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Biologie générale II Cahier de laboratoires 17

CULTURE IN VITRO

«L'intérêt actuel pour les biotechnologies, qui se manifeste dans la plupart des pays industrialisés ou qui aspirent à l'industrialisation, repose sur la quasi-certitude d'une autre révolution industrielle qui aura, par définition, des effets profonds sur la structure des économies. Les pays qui accèderont aux savoirs et au savoir-faire afférents aux biotechnologies seront aussi ceux qui se montreront les plus aptes à prendre en main leur destin économique; ceux qui se laisseront devancer risquent de compromettre gravement leur sécurité économique nationale.» (Conseil des sciences du Canada)

«Étant donné cette perception de l'importance des enjeux, il a été irresponsable de la part des pouvoirs publics québécois de ne pas définir une politique et des objectifs en matière de développement des biotechnologies au Québec. Le secteur biotechnologique québécois est ainsi devenu l'un des secteurs technologiques de pointe dont la programmation des mesures d'intervention est la plus élaboré.» (Le virage technologique. Bâtir le Québec - Phase 2.)

«Un des facteurs importants dans le développement des biotechnologies est le nombre de praticiens formés dans les disciplines scientifiques qui alimentent les biotechnologies. Quoique les praticiens soient formés principalement dans les universités, il n'en reste pas moins qu'une approche dans le domaine au niveau collégial pourrait être le creuset où prendrait naissance de futurs biotechnologistes.»

C'est précisément l'objectif que veut réaliser, modestement, ce laboratoire sur la culture de cellules végétales.

Buts • Connaître un des grands domaines des biotechnologies. • Pratiquer la multiplication végétative in vitro. • Appliquer les techniques propres à la propagation in vitro. • Acquérir des connaissances sur la culture de tissus végétaux.

À lire : Starr, C. et Taggart, R. Biologie générale, pages


Théorie La culture in vitro ou culture de tissus se définit comme l'ensemble des techniques qui

permettent de faire croître en milieu artificiel (en éprouvette) des cellules spécialisés, par exemple des cellules animales comme la peau humaine ou des cellules végétales, ce qui représente une grande variété de tissus.

Par opposition à la culture en terre ou dans des substrats imbibés de solution nutritive, la culture in vitro se fait en laboratoire à l’abri de toute contamination cryptogamique, dans des récipients qui peuvent être tant des tubes à essai que des bocaux à conserve. Ces récipients sont placés dans un endroit où l'intensité de la lumière, la durée de l'illumination, la température et l'hygrométrie sont constamment contrôlées.

Afin de mieux comprendre la culture in vitro des tissus végétaux, il faut posséder quelques notions sur la reproduction des végétaux. La reproduction chez les végétaux peut se faire de 2 manières :

- la multiplication sexuée, à l'aide d'échanges génétiques : gamètes mâles X gamètes femelles = graine

- la multiplication asexuée comme par bouturage où un seul petit fragment de tige ou de feuille peut redonner après développement, une plante entière. C'est précisément ce type de multiplication végétative qui est mis en pratique dans la culture in vitro de manière accéléré à l'abri de toutes contaminations par des bactéries ou par des champignons.

La culture in vitro végétale est possible parce que les cellules végétales présentent la

potentialité de reproduire des individus complets identiques à la plante sur laquelle les cellules ont été prélevées. Cette propriété a été baptisée «totipotence cellulaire». La cellule animale présente aussi cette capacité mais à un degré moindre. Toutes les cellules d'un même organisme renferment dans leur noyau exactement les mêmes chromosomes, l’information génétique pour reconstruire l’organisme entier. Ce message héréditaire représente toutes les potentialités de l'individu. Cependant, à un moment donné de la vie embryonnaire, un choix va se faire, dans un groupe de cellules données, destiné à former un organe ayant une forme et une fonction précise. Une grande partie du message héréditaire va être mise en sommeil, dans un autre groupe, destiné à une autre fonction, c'est une autre partie du message qui sera occultée.

