re AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMinéralisation



180

Figure 55 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu minéral (MM-Glucose), extrait aqueux d’écorce de pin, en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile (E st.) ou non stérile (E non st.) après

350 h d’incubation à 20 ± 2 °C ; concentration initiale en atrazine = 20 mg.L-1 ; agitation lente

Dans les deux séries d’essais (atrazine = 44,2 µg.L-1 ou 20 mg.L-1), la radioactivité résiduelle en

solution représente entre 8 et 11% de la radioactivité totale lorsque l’écorce n’est pas présente dans le

milieu. En présence de particules d’écorce de pin, environ 1% seulement de la radioactivité est

retrouvée en solution après 350 h d’incubation. Lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas inoculé au

milieu contenant l’écorce de pin (« Témoins »), la radioactivité en solution est supérieure à celle

observée en présence de Pseudomonas ADP sp. soulignant son rôle prépondérant dans la

minéralisation. Environ 2% de la radioactivité est retrouvée en solution dans les témoins « Ecorce non

stérile » et environ 6 à 8% dans les témoins non inoculés « Ecorce stérile », indiquant que la

microflore indigène de l’écorce participe également à la minéralisation de l’atrazine en solution.

C’est résultats concordent avec les isothermes d’adsorption en batch ; dans les témoins stériles

(20 mg.L-1), 8% de l’atrazine initialement présente est retrouvée en solution après 350 h d’incubation,

soit une concentration à l’équilibre de Ce = 1,6 mg.L-1. Si l’on se réfère aux isothermes d’adsorption

obtenues par exemple Figure 15, pour le ratio L/S=20 mg.g-1, la quantité d’atrazine adsorbée q pour

cette concentration à l’équilibre est environ 0,3 mg.g-1. Pour une quantité de 2,5g d’écorce dans 50 ml

de milieu liquide cette quantité d’atrazine adsorbée (0,3 mg.g-1) représente 75 % de l’atrazine

initialement additionnée au milieu MM. Dans nos essais on retrouve 80% de résidus liés à l’écorce de

pin.

A faible concentration en atrazine, dans les essais « E st. » et « E non st. » inoculés avec

Pseudomonas ADP sp., 26% à 38% de la radioactivité est retrouvée sur l’écorce de pin (stérile et non

stérile respectivement) dont seulement 1% représente la fraction extractible. Même bilan à forte

concentration en atrazine, où la fraction extractible représente environ 1,5% de la radioactivité totale

[Atrazine]i= 20g.mL-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

MM Extrait E st. E non st. Tém st. Tém nonst.

Bila

n m

atiè

re

AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMinéralisation



181

sur les 22 à 38% de radioactivité résiduelle retrouvée dans l’écorce dans les essais inoculés avec

Pseudomonas ADP sp.

Dans les essais non inoculés (« Témoin Ecorce non stérile » et « Témoin écorce stérile »), la

radioactivité non extractible retrouvée dans l’écorce représente respectivement entre 74 et 92% de la

radioactivité totale en fin d’expérience à faible concentration et entre 63 et 81% pour les essais à forte

concentration. On note ainsi, qu’en présence de la microflore de l’écorce de pin, le taux d’atrazine (ou

autres résidus radioactifs) retenue sur l’écorce est moindre par rapport au taux observé en absence

de cette microflore. D’autre part, la présence de Pseudomonas ADP sp. dans le milieu réduit de plus

de la moitié le pourcentage de radioactivité résiduelle retrouvée sur l’écorce de pin.

Ces résultats montrent que l’atrazine (ou ses métabolites de dégradation) est globalement très

difficilement extractible, rendant difficile sa disponibilité et donc sa consommation par les micro-

organismes. Après 15 jours d’incubation, une fraction importante est fortement liée à l’écorce (Figure

54 et Figure 55) et le taux de minéralisation n’évolue plus.

V.2.1.4 Devenir à long terme de l’écorce à l’issue du traitement

Le devenir de l’écorce en tant que déchet à l’issue du traitement combiné réalisé plus haut à été

étudié sur une durée de 7 mois par suivi de la minéralisation (dégagement de 14CO2) puis combustion

des écorces en fin d’expérience. Les essais ont été réalisés dans des biomètres, tels qu’utilisés ci-

dessus, en présence de milieu liquide (MM, ratio L/S=20 mL.g-1) et sur l’écorce humide issue des

essais précédents. Le protocole de ces essais est détaillé au § V.1.1.3.

Les Figure 57 et Figure 58 présentent les résultats obtenus en milieu liquide et en microcosme,

respectivement, pour une concentration initiale en atrazine de 20 mg.L-1 et 44,2 µg.L-1. Il s’agit de

résultats cumulés avec ceux obtenus à t=350 h. Ces résultats sont également présentés sous fome de

tableau récapitulatif (Tableau 18).

