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Mtabolites secondaires ?
Biomolcules dorigine vgtale
dintrts industriels:
Les polyphnols
Cours ULBI 456 Licence L2
Second semestre 2009Christian Jay-Allemand
Universit Montpellier 2
France(Tl: 04 67143612, E-mail: [email protected])
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Plan gnral du cours
Partie I- Introduction
-Biodiversit vgtale, adaptation et
plantes comme source de biomolcules
-Sensibilisation aux
mtabolites
secondaires produits par les plantes
-Alcalodes
-Saponines et sapognines
-Acides phnoliques et flavonodes
-Mtabolisme et voies mtaboliques
-Importance des composs phnoliques
utiliss par lhomme / Historique
Partie II- Biochimie des phnols ettechniques danalyses
-Quest-ce quun phnol ?
-Rseaux mtaboliques
-Diversit des structures chimiques
-Proprits physico-chimiques
-Principales techniques danalyse
- Extraction, hydrolyses,
- Sparat, dtect, quantificat
- Histolocalisation
Partie III- Propritset rles des
composs phnoliques / Utilisations-Couleur du bois
-Couleur des fleurs et des fruits
-Brunissement des tissus
-Qualits organoleptiques
-Proprits antioxydantes
-Proprits pharmacologiques
Partie IV- Conclusion et perspectives
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PARTIE II-2Biochimie des phnols et
techniques danalyses
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- Intrts et limites de leurs utilisations en biotraabilit
(marqueurs) et en biodtection(fluorescence naturelle ou
intensifie laide de ractifs chimiques, coloration spcifique
dans le visible en bleu ou en rouge et traceurs radioactifs)
- Utilisations des composs phnoliques comme marqueurs
gntiques, marqueurs physiologiques et marqueurs des effets des
conditions environnementales sur les vgtaux utiliss parlhomme
- Intrts industrielset agronomiques(colorants, bois,
papier, amlioration gntique des varits, identification des
cultivars, couleur des fleurs, )
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II-3 Techniques danalyse
des composs phnoliques Histolocalisation
Protines
(Enzymes)
ARN
ADN
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Caractrisation et localisationCaractrisation et localisation de la zonede la zone
dede transitiontransition (ZT)(ZT)
UV lightUV light Visible lightVisible light
ZT AD
!!Changements drastiques entre lChangements drastiques entre laubieraubier (A)(A) etet lele duramenduramen (D)(D)PhysiquePhysique (UV(UV fluorescencefluorescence,, teneurteneur en eau,en eau, contrainte mcaniquecontrainte mcanique))BiochemiqueBiochemique ((accumulationaccumulation dede composs phnoliquescomposs phnoliques))
!!UVUV fluorescencefluorescence est unest un marqueurmarqueur de ZTde ZT ((MagelMagel etet alal, 2001), 2001)
Rondelle de bois
de noyer
(Juglans nigra)
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HEARTWOODHEARTWOOD SAPWOODSAPWOOD
RAYS
Flavanols colored in blue by DMACA reagent in walnut wood
LocalisationLocalisation of cells containing flavanolsof cells containing flavanols inin differentdifferent zoneszones of woodof wood
(after Andary C. and Mondolot-Cosson L., Montpellier Univ., France)
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Lumire UV
Mutant sin1 Type sauvage At
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Voie des acides hydroxycinnamiques et
biosynthse des lignines
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BiodtectionPlanches A & B- Accumulation de
naringnine chalcone (A, fluorescence
jaune clair) et de querctine (B,
fluorescence orange) lors de la formation
des racines latrales le long dune racineprimaire de jeunes plants dArabidopsis
thaliana g de 5 7 jours aprs
germination. Les jeunes racines sont
observes directement en microscopie
pifluorescence
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Voies de
biosynthsedes
flavonodes
(tt 3, 4, 5, =mutants
chimiques ou
dinsertion dAtdisponibles)
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Les flavonols sont synthtiss dans le cortex et saccumulent la fois dans le
cortex et la stle de la racine dArabidopsis thaliana
Figure : Immunolocalisation de la chacone
synthase (CHS) et la chalcone isomrase (CHI)dans les cellules de racines. La flche indique
une zone dintense fluorescence de CHS et CHI
localise dans la partie apicale des cellules du
cortex dune racine.
Figure : Visualisation en microscopie
confocale des flavonodes (flavonols) par
fluorescence amplifie et stabilise par leractif de Neu dans la zone dlongation des
cellules du cortex (flche) et de lpiderme
dune racine.
Racine
primaire
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CB
Myricitrine(m
olg-1M
S)
0
2
4
6
8
T1 10
Souches non transforme (T1) ou transformes
987654321T2 11 12 13
APlanches - Modifications de la
teneur en composs phnoliques de
jeunes tiges de noyers (Juglans sp.)
transforms avec le gne antisens
CHS ( chalcone synthase)
A-Teneurs en un glycoside de flavonol,
la myricitrine. Chaque valeur
correspond la moyenne de 6 mesures.
effectues sur 6 tiges diffrentes pour
chacune des souches (T1, T2, 1, 2, )
de noyer produites in vitro aprs 3
semaines de culture (4me repiquage).
Les barres indiquent les erreurs
standards.. T1: souche non transforme;T2: souche transforme par le gne
GUS-INTRON + le gne NPTII; les
souches 1, 2, 3, sont transformes
avec le gne antisens CHS + GUS-
INTRON+NPTII.
B et C- Rvlation des flavanes par la
vanilline chlorhydrique (couleur rouge)
dans des coupes transversales semi-
fines. Les flavanes sont localiss danslpiderme et le parenchyme cortical
des tiges des souches non transforme
(B)et transforme n 9 (C). On notera
la trs forte diffrence de teneurs entre
les deux souches.
