COPROLOGIE PARASITAIRE

PARA

SITOLO

GIE

PRATIQ

UE

BIOLOGIE

CLINIQUELACOPROLOGIEPARASITAIRE

Grand Cours

Institut Pasteur d’Algérie

Dr I.Achir

(Laboratoire deParasitologie-Mycologie

de l’IPA)

Pr B.Hamrioui.(Laboratoire de

Parasitologie-Mycologiedu CHU Mustapha)

Edition Pirates

COPROLOGIE PARASITAIRE

GRANDS COURS IPA

1

Grands Cours

Institut Pasteur d’Algérie

LA COPROLOGIEPARASITAIRE


GRANDS COURS IPA

2

Le Plan

I - Introduction –définition 03

II-Conditions de l’examen parasitologique des selles 04

III-Préparation du malade 05

IV-Conservation des selles et des parasites 07

IV-1-Conservation par le froid : 07

IV-2-Eau formolée 07

IV-3-Mercurothiolate Iode Formol (MIF) 07

IV-4-Mélange fixateur à l’alcool polyvinylique (APV). 08

IV-5-Conservation des vers : 10

V- Aspect normal de la selle 11

VI- Examen parasitologique des selles : 12

VI -1-Examen macroscopique : 12

VI -2-Examen microscopique : 13

VI-2-1- Un examen direct : 13

VI-2-1- 1-Un examen direct sans concentration 13

VI-2-1-2-Examen direct après concentration 15

A-Les méthodes physiques : 15

A1-Techniques de flottation 16

A2-Techniques de sédimentation 19

B-Les méthodes physico-chimiques ou diphasiques : 20

VI.2.1.3-Méthodes spéciales 22VI-2-2- Examen après coloration : 23

VI-2-2-1-Coloration entre lame et lamelle : 23

A-Méthode de Bailenger et faraggi : 23

B-Méthode de Sapero, Lawless et Strome (1953) : 24

C-Méthode de Horkin 25

D-Méthode de Sargeaunt (1962) : 26

E-Méthode au bleu de méthylène tamponné : 26

VI.2.2-Coloration d’un frottis humide. 27

A-Confection du frottis de selles : 27

B-La Fixation 28

C-Colorations : 30

C1-Hématoxyline ferrique : 30

C2-Trichrome de Wheatley : 32

C3-Méthode de Kohn : 32

D-Montage des préparations 33

VI.2.3--Coloration d’un frottis sec : 34

VI.2.4--Colorations spécifiques : 34

A-Coloration des cryptosporidies : 34

B--Coloration des microsporidies : 35

C-Numération des œufs d’helminthes : 36


GRANDS COURS IPA

3

I - Introduction –définition :La coprologie parasitaire ou examen parasitologique des selles met en évidence etidentifie :Les parasites vivants dans le tube digestif de l’homme.Exemple : Ascaris lumbricoides vit dans l’intestin grêle et élimine ses œufs dans lesselles.Les parasites pour lesquels les selles sont un moyen d’élimination de leurs formes dedissémination dans le milieu extérieur.Exemple : Schistosoma mansoni adulte vit dans les vaisseaux sanguins et élimine sesœufs dans les selles.L’EPS mettra en évidence une partie du parasite (anneaux de Teania), une formeévolutive du parasite (larves et œufs d’helminthes), ou la forme définitive du parasite(adultes d’helminthes)C’est un examen qui possède néanmoins des limites : L’hors de l’Oxyurose, la ponte ovulaire se fait au niveau de la marge anale et nonpas dans l’intestin, l’EPS est souvent faussement négatif. Le Teania saginata élimine ses proglottis murs en dehors de la défécation quantle parasite est immature : c’est la phase de migration larvaire des helminthes ouseul un diagnostic indirect (séro-immunologique) est possible. (Il faut parexemple 8 à 10 semaines pour Ascaris lumbricoides pour devenir adulte). Enfin, il faut toujours avoir à l’esprit qu’il existe des phases coprologiquementnégatives, particulièrement pour les amibes. Ce sont des périodes pendantlesquelles les amibes sont tellement rares dans les selles qu’il est impossible deles découvrir.