Globalement, on remarque que l’évolution de la radioactivité dans les biomètres, que ce soit en

microcosme ou en milieu liquide, est similaire au bilan établi après 350 h d’incubation (Figure 56) ; la

Figure est de nouveau présentée ici pour faciliter la comparaison entre le bilan à 15 jours et le bilan à

7 mois. Le processus d’évolution est donc très lent dans les conditions expérimentales traduisant une

bonne stabilité du matériau.



182

Figure 56 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., après 15 jours d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L-1

(Figure de Gauche) et [atrazine]i = 20 mg.L-1 (Figure de Droite)

A forte concentration initiale en atrazine (20 mg.L-1) on observe que 2 à 3% supplémentaires

d’atrazine (par rapport au bilan établi après 350 h) sont minéralisés dans les témoins non inoculés

avec Pseudomonas ADP sp. contenant l’écorce stérile, traduisant sans doute une contamination du

milieu par des micro-organismes extérieurs.

Figure 57 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile

(Ec st.) ou non stérile (Ec non st.) 7 mois d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 20 mg.L-1

A faible concentration en atrazine (44,2 µg.L-1), la Figure 58 montre également que la minéralisation

n’a pas évolué pendant les 7 mois d’incubation supplémentaires (par rapport à la Figure 56) dans les

biomètres inoculés avec Pseudomonas ADP sp. que ce soit en milieu liquide ou en microcosme. En

Evolution en milieu liquide L/S=20à 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec nonst.

Tém. Ecst.

Tém. Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMineralisation

Evolution en microcosmeà 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec non st. Tém. Ecst.

Tém. Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re

Après 7 mois supplémentaires en

milieu liquide L/S=20


microcosme

[Atrazine]i= 20g.mL-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec non st. Tém st. Tém non st.

Bila

n m

atiè

re

Autres

Résidus liésRésidus extractibles

En solution

Minéralisation

[Atrazine]i= 44,2 µg.L-1

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec non st. Tém. E st. Tém. E non st.

Bila

n m

atiè

re

Après 15 jours en milieu liquide L/S=20



183

revanche, les Témoins non inoculés contenant initialement l’écorce stérile ou l’écorce non stérile

continuent d’évoluer et des valeurs de minéralisation de 2 à 7% (Ecorce stérile) et 14 à 18% (Ecorce

non stérile) sont observés au bout de 7 mois d’incubation, avec une minéralisation un peu plus

importante en microcosme. La minéralisation observée dans les témoins d’écorce stérile non inoculés

est attribuée à une contamination microbienne survenue en cours d’incubation après les 15 premiers

jours d’incubation.

Figure 58 : Répartition de la radioactivité originaire de l’atrazine marquée dans les essais de minéralisation par Pseudomonas ADP sp., en milieu MM contenant de l’écorce de pin (d<200 µm) stérile

(Ec st.) ou non stérile (Ec non st.) 7 mois d’incubation à 20 ± 2 °C ; [atrazine]i = 44,2 µg.L-1

Dans les essais en milieu liquide (L/S = 20), on ne retrouve plus que de très légères traces de

radioactivité en solution. Pour les essais en microcosmes, la part de radioactivité en solution

correspond à la radioactivité présente à 350h, avant élimination de cette fraction liquide.

Tableau 18 : % de résidus liés à l’écorce de pin après 15 jours ou 7 mois d’incubation par rapport à la radioactivité retrouvée dans l’écorce

D’une manière générale, l’évolution de la radioactivité dans les microcosmes et en milieu liquide

(L/S = 20 mg.L-1) est similaire. Le matériau est donc stable dans les deux conditions testées. Par

Evolution en milieu liquide L/S=20à 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec nonst.

Tém Ecst.

Tém Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re

AutresRésidus liésRésidus extractiblesEn solutionMineralisation

Evolution en microcosmeà 7 mois

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Ec st. Ec nonst.

Tém Ecst.

Tém Ecnon st.

Bila

n m

atiè

re


milieu liquide L/S=20


microcosme

Après 15 jours d'incubation Après 7 mois d'inubation [atrazine]i=44,2µg/L [atrazine]i=20mg/L [atrazine]i=44,2µg/L [atrazine]i=20µg/L

Ec st. 95,7 96,9 95,2 92,4 Ec non st. 97,0 92,9 91,4 79,2 Tém Ec st. 96,1 94,1 98,3 95,2

% Résidus liés restant sur l'écorce

Tém Ec non st. 96,6 95,5 93,5 92,6 Ec st. 24,5 37,0 26,2 22,2 Ec non st. 37,5 20,1 42,2 17,0 Tém Ec st. 92,2 81,0 90,9 74,8