Le développement à partir d'une cellule simple va se faire par de nombreuses divisions

cellulaires (mitose) et par le blocage ou le déblocage de certains gènes, les cellules orienteront leur développement vers une voie particulière qui formera soit un tissu, soit un organe ou autres éléments nécessaires à la future plante.


Ce sont des inhibitions sélectives qui provoquent la différenciation entre les cellules et leur spécialisation. Toutes les cellules contiennent en puissance la totalité de l'organisme, mais elles n'en expriment qu'une partie. Cependant, contrairement aux cellules humaines ou animales, certaines cellules végétales ont le don de se déspécialiser et de redevenir capables d'engendrer un organisme entier. C'est précisément cette faculté que l'on exploite dans la propagation in vitro de plusieurs plantes. Les cellules végétales appartiennent à des tissus très spécialisés qui possèdent la possibilité de se déspécialiser, formation d'un CAL, et redevenir capables d'engendrer une plante entière en recommençant tout le processus de spécialisation (blocage et déblocage).

Afin de réaliser la culture in vitro de tissus végétaux, il est important de respecter les

étapes de mêmes que les différentes conditions nécessaires, le choix de l’explant et le milieu de culture.

Les explants

L’explant est une petite partie ou fragment du plante-mère, qui est mis en culture dans l’éprouvette. L'état sanitaire de cette plante conditionne la nature de l'explant.

- Si le plant-mère est malade, virosée, alors il faudra prélever un explant constitué de cellules méristématiques. Ce type d'explant est appelé indifférencier.

- Si le plant-mère est en santé, alors d'autres types d'explant pourront être

prélevés, c’est explants sont appelés différenciés. Cependant, il est important de noter que d'autres facteurs vont conditionner les

réactions de l'explant, l'âge ou le stade physiologique du plant-mère, la structure, la taille et l'emplacement de l'explant lui-même. En effet, des explants différents prélevés sur une même plante donnent des résultats différents sur un milieu identique.

L’explant peut être prélevé sur n'importe quelle partie du plant-mère à condition de

renfermer des tissus vivants et de tenir compte de l’état du plant. Il y a plusieurs sortes d'explants,

- Les explants indifférenciés sont prélevés à l’apex de tige, de racine, de bourgeons, de nœuds

- Les explants différenciés sont prélevés sur la tige, la feuille, la racine. Ces

explants sont des structures constituées de cellules très spécialisées qui devront se déspécialiser avant de pouvoir régénérer la plante entière.


Le milieu de culture

Le milieu de culture est important pour la croissance. Il est le plus souvent une solution aqueuse rendue semi-solide ou moyen de gélose (agar). Remplaçant le sol et suppléant la plante, il doit contenir différents éléments. Très généralement il est composé d’une base comprenant des sucres (énergie), des éléments minéraux divers, des régulateurs de croissance, des vitamines (complexe B), des composés organiques (acides aminés, polypeptides, …). La concentration de ces composés peut varier d'une espèce à l'autre, mais ces variations n'ont qu'une incidence faible sur les réactions des cellules. Les facteurs essentiels sont les régulateurs de croissance qui stimuleront la multiplication cellulaire et orienteront la morphogenèse.

Dans le milieu de culture, on retrouve des substances qui sont :

- soit endogènes, c’est-à-dire qu’elles sont produits par la plante - soit exogènes, c’est-à-dire des substances de synthèse ou artificiel mais dont

l'effet est similaire. Les principales substances (régulateur de croissance) utilisées pour la culture in vitro

sont les auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Leurs effets varient avec les concentrations utilisées et le dosage, à doses élevés, ils peuvent se montrer inhibiteurs ou toxiques.

Dans la famille des auxines, on retrouve l’acide indolyocétique (AIA) et les substances

de synthèse à action analogue comme l'acide naphtylacétique (ANA), l'acide indolybutyrique (AIB) ou l'acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4D). Ces substances possèdent de nombreuses propriétés.

