Cours Biomolec2 2c

7/26/2019 Cours Biomolec2 2c

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Mtabolites secondaires ?

Biomolcules dorigine vgtale

dintrts industriels:

Les polyphnols

Cours ULBI 456 Licence L2

Second semestre 2009Christian Jay-Allemand

Universit Montpellier 2

France(Tl: 04 67143612, E-mail: [email protected])


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Plan gnral du cours

Partie I- Introduction

-Biodiversit vgtale, adaptation et

plantes comme source de biomolcules

-Sensibilisation aux

mtabolites

secondaires produits par les plantes

-Alcalodes

-Saponines et sapognines

-Acides phnoliques et flavonodes

-Mtabolisme et voies mtaboliques

-Importance des composs phnoliques

utiliss par lhomme / Historique

Partie II- Biochimie des phnols ettechniques danalyses

-Quest-ce quun phnol ?

-Rseaux mtaboliques

-Diversit des structures chimiques

-Proprits physico-chimiques

-Principales techniques danalyse

- Extraction, hydrolyses,

- Sparat, dtect, quantificat

- Histolocalisation

Partie III- Propritset rles des

composs phnoliques / Utilisations-Couleur du bois

-Couleur des fleurs et des fruits

-Brunissement des tissus

-Qualits organoleptiques

-Proprits antioxydantes

-Proprits pharmacologiques

Partie IV- Conclusion et perspectives


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PARTIE II-2Biochimie des phnols et

techniques danalyses


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- Intrts et limites de leurs utilisations en biotraabilit

(marqueurs) et en biodtection(fluorescence naturelle ou

intensifie laide de ractifs chimiques, coloration spcifique

dans le visible en bleu ou en rouge et traceurs radioactifs)

- Utilisations des composs phnoliques comme marqueurs

gntiques, marqueurs physiologiques et marqueurs des effets des

conditions environnementales sur les vgtaux utiliss parlhomme

- Intrts industrielset agronomiques(colorants, bois,

papier, amlioration gntique des varits, identification des

cultivars, couleur des fleurs, )


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II-3 Techniques danalyse

des composs phnoliques Histolocalisation

Protines

(Enzymes)

ARN

ADN


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Caractrisation et localisationCaractrisation et localisation de la zonede la zone

dede transitiontransition (ZT)(ZT)

UV lightUV light Visible lightVisible light

ZT AD

!!Changements drastiques entre lChangements drastiques entre laubieraubier (A)(A) etet lele duramenduramen (D)(D)PhysiquePhysique (UV(UV fluorescencefluorescence,, teneurteneur en eau,en eau, contrainte mcaniquecontrainte mcanique))BiochemiqueBiochemique ((accumulationaccumulation dede composs phnoliquescomposs phnoliques))

!!UVUV fluorescencefluorescence est unest un marqueurmarqueur de ZTde ZT ((MagelMagel etet alal, 2001), 2001)

Rondelle de bois

de noyer

(Juglans nigra)


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HEARTWOODHEARTWOOD SAPWOODSAPWOOD

RAYS

Flavanols colored in blue by DMACA reagent in walnut wood

LocalisationLocalisation of cells containing flavanolsof cells containing flavanols inin differentdifferent zoneszones of woodof wood

(after Andary C. and Mondolot-Cosson L., Montpellier Univ., France)


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Lumire UV

Mutant sin1 Type sauvage At


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Voie des acides hydroxycinnamiques et

biosynthse des lignines


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BiodtectionPlanches A & B- Accumulation de

naringnine chalcone (A, fluorescence

jaune clair) et de querctine (B,

fluorescence orange) lors de la formation

des racines latrales le long dune racineprimaire de jeunes plants dArabidopsis

thaliana g de 5 7 jours aprs

germination. Les jeunes racines sont

observes directement en microscopie

pifluorescence


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Voies de

biosynthsedes

flavonodes

(tt 3, 4, 5, =mutants

chimiques ou

dinsertion dAtdisponibles)


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Les flavonols sont synthtiss dans le cortex et saccumulent la fois dans le

cortex et la stle de la racine dArabidopsis thaliana

Figure : Immunolocalisation de la chacone

synthase (CHS) et la chalcone isomrase (CHI)dans les cellules de racines. La flche indique

une zone dintense fluorescence de CHS et CHI

localise dans la partie apicale des cellules du

cortex dune racine.

Figure : Visualisation en microscopie

confocale des flavonodes (flavonols) par

fluorescence amplifie et stabilise par leractif de Neu dans la zone dlongation des

cellules du cortex (flche) et de lpiderme

dune racine.

Racine

primaire


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CB

Myricitrine(m

olg-1M

S)

0

2

4

6

8

T1 10

Souches non transforme (T1) ou transformes

987654321T2 11 12 13

APlanches - Modifications de la

teneur en composs phnoliques de

jeunes tiges de noyers (Juglans sp.)

transforms avec le gne antisens

CHS ( chalcone synthase)

A-Teneurs en un glycoside de flavonol,

la myricitrine. Chaque valeur

correspond la moyenne de 6 mesures.

effectues sur 6 tiges diffrentes pour

chacune des souches (T1, T2, 1, 2, )

de noyer produites in vitro aprs 3

semaines de culture (4me repiquage).

Les barres indiquent les erreurs

standards.. T1: souche non transforme;T2: souche transforme par le gne

GUS-INTRON + le gne NPTII; les

souches 1, 2, 3, sont transformes

avec le gne antisens CHS + GUS-

INTRON+NPTII.

B et C- Rvlation des flavanes par la

vanilline chlorhydrique (couleur rouge)

dans des coupes transversales semi-

fines. Les flavanes sont localiss danslpiderme et le parenchyme cortical

des tiges des souches non transforme

(B)et transforme n 9 (C). On notera

la trs forte diffrence de teneurs entre

les deux souches.