% Résidus liés par rapport à la radioactivité initiale

Tém Ec non st. 73,9 63,5 91,8 65,3



184

rapport au bilan établi à 350h d’incubation (Tableau 18), on note un taux de résidus liés légèrement

supérieur dans les essais à faible concentration initiale en atrazine. Dans les essais contenant

l’écorce non stérile, on retrouve 37,5% de résidus liés après 15 jours d’incubation contre 42,2% de

l’atrazine initialement apportée après 7 mois d’incubation (même observations pour les essais avec

l’écorce stérile ou les Témoins avec écorce non stérile). Le vieillissement du déchet, que ce soit en

milieu liquide ou en microcosme permet aux résidus de se lier plus fortement et irréversiblement au

support, en pénétrant plus profondément dans la structure de l’écorce ou en établissant des liaisons

chimiques plus fortes.

Si l’on compare les essais à forte et à faibles concentrations (Tableau 18), la principale différence

porte sur le pourcentage de résidus liés : pour les essais en milieu liquide en présence d’écorce non

stérile, les résidus non extractibles (ou résidus liés) représentent 17% de la radioactivité totale à forte

concentration initiale en atrazine, contre 42% dans les essais à faible concentration en atrazine. On

remarque le même phénomène dans les Témoins « Ecorce stérile » et « Ecorce non stérile ». Cette

observation est logique puisque plus la concentration à l’équilibre Ce sera petite, plus la proportion de

substrat adsorbée (qe/Ce) sera grande ; a forte concentration, les sites d’adsorption sont rapidement

saturés et la proportion de substrat adsorbée est donc moins grande. De plus, on peut imaginer que la

flore indigène de l’écorce consomme plus facilement l’atrazine lorsque celle-ci est présente à forte

concentration ; ainsi, on retrouverait moins (en proportion) de résidus liés à l’écorce à forte

concentration qu’à faible concentration.

D’autre part, le Tableau 18 montre que le pourcentage de résidus non extractibles dans l’écorce par

rapport à la radioactivité totale retrouvée dans celle-ci est dans tous les cas compris entre 90 et 98%.

Ces résultats montrent que l’atrazine au contact de l’écorce est principalement adsorbée

irréversiblement, que ce soit après 15 jours d’incubation ou après 7 mois. Si l’on se réfère aux

cinétiques d’adsorption établies en batch (Figure 11, p.102), on voit que ce phénomème est quasi

instantané et que l’atrazine est majoritairement adsorbée lors de la première heure avec contact

l’écorce. Ceci explique, entre autre, que la distribution de l’atrazine (de la radioactivité plus

exactement) évolue peu, entre les différents compartiments, entre 15 jours et 7 mois d’incubation.

V.2.1.5 Conclusions

Concernant le suivi de minéralisation de l’atrazine en milieu dispersé, les résultats obtenus

permettent de conclure qu’il existe une relation de proportionnalité entre la concentration initiale en

atrazine et la vitesse initiale moyenne de minéralisation, suggérant une cinétique initiale de 1er ordre

dans le domaine de concentration étudié, avec une constante cinétique de l’ordre de 0,0022 h-1.

La présence d’écorce de pin dans le milieu diminue de 25 à 30% le taux de minéralisation par rapport

aux taux observés en milieu liquide sans écorce (MM ou extrait aqueux d’écorce de pin).



185

Les essais confirment une faible activité minéralisatrice de la microflore indigène de l’écorce de pin :

entre 12 et 14 % de l’atrazine sont minéralisés dans les témoins non inoculés avec Pseudomonas

ADP sp.

A forte concentration initiale en atrazine, dans les essais inoculés avec Pseudomonas ADP sp., cette

microflore augmente significativement le taux global de minéralisation, alors qu’à faible concentration

on n’observe pas d’effet significatif.

Le bilan matière réalisé après 15 jours d’incubation des biomètres à température ambiante montre

que le taux de radioactivité retrouvé en solution est moins élevé dans les témoins « Ecorce stérile »

que dans les témoins « Ecorce non stérile », traduisant à nouveau le rôle de la microflore dans la

biodégradation de l’atrazine (confirmé par le suivi du 14CO2).

Au bout de 15 jours, une grande proportion d’atrazine est liée à l’écorce de pin (22 à 38%) diminuant

la biodisponibilité de celle-ci vis à vis des micro-organismes impliqués dans la biodégradation. Parmi

cette proportion d’atrazine liée, environ 1 à 2 % seulement sont extractibles (CaCl2 et MeOH).

L’atrazine est ainsi fortement liée à l’écorce de pin après 15 jours de mise en contact, et la

minéralisation n’évolue quasiment plus.

