Congrès Francophone d’Allergologie 2016

Laurence Guzylack-Piriou

DIXIT Développement Intestinal, Xénobiotiques

& ImmunoToxicologie

Dérégulation des réponses immunitaires intestinales et systémiques après

exposition périnatale au bisphénol A (BPA) : possible

implication dans les réactions d’intolérance alimentaire

polycarbonate résine époxy

Haute température, pH acide, …

Bisphénol A

Aliments

Concentration de BPA dans les fluides humains 0,1 – 10nM!Calafat et al, 2008; Vandenberg et al, 2007; Sun et al, 2004!

PC

Bisphénol A : contaminant alimentaire, xénoestrogène présent dans l’alimentation

dépolymérisation

2

EFSA DJT = 50µg/kg/j DJT = 5µg/kg/j

DJT : 4µg/kg/j Dose journalière temporaire

(proposée)

Octobre 2008 Janvier 2014 Janvier 2015

Interdiction du BPA dans les

biberons

ANSES Interdiction du BPA dans les produits pour enfants de - 3 ans

Interdiction du BPA pour tout conditionnement

alimentaire

Mars 2010 Janvier 2013 Janvier 2015

Devenir du BPA et réglementation

Doses de référence: !NOAEL : No Observed Adverse Effect Level!DJT : Dose Journalière Tolérable pour l’homme !

3

Réglementation

- Elimination du BPA

Conjugaison par le foie (90% chez le rat) Elimination par les urines

Retrouvé dans l’urine de 95% de la population de pays industrialisés

Contamination orale maternelle du BPA

Sang maternel Cordon

ombilical Liquide

amniotique Placenta Sang foetal

Concentration en ng/ml

5.9 1.1 8.3 11.2 1.13

E. Houdeau 2011; Vandenberg et al. 2007; Bondesson et al. 2009; Ruthann A. Rudel et al., 2011; Ikezuki et al., 2002; Schönfelder et al., 2002 ; Zalko et al, 2003

F  Exposition importante de l’Homme au bisphénol A F  Absorption et transmission de la mère au fœtus

4

Immunotoxicité développementale

Régime maternel /environnement Régime pédiatrique / environnement

Exposition microbienne maternelle Exposition microbienne pédiatrique

Conception Naissance

4 ans

Apparition et migration des cellules apparentées aux macrophages

Etablissement, expansion et spécialisation des macrophages résidents

Cellules T (Th, Tregs, Th17)

Mise en place et maturation du GALT/BALT

Maturation des cellules dendritiques Fenêtres critiques dans le

développement du système immunitaire qui peuvent prédisposer

aux maladies chroniques à l’âge adulte

Maturation de la tolérance (GALT/microbiote)

Chimiques environmentaux : EDC / BPA

Importance de la période périnatale dans le développement du SI

Déclencheurs post-natales cibles de la maladie

5

naissance

Perméabilité intestinale

Maturation du GALT Barrière

intestinale mature

« gut closure »

?

lumen

Lamina propria

TOLÉRANCE IMMUNITAIRE &

STIMULATION BACTÉRIENNE =

HOMEOSTASIE

Colonisation bactérienne postnatale (entre commensales et pathogènes)

Echanges facilités (trans- ET paracellulaires)

Système immunitaire (présent à la naissance)

1 2 Développement postnatal du système

immunitaire dépendant de la perméabilité épithéliale

intestinale Wagner et al, Clinic Rev Allerg Immunol (2008)

Importance de la période périnatale dans le développement du SI (système immunitaire)

6

7

Tolérance orale : implication des cellules immunitaires

Mowat, 2003

1.  Protéines alimentaires sont capturées par les cellules dendritiques directement au niveau de la lumière ou après transcytose par l’épithélium intestinal