GRANDS COURS IPA

4

II-Conditions de l’examenparasitologique des sellesIl peut s’agir

Soit d’un examen de routine, voire systématique, et dans ce cas un examenparasitologique standard sera suffisant. Soit d’un examen motivé, et il faudra alors pratiquer des techniques particulièreset spéciales (antécédents de parasitose digestive, séjour en zone d’endémie,contexte clinique d’une dysenterie, hyper éosinophilie sanguine…etc.).C’est dire l’intérêt des renseignements fournis par le praticien dans le cadre d’unecollaboration étroite avec le biologiste.En pratique il faudra procéder à l’interrogatoire du malade et remplir une fiche derenseignement sur laquelle devra figurer :1. Le Nom et le prénom.2. L’âge.3. L’adresse (zone urbaine, rurale, d’endémie….).4. La notion de séjour en zone d’endémie (pays chauds).5. Les habitudes alimentaires (viande mal cuite, salades sauvages).6. Les signes cliniques, particulièrement digestifs.7. La notion de terrain (immunodépression).8. Les résultats d’examens para cliniques (biologiques : anémie, hyper éosinophiliesanguine ou radiologiques).9. La notion de traitement en cours. (notamment antiparasitaires).


GRANDS COURS IPA

5

III-Préparation du malade

1-Réactivation salineLongtemps utilisée systématiquement, elle n’est plus pratiquée actuellement malgrétout son intérêt.Elle consiste en la prescription de 5 à 10 grammes de sulfate de sodium ou demagnésium la veille de l’examen ou le matin même (une cuillerée à café dans un verred’eau sucrée).L’idéal serait d’examiner deux selles différentes pour un même malade : Une selle de consistance normale (les kystes de protozoaires et les œufsd’helminthes sont plus aisément retrouvés dans les selles moulées et compactesque dans les selles liquides). Une selle en période de diarrhée (les formes végétatives d’amibes sont plusabondantes dans les selles pâteuses et glaireuses).En pratique, trois examens de selles sont prescrits à quelques jours d’intervalles (Phasesmuettes) : les deux premières émises spontanément, et la troisième après réactivation.

2-Abstention médicamenteuseIl faut dans la mesure du possible. Proscrire tous médicament à base de dérivés quinoléiques (pouvoir amoebicide)sinon émettre des réserves quant au résultat négatif de l’EPS. Proscrire les médicaments contenant des substances gênant l’observationmicroscopique trois jours voir une semaine avant l’EPS : substances grasses,suppositoires dont l’excipient est un corps gras), médicament à base de charbon,de bismuth. Pratiquer une éventuelle exploration radiologique à produit de contraste plutôtaprès qu’avant un EPS (les produits de contraste peuvent persister jusqu'à 15jours).


GRANDS COURS IPA

6

3-Régime sans résidusCertains aliments, riches en résidus et rendant difficiles un EPS sont à éviter pendant lestrois jours qui précédent l’EPS. Ce sont : Les fruits de cuticules non digérées (pêches, abricots, tomates). Les fruits à graines (figues). Les fruits de rosacées (pommes et surtout poires). Les légumes secs. Les graines à enveloppes (haricots, lentilles).


GRANDS COURS IPA

7

IV-Conservation des selles et desparasites

IV-1-Conservation par le froid :En mettant la selle dans une boite hermétique, à + 4° C, on pourra conserver d’unemanière acceptable les kystes de protozoaires et les œufs d’helminthes.IV-2-Eau formoléeC’est une solution fixatrice et conservatrice.Kystes de protozoaires et œufs d’helminthes seront conservés dans du formol à 10 %pour les selles pâteuses, et à 5 % pour les selles fermes.Les formes végétatives pourront être fixées et conservées quelques semaines dans duformol à 10 %.Quant aux œufs qui peuvent continuer leurs segmentation après émission il faudrautiliser le formol à 20 %.(Ankylostome, Ascaris, Trichocéphale).IV-3-Mercurothiolate Iode Formol (MIF)Il permet une conservation beaucoup plus longue des formes végétatives (quelquesannées) et des kystes de protozoaires (indéfinie) colorés (Lugol, éosine).De plus.il permet d’effectuer une concentration physico-chimique sur des sellesprélevées hors du laboratoire (technique de Sapero, Lawless et Strome).On pratique au moment de l’emploi dans un tube à hémolyse ou une boite, le mélangesuivant : t1

Puis on y ajoute environ 0.25 g de selles qu’on triture.On prend soin de fermer hermétiquement le récipient utilisé pour une bonneconservation.(t2)

T1Mercurothiolate Iode Formol (MIF)

2.35 ml de solution de merthiolate. 0.15 ml de Lugol à 5%.