Concernant le devenir à long terme de l’écorce de pin issue du traitement combiné en batch, on

note peu d’évolution entre 15 jours et 7 mois, que ce soit en microcosme ou en milieu liquide (ratio

L/S=20 mg.L-1). En fait, le phénomène d’adsorption qui régit principalement le devenir de l’atrazine a

lieu au cours des premières heures de contact avec l’écorce de pin. Cependant, on note que l’atrazine

est liée plus fortement à l’écorce au bout de 7 mois : le pourcentage de résidus non extractibles parmi

les résidus liés à l’écorce augmente légèrement (quelques %, essais Témoin avec écorce stérile) par

rapport au bilan établi à 15 jours.

Cette interaction forte avec l’écorce limite la biodisponibilité de l’atrazine et donc l’évolution du déchet.

On pourra donc difficilement imaginer un traitement biologique du déchet pour éliminer les résidus

d’atrazine et régénérer le support pour une nouvelle utilisation. L’inoculation régulière des biomètres

tout au long des 7 mois, avec un plus grand nombre de micro-organismes pourrait être testé mais

n’aurait sans doute aucun effet puisque l’atrazine migre dans les particules alors que les micro-

organismes apportés s’accumulent à l’extérieur.

Par contre, cette forte interaction diminue la mobilité de l’atrazine, abaissant le risque environnemental

et permettant ainsi d’envisager des filières de stockage ou de valorisation de l’écorce. Des tests

d’écotoxicologie devraient être mis en œuvre pour vérifier cette possibilité.



186

Si la présence résiduelle de l’atrazine ou de ces produits de dégradation dans l’écorce était jugée

inacceptable environnementalement pour valoriser ce matériau, la combustion serait alors la seule

issue pour ces déchets d’écorce provenant du traitement combiné.

V.2.2 Etude en colonne du traitement combiné

V.2.2.1 Etude du développement de Pseudomonas ADP sp. en colonne d’écorce de pin

Une observation au Microscope Electronique à Balayage (MEB) (voir préparation des échantillons §

V.1.2.2.1) d’échantillons prélevés des cylindres d’écorce de pin (extraits des colonnes) préalablement

inoculés avec Pseudomonas ADP sp. selon le protocole décrit en V.1.2.2, a permis de vérifier la

capacité de Pseudomonas ADP sp. à survivre dans ce contexte et à coloniser le matériau. D’autre

part, ces observations réalisées après différentes durées de circulation d’une culture cellulaire ont

permis d’évaluer une durée minimale d’inoculation pour le développement et la colonisation des

cellules au sein de l’écorce de pin. De plus, ces essais ont été réalisés sur des colonnes d’écorce

stériles ou non stériles ; l’influence de la microflore indigène de l’écorce sur la colonisation de celle-ci

par Pseudomonas ADP sp. a ainsi pu être mise en évidence de manière qualitative.

Deux durées de circulation ont été testées : 2 jours et 6 jours. Les observations au MEB ont été

réalisées sur des échantillons prélevés en entrée de colonne et au centre de la colonne.

Les clichés obtenus sont présentés en ANNEXE 5.

Après deux jours de circulation d’une culture à travers les colonnes, on constate que Pseudomonas

ADP sp. n’a pas proprement dit colonisé l’écorce de pin. Les cellules sont très clairsemées sur le

support ; cependant, on note que sur l’écorce non stérile les cellules sont présentes en plus grand

nombre que sur l’écorce stérilisée. On peut différencier des cellules de tailles variables constituant

une partie de la flore indigène de l’écorce : les grosses cellules (environ 5 µm) pourraient

correspondrent aux levures nommées CP2 préalablement identifiées au cours de l’isolement de la

microflore de l’écorce de pin par microscopie optique (IV.2.1p.150). On note également la présence

de cellules possédant des filaments mycéliens.

Deux jours d’inoculation ne sont pas suffisants pour coloniser l’écorce avec Pseudomonas ADP sp. et

donc pour espérer obtenir une biodégradation de l’atrazine efficace dans le cadre d’un traitement

combiné par biofiltration.

Après 6 jours de circulation d’une culture de Pseudomonas ADP sp. à travers les colonnes, un biofilm

cellulaire plus dense tapisse l’écorce de pin surtout en entrée de colonne, que ce soit sur l’écorce

préalablement stérilisée ou non stérilisée. Les cellules sont encrées dans une sorte de structure

spongieuse vraisemblablement constituée d’exo-polymères sécrétés par les cellules.

Dans les colonnes d’écorce préalablement stérilisée, les cellules sont toutes identiques d’une taille

moyenne de 1 à 2 µm en forme de bâtonnet, caractéristiques de Pseudomonas ADP sp.



187

Dans les colonnes d’écorce non stérilisée, ces bâtonnets cohabitent avec d’autre formes cellulaires

(cellules plus grosses et filaments mycéliens). La présence de Pseudomonas ADP sp. semble tout de

même plus limitée que dans l’écorce stérilisée, suggérant de nouveau un effet de compétition entre

les différentes populations microbiennes présentes dans l’écorce.