- Activent la multiplication cellulaire (mitose) - Amènent la formation de racines (rhizogénèse) - Stimulent le métabolisme

Dans la famille des cytokinines, certaines sont des composés endogènes comme la

zéatine et l'isopentényladénine (IPA), ou de synthèse comme la benzyladénine (BA) ou la kinétine.

- Agissent en synergie avec les auxines avec un effet stimulant sur le métabolisme et sur la division cellulaire. Si de fortes concentrations de cytokinines sont combinées à des concentrations plus faibles d'auxines, les cytokinines

- Agissent en synergie avec les auxines - Activent la multiplication cellulaire (mitose) avec la formation d'un cal


Dans la famille des Gibbérellines on retrouve que des substances endogènes. La plus utilisée est l'acide gibbérellique (GA3). Les gibbérellines seront utiles dans les cas ou seule la croissance est souhaitée.

- Stimulent l'élongation cellulaire et la multiplication cellulaire - Elles peuvent rendre les cellules plus sensibles à l'action des auxines

Comportements des deux grands types d'explants dans le milieu de culture

Pour les explants indifférenciés, lorsqu’ils sont disposés sur le milieu approprié, on observe rapidement une cicatrisation de la blessure. Il se produit alors la différenciation ou la spécialisation. Par la suite, plusieurs modalités sont possibles :

- la plus simple, (œillet ou chrysanthème) un seul milieu contenant une auxine et une gibbérelline suffira pour assurer la croissance de la jeune plante jusqu'au stade d'acclimatation. Dans ce cas, l’auxine et la gibbérelline assurent la croissance de la jeune tige qui émettra ensuite des racines.

- la plus complexe, (rosier ou pommier) une succession de milieux est nécessaire

pour assurer les différentes étapes de la morphogenèse. Pour les explants différenciés, ils doivent effectuer un retour à l'état méristématique.

Après le repiquage on observe la formation du tissu cicatriciel (le cal), qui procédé la multiplication cellulaire. Il se produit la dédifférenciation ou la déspécialisation qui sera suivit d'une différenciation ou d'une spécialisation. Si cette phase se réalise, plusieurs voies sont possibles selon les espèces.

- la première est la voie de la callogenèse dans laquelle les cellules se multiplient activement, forment un massif globuleux et sont plus ou moins fortement liés. Ce stade qui constitue la première étape du retour peut être le seul atteint, ensuite, quel que soit le milieu, il n'est pas possible d'obtenir de néoformations de bourgeons. Quelquefois cette phase est un préalable à l'organogenèse.

- la seconde voie qui parcourt toutes les étapes et conduit à l’état méristématique soit à partir du cal ou de certaines cellules épidermiques.

- la troisième voie est celle qui conduit à la formation d'embryons somatiques (les clones). Elle peut se produire après la formation d'un cal ou bien directement à partir de quelques cellules ou de cellules isolés. Les embryons somatiques mis en culture sur un milieu de croissance redonnent une plantule identique au pied-mère. C’est le cas de la violette africaine.

Dans ce type d'explant, il faut noté que le comportement est conditionné par d'autres

facteurs comme l'âge du plant-mère, les dimensions de l'explant, la manière de placer l'explant dans le milieu de culture, l'exposition du plant-mère à la lumière, …


Comportement de l’explant différencié (feuille) dans un milieu de culture de multiplication riche en kinétine cytokinine et pauvre en auxine

Feuille Explant Multiplication cellulaire intense (mitoses) Renflement (cal) couleur plus pâle que la feuille

Microfeuilles «Microplants»

Cellules spécialisées

⇓ Tissus

spécialisés

Cellules spécialisés

⇓ Tissus

spécialisés

⇓

CAL

Ce qui se passe

Cellules spécialisées

et Tissus

spécialisés

Différenciation ou

Déspécialisation ou

Simplification

Cellules simples ⇓

Tissus simples ⇓

Tissus méristématiques

Différenciation ou

Spécialisation ou

Complexification

Bourgeons microscopiques

⇓ Bourgeons

et Microfeuilles

⇓ Cellules

spécialisées ⇓

Tissus spécialisés

Multiplication cellulaire intense (mitoses) Environ 6 semaines

Dans un milieu de culture nécessaire à la rhyzogenèse, formation des racines, celles-ci font leur apparition quelques semaines après que les microplants y soient placés. Ce milieu de culture est plus riche en auxine et il y a une absence de kinétine (cytokinine),


