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E.T.S.L. BREVET de TECHNICIEN SUPERIEUR de

BIOPHYSICIEN

Session 2009

ÉPREUVE de TECHNIQUES d’ANALYSES SPECTRALES & SEPARATIVES

ÉPREUVE SUR 80 POINTS

Aucun document autorisé. Machine à calculer autorisée. Durée : 4 heures 12 pages Chaque exercice est indépendant. Exercice 1 : Étude de l’efficacité de nouvelles phases stationnaires chirales utilisées en HPLC en vue de la séparation rapide d’énantiomères ( 26,5 points) La mise au point récente en 2008 de nouvelles colonnes chromatographiques permet d’augmenter la rapidité de séparation d’énantiomères à partir d’instruments HPLC conventionnels. La diminution de la taille des particules de silice, habituellement de 5 µm ou plus, à 3 µm permet d’obtenir des séparations plus efficaces. Dans la pratique, la chromatographie haute vitesse peut avoir lieu en ajustant certaines variables telles que le débit, la température, les dimensions de la colonne et la taille des particules constituant la phase stationnaire. Réduire la taille des particules est considéré, à l’heure actuelle, comme une des meilleures approches pour obtenir une séparation rapide et efficace ; en théorie N ∝

!

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d, d étant le diamètre des

particules. La résolution d’énantiomères en HPLC est augmentée en utilisant des phases stationnaires chirales (CSP). L’une des plus utilisées est celle utilisant un support chiral à base de polysaccharide sur support en silice. L’étude est basée sur la comparaison de résultats, obtenus à l’aide de colonnes constituées de particules de 3 µm et de colonnes classiques constituées de particules de 5 µm. 1/ Rappeler ce qu’est l’énantiomérie. (1 point) 2/ Tests préliminaires : on effectue des mesures de la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) en fonction de la vitesse linéaire de la phase mobile u sur la colonne Chiralpak® AD-H (particules de 5 µm) et sur la colonne Chiralpak® AD-3 (particules de 3 µm). On obtient les courbes ci-après :

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Figure 1 : Courbes de Van Deemter pour la colonne

Chiralpak® AD-H (courbe a) et Chiralpak® AD-3 (courbe b)

Dimension des colonnes : 4,6x150mm. Phase mobile : Hexane/Propan-2-ol 90/10. T = 25 °C. Soluté : l’oxyde trans-stilbene

Comparer la forme et la position respectives de ces courbes. Conclure sur l’intérêt des colonnes Chiralpak® AD-3 (maximum 10 lignes). (2 points) 3/ On pourrait utiliser des colonnes dont le diamètre des particules est inférieur à 3 µm. Cela n’est pas possible à cause de la pression utilisable dans les dispositifs HPLC conventionnels. Il faut alors utiliser des appareillages dit UHPLC (Chromatographie Liquide Ultra Haute performance) avec lesquels on peut travailler à des pressions jusqu’à 1000 bar, mais qui sont beaucoup plus coûteux. Donner la fourchette de pression ainsi que celle du débit classiquement utilisées dans les appareillages HPLC classiques. (2 points) 4/ On donne en annexe (à rendre avec la copie) le schéma d’un dispositif classique d’une chaîne HPLC. Indiquer sur celui-ci, l’emplacement des éléments suivants : l’entrée de l’hélium à pression contrôlé, les réservoirs de solvant, la vanne proportionnante (encore appelée électrovanne) de solvant, la pompe, l’amortisseur de pulsation, le transducteur de pression, la vanne d’injection et la colonne. (4 points) 5/ Une première étude consiste à injecter deux énantiomère de l’ibuprofène. On obtient les résultats ci-dessous :

Figure 2 : Chromatogrammes des énantiomères de l’ibuprofène dans le cas de l’utilisation des colonnes Chiralpak® AD-H (a) et Chiralpak® AD-3 (b). Dimension des colonnes : 4,6x150mm. Phase mobile : ACN/HCOOH – pH 2,0 - 50/50. T = 25 °C.

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Indiquer le carbone asymétrique de l’ibuprofène et représenter ses deux énantiomères en représentation de Cram. (1 point) Comparer, de façon qualitative, les chromatogrammes obtenus (en quelques lignes). (2 points) 6/ Une seconde étude est effectuée en mesurant les temps de rétention ainsi que les largeurs à la base des pics afin d’estimer les valeurs du facteur de sélectivité et de la résolution, pour deux autres molécules en mélange racémique. Tableau 1 : Largeur à la base des pics du γ-(4-fluorophenyl)-γ-butyrolactone et du Propanolol selon le type de colonne utilisée.