On note également que, quelle que soit l’écorce (stérilisée ou non) les cellules sont en très grand

nombre en entrée de colonne et qu’elles sont réparties de manière plus éparse au centre de la

colonne. La structure d’exo-polymères est absente du centre de la colonne et ne se retrouve que

lorsque les cellules sont présentes en grand nombre.

Ces observations permettent de conclure qu’une durée d’inoculation de 6 jours est nécessaire pour

une bonne colonisation de l’écorce par Pseudomonas ADP sp. D’autre part, l’écorce stérilisée semble

présenter un avantage par rapport à l’écorce contenant la microflore indigène intacte, pour le

développement d’un biofilm de Pseudomonas ADP sp.

V.2.2.2 Influence du biofilm sur l’hydrodynamique de la colonne

L’influence du biofilm de Pseudomonas ADP sp., observé plus haut, sur l’hydrodynamique des

colonnes d’écorce de pin a été testée par injection du traceur KCl, comme décrit au § V.1.2.2., avant

et après colonisation des colonnes. La Figure 48 (p.170) résume les différentes étapes de ces

expériences.

Seuls les résultats pour une inoculation avec Pseudomonas ADP sp. de 6 jours sont présentés

Figure 59. L’inoculation de 2 jours n’a pas été retenue à cause d’une colonisation trop faible de

l’écorce. Les caractéristiques des colonnes d’écorce sont présentées en ANNEXE 6.

La Figure 59 montre que les courbes d’élution du KCl avant et après inoculation avec Pseudomonas

ADP sp. se superposent quasiment : La présence de Pseudomonas ADP sp. ne modifie pas le

comportement hydrodynamique de la colonne (écorce stérile ou non stérile). L’écoulement a lieu dans

les deux cas (avec et sans Pseudomonas ADP sp.) sans retard (courbe symétrique) et de façon

homogène dans la colonne, sans emprunter de chemins préférentiels. Aucun signe caractéristique de

la présence de zones mortes n’est observé (pas de pics).



188

Figure 59 : Courbe d’élution de KCl pour les colonnes d’écorce de pin stérile (gauche) ou non stérile (droite), avant (ronds) et après (carrés) circulation pendant 6 jours d’une culture de Pseudomonas ADP

sp. ; 20 ± 2°C ; débit 1,0 mL.min-1 ; temps de contact 20 min

V.2.2.3 Traitement combiné en colonne

Le traitement combiné « Adsorption + Biodégradation » a été testé sur les colonnes d’écorce de pin

stérile ou non stérile, après inoculation de Pseudomonas ADP sp. pendant 6 jours, défini comme

temps suffisant pour une bonne colonisation du support, selon les résultats obtenus au § V.2.2.1.

Deux débits de circulation de la solution en atrazine ont été testés :

1 mL.min-1 et 0,3 mL.min-1, correspondant respectivement à des temps de contact d’environ 22 et

100 minutes. Deux concentrations entrantes en atrazine ont également été testées : 0,2 mg.L-1 et

2,34 µg.L-1. La Figure 49 (p.172) résume les différentes étapes du traitement combiné testé ci-

dessous. La photo illustre le montage expérimentale utilisé pour ces essais.

Ecorce non stérile

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4V/Vo

C/C

o

Without biofilm

With biofilmSans BiofilmAvec Biof ilm

Ecorce stérile

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4V/Vo

C/C

o

Without biofilm

With biof ilmSans BiofilmAvec Biof ilm

Sans

Pseudo

Sans

Pseudo



189

Figure 60 : Montage expérimentale pour les essais d’adsorption en colonne composé d’une étuve climatisée à 20±2°C , d’un multianalyseur (pH, conductivité) ; de deux pompes peristaltiques et d’un

collecteur de fractions

La Figure 61 présente les courbes d’élution d’une solution d’atrazine à 0,2 mg.L-1, injectée à un débit

de 1 mL.min-1, à travers les colonnes d’écorce préalablement stérilisée ou non.

Lors du traitement combiné (colonne inoculée avec Pseudomonas ADP sp.) la courbe d’élution

exprimée par C/C0 en fonction de V/V0 (V0 étant le volume d’eau dans la colonne ou volume de pore)

tend plus lentement vers la saturation (C/C0=1) que lors d’une simple adsorption sans Pseudomonas

ADP sp. Dans les colonne d’écorce stérilisée, la quantité d’atrazine retenue et/ou dégradée après une

injection de 350 V0 (calculée par la surface au dessus de la courbe) représente 0,070 mg par gramme

d’écorce par « traitement combiné » contre 0,046 mg.g-1 lorsque la colonne n’est pas inoculée avec

Pseudomonas ADP sp. et que seule l’adsorption intervient dans le traitement. Les résultats sont

résumés dans le Tableau 19 p.192).