FoxP3

Th17/ Th1

Tregs

Tolerance

Inflammation

1

2

3

4

2. TFG-β et IL-10 et autres facteurs (ex RA) produits par les cellules épithéliales : maturation partielle des DCs dans Lamina Propria (LP) et les plaques de Peyer (PP)

3. Antigènes sont présentés par les DCs aux cellules T naïves dans MLNs (ganglions mésentériques) ou PP

4. Différenciation des cellules T en -  Treg : tolérance -  Th1 (production IFN-γ) ou Th17

(IL-17) : inflammation

8

Guandalini et Newland, 2011

Classification des intolérances alimentaires avec manifestation gastro-intestinale

Vehicule (huile maïs) BPA [0; 5 µg/kg bw/d]

G15 Nai

ssan

ce

(G23

)

gestation

Conséquences d’une exposition à de faibles doses de BPA pendant la période périnatale sur la tolérance orale chez

de jeunes rats après sevrage (J25)

Sevr

age

lactation

Ø  Protocole d’induction de la tolérance orale et immunisation

(J25)

♀

9

2014

1. Protocole de tolérance orale

Protocole de tolérance orale et d’immunisation

Gavage    • OVA  

Sensibilisa1on  OVA/CFA  

Boost  OVA/CFA  

Euthanasie  

P0 P7 P21 P28

♀ •  Réponse humorale

(IgG anti-OVA dans sérum)

•  Réponse cellulaire (rate et MLN) Res1mula1on  in  vitro  +/-­‐OVA  10  µg/ml  

10

2. Protocole d’immunisation

Sensibilisa1on  OVA/CFA    100  µg  

Boost  OVA/CFA  

Euthanasie  

P0 P7 P21 P28

Gavage    •   bicarbonate  buffer    

Réponse humorale à J25 (sevrage) suite à un protocole de tolérance orale ou d’immunisation à l’OVA

Tolérisés Immunisés

0

250

500 Control BPA 5µg/kg/d

An

ti-O

VA

Ig

G t

iter

s x

103

Ø   L’exposi1on  périnatale  au  BPA  n’affecte  pas  la  réponse  en  IgG  an1-­‐OVA  chez  les  anx  tolérisés  ou  immunisés  à  l’OVA  chez  la  descendance  juvénile  à  J25  

F1 : J25 Réponse IgG anti-OVA

♀

11

Réponse cellulaire dans la rate et les MLNs à J25

0

100

200

300

pg/m

l

Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

0

1000

2000

pg/m

l

Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

IL-10

L’exposi1on  périnatale  au  BPA  conduit  à  une  ne%e  diminu)on  de  la  produc)on  d’IFN-­‐γ  spécifique  OVA  par  les  splénocytes  

et  les  cellules  des  MLNs  

Control BPA 5µg/kg/d

IFNγ

0

250

500

* §

§ §

* §

pg/m

l

Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

0 5

10 15 20 25 30 35 40 45

*

§

*

pg/m

l

Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

Rate     MLN  

F1 : J25

♀

12

Effets sur les sous-populations de lymphocytes T et cellules dendritiques à J25 dans la rate et les MLNs

L’exposi1on  périnatale  au  BPA  diminue  les  lymphocytes  Th  (auxillaires)/Treg  et  les  sous-­‐popula)ons  de  cellules  dendri)ques  dans  la  rate  et  les  MLNs  

chez  la  descendance  à  J25  

Lymphocytes  T  auxillaires  

F1 : J25

♀

13

Control

BPA 5µg/kg of BW/d

Cellules    dendri)ques    

Rate     MLN  

Lymphocytes  T  régulateurs  CD4+CD25+FoxP3+  

•  Solvant (huile de maïs) •  BPA [0; 0.5; 5; 50µg/kg bw/d]

G15

nais

sanc

e (G

23)

Sevrage (J21)

Lactation Gestation

Conséquences d’une exposition à de faibles doses de BPA pendant la période périnatale sur la tolérance orale à l’âge

adulte

Adulte F1 J45 ♀

14

Ø  Protocole d’induction de la tolérance orale et immunisation (OVA)