GRANDS COURS IPA

8

IV-4-Mélange fixateur à l’alcoolpolyvinylique (APV).Il entraine non seulement une bonne conservation mais aussi une fixation permettant depratiquer des frottis pouvant être colorés par la suite.On place le mélange à l’APV dans un bain marie (température 70 à 75°C) pendantenviron 10 minutes en remuant fréquemment (jusqu'à dissolution complète).Puis on verse dessus le fixateur de Schaudinn modifié, on rebouche et on remue pendant2 à 3 minutes jusqu'à ce que la solution devienne limpide.Le fixateur pourra être conservé dans un flacon à bouchon vissé jusqu'à une année.

Solution mère de Merthiolate (Réactif de Sapero et Lawless) :

Teinture de merthiolate : 200ml. Formol : 25 ml. Glycérine : 5 ml. Eau distillée : 250 ml.

Solution de Lugol à 5 % fraiche :

Iode métalloïdique : 5g. Iodure de potassium : 10 g. Eau distillée : 100 ml.

Dissoudre d’abord l’iodure de potassium dans un peu d’eau (30 ml) ,puis l’iode et mélanger jusqu’à dissolution , enfin ajouter le reste del’eau distillée , la conservation se fait en flacon brun.

Teinture de merthiolate :

Mercurothiolate de sodium :0.1 g. Ethanol :2,5 ml. Acétone :10 ml. Mono-éthanolamine :0,1 ml. Eosine… : 0,1 ml. Eau distillée : qsp 100 ml.


GRANDS COURS IPA

9

Fixateur de Schaudinn modifié

Cristaux de chlorure de mercure (HgCl2) :1,5 g. Ethanol à 95 % : 31 ml. Acide acétique glacial : 5 ml.

Dissoudre d’abord le chlorure mercurique dans l’éthanol, puis ajouterl’acide acétique et mélanger, le tout dans une fiole bouchée.

Attention ! Le chlorure de mercure est très toxique, l’acide acétique glacialest très corrosif.

Mélange à l’APV

Alcool polyvinylique en poudre : 5g. Glycérol : 1, 5 ml. Eau distillée : 62.5 ml.

Verser le glycérol sur la poudre d’APV, qui doit être de faible viscosité, et bienmélanger. Ajouter l’eau distillée, boucher la fiole et laisser à température dulaboratoire une nuit.


GRANDS COURS IPA

10

IV-5-Conservation des vers :NématodesIl suffit après avoir bien lavé le spécimen à l’eau physiologique, de verser dessus del’alcool à 70 % bouillant (faire bouillir l’alcool sur un agitateur magnétique à 50-60°C).Le ver meurt ainsi en extension.Rejeter la solution fixatrice après refroidissement et conserver le ver dans de l’alcool à70 % dans un récipient en verre hermétiquement bouché.TrématodeLe ver placé entre 2 lames de verre est fixé en extension en versant dessus soit del’alcool à 70 % bouillant soit un mélange à parties égales de formol à 10 % et d’alcool à70 %.CestodesLes anneaux de cestodes, lavés à l’eau physiologique, et placés entre 2 lames, sontplongés dans le fixateur qui est :

Soit de l’alcool à 70 % bouillant. Soit un mélange alcool à 90 % (90 ml) – Formol du commerce (10 ml). Soit le fixateur de Bouin. Soit le fixateur de Duboscq-Brasil.