Milieu de culture et croissance des explants Ce que vous avez fait lors de l’expérimentation a consisté à prélever des explants de

feuille et de tige, à les stériliser et à les placer sur un milieu de multiplication expérimentale et un milieu témoin. Milieu expérimental

Les milieux de multiplication utilisés pour les explants de feuille et de tige ont été mis au point par MURASHIGE & SKOOG.

Voici la composition chimique de ces milieux :

Composition chimique Milieu témoin

Milieu expérimental

Milieu rhizogénese

mg/L mg/L mg/L • NH4N03 1650.0 1650.0 1650.0 • KNO3 1900.0 1900.0 1900.0 • CaCl2 • 2H2Oa 440.0 440.0 440.0 • MgSO4 • 7H2Ob 370.0 370.0 370.0 • KH2PO4 170.0 170.0 170.0 • Na2 • EDTA 37.3 37.3 37.3 • FeSO4 • 7H20 27.8 27.8 27.8 • H3B03 6.2 6.2 6.2 • MnSO4 • H20 16.9 16.9 16.9 • ZnSO4 • 7H20 8.6 8.6 8.6 • KI 0.83 0.83 0.83 • Na2MO4 • 2H2O 0.25 0.25 0.25 • CuSO4 • 5H2O 0.025 0.025 0.025 • CoCl2 • 6H2O 0.025 0.025 0.025

Sels minéraux

Total: 4,628.00 4,628.00 4,628.00 • Phosphate de sodium monobasique 170.0 170.0 170.0 • Sucrose 30 000.00 30 000.00 30 000.00 • Sulfate d'adénine • 2H2O 80.00 80.00 80.00

Autres

• Agar 8 000.00 8 000.00 8 000.00 • IAA 0 0.10 1.00 • Kinétine 0 10.00 0 • 1-inositol 100.00 100.00 100.00 • Thiamine HCl 0.40 0.40 0.40

Hormones

• Tampon (phytion TM) pH 7±0.1 159.0 159.0 159.0


Les explants que vous allez mis en culture dans le milieu expérimental (multiplication) vont être soumis à l'action de régulateurs de croissance (hormones), particulièrement à l'action d'une kinétine et secondairement à l'action d'une auxine (IAA). La seule différence qui existe entre le milieu témoin et le milieu expérimental (multiplication) est l'absence de régulateurs de croissance (hormone).

Suite à 4 ou 5 semaines de croissance, vous devriez observer dans les éprouvettes

expérimentales, la présence de petits bourgeons, de micro-feuilles ou de micro-plants dépourvus en grande partie de racines. Souvenez-vous que les racines sont produites en réponse à l'action d'AUXINE (hormone) en concentration relativement élevée. Cependant, en laissant les micro-plants encore quelques semaines supplémentaires en éprouvettes, vous observeriez l’apparition de petites racines résultant de l'action d’une AUXINE ENDOGÈNE synthétisée par les micro-feuilles qui sont capables, à ce moment, d'élaborer plusieurs éléments essentiels à leur croissance.

Si vous désiriez, comme dans l'industrie, obtenir des racines rapidement, vous pourriez

transférer les micro-plants, qui ont peu ou pas de racines, dans un second milieu de culture. La caractéristique principale de ce milieu est qu'il est surtout riche en AUXINE (1.00mg/L) et la KINÉTINE est totalement absente c’est un milieu pour la RHIZOGÉNESE.


Expérience Par équipe (2 étudiants), sans bijoux et montre et les mains extrêmement propre.