2014

Mesure de la perméabilité intestinale

Electrical  resistance  

Perméabilité  Intes)nale  :  mesure  dans  les  chambres  de  Ussing  

Dextran-­‐FITC  4  000  Da  

 HRP      

40  000  Da   DP   Isc  

Coté muqueux (lumen)

Coté séreux (blood)

 fragment  jéjunal    

Chambre  de  Ussing  

15

Effets d’une exposition périnatale au BPA sur la perméabilité jéjunale

Dextran  4kDa-­‐FITC    

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45

Per

mea

bil

ity

cm

/s x

10-

6

BPA (µg/kg/d) - 0.5 5 50

*† *†

(TDI)

HRP  intacte  40kDa    

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12

Per

mea

bil

ity

cm

/s x

10-

7

***

- 0.5 5 50

(TDI)

BPA (µg/kg/d)

* *

L’exposi1on  périnatale  au  BPA  diminue  la  perméabilité  intes)nale  chez  la  descendance  en  suivant  une  courbe  dose/réponse  non  linéaire  

Adulte F1 J45

♀

16

L’exposition périnatale au BPA exacerbe la réponse humorale

Tolérisés   Immunisés  

0

250

500

750 x 10-3

BPA (µg/kg/d) - 0.5 5 50 - 0.5 5 50 (DJA)

(DJA)

OV

A-s

pec

ific

Ig

G t

iter

*

* *

Ø   Les  1tres  IgG  an1-­‐OVA  dans  les  deux  groupes  (tolérisés  et  immunisés)  sont  significa1vement  plus  élevés  chez  tous  les  animaux  

exposés  périnatallement  au  BPA  comparés  aux  anx  contrôles  Ø   Hypers)mula)on  de  la  réponse  immunitaire    

Adulte F1 J45

♀

17

22% ±4% 16% ±1.6%

*

0 2 10 3

10 4 10 5

10 2 -10

0 10 2

10 3

10 4 10 5

-10 2

CD62L-APC C D 4

4 - P E

CONTROL

0 2 10 3

10 4 10 5

10 2 -10

0 10 2

10 3

10 4 10 5

-10 2

CD62L-APC

C D 4

4 - P E

BPA 5µg/kg bw/d Lymphocytes  T  ac)vés  CD4+CD44highCD62Llow  

0.9% ± 0.1 1.01% ± 0.1

0 2 10 3 10 4 10 5 10 2 -10

0 10 2

10 3

10 4 10 5

-10 2

FoxP3-A660

C D

2 5 - P

E

0 2 10 3 10 4 10 5 10 2 -10

0 10 2

10 3

10 4 10 5

-10 2

FoxP3-A660 C

D 2 5

- P E

CONTROL BPA 5µg/kg bw/d

Lymphocytes  T  régulateurs  CD4+CD25+FoxP3+  

L’exposi1on   périnatale   à   5   µg/kg  bw/d  of  BPA    :     -­‐   augmente   la   fréquence   des  lymphocytes   T   ac)vés   dans   la  rate  -­‐   Pas   d’effet   sur   la   fréquence  des   lymphocytes   T   régulateurs  dans  la  rate  

Adulte F1 J45

♀

18

L’exposition périnatale au BPA augmente la fréquence des lymphocytes T activés spléniques

Control BPA 5µg/kg/d

0.00

0.25

0.50 *§

§

§

OD

490

nm

Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

NS

Proliféra)on  cellulaire  des  splénocytes  

L’exposi1on   périnatale   au  B P A   i n d u i t   u n e  augmenta)on   significa)ve  de   la  proliféra)on  cellulaire  chez  les  anx  tolérisés  à  l’OVA  