GRANDS COURS IPA

11

V- Aspect normal de la selleUne selle normale possède les caractéristiques suivantes : Un poids de 110 à 150 grammes. Une couleur brune par transformation de la bilirubine en stercobiline. Une consistance ferme et un aspect moulé. Un PH d’environ 7.Microscopiquement on doit observer. Des fibres musculaires qui sont bien digérées : angles arrondis, striations peuvisibles (Corps de Nothnagel). De la cellulose non digestible : poils, vaisseaux, ligneux, éléments scléreux. De l’amidon si le régime est riche en féculents et chez l’enfant. Quelques masses amorphes ou disques radiés qui représentent les savons.Il ne doit pas y avoir de globules gras (graisses neutres).


GRANDS COURS IPA

12

VI- Examen parasitologique des selles :

VI -1-Examen macroscopique :

VI-1-1-Couleur :

Brune : couleur normale. Jaune ou ocre : présence de bilirubine ou stercobilinogène. Verte : Produits d’oxydation de la bilirubine. Décolorée : défaut de pigment biliaire, putréfaction modifiant le Ph (alcalin) ,présence de Baryte ou de pansements intestinaux. Noire : présence de sang digéré endogène ou exogène, médicaments à base decharbon. Rouge : en surface s’il s’agit de sang, dans la masse fécale lors d’ingestion debetteraves, de phénolphtaléine, de Carmin.

VI-1-2-Consistance :Les selles peuvent être : moulées dures, moulées souples, pâteuses non moulées, fermeen partie et très molles de l’autre, liquide hétérogène, liquides homogènes.VI-1-3-Aspect :La présence de bulles ou de petites cavités est due au gaz lors de fermentationsanormales. L’aspect gras et luisant correspond à une stéatorrhée (dans le sens d’uneaugmentation des lipides fécaux).VI-1-4-Eléments surajoutés :

Parasitaires : adultes d’ascaris, adultes d’oxyures, anneaux ou fragments dechaines de Teania, exceptionnellement adultes de Trichocéphale. Glaires (mucus). Sang.


GRANDS COURS IPA

13

VI -2-Examen microscopique :L’examen standard classique doit comporter : Un examen direct à l’état frais. Un examen après coloration par 2 méthodes différentes.

VI-2-1- Un examen direct :

VI-2-1- 1-Un examen direct sans concentrationIl se pratique en réalisant une dilution dans un verre à pied, de la selle avec de l’eauphysiologique à 0.9 % (une noix de selle avec environ 10 fois son volume d’eau).On pourra mettre l’eau préalable à 37°.Sur une lame porte objet, on dispose à l’aide d’une lame pipette pasteur, deux gouttesde cette dilution (une goutte à droite et une goutte à gauche).l’une d’elle sera mélangéeà une goute de Lugol double à 1%.

Pour les selles glaireuses, on prélèvera à l’aide d’une anse de platine directement laglaire qu’on disposera sur la lame.Les deux préparations, recouvertes de lamelles (22 x 22), on procédera à la lecturemicroscopique de la manière suivante : On commence toujours par la lecture de l’examen direct en solution saléeisotonique à l’objectif x10, diaphragme fermé au maximum (réduction del’intensité lumineuse). On fait la mise au point sur un des coins de la lamelle et on examine toute lasurface recouverte par la lamelle en déplaçant la lame de gauche à droite ou dehaut en bas. A chaque fois qu’un parasite ou qu’un élément suspect est repéré, on passe àl’objectif x 40 en ouvrant un peu le diaphragme.

L’examen à l’eau physiologique est un temps majeur et irremplaçable de l’EPS.

Eau physiologique à 0.9 %.

Nacl…………………9 g.

Eau distillée…….1000 ml

Lugol double :

Iode métalloïdique……………..1g.

Iodure de potassium…………..2 g. Eau distillée………………………..100 ml


GRANDS COURS IPA

14

Il permet d’identifier les œufs et les larves d’helminthes ainsi que les kystes et les formesvégétatives de protozoaires.Les trophozoïte de protozoaires vont être observés vivants et donc mobiles, aidant ainsiau diagnostic d’espèce (selles fraiches. Platine chauffante).On passera ensuite à la préparation à l’iode, qui va servir à repérer les kystes d’amibes etde flagellés et à les identifier. L’iode colore le glycogène (présent dans les kystes jeunes d’amibes), et les

noyaux des kystes en brun foncé (chromatine). L’amidon mal digéré apparait en bleu. L’érythrodextrine (amidon transformé) en rouge violet.Ces deux examens permettent d’identifier un grand nombre de parasites mais parfois onaura recours à des colorations permanentes pour établir le diagnostic d’espèceParfois il est nécessaire de faire une dilution de la selle dans de l’eau distillée(hypotonique) : Les globules blancs et les blastocystis éclatent alors que les kystes deprotozoaires résistent ce qui permet d’éviter une éventuelle confusion.L’action de l’eau du robinet est identique (hypochlorite, hypotonicité).