Matériel

• flux laminaire ou équipement similaire • plant de violette africaine • six (6) tubes de milieu de culture • eau désionisée stérile (bocaux) • scalpel et pince • deux (2) pinces • un brûleur et briquet • béchers • alcool éthylique (70% v/v) • boîtes de Pétri stériles • hypochlorite de sodium (1% v/v) • agent mouillant (Triton 80) • agitateur magnétique • pipette pasteur • Pince à ensemencement • chronomètre • milieux de culture de Murashige (expérimental et témoin) spécifique pour la violette africaine Manipulation

En groupe de 6, 3 équipes de 2

a) Prélèvement de l'explant - Choisir un plant de violette africaine en parfaite santé (vigoureux) - Sélectionner une jeune feuille et la sectionner à l’aide du scalpel. Garder à cette

feuille son pétiole. (1 par équipe)

- Identification des éprouvettes sur une zone apparente, les initiales, la date, l’explant F (feuille) T (tige), et particularité E (expérimental) T (témoin) avec # (1, 2, 3) si plusieurs (voir p.24 schématisation). (1 par équipe)

b) Stérilisation de l'explant

- Déposer la feuille munie de son pétiole dans 400ml d'une solution d'hypochlorite de sodium (l% v/v) contenant deux ou trois gouttes de Triton 80. Ajouter les feuilles des 3 équipes en même temps.

- Agiter constamment la solution au moyen d'un agitateur magnétique pendant une

période de six (6) minutes, pour bien stériliser les tissus. S’assurer que les feuilles soient bien immerger. (1 par groupe)


Après une période de 5 minutes 30 secondes, le bécher de stérilisation est transféré dans un milieu totalement aseptique, c’est-à-dire dans le flux laminaire. Toutes les manipulations ultérieures devront s'y effectuer.

Aseptie Aseptie Aseptie

c) Lavage de l'explant

- À l'intérieur de l'enceinte du flux laminaire, retirer à l'aide des pinces qui auront été préalablement stérilisés dans la flamme du brûleur, les feuilles et les déposer successivement dans trois (3) bocaux contenant de l'eau désionisée stérile, 15 seconde par bocaux. Bien agiter à chaque passage dans l’eau stérile. (1 par groupe)

d) Préparation de l'explant pour sa mise dans le milieu de culture

- Retirer les explants du dernier bocal d'eau stérile et les déposer dans 3 boîtes de Pétri stériles. (1 par groupe même que c)

- À l'aide d'un scalpel et d'une pince, séparer la feuille du pétiole. (1 par équipe) - Découper en vous servant d'un scalpel et d'une pince un «explant de feuille» dont les

dimensions sont d’environ de 10 mm x 10 mm. Attention de ne pas brûler ou abimer l’explant. Vous inspirez du modèle suivant :

- Déterminer ensuite un «explant de tige» ou de pétiole en sectionnant avec le scalpel

une rondelle d'environ 5 mm de longueur. Il est préférable, tout d'abord, d'éliminer la première rondelle produite. Attention de ne pas brûler ou abimer l’explant. Vous inspirez du modèle suivant :

- Toujours à l'intérieur de l'enceinte du flux laminaire, prendre un tube de milieu de

culture et passer son ouverture, pendant quelques secondes, dans la flamme du brûleur et éliminer la condensation pouvant s’y être accumuler. Répéter cette opération pour les 6 tubes de l’équipe.


e) Mise en culture de l'explant et installation pour croissance - Toujours à l'intérieur de l'enceinte du flux laminaire, prendre un tube de milieu de

culture et passer son ouverture, pendant quelques secondes, dans la flamme du brûleur.

- Tout en conservant dans une main le tube, prendre, à l'aide d'une pince

d’ensemencement pré-flambée, un explant et l'enfoncer légèrement dans la gélose du milieu de culture contenu dans le tube. Attention de ne pas brûler ou abimer l’explant. Flamber de nouveau l'ouverture du tube et y mettre le bouchon.

- Recommencer la même procédure pour tous les explants. (chaque équipier met en

culture 3 explants) - Les tubes de culture sont disposés dans la biotronette qui assure le maintien des

conditions de croissance. f) Croissance et observations

- Observer à chaque semaine, pendant environ six (6) semaines, les explants. Autant que possible, essayez de faire vos observations à travers les vitres de la biotronette afin de minimiser les risques de contaminations. Regrouper vos observations sur une feuille d'observation.