Composés Type de colonne wA (min) WB (min) Colonne classique 0,12 0,16 γ-(4-fluorophenyl)-γ-

butyrolactone Colonne 3 µm 0,09 0,12 Colonne classique 0,21 0,25 Propanolol

Colonne 3 µm 0,14 0,19 On rappelle, par convention, que B est l’espèce la plus retenue le long de la colonne

Figure 3 : Chromatogrammes des énantiomères du γ-(4-fluorophenyl)-γ-butyrolactone dans le cas de l’utilisation des colonnes Chiralpak AD-H (a) et Chiralpak AD-3 (b) et de ceux du propanolol dans le cas de l’utilisation des colonnes Chiralpak OD-H (c) et Chiralpak OD-3 (d) On donne le temps mort tM = 1,6 min. - a - Définir le temps mort. (1 point) - b - Rappeler les expressions de α et RS. (2 points)

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- c - Calculer leur valeur pour chaque chromatogramme. (2 points)

- d - Comparer les chromatogrammes deux à deux (en s’appuyant notamment sur les calcules précédents), puis conclure (pas plus d’une douzaine de lignes). (2 points)

7/ Indiquer l’effet d’une augmentation de débit, pour une taille de particules donnée, sur la résistance au transfert de masse et donc sur l’efficacité de séparation de la colonne. (1 point) 8/ Effet de la température et du débit. Pour remédier au problème qu’engendre une augmentation de débit sur l’efficacité d’une colonne, une augmentation modérée de la température permet de diminuer la pression interne de la colonne et donc de résoudre ce problème. En effet, dans le cas de la séparation de l’indapamide en mélange racémique, on obtient les chromatogrammes suivants :

Figure 4 : Effets de l’augmentation du débit (b) ou de la température (c). Colonne Chiracel® OD-3 (4,6x50 mm). Phase mobile : MeOH. - a - Calculer pour chaque chromatogramme NA, NB et RS (attention aux unités). (1,5 points)

Largeurs à la base du pic wA (s) wB (s) Chromatogramme (a) 1,83 4,28 Chromatogramme (b) 1,32 2,96 Chromatogramme (c) 1,42 2,36

Tableau 2 : Largeur à la base des pics des énantiomères de l’indapamide - b - Commenter les résultats obtenus (maximum 5 lignes). (2 points) 9/ Une dernière étude a été effectuée avec un mélange racémique de mephobarbital, en combinant les effets du débit et de la température.

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On a obtenu les chromatogrammes ci-dessous :

Figure 5 : Effets combinés d’une augmentation du débit et de la température. Comparer ces chromatogrammes en termes de durée d’analyse et de résolution (maximum 10 lignes) et conclure. (2 points) 10/ Conclure sur l’avantage de ces nouvelles colonnes, tout en sachant qu’elles sont facilement adaptables sur des chaînes HPLC classique. (1 point) Exercice 2 : Pression osmotique. ( 12 points) Soit une solution mère de protéine X à 1,5 % (p/v). Pour déterminer la masse molaire de X, on fait des mesures de la pression osmotique en fonction de la concentration en protéine. La température de travail est de 27 °C. Tableau 3 : Concentration de X en fonction de la pression osmotique.

Concentration de X en % (p/v)

Pression osmotique Π (cm d’eau)

1,5 10,98 1,25 8,87 1,0 6,89 0,75 5,00 0,50 3,22 0,25 1,56

1/ Tracer la courbe

!