GRANDS COURS IPA

15

VI-2-1-2-Examen après concentrationLes techniques de concentration ont pour but de réunir dans un faible volume, desparasites dispersés dans une masse de selle.Elles sont nombreuses et altèrent en général les formes végétatives, chacune ayant sesavantages et ses limites.Elles doivent être pratiquées même si l’examen direct est positif.Elles se repartissent en deux groupes :

Les méthodes physiques. Les méthodes physico-chimiques.

A-Les méthodes physiques :Les selles diluées dans un réactif de densité différente de celle du parasite. Si le réactif utilisé est de densité supérieure à celle des parasites, ceux-ci vontflotter à la surface : c’est une concentration par flottation. Si le réactif utilisé est de densité inferieure à celle des parasites, ceux ci vontsédimenter et se retrouver dans le culot : c’est une concentration par

sédimentation.En général un échantillon de 15 à 20 g de selles prélevé à différents endroits de la massefécale est dilué dans le réactif en fonction de la technique choisie.La dilution est ensuite passée à travers un tamis métallique (élimination des grosdébris et résidus) vers un tube conique en verre.Bailenger nous donne la densité de quelques parasites :Ankylostome (1.055) , Giardia intestinalis (1,060) , Entamoeba histolytica et Endolimaxnanus (1,065 – 1,070), ascaris lumbricoides fertile (1,110), Trichocéphale (1,150) ,Chilomastix mesnili (1,180) , Ascaris lumbricoides infertile (1,200).


GRANDS COURS IPA

16

A1-Techniques de flottationOn effectue une dilution fécale avec un réactif plus dense que les parasites. Ceux ci vontse retrouver à la surface de la dilution et vont être recueillis soit par une anse de platine,soit par adhérence au verre.Avantage :

Technique simple. Matériel rudimentaire. Réalisable en série.

Inconvénients :

Les réactifs utilisés hypertoniques, altèrent les œufs operculés volumineux.(Bothriocéphale, Fasciola), et même les œufs de schistosomes. De plus les manipulations trop longues font que les parasites s’imprègnent deréactifs et ont tendance à sédimenter alors qu’on veut les faire flotter. Les œufs d’ascaris infertiles ne sont pas bien concentrés par ces méthodes.

Il existe de nombreuses méthodes de flottation.les principales sont :

Méthode de Füllborn (1920).Elle utilise une solution saturée de Na Cl, d=1.2 :

Les parasites après environ 30 minutes, sont recueillis avec une anse de platine.Méthode de Willis (1921).C’est le même réactif que précédemment .mais les parasites ici sont recueillis à l’aided’une lamelle déposée sur le tube au contact de la dilution (surface supérieure formantun ménisque saillant).L’auteur préconise 45 minutes, mais en pratique on peut lire après 15 minutes la lamelleposée sur la lame porte objet.Elle concentre bien les œufs d’Hymenolepis nana et d’ankylostomes.

Solution saturée de Nacl

Na Cl 250 g

Eau distillée 750 ml


GRANDS COURS IPA

17

Méthode de Janeckso et Urbanyi (1931).Utilise comme réactif une solution de Iodomercurate de potassium (d=1,140), qui doitêtre manipulée avec prudence.On réalise une dilution d’environ 5 g de selles dans 20 ml de solution, on tamise et oncentrifuge 2 mn à 1500 t / mn.On prélève immédiatement la pellicule de surface qu’on observe au microscope.Initialement introduite en coprologie parasitaire par Roman et Euzeby en 1956 pour laconcentration des œufs de la grande douve, elle est très intéressante en fait aussi pourles œufs de Schistosoma mansoni, d’Ankylostomidés, de trichocéphale et d’oxyures, delarves d’anguillules, un peu moins pour les œufs d’ascaris.Mais ses inconvénients, altération des parasites, utilisation d’un réactif cher, à actioncaustique et allergique (manipulation avec des gants), et à action corrosive pour lesobjets métalliques, font que cette technique n’est guère indiquée en routine.