Des résultats similaires sont obtenus pour l’écorce non stérilisée : la quantité d’atrazine traitée est de

0,041 mg.g-1 et 0,050 mg.g-1 pour les colonnes non inoculées et inoculées respectivement avec

Pseudomonas ADP sp.. Ces résultats sont cohérents avec ceux obtenus en batch ; pour une

concentration à l’équilibre Ce= 0,2 mg.L-1, la quantité d’atrazine retenue par l’écorce qe était de

0,04 mg.g-1 (Figure 15 p.106) pour un ratio liquide/solide de 10 mL.g-1. On note cependant que

l’efficacité des colonnes d’écorce stérilisée est légèrement meilleure que celle des colonnes contenant

l’écorce non stérilisée. Ce phénomène peut être expliqué d’une part par l’adsorption de l’atrazine sur

l’écorce et d’autre part, par sa biodégradation par Pseudomonas ADP sp. En effet, dans les essais en



190

batch nous avons pu mettre en évidence une légère différence entre à la capacité d’adsorption de

l’atrazine sur l’écorce stérilisée et celle sur l’écorce non stérilisée :

L’écorce stérilisée présente des coefficients d’adsorption pour l’atrazine légèrement supérieurs à ceux

obtenus avec l’écorce non stérilisée. D’autre part, nous avons à plusieurs reprises évoqué des

phénomènes de compétition entre Pseudomonas ADP sp. et la microflore indigène de l’écorce,

pouvant également justifier de cette différence d’efficacité observée entre le traitement combiné avec

l’écorce stérilisée et celui utilisant l’écorce non stérilisée.

Figure 61 : Courbe d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L-1) traversant une colonne d’écorce de pin non stérilisée (à gauche) ou d’écorce stérilisée (à droite) inoculée (traitement

combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 1 ml.min-1 ; temps de contact 22 min

Suite à ces essais, le traitement combiné a été testé uniquement sur des colonnes d’écorce de pin

préalablement stérilisée. D’autre part, pour améliorer l’efficacité du traitement, le débit de circulation

de la solution en atrazine a été diminué afin d’augmenter le temps de séjour de l’atrazine dans les

colonnes. Un temps de séjour plus long dans les colonnes pourra éventuellement permettre une

meilleure biodégradation de celle-ci par Pseudomonas ADP sp. et/ou une meilleure adsorption sur le

support écorce/biofilm. Nous avons vu plus haut que la biodégradation de l’atrazine avait lieu

majoritairement dans les premières heures de contact avec Pseudomonas ADP sp. (voir par exemple,

Figure 37 p.144).

Les Figure 62 et Figure 63 présentent les courbes d’élution obtenues pour un débit de circulation de

0,3 ml.min-1 (temps de contact environ 100 minutes) de solutions entrantes à 2,34 µg.L-1 ou

0,2 mg. L -1 d’atrazine respectivement, traversant les colonnes d’écorce de pin stérilisée préalablement

colonisées ou non par Pseudomonas ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement.

Ecorce non stérile

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200 250 300 350 400

V/Vo

C/C

o

Adsorption

Traitement combiné

Ecorce stérile

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200 250 300 350V/Vo

C/C

o

AdsorptionTraitement combiné

Ecorce non stérilisée Ecorce stérilisée



191

Figure 62 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 2,34 µg.L-1) traversant une colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas

ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min-1 ; temps de contact 100 min

Figure 63 : Courbes d’élution d’une solution d’atrazine (concentration d’entrée 0,2 mg.L-1) traversant une colonne d’écorce de pin stérile inoculée (traitement combiné) ou non (adsorption) avec Pseudomonas

ADP sp. pendant les 6 jours précédant le traitement. 20 ± 2°C ; débit 0,3 ml.min-1 ; temps de contact 100 min

[Atrazine]i = 2.34 µg.L-1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200

V/Vo

C/C

o


[Atrazine]i= 0,2 mg.L-1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

0 50 100 150 200

V/V0

C/C

0




192

La variabilité des résultats obtenus à faible concentration en atrazine (Figure 62) est due à l’utilisation

de kit de dosage immunologique permettant de travailler à très petite concentration mais parfois peu

précis dans cette gamme de concentrations (dosage colorimétrique).

D’autre part, la Figure 63 présente une chute brutale de la concentration en atrazine en sortie de

colonne au temps t=120h environ. Cette chute provoquée par un problème technique a impliqué la

stagnation de la solution d’atrazine dans la colonne pendant plusieurs heures. Cette observation

montre qu’avec un temps de contact plus long que celui imposé par un débit de 0,3 mL.min-1 (soit

100 minutes environ), la concentration en atrazine chute et donc que la biodégradation peut avoir lieu

de façon plus importante. Le temps de séjour dans les colonnes serait donc insuffisant pour une

bonne biodégradation.