Stratgie ARN antisens chalcone synthase

T 1 Souche 9


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Production de plants partir

dembryons somatiques

chez le noyer (Juglans regia)


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Extraction

(Protection / purification)

Sparation

Dtection

Caractrisation & quantification

Identification Calculs / Std

Matriel vgtal


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1D

2D

Solvant 1: MFE

Solvan

t2:AFE

CMC

Dpt de 20 L dextrait

HJG

MYR

Figure : Carte phnolique dun extrait de jeunes feuilles de noyer

(Juglans sp.) obtenue par chromatographie sur couche mince de cellulose


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Rvlation avec le ractif DMACA et

observation en lumire visible

Rvlation avec le ractif de Neu et

observation sous UV

Sparation par CMC dextraits

phnoliques de diffrentes espces

dignames (Dioscorea sp.)

rcoltes en Guyane


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Appareil de

chromatographie liquide

haute performance

(CLHP ou HPLC)

Pompes

Injecteur

automatiqueDtecteur

UV/Visible =

Barette de diode

Solvants

Colonne

HPLC


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I.C.-NH3

129 146 164 248 319 465 u.m.a.

SM 2

Rhm

Hydrojuglone glucoside (HJG)

Myricitrine (MYR)

Temps de rtention (min)

HJG

MYR

STDi

0 10 20 30

CLHP

Absorbance340nm

I.C.-CH4

I.C.-NH3

176

339

339 356

338

177 18052

17761

u.m.a.

SM 1Im.E.

1D

2D

Solvant 1: MFE

Solvant2:AFE CMC

Dpt de

20 L dextrait

HJG

MYR


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Planche I- Principales techniques d'analyse des composs phnoliques permettant leur quantification et leur identification

chimique partir d'extraits aqueux, alcoolique ou actonique de tissus vgtaux. titre d'exemple, sont prsentes ici la sparationpar chromatographie sur couche mince de cellulose (CMC) et par chromatographie liquide haute performance (CLHP) d'un extraitactonique de feuilles de noyer (Juglans sp.) et l'identification par spectromtrie de masse (SM 1 et SM 2) de deux polyphnolsglycosyls majeurs, l'hydrojuglone glucoside (HJG) et la myricitrine (MYR) (daprs rf. 14, Chap . I et daprs G. Kravis,communication personnelle).

La sparation bidimensionnelle [1redimension -1D- avec le solvant MFE (mthyl-iso-butyl ctone / acide formique / eau, 3/1/2) et 2e

dimension -2D- avec le solvant AFE (eau 5% d'acide formique)] sur couche mince de cellulose se rvle trs utile pour visualiser enlumire visible, sous forme de tches jaune vif, diffrents glycosides de flavonols dont la myricitrine. La tche centrale brunecorrespondant l'hydrojuglone glucoside est apparue aprs oxydation l'air. Lobservation du mme chromatogramme sous UVpermettrait de rvler dautres composs phnoliques par leur fluorescence.

HJG et MYR ont t spars par CLHP l'aide d'une colonne Licrospher RP 18 de dimension 250 x 4 mm dans laquelle un gradient,rsultant du mlange progressif d'un solvant aqueux acidifi (1% d'acide actique) et d'un solvant organique (actonitrile / mthanol, 1/1),a t appliqu pendant 35 min. Noter l'excellente rsolution des pics ainsi que la prsence d'un compos tmoin appel standard interne(STDi) qui est ici la 6-mthoxyflavone. Les composs ont t dtects 340 nm et leur concentration, directement corrle la surface de

chaque pic, est calcule laide des coefficients dextinction molaire caractristiques lorsquils sont connus. Le standard interne (STDi)permet de s'assurer que toutes les tapes, de l'extraction la dtection, se sont bien droules et aussi de calculer les teneurs relatives despics inconnus. La sparation en CLHP peut tre couple l'analyse en SM pour confirmer l'identification d'un compos donn. L'analyseen RMN peut galement s'avrer indispensable pour identifier une structure chimique nouvelle.

Les analyses en spectromtrie de masse de HJG (SM 1) ont t effectues en impact lectronique (Im.E.), en ionisation chimique aumthane (I.C.-CH4) ou encore en ionisation chimique l'ammoniac (I.C.-NH4). En Im.E., l'ion molculaire M

+.= 338 u.m.a. (units demasse atomique) est peu visible alors que l'ion fragment F+= 176 majeur correspond la perte d'une partie du glucose (-163) avec untransfert d'hydrogne sur le reste de la molcule donnant un [F+H]+. Par contre l'ionisation chimique l'ammoniac, plus douce, permet devisualiser nettement le [M+H]+= 339 et le [M+NH4]

+ = 356. L'ion F+= 180 est caractristique du glucose. La masse de l'ion molculaire

M+.

est alors confirme en I.C.-CH4(ionisation de force intermdiaire) par l'obtention de l'ion [M+H]+

= 339, d'o M = 338.

L'analyse en spectromtrie de masse de la MYR (SM 2) a t ralise en I.C.-NH3. On obtient en particulier le [M+H]+= 465. La masse

de la MYR est de 464. L'identification du pic obtenu en CLHP correspondant la MYR a t ainsi confirme par simple comparaison desspectres de masse entre celui de la MYR du commerce et celui de la fraction collecte aprs sparation en CLHP.


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Analyse CLHP dun extrait de

feuilles de merisier (Prunus avium)


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Comment calculer les teneurs en

composs phnoliques

spars et dtects par

Chromatographie

liquide haute performance

(CLHP ou HPLC) ?


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Merci pour votre attention

Et un peu de lecture

Pour en savoir plus

Hommage J.J. Macheix

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