Méthode de Faust (1938).On centrifuge à 1500 t /mn une dilution de la selle dans de l’au ordinaire tiède.On rejette le surnageant et on remet le culot en suspension dans l’eau.On répète l’opération jusqu’à ce que le surnageant soit limpide. On remet alors le culoten suspension dans le sulfate de zinc à 33 %.Apres centrifugation on prélève à l’anse de platine la pellicule de surface qu’on examineau microscope.

Iodomercurate de potassium (Solution mère)

Bi iodure de mercure………….100g. Iodure de potassium…………74 g.

Eau distillée………………………..50 ml.

Dissoudre d’abord l’iodure de potassium dans un peu d’eau, puis ajouter peu à peu le biiodure de mercure en mélangeant avec un agitateur en verre .Rajouter enfin le reste del’eau.

Sulfate de Zinc à 33 % :

Sulfate de zinc pur…………..33 g

Eau distillée………………….100 ml.


GRANDS COURS IPA

18

Méthode d’Otto, Hewitt et Strahan (1941).On procède de la même manière que pour le Willis mais avec une solution aqueuse desulfate de zinc à 33 %, d=1,180.A2-Techniques de sédimentationPour ces techniques .les réactifs ont une densité inferieure à celle des parasites qui vontse déposer au fond du tube, et supérieure à celle des particules alimentaires nondigérées qui vont se retrouver en surface.Avantages :

Simples, matériel rudimentaire. Traitent une grande masse fécale (parasites rares ou irrégulièrement repartisdans la selle).

Inconvénients :

Techniques longues, à nombreuses manipulations non indiqués en routine.Méthodes :Parmi ces techniques on retiendra :

Méthode par sédimentation simple. Méthode de Faust et Ingalls (1946). Méthode de Jahnes et Hodges (1947). Méthode de Baroody et Most (1946).


GRANDS COURS IPA

19

B-Les méthodes physico-chimiques ou diphasiques :

B1-Principe :Toutes les méthodes diphasiques découlent de celle de Telemann (1908) qui diluaittoute la selle dans un mélange égal d’éther et d’acide chlorhydrique concentré etexaminait le culot de centrifugation.On pensait alors que l’élimination des déchets fécaux résultait de l’action dissolvante desréactifs utilisés.Plusieurs auteurs, et d’une manière empirique, décrivent de nouvelles méthodesutilisant des réactifs variés (l’HCl concentré ayant des vapeurs nocives et altère leskystes et les œufs de parasites).Bailenger montre enfin que la concentration par méthodes physico-chimiques découlaitde la mise en présence de deux phases non miscibles, l’une aqueuse et l’autrelipophile, réalisant un coefficient de partage dont la valeur est conditionnée pourchaque particule fécale (parasite et déchets) par balance hydrophile-lipophile.Les éléments ayant une balance hydrophile-lipophile qui penche en faveur desgroupements hydrophiles se retrouvent dans la phase aqueuse et se déposent au fonddu tube de centrifugation.Ceux dont la balance hydrophile lipophile penche vers les groupements lipophiles seretrouveront au contact de la phase organique.L’équilibre hydrophile-lipophile dépend en fait de plusieurs paramètres, dont leprincipal est le PH.B2-Précautions à prendre :

Il faut une dilution homogène de la selle dans le réactif Il faut éliminer les gros débris fécaux. Utiliser un tamis métallique et non de la gaze, sédimentation rapide de 1 à 2minutes. Il faut bien émulsionner la dilution fécale avec l’éther dans un tube à centrifuger :

o On verse d’abord la dilution dans un tube conique à centrifuger enverre (2/3 du volume) puis on ajoute de l’éther (1/3 du volume) enlaissant 1 cm de hauteur vide.