Premiers jours : Observez s’il y a des contaminations causées par les champignons Observez s’il se produit une dégénérescence de l’explant

Les jours suivants : Observez s’il a des contaminations causées par des bactéries Observez s’il se produit de la dégénérescence au niveau de l’explant Observez l’apparition du cal (renflement) Observez l’apparition des micro feuilles… des micro plants Observez l’apparition des racines (possible dans le milieu I)

Il est important de vérifier la disposition des tubes dans la biotronette. L’explant doit toujours être orienté vers la lumière des fluorescents

Lumière

- Normalement au bout de cette période de six (6) semaines, des micro-plants

devraient être visibles dans les tubes de culture. Après une période de trois mois, les plants sont prêt à mettre en terre.


Schématisation des ensemencements à effectuer Prélever les explants témoins de feuille et de tige de même que les explants

expérimentaux de feuille et de tige sur la même feuille FT FE-1 FE-2 FE-3 TT TE-1 Témoin (T) Expérimentaux (E) Témoin (T) Expérimentaux(E)

Explants de feuille (F) Explants de tige (T) (4 éprouvettes) (2 éprouvettes)

Légende:

FT: milieu de multiplication + explant de feuille témoin FE-1, FE-2, FE-3: milieu de multiplication + explant de feuille expérimental no.1, 2 et 3 TT: milieu de multiplication + explant de tige témoin TE-1: milieu de multiplication + explant de tige expérimentale no.1


Voici une fiche d’observation : Fiches d’observation

Date

(semaine et jour)

Identification (éprouvettes)

Observations

FT

FE-1

FE-2

FE-3

TT

TE-1


Un peu de pratique Ce formatif doit être fait avec les documents du laboratoire, votre livre de référence et la vidéo sur le site du cours. 1- Nommez et décrivez brièvement deux modes de reproduction chez les végétaux ? 2- Quelle est la caractéristique que possède la cellule végétale qui permet sa culture «in

vitro» ? 3- Qu’est-ce qu’un explant ? 4- Nommez deux éléments importants pour la culture «in vitro» ? 5- Quel nom porte un explant constitué de cellules méristématiques ? 6- Quel nom porte un explant constitué de cellules très spécialisées ? 7- Nommez des facteurs (5) qui vont conditionner la réaction de l’explant ? 8- Dans quelle partie de la plante est prélevé un explant différencié? 9- Nommez les éléments (5) constitutif d’un milieu utilisé pour la culture «in vitro» ? 10- Qu’est-ce qu’un régulateur de croissance et nommez en trois utilisés en culture «in

vitro» ? 11- Pour chaque régulateur de croissance nommez au numéro précédent, indiquez ces

propriétés ou effets ?


12- Quelle est la particularité, au niveau des concentrations de cytokine et d’auxine quant à leur effet ?

13- Nommez les étapes que doivent subir ou franchir les cellules d’un explant différencier

pour produire un clone ? 14- Décrivez ce qu’est un cal ? 15- En comparant les milieux témoin et expérimental, mentionnez les différences ? 16- Lors de la stérilisation de la feuille, quelle précaution doit-on prendre ? 17- Lors de la manipulation de la feuille, pour les transferts et pour la coupe, quelles

précautions doit-on prendre et pourquoi ? 18- D’après votre compréhension de l’expérience (les faits) et des notions théoriques, (les

faits) tentez d’établir une problématique (question générale et spécifique) ? 19- D’après votre problématique (question générale et spécifique), tentez de prévoir le

résultat et rédiger ce dernier sous forme d’une hypothèse ? 20- À quelle fréquence sont faites les observations sur les explants en croissance et pour

combien de temps ? 21- Quelles sont, pour les périodes suivantes, les observations importantes à faire sur les

tubes de cultures ? a) Les premiers jours : b) Les premières semaines : c) Les semaines suivantes : d) Les dernières semaines :