Sécré)on  des  cytokines  (splénocytes)  IL-10

0

200

400

600

800

pg/m

l Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

IFN-γ

Tolérisés Immunisés

OVA - + - +

0

100

200

300

§

*§

§ pg/m

l

NS

•   L’exposi1on  périnatale  au  B P A   i n d u i t   u n e  augmenta)on   significa)ve  de   l’IFN-­‐γ   en   réponse   à  l’OVA  chez  les  anx  tolérisés  et  immunisés  OVA  •   Pas  d’effet  sur  la  réponse  IL-­‐10    

§ compared to tolerized

* Compared to control

Adulte F1 J45

♀

L’exposition périnatale au BPA exacerbe la réponse cellulaire spécifique OVA dans la rate

Challenge Oral (5 µg/kg/j)

Gavage    • OVA  (Tolérisés)  

• Buffer  (Immunisés)  

Immunisa1on  OVA/CFA    25  µg  

D0  

Challenge  Oral  50mg  OVA  

1   2   3   4  

D7   D14   D16   D18   D20   D22+1H  

Euthanasie  Echan1llon  Colon  

D22  

5  

MPO  

0

100

200

300

400 *

U/g

of

prot

ein

Tolérisés Immunisés

BPA - + - +

0

10

20

30

40 *

§ compare aux anx tolérisés

* compare aux anx contrôles

pg/m

g of

pro

tein

§

Tolérisés Immunisés

BPA - + - +

IFNɤ  TGFβ  

0

100

200

300

*

§

§

pg/m

l

Tolérisés Immunisés

BPA - + - +

Ø   L’exposi1on  périnatale  au  BPA  favorise  l’inflamma)on  colique  suite  à  un  challenge  oral  répété  à  l’OVA  

Adulte F1 J45 ♀

20

Ø     L’exposi)on  périnatale  à  de  faibles  doses  de  BPA  affecte  l’homéostasie  immunitaire  chez  la  descendance  et  prédispose  l’adulte  à  l’intolérance  

alimentaire  

21

Jeunes rats F1 : J25 (sevrage)

♀ An2gènes  alimentaires  (OVA)  

BPA  affecte  l’homéostasie  immunitaire    

§   ↘    de  la  sécré1on  IFNγ    spécifique  OVA  §   Pas  d’impact  sur  la  réponse  humorale  §   Diminu1on  de  la  fréquence  des  Th/Treg  et  des  cellules  dendri1ques    

Cellules  immunitaires  

BPA    diminue  la  perméabilité  transcellulaire  

BPA  affecte  la  tolérance  orale  et  l’immunisa)on      

•   Augmenta1on  des  IgG  an1-­‐OVA  •   Augmenta1on  de  la  sécré1on  d’IFN-­‐γ  spécifique  OVA  •   Augmenta1on  de  l’inflamma1on  colique  (MPO  and  IFNγ)  suite  à  un  challenge  oral  et  diminu1on  du  TGF-­‐β

Adulte F1 : J45 ♀

Lamina  propria  

Endosome  

An2gènes    alimentaires  

(OVA)  

Lysosome  

Dégradés  

 Intactes  

Gut  lumen  

Transcellular

Conclusion

Sandrine Ménard Corinne Lencina

Mathilde Leveque Lara Moussa

Cherryl Harkat Maïween Olier

Vassilia Théodorou

TRI - M2C Thierry Gauthier « Plateau technologique d'imagerie cellulaire & cytométrie »

EZOP Caroline Sommer Patrice Rouby

Laurence Guzylack-Piriou Viorica Braniste Christel Cartier Soraya Sekkal Eric Gaultier

Eric Houdeau

PERINATOX ANR-10-CESA-005

Neuro-Gastroentérologie & Nutrition

Développement Intestinal, Xénobiotiques & ImmunoToxicologie

CONFLITS D’INTÉRÊT

•  Intérêts financiers : néant

•  Liens durables ou permanents : néant

•  Interventions ponctuelles : néant

•  Intérêts indirects : néant

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