o On agite alors vigoureusement le tube pendant une minute en bouchant letube avec le pouce (mettre les gants). La centrifugation doit être douce (1500t/mn, 2 à 3 mn). Isolement du culot de centrifugation :


GRANDS COURS IPA

20

o Apres centrifugation on obtient 4 couches qui se superposent, seul leculot nous intéresse.o On rejette les 3 couches qui le surmontent :(La phase aqueuse, l’anneau del’interphase et la couche éthérée supérieure).o Il faudra toujours par la suite et en maintenant le tube horizontalementessuyer à l’aide d’un tampon en coton (écouvillon) ou mieux papier filtreles trainées laissées sur les parois du tube par l’anneau rejeté.

Il faut secouer le sédiment collé, voire ajouter quelques gouttes d’eau s’il est tropépais, et examiner tous le culot.B3-Méthodes :Plusieurs méthodes existent parmi elles :

Méthode de Telemann (1908). Méthode de Rivas (1928) ou Telemann-Rivas. Méthode de Carles et Barthélémy (1917). Méthode de Faust et Ingalls (1946). Méthode de Ritchie (1948). Méthode de Ritchie simplifiée par Ridley et Hawgood (1956). Méthode de Blagg, Schloegell, Mansour et Khalaf (1955). Méthode de Roman (1957). Méthode de Bailenger (1962-1963). Méthode de Thébault simplifiée par Valentin et Solle. Méthode de Junod (1972).


GRANDS COURS IPA

21

VI.2.1.3-Méthodes spéciales

A-Méthode à la cellophane adhésive : Scotch test (Graham1941 Jacobs 1942) :Pour la recherche d’œufs d’oxyures, et puisque la femelle ne pond pas ses œufs dansl’intestin mais sur le pourtour de l’anus, c’est au niveau de la marge anale qu’on ira lesprélever.Pour cela, on applique environ 10 cm de cellophane adhésive transparente sur lepourtour anal, malade en position génu-pectorale, en appuyant pour bien pénétrer lesplis anaux et perianaux.Puis, face adhésive en dessous, on applique le ruban sur une lame porte objet.Le prélèvement est pratiqué le matin avant la défécation et la toilette.L’examen microscopique se fait à l’objectif X10.B-Recherche de larves d’anguillules.Ces larves peuvent être trouvées à l’examen direct voire par les méthodes physico-chimiques et le Janeckso-Urbanyi.Mais on peut, lors d’examen spécialement motivés, utiliser le thermotropisme etl’hydrotropisme positif des larves pour les rechercher dans les selles : elles sont attiréespar l’eau tiède.Méthode de Baermann et Brugg.Méthode de Baermann et Lee.C-Méthode par éclaircissement : Méthode de Kato.Elle permet la recherche des œufs et larves d’helminthes dans une quantité importantede selles, ce qui nécessite l’emploi d’une solution éclaircissante.Des rectangles de cellophane de 2 cm x 5 cm, trempés au moins 24 heures dans lasolution éclaircissante, vont être déposées sur les étalements de selles (tamisées aupréalable) et retournés sur un papier filtre.Les préparations sont lues 30 à 50 minutes après à l’objectif X10.


GRANDS COURS IPA

22

VI-2-2- Examen après coloration :

La coloration est :

Utile en cas de doute dans l’identification des kystes surtout pour un diagnosticd’espèces des formes végétatives (structures nucléaires colorées). Recommandée pour la conservation de matériel de référence ou l’envoi vers unautre laboratoire pour avis. Indispensable pour le diagnostic de certains parasites (Cryptosporidies,microsporidies).

VI-2-2-1-Coloration entre lame et lamelle :A pratiquer sur des selles contenants des trophozoïte vivants.A-Méthode de Bailenger et faraggi :Les kystes et les formes végetatives sont bien colorés : le cytoplasme et cristalloïde sontcolorés en rouge, et les structures nucléaires en noir. (Les noyaux de Dientamoebafragilis ne sont pas colorés).

Le colorant est mis dans un flacon hermétiquement clos et à l’abri de la lumière.Pour la coloration, le colorant sera prélevé en surface, déposé sur la lame et mélangé àune goutte de suspension fécale.