22- Mettez en ordre les étapes de l’expérience ? a) La feuille déposer dans une boîte de Pétri stérile est coupée à l’aide d’un scalpel et d’une

pince pour former six explants de feuille et deux explants de tige. b) Stériliser la feuille et son pétiole dans une solution d’hypochlorite de sodium (1% v\v) et

Triton 80 en agitant pendant six (6) minutes. c) Placer les tubes de culture dans la biotronette qui assure le maintien des conditions de

croissance. d) Laver la feuille successivement dans trois (3) bocaux (15 secondes chacun) contenant de

l’eau désionisée stérile. Utiliser, pour le transfert, des pinces qui auront été préalablement stérilisés dans la flamme.

e) Sur un plan de violette africaine en parfaite santé, sélectionner une jeune feuille avec son pétiole à l’aide du scalpel.

f) Stériliser un tube de milieu de culture et la pince, prendre avec celle-ci un explant et l’enfoncer légèrement dans la gélose du milieu de culture.

23- D’après votre compréhension de l’expérience (les faits) et des notions théoriques, (les

faits) tentez d’établir une problématique (question générale et spécifique) ? 24- D’après votre problématique (question générale et spécifique), tentez de prévoir le

résultat et rédiger ce dernier sous forme d’une hypothèse ?


Référence (À noter que les références sont parfois incomplètes)

Livres AUGE, R. et al., La culture in vitro et ses applications horticoles, Lavoisier, Paris, 1986. BOUCHARD, L., GAGNÉ F., MINVILLE, JJ., Les biotechnologies, Conseil de développement du loisir scientifique, 1989. BUVAT, R., La cellule végétale, Hachette, l’Univers des Connaissances, Paris, 1968. CAMPBELL, Neil A., Biologie, Saint-Laurent (Québec), éditions du Renouveau Pédagogique inc., 2006. (Adaptation et révision scientifique en français par Richard Mathieu). DODDS, J.H. et ROBERTS, L.W., Plant Tissue Culture, Cambridge University Press, Cambridge, 1986. LARPENT et all., Biotechnologie, Principes et méthodes, Doin Editeurs, Paris, 1992. SCRIBAN, R., Biotechnologie, Lavoisier, Technique et Documentation, Paris, 2ième édition, Paris, 1984. SIMMONDS, N.W., Principes d’amélioration génétique des végétaux, Les Presses de l’Université Laval, Québec, 1988. VERNE, J. et HERBERT, S., La culture des tissus, Que sais-je? no 1274, PUF, 1967. Handbook of Plant Cell culture, (Vol. 1,3,4,5,6), Mc Graw-Hill Publishing Compagny. (Cote:631.52 -H 236 -1990) Revues Augé R. (1984) La culture «in vitro». Sciences et Vie Hors Série, no 146. Dontigny (D.), 1987. - L’horticulture de verre. Québec Science, no 8, 25: 22-27. Famelart (M.), 1979. La culture de tissus végétaux ou la production de plantes en éprouvettes. Sajib. no4:44-50. L’Heureux (P.), Cellule végétale: évolutions récentes et perspectives. Bio futur, décembre 1984, p. 53-59. Martin C. (1984) La culture des plantes en éprouvettes. La recherche, no 160, novembre, 1984. Moinet, M.-L. (1983) La prodigieuse aventure de l'horticulture en éprouvette. Sciences et Vie, no 787. Morel (M.), Martin et Muller, 1968. La guérison des pommes de terre atteintes de maladies à virus. Ann. Physiol. vég., 10 (2), 113-139. Prieur B. (1985) Dossier sur la multiplication in vitro. Québec Vert, octobre, p. 14-36. Rajnchapel-Messai J. et Guerche Ph. Méthodes in vitro et productions végétales. Biofutur, octobre 1985, p.31-45. Shepard J. 1982 La régénération in vitro de pommes de terre. Pour la Science, p. M-47. Tisdall P. 1985. Au seuil d’une ère nouvelle. Dimension Science 3: 24-31. Winter P. 1985 Les micro forets. Dimension Science 6: 9-14.

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