Stratgie ARN antisens chalcone synthase
T 1 Souche 9
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Production de plants partir
dembryons somatiques
chez le noyer (Juglans regia)
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Extraction
(Protection / purification)
Sparation
Dtection
Caractrisation & quantification
Identification Calculs / Std
Matriel vgtal
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1D
2D
Solvant 1: MFE
Solvan
t2:AFE
CMC
Dpt de 20 L dextrait
HJG
MYR
Figure : Carte phnolique dun extrait de jeunes feuilles de noyer
(Juglans sp.) obtenue par chromatographie sur couche mince de cellulose
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Rvlation avec le ractif DMACA et
observation en lumire visible
Rvlation avec le ractif de Neu et
observation sous UV
Sparation par CMC dextraits
phnoliques de diffrentes espces
dignames (Dioscorea sp.)
rcoltes en Guyane
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Appareil de
chromatographie liquide
haute performance
(CLHP ou HPLC)
Pompes
Injecteur
automatiqueDtecteur
UV/Visible =
Barette de diode
Solvants
Colonne
HPLC
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I.C.-NH3
129 146 164 248 319 465 u.m.a.
SM 2
Rhm
Hydrojuglone glucoside (HJG)
Myricitrine (MYR)
Temps de rtention (min)
HJG
MYR
STDi
0 10 20 30
CLHP
Absorbance340nm
I.C.-CH4
I.C.-NH3
176
339
339 356
338
177 18052
17761
u.m.a.
SM 1Im.E.
1D
2D
Solvant 1: MFE
Solvant2:AFE CMC
Dpt de
20 L dextrait
HJG
MYR
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Planche I- Principales techniques d'analyse des composs phnoliques permettant leur quantification et leur identification
chimique partir d'extraits aqueux, alcoolique ou actonique de tissus vgtaux. titre d'exemple, sont prsentes ici la sparationpar chromatographie sur couche mince de cellulose (CMC) et par chromatographie liquide haute performance (CLHP) d'un extraitactonique de feuilles de noyer (Juglans sp.) et l'identification par spectromtrie de masse (SM 1 et SM 2) de deux polyphnolsglycosyls majeurs, l'hydrojuglone glucoside (HJG) et la myricitrine (MYR) (daprs rf. 14, Chap . I et daprs G. Kravis,communication personnelle).
La sparation bidimensionnelle [1redimension -1D- avec le solvant MFE (mthyl-iso-butyl ctone / acide formique / eau, 3/1/2) et 2e
dimension -2D- avec le solvant AFE (eau 5% d'acide formique)] sur couche mince de cellulose se rvle trs utile pour visualiser enlumire visible, sous forme de tches jaune vif, diffrents glycosides de flavonols dont la myricitrine. La tche centrale brunecorrespondant l'hydrojuglone glucoside est apparue aprs oxydation l'air. Lobservation du mme chromatogramme sous UVpermettrait de rvler dautres composs phnoliques par leur fluorescence.
HJG et MYR ont t spars par CLHP l'aide d'une colonne Licrospher RP 18 de dimension 250 x 4 mm dans laquelle un gradient,rsultant du mlange progressif d'un solvant aqueux acidifi (1% d'acide actique) et d'un solvant organique (actonitrile / mthanol, 1/1),a t appliqu pendant 35 min. Noter l'excellente rsolution des pics ainsi que la prsence d'un compos tmoin appel standard interne(STDi) qui est ici la 6-mthoxyflavone. Les composs ont t dtects 340 nm et leur concentration, directement corrle la surface de
chaque pic, est calcule laide des coefficients dextinction molaire caractristiques lorsquils sont connus. Le standard interne (STDi)permet de s'assurer que toutes les tapes, de l'extraction la dtection, se sont bien droules et aussi de calculer les teneurs relatives despics inconnus. La sparation en CLHP peut tre couple l'analyse en SM pour confirmer l'identification d'un compos donn. L'analyseen RMN peut galement s'avrer indispensable pour identifier une structure chimique nouvelle.
Les analyses en spectromtrie de masse de HJG (SM 1) ont t effectues en impact lectronique (Im.E.), en ionisation chimique aumthane (I.C.-CH4) ou encore en ionisation chimique l'ammoniac (I.C.-NH4). En Im.E., l'ion molculaire M
+.= 338 u.m.a. (units demasse atomique) est peu visible alors que l'ion fragment F+= 176 majeur correspond la perte d'une partie du glucose (-163) avec untransfert d'hydrogne sur le reste de la molcule donnant un [F+H]+. Par contre l'ionisation chimique l'ammoniac, plus douce, permet devisualiser nettement le [M+H]+= 339 et le [M+NH4]
+ = 356. L'ion F+= 180 est caractristique du glucose. La masse de l'ion molculaire
M+.
est alors confirme en I.C.-CH4(ionisation de force intermdiaire) par l'obtention de l'ion [M+H]+
= 339, d'o M = 338.
L'analyse en spectromtrie de masse de la MYR (SM 2) a t ralise en I.C.-NH3. On obtient en particulier le [M+H]+= 465. La masse
de la MYR est de 464. L'identification du pic obtenu en CLHP correspondant la MYR a t ainsi confirme par simple comparaison desspectres de masse entre celui de la MYR du commerce et celui de la fraction collecte aprs sparation en CLHP.
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Analyse CLHP dun extrait de
feuilles de merisier (Prunus avium)
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Comment calculer les teneurs en
composs phnoliques
spars et dtects par
Chromatographie
liquide haute performance
(CLHP ou HPLC) ?
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Merci pour votre attention
Et un peu de lecture
Pour en savoir plus
Hommage J.J. Macheix
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