"

C = f(C). C étant la concentration massique de X. Rendre le graphe avec un

titre complet et des échelles convenables. (6 points) 2/ Calculer la masse molaire de la protéine X. (4 points)

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3/ D’après l’allure du graphe, que pouvez-vous dire à propos des interactions entre X et le solvant. (2 points) Données : 1 cm de Hg = 13,6 cm d’eau ; 1 atm = 760 mm de Hg ; R = 0,082 L.atm.K-1.mol-1. Exercice 3 : Titrage de la Dexchloropheniramine par spectrophotométrie dérivée UV en présence d’excipient et autres agents colorants ( 26,5 points) La Dexchloropheniramine (DPM) présente des effets anti-histaminiques, et est une molécule utilisée dans les traitements symptomatiques des rhinites allergiques. On la retrouve sous forme solide dans les comprimés ou liquide dans les sirops. Un de ces noms commerciaux connus est la Polaramine®. Jusqu’en 2005, le dosage de cette molécule se faisait par spectrophotométrie UV ou par CPG, mais des extractions liquide-liquide ou liquide-solide préalables ainsi que des prétraitements chimiques étaient obligatoires pour séparer le produit actif des excipients et autres agents colorants qui interféraient dans le dosage. Ces méthodes étaient donc longues, laborieuses et dispendieuses. L’utilisation de la spectrophotométrie dérivée UV présente l’avantage de pouvoir doser directement la DPM, sans se préoccuper de son environnement. Des études préliminaires ont montrés que cette technique était linéaire dans le domaine de concentration 9,75 – 32,5 µg.mL-1 de DPM dans 0,1 mol.L-1 d’acide sulfurique.

Figure 6 : Structure de la DPM.

1/ Dire pourquoi, en examinant la structure chimique de la DPM, celle-ci absorbe dans l’UV ? (1 point) Pour faire les mesures, on utilise un spectrophotomètre Hewlett Packard double faisceau UV-Visible. 2/ Quel type de cuve doit-on utiliser et pourquoi ? Quelle précaution doit-on prendre et pourquoi ? Avec quelle entité chimique remplie-t-on la cuve de référence ? (2,5 points) Toutes ces conditions sont réalisées par la suite. On veut dans un premier temps vérifier l’utilité de travailler sur un spectre dérivée par rapport au spectre d’absorbance. On va donc comparer les spectres d’un placebo (substance inactive substituée à un médicament pour étudier l’efficacité réelle de ce dernier), d’un étalon (standard de DPM seule à 20 µg.mL-1) et d’un échantillon de DPM (avec excipient à 20 µg.mL-1).

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3/ Sachant qu’un comprimé contient 2 mg de DPM, indiquer, pas à pas, la procédure pratique utilisée pour fabriquer un échantillon liquide à 20 µg.mL-1 ? (Vous disposez pour cela, d’un mortier et son pilon, d’une fiole jaugée de 100 mL, d’acide sulfurique à 0,1 mol.L-1 et d’un bain à ultrason (la poudre contenant le DPM se dissout très mal)). (2 points) On obtient les spectres suivants :

Figure 7 : Spectres d’absorbance (A), de la dérivée première d1 (B), et de la dérivée seconde

d2 (C) du standard (traits plein), de l’échantillon de DPM (segments) et du placebo (pointillés) 4/ L’étalon et l’échantillon de DPM étant à la même concentration, expliquer pourquoi leur spectre d’absorbance ne sont pas parfaitement superposés ? (1 point) 5/ Expliquer pourquoi le spectre de dérivée première d1 du placebo est à zéro ? (1 point)

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L’observation de la figure (C) montre que les spectres de dérivée seconde d2 de l’étalon et de l’échantillon de DPM sont parfaitement superposés ce qui permet de s’affranchir des interférences dues aux excipients et autres agents colorants. On va donc, dans un second temps, doser à l’aide de la méthode des additions connues, la quantité de DPM dans 2 échantillons A (comprimés de 2mg) et B (comprimés de 1 mg). Pour cela, on construit deux gammes comme suit : Différents volumes VS (5,0 ; 10,0 et 15,0 mL) de concentration CS = 20 µg.mL-1 de DPM standard sont additionnés dans des fioles jaugées de 20 mL contenant Vx = 1,00 mL à une concentration Cx ≈ 20 µg.mL-1 d’échantillon A pour la première gamme et Cx ≈ 10 µg.mL-1 d’échantillon B pour la seconde. 6/ Rappeler l’expression de l’absorbance A d’un point de gamme en fonction de a(λ) coefficient d’absorption massique de la DPM (ne dépendant que de la longueur d’onde λ), b longueur de cuve, CS concentration étalon, VS volume étalon, Cx concentration de l’échantillon, VX volume de l’échantillon, et Vt le volume total. (1,5 points) 7/ En déduire facilement que l’expression de la dérivée seconde de l’absorbance s’écrit : (1,5 points)

!

d2A

d"2 =

d2a(")

d"2.b

CSVS

Vt

+ CxVx

Vt

#

$ %

&

' ( = m.VS + p

Donner les expressions littérales de m et p. (2 points)

8/ À la longueur d’onde de 265 nm, on obtient les valeurs de

!

d2A

d"2 pour les deux échantillons.