Le Tableau 19 résume les résultats obtenus pour les différents traitements appliqués (différents

débits, différentes concentrations initiales en atrazine, avec ou sans Pseudomonas ADP sp.) et

permet d’évaluer l’éfficacité du traitement selon les différents paramètres d’étude choisis.

Tableau 19 : Quantité d’atrazine retenue ou dégradée par gramme d’écorce par circulation des solutions polluées à 0,2 mg.L-1 ou 3 µg.L-1 à des débits de 1 ou 0,3 ml.min-1 dans des colonnes d’écorce de pin

stérilisée, ayant ou non été colonisées par Pseudomonas ADP sp.

Lorsque Pseudomonas ADP sp. n’est pas inoculée dans les colonnes d’écorce de pin, l’efficacité du

traitement est équivalente pour les débits de 1 mL.min-1 ou 0,3 mL.min-1. L’augmentation du temps de

séjour dans les colonnes (multiplié par 3) n’augmente pas l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce. En

effet, les essais en batch ont montré que l’adsorption de l’atrazine sur l’écorce de pin était un

phénomène quasi instantané (Figure 11, p.102) ; l’atrazine est majoritairement adsorbée lors des

premières minutes de contact avec l’écorce.

Lorsque les colonnes sont colonisées par Pseudomonas ADP sp., la présence du biofilm améliore de

50% la quantité d’atrazine éliminée de la solution par rapport aux colonnes non inoculées, lorsque la

concentration en atrazine de la solution à traiter est de 0,2 mg.L-1 pour un débit de 1 ml.min-1.

A faible débit (0,3 mL.min-1), la présence de Pseudomonas ADP sp. permet de doubler la masse

d’atrazine éliminée, que ce soit pour une concentration entrante de 0,2 mg.L-1 ou 2,34 µg.L-1.

Débit = 1 ml.min-1 Débit = 0,3 ml.min-1 [Atrazine]= 0,2 mg.L-1 [Atrazine]= 3 µg.L-1 [Atrazine]= 0,2 mg.L-1 [Atrazine]= 3 µg.L-1

Sans Pseudo. 0,046 mg.g-1 ND 0,046 mg.g-1 0,348 µg.g-1

Avec Pseudo. 0,07 mg.g-1 ND 0,087mg.g-1 0,65 µg.g-1



193

La diminution du débit de 1 à 0,3 mL.min-1, rend également le procédé de biofiltration plus efficace

(+ 25 % d’atrazine éliminée à 0,3 mL.min-1 par rapport au débit de 1 mL.min-1), contrairement à ce qui

a été observé plus haut dans les colonnes non inoculées. L’augmentation du temps de séjour permet

donc d’obtenir un meilleur taux de biodégradation de l’atrazine.

Les études en batch (Figure 50, Figure 51, p.174) ont montré que la minéralisation de l’atrazine avait

lieu majoritairement au cours des 15 premières heures. Il pourrait donc être intéressant de répéter ces

expériences soit avec des débits plus faibles, afin d’atteindre des temps de séjour de plusieurs heures

dans la colonne (alors, la diminution du débit pourrait entraîner des problèmes d’oxygénation ou

d’apport en nutriments pouvant devenir limitant pour les micro-organismes) soit par recirculation de la

solution à traiter, ce qui augmenterait le temps de séjour de l’atrazine sans poser de problème

d’aération des colonnes. Dans le cas de l’utilisation de débit plus faible, l’utilisation de colonnes

aérées, type Airlift pourrait être la solution au problème d’oxygénation des bactéries.

Les analyses de carbone organique dissous (COD) effectuées tout au long de ces expériences ont

montré des concentrations toujours inférieures à 1g.L-1, soit une charge organique acceptable pour

être rejetée dans le milieu naturel. De plus, ces analyses ont montré que cette concentration en COD

en sortie de colonne variait très peu au cours du temps. L’activité biologique (consommation de la

matière organique de l’écorce) à l’intérieur de la colonne pourrait être responsable du transfert de

composés de l’écorce e solution et donc de la stabilité de la concentration en COD en sortie de

colonne (équilibre entre consommation de la matière organique et dissolution de celle-ci dans la

phase aqueuse circulante).

Si on calcule le volume d’élution par gramme d’écorce pour lequel on obtient en sortie de colonne la

concentration en atrazine maximale autorisée (soit 0,1 µg.L-1), on voit que pour traiter une eau

naturelle polluée à 2,34 µg.L-1 cette concentration maximale est atteinte pour un volume d’environ

40 ml pour 1 gramme d’écorce (débit de 0,3 ml.min-1) avec ou sans Pseudomonas ADP sp. Il faudrait

donc 25 kg d’écorce pour traiter 1m3 de cette eau, ce qui représente une masse considérable.

