Cytogénétique - 10/02/2000 Nora Chelloug -...

HémochromatoseNora Chelloug

Cytogénétique - 10/02/2000

Hémochromatose - 10/02/2000

INTRODUCTIONINTRODUCTION

� Hémochromatose génétique ouhéréditaire

� Maladie autosomique récessive� Surcharge progressive en fer

� Accumulation dans parenchyme decertains organes (foie, surrénales,cœur…)

� Apparition d ’insuffisancesfonctionnelles



� Mécanisme physiopathologique ? =augmentation de l ’absorptionintestinale du fer

� Maladie rare = la plus commune dansles populations d ’Europe du Nord

� Prévalence = 1/300 (1/200) :homozygotes atteints

10 % d ’hétérozygotes (1/8 : populationscaucasiennes)



� Identification récente du gène HFEet de la mutation C282Y

� Confirmer la prévalence, l’ethnie, lemode de transmission

� Diagnostic simple, spécifique

� Stratégie par un dépistage

systématique de masse


CLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitiveCLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitive

� Hémochromatose héréditaire - HFE lié

= C282Y, HLA, H63D ?

� Hémochromatose héréditaire - HFE non

lié = ∅ C282Y, HFE2 ?

� Hémochromatose juvénile (nouveau-né,

enfant) = ∅ C282Y, ∅ HLA


CLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitiveCLASSIFICATIONSurcharge ferrique primitive

� Surcharge ferrique de l’Africain etde l ’Américain noir = ∅ C282Y

� Hyperferritinémie - Saturationnormale = C282Y, H63D (2/3)

� Hyperferritinémie - Cataracte


CLASSIFICATIONSurcharge ferrique secondaireCLASSIFICATIONSurcharge ferrique secondaire

� Thalassémie majeure

Sphérocytose héréditaire

=

érythropoïèse inefficace

� Alcool

� Porphyrie cutanée tardive = C282Y(homozygote, hétérozygote)


CLINIQUECLINIQUE

� Précoce� Diabète, hypogonadisme

� Sécheresse ichtyosiforme, déformationdes ongles, cheveux fins

� Myocardite, arthralgie (2ème, 3èmeMCP)

� Asthénie, hépatomégalie,

� Transaminases ➚ , hypersidérinémie


CLINIQUECLINIQUE

� Tardif� Mélanodermie� Insuffisance cardiaque, rhumatisme

chronique� Cirrhose, hépatocarcinome� ➚ Fer périportal → ➚ Fer

intrahépatocytaire

→ Fibrose = constante (réserve en fer = 10 x VN

Fer serrique > 1000 µg/l)


CLINIQUECLINIQUE

Intérêt du diagnostic précoce

Prévention = Saignée-------------------------

Rq : 90 % H : homozygotes C282Y

70 % F : homozygotes C282Y

développent la maladie en absencede traitement


DIAGNOSTIC BIOLOGIQUEDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE

� Indications� Hépatomégalie, pigmentation cutanée,

asthénie� Cardiomyopathie

� Diagnostic d ’orientation� Bilan martial :

� Fer serrique : > 35 µmol/l� Coefficient de saturation de latransferrine (CST) >0,60 H, >0,50 F� Ferritinémie : > 300 µg/l H, > 400µg/l F



� Transaminases : SGOT ➚ , SGPT ➚� Groupage HLA =

� HLA A3� 25% population générale� 75% hémochromatose

� HLA B14

Rq = CST normal - Ferritine ➚� Traitement = oestroprogestatif� Hyperthyroïdie� Syndrome inflammatoire� Alcool



� Diagnostic de certitude

� Ponction biopsie hépatique

� Concentration hépatique en fer (=CHF) :

> 100 µmol/g de tissu sec

� Ratio : CHF / AGE (> 2)


GENETIQUE MOLECULAIRELE GENEGENETIQUE MOLECULAIRELE GENE

Historique� 1975

� Localisation chromosomique = 6p21� Liaison avec gènes du complexe

majeur d ’histocompatibilité : HLA - A

� 1996� Découverte du gène� Hypothèse

� Effet fondateur d ’une mutation� Déséquilibre de liaison



� Gène / marqueurs polymorphes (45)

� Région de 6 mégabases

� Haplotype ancestral (sujets malades)

� Haplotype Commun = région restreinte = 250 Kb

� Séquençage

� 15 gènes inconnus

� 1 mutation préférentielle (malades / témoin)



Gène candidat� HLA - H = HFE (nomenclature

internationale)� Séquence d ’ADN = 12 Kb� CDNA (partie codante) = 2,4 Kb� 7 exons� Expression ubiquitaire (sauf cerveau)


GENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONSGENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONS

� C282Y� 282 (cystéine / tyrosine)� Absente : Asie, Afrique, Finlande� USA (juifs séfarades)� Europe

� Gradient décroissant (Nord/Ouest,Sud/Est)� 20% hétérozygotes - Irlande� 3% hétérozygotes - Italie

� Mutation Nord-européenne� Fréquence dans population générale = 6%


GENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONSGENETIQUE MOLECULAIRELES MUTATIONS

� H63D� 63 (histidine / acide aspartique)� Polymorphisme ? Mutation mineure ?� Fréquence élevée dans population

générale = 17%� Mais : > 50% sujets atteints

Rq = fréquence des hétérozygotes = 1/17


GENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINEGENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINE

� Protéine� 348 AA� Protéine transmembranaire� Structure primaire connue� Homologie avec HLA-A2

� Rôle ?� Récepteur d ’un ligand fixant le fer� Signal de transduction� Système immunitaire (expressionHLAI sur membranes)


GENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINEGENETIQUE MOLECULAIRELA PROTEINE

� Cystéine : rôle dans maintien destructure tertiaire du domaine α3

� Conformation essentielle à

l ’interaction de chaîne α avec B2

microglobuline

� Mutation C282Y = destruction du pontdisulfure indispensable à cette liaison


DIAGNOSTIC MOLECULAIREDIAGNOSTIC MOLECULAIRE

� Diagnostic simple = techniquesclassiques de biologie moléculaire

� Altération de sites de restrictionsenzymatique par les deux mutations =C282Y - H63D

� Méthode :� Sang total (EDTA : 5 ml)� Extraction d ’ADN

Rq : Consentement écrit indispensable (loi = article L145-

15 - loi du 29 juillet 1994)



� PCR = Amplification simultanée desdeux fragments d ’ADN

� Digestion enzymatique = 2 enzymes derestriction = RSAI, BCLI

� Migration : électrophorèse = Geld ’agarose



PCR = principe de base

5 ’

A T C G C T T

T A G C G A A

3 ’

3 ’ 5 ’

ADN = Double brin



PCR = principe de base5 ’ Dénaturation = 94°C

ADN : simple brinA T C G C T T

C G A A

3 ’

3 ’ 5 ’*5 ’

A T C

T A G C G A A

3 ’

3 ’ 5 ’

Séquence d ’acidenucléique = amorce(15 à 17 nucléotides)

* Fixation des amorces = 57°C (température d ’annealing)

* Elongation = 72°C

Ezyne TAQ polymerase



PCR = principe de base5 ’

A T C G C T T

T A G C G A A

3 ’

3 ’ 5 ’

5 ’

A T C G C T T

T A G C G A A

3 ’

3 ’ 5 ’



Digestion enzymatiqueRSA I

ADN normal5 ’

G T C C

C A G G

3 ’

3 ’ 5 ’

G T C C

C A G G→1 fragment



Digestion enzymatique

ADN mutéCréation d ’un sitede restriction

5 ’

G T A C

C A T G

3 ’

3 ’ 5 ’

G T A C

C A T G

*

2 fragments

*


DIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIRDIAGNOSTIC : CONDUITE A TENIR

� Bilan biologique perturbé

� CST (++)� Ferritine� Tests hépatiques fonctionnels normaux� Eliminer une cause secondaire

surcharge fer



Diagnostic génotypique

Homozygote hétérozygote composite hétérozygote → hyperferritinémieC282Y / C282Y C282Y /H63D C282Y/normal un peu élevé

homozygote hétérozygote → non en faveur duH63D / H63D H63D / normal diagnostic

Confirme le compatible avec une Enquête familialediagnostic hémochromatosed’hémochromatosehéréditaire( degré de ferritinémie) Examens complémentaires = IRM) Ponction biopsie hépatique

(CHF / AGE)IRM --> diagnostic de certitude



Diagnostic génotypique

Enquête familiale

- 2 individus hétérozygotes → 1/4 enfant atteint

- 1 individu homozygote 1/20 enfant atteint + → - 1 individu hétérozygote


CONCLUSIONCONCLUSION

� Questions ?� Pénétrance

� Expressivité variable de la maladie� Sujets homozygotes C282Y = absencedu tableau classique� Fréquence élevée en Bretagne etIrlande des hétérozygotes = 17 à 20 %

→ Fréquence théorique de lamaladie =

1/100 à 1/150� Rôle de facteurs génétiques associés



� Dépistage de masse� Caractéristiques :

� Sévérité clinique� Caractère invalidant� Mortalité� Fréquence élevée� Méthode simple de diagnostic

� Etude de la protéine� Meilleure compréhension de laphysiopathologie



� Hémochromatose héréditaire non HFElié

� Autres mutations ?

� Introns

� Séquences régulatrices

� Autres gènes ?

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