Tableau 4 : Valeurs de

!

d2A

d"2 pour les échantillons A et B en fonction du volume d’étalon VS.

Volume VS

(mL)

!

d2A

d"2 pour l’échantillon A

(10-3 S.I)

!

d2A

d"2 pour l’échantillon B

(10-3 S.I) 5,00 8,59 4,27 10,0 15,9 8,12 15,0 23,0 11,8

Tracer les deux droites d’étalonnages sur la même feuille de papier millimétré. En déduire les valeurs des pentes m, et celles des ordonnées à l’origine p, de chaque courbe (attention aux unités). (8 points)

9/ Montrer que Cx =

!

CS

Vx

.p

m. (1 point)

En déduire les concentrations de la DPM dans les échantillons A et B. Ces valeurs sont-elles en accord avec celles indiquées sur les boîtes de comprimés ? (faites des calculs d’écarts relatifs). (4 points) Conclure sur l’efficacité de cette méthode. (1 point)

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Exercice 4 : Résolution et identification des colorants Sudan® I à IV par CPG/masse ( 15 points) Les colorants Sudan® sont des colorants synthétiques azotés. Ils sont solubles dans les hydrocarbures. Ils sont utilisés dans l’industrie textile, mais on les retrouve aussi dans l’industrie agroalimentaire. Ils ne sont plus autorisés comme colorants alimentaires depuis 1995 par l’Union européenne, car ils sont cancérigènes. Depuis 2003, des contrôles sur des produits importés ont montré leur présence, en particulier dans des poudres de piments, dans du curcuma et de l’huile de palme. On en trouve aussi dans les plats préparés contenant de la tomate ou du poivron tel que le pesto. Les laboratoires d’analyse et de contrôle utilisent la spectrométrie de masse couplée à la CPG pour détecter et séparer ces colorants en moins de 8 minutes. La CPG utilise comme détecteur un TCD. En SM, l’ionisation utilisée est une ionisation chimique et l’analyseur un simple quadripôle. Les formules chimiques de ces colorants sont données ci-dessous :

Figure 8 : Sudan® I jaune (248,3 g.mol-1).

Figure 9 : Sudan® II orange

(276,3 g.mol-1).

Figure 10 : Sudan® III rouge ceresin

(352,4 g.mol-1).

Figure 11 : Sudan® IV rouge scharlarch

(380,4 g.mol-1).

1/ Quel est l’intérêt de coupler la CPG à un spectromètre de masse ? Au laboratoire TASS, nous ne disposons pas de ce type de couplage, que feriez-vous pour identifier les colorants ? (2 points) 2/ Indiquer le principe de fonctionnement d’un TCD. (2 points) 3/ La colonne employée en CPG possède une phase stationnaire 50 % Trifluoropropyl-polydiméthyl siloxane. Ce type de phase stationnaire est-elle liquide ou solide ? (1 point) Indiquer clairement ce que représente la valeur 50 %. (1 point) On rappelle que la phase stationnaire polydiméthyl siloxane à la structure générale suivante pour laquelle les groupements –R sont tous des groupements méthyles –CH3.

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Figure 12 : Structure générale des polysiloxanes.

4/ Indiquer en quoi consiste l’ionisation chimique et son impact sur l’aspect des spectres de masse obtenus ? (3 points) On obtient le chromatogramme suivant :

Figure 13 : Chromatogramme du mélange de colorants Sudan® I à IV.

5/ Les 4 pics principaux représentent les 4 colorants avec leur temps de rétention, par contre on ne sait pas dans quel ordre ils sont élués (tM = 1,38 min). (6 points) Les spectres de masse de chacun de ces colorants (avec leur temps de rétention entre parenthèse) sont donnés ci-dessous. Attribuer chacun des spectres de masse au colorant correspondant.

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Figure 14 : Spectres de masse des colorants Sudan® selon leur ordre d’élution.

FIN DE L’ÉPREUVE

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ANNEXE À RENDRE AVEC LA COPIE

Appareillage d’HPLC classique