L’efficacité du traitement étudié reste donc limitée par rapport à un traitement classique sur charbon

actif puisque la capacité d’adsorption de l’atrazine sur un charbon actif en poudre est d’environ de 10

à 30 g.m-3 pour une concentration en atrazine de 0,1 µg.L-1, et utilise donc environ 1000 fois moins

d’adsorbant qu’un traitement sur écorce de pin (Detoc, 1998).

Dans le cas du traitement d’une solution polluée à environ 0,2 mg.L-1, correspondant à une forte

pollution (eaux provenant de lavage de cuve contenant des pesticides, eaux accidentellement émises

par une usine de production ou issues d’une mauvaise utilisation ou d’un mauvais stockage), on

observe un taux d’abattement de 60% après circulation d’environ 3 litres de solution lorsque la

colonne ne contient pas Pseudomonas ADP sp. contre 6 litres lorsque la colonne a été inoculée avec

Pseudomonas ADP sp. L’efficacité du traitement est doublée lorsque adsorption et biodégradation

sont combiné. La capacité de l’écorce pour abattre 60% de l’atrazine initialement présente à

0,2 mg.L - 1 est 1500 g.m-3. On pourrait donc imaginer mettre en œuvre ce procédé de traitement dans



194

le cadre d’une pollution ponctuelle, avec des quantités d’eau à traiter de quelques dizaines de mètres

cube.

Le traitement combiné pourrait dans ces conditions être utilisé comme un pré-traitement pour abattre

la majeure partie de la pollution, avant d’être envoyée dans une filière de traitement classique, en tête

de station d’épuration ou de subir un traitement final sur charbon actif.

V.2.2.4 Conclusions

Les résultats obtenus lors de l’étude du traitement combiné en colonne montrent qu’un temps d’inoculation de 6 jours est nécessaire pour coloniser la colonne d’écorce de pin avec

Pseudomonas ADP sp., avant qu’elle ne soit utilisée comme biofiltre.

D’autre part, la présence de la microflore de l’écorce de pin diminue faiblement la colonisation par

Pseudomonas ADP sp. suggérant à nouveau l’existence d’une faible compétition entre cette flore indigène et Pseudomonas ADP sp. pour les nutriments à leur disposition.

Lorsque le biofilm est établi, celui-ci ne modifie pas le comportement hydrodynamique des colonnes

d’écorce de pin.

D’une manière générale, les quantités d’atrazine éliminées par le traitement combiné ne sont pas très

importantes. On note cependant que la présence de Pseudomonas ADP sp. dans les colonnes améliore de 50 à 100 % l’efficacité du traitement par rapport au procédé d’adsorption seul. On note

également que la diminution du débit de circulation de la solution polluée dans les colonnes (de 1 à

0,3 ml.min-1), soit l’augmentation du temps de séjour de l’atrazine dans les colonnes augmente significativement le taux de biodégradation de celle-ci.

Globalement, les conditions testées dans ces essais n’ont pas été favorables à la biodégradation. Il

pourrait donc être intéressant d’optimiser ces conditions (diminution du débit circulation de la solution

polluée ou recirculation de la solution afin d’augmenter le temps de contact entre atrazine et écorce)

afin de provoquer la biodégradation de manière plus efficace. D’autre part, la connaissance de la

densité cellulaire à l’intérieur des colonnes permettrait d’accéder aux valeurs de taux de croissance et

de déterminer des vitesses de dégradation de l’atrazine dans les colonnes. En connaissant les

vitesses de dégradation, un débit optimal (ou temps de séjour) pourrait être calculé pour traiter de

façon optimisée l’eau polluée.

Ces essais ont montré que le traitement combiné était d’une manière générale inexploitable pour traiter des eaux contenant de faibles concentrations en atrazine. Cette méthode utiliserait des

quantités considérables d’écorce de pin. Le traitement sur charbon actif (inoculé ou non) est dans ce

cas beaucoup plus efficace et plus adapté malgré un coût supérieur du support d’adsorption.



195

En revanche, dans le cas d’une forte pollution ponctuelle en atrazine, le traitement combiné sur écorce de pin inoculée peut être envisagé en tant que pré-traitement. L’eau serait ainsi

débarrassée de la majeure partie de sa charge polluante avant d’être envoyée dans les filières de

traitement classique. Ainsi, on peut imaginer qu’un agriculteur lavant ses cuves de pesticides ou un

producteur d’atrazine pourrait, sur site, être équipé de colonne ou de bioréacteur individuel pour traiter

ses eaux fortement concentrées en atrazine, afin d’éliminer la plus grosse partie de la pollution. Cette

solution est d’ailleurs en accord avec la politique actuelle qui tend à responsabiliser de plus en plus

les pollueurs.



196

Etude d'un traitement combiné bio-physico-chimique...

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