Colorant de Bailenger

Violet cristal…………………………………..50 mg

Fuchsine basique…………………………..10 mg Alcool à 90 %....................................20 ml

Phénol cristallisé fondu………………….4 ml Eau distillée……………………………………100 ml

Coloration de Bailenger et Faraggi. Un kyste d'Entamoeba coli à huitnoyaux dont trois bien visibles. Obj. X 100.


GRANDS COURS IPA

23

B-Méthode de Sapero, Lawless et Strome (1953) :

Le MIF permet une :

Coloration immédiate : Kystes et trophozoites ont une couleur allant du vertjaune au jaune brun. Coloration retardée : membrane nucléaire rouge foncé à noir, chromatine noncolorée, cytoplasme en rouge. Dientamoeba fragilis n’est pas coloré par le MIF.

Une variante à cette méthode consiste à réaliser cette coloration en tube mélangeantextemporanément dans un tube à hémolyse.

MIF

Teinture de merthiolate………7.75 ml Lugol à 5 %…………………………1 ml

Formol....................................1.25 ml

La solution est stable 6 à 8 h

MIF

Solution mère de merthiolate ………..2.35 ml Lugol à 5 % ………………………………………1 ml

On y ajoute environ 0.25 g de selles

Coloration de Bailenger et Faraggi. Kyste à un noyau d'E.histolytica / E.dispar mesurant 11 μm, avec une importantevacuole. Obj. X 100.


GRANDS COURS IPA

24

Apres 20 minutes on examine la couche supérieure du sédiment (fixation, coloration etconservation).

C-Méthode de HorkinElle est indiquée après une concentration à l’acide trichloracétique (Thébault).On obtient une bonne coloration des corps sidérophiles après le colorant suivant : Sulfate de sodium ………..2.35 ml Acide acétique………………33.33 ml

Rouge neutre……………….0.20 g Vert lumière……………….0.20 g

Rouge neutre……………….200 ml

On y ajoute environ 0.25 g de selles

Coloration au M.I.F. Forme végétative allongée, d'E. histolytica / E. disparfixée en mouvement. Obj. X 100.

Coloration au M.I.F. Trois formes végétatives arrondies d'E. histolytica / E.dispar. Obj. X 100.

Coloration au M.I.F. Kyste à un noyau d'E. histolytica / E. dispar avecune grande vacuole. Obj. X 100.


GRANDS COURS IPA

25

D-Méthode de Sargeaunt (1962) :C’est une coloration au vert de malachite qui permet de colorer les cristalloïdes aprèsaction de l’éther (en pratique, après une méthode de concentration diphasique).

E-Méthode au bleu de méthylène tamponné :Cette coloration est recommandée par l’OMS pour les trophozoites d’amibes.Solution de bleu de méthylène tamponné :

Solution A………………………46,3 ml Solution B………………………3.7 ml

Bleu de méthylène…………0.5 g

Eau distillé……………………..qsp 100 ml

Solution A

Acide acétique glacial……………..1.2 ml.

Eau distillée…………………………….98.8 ml.

Solution A

Acétate de sodium……………..…..1.6 ml.

Eau distillée…………………………….100 ml.

Colorant de Sargeaunt :

Vert malachite ………………0.2 g. Acide acétique glacial…….3 ml.

Ethanol…………………………..0.5 ml.

Eau distillée……………………qsp 100 ml


GRANDS COURS IPA

26

VI.2.2.2-Coloration d’un frottis humide.Si la coloration entre lame et lamelle est non concluante, ou si on désire garder dumatériel de référence, on doit procéder à la confection d’un frottis de selles, à sa fixationet à sa coloration.Il existe 3 groupes de méthodes : Technique en 3 temps : fixation puis coloration puis différenciation. Exp :Méthode de Heidenhain (coloration progressive). Technique en 2 temps : fixation puis coloration. Exp : Méthode de Wheatley(coloration progressive). Technique en 1 temps : Fixation/Coloration. Exp : Méthode de Kohn.

A-Confection du frottis de selles :L’étalement de la selle est une étape commune aux 3 groupes de méthodes.Sur la lame porte objet, on dépose une petite goutte de selles liquides ou de glaires.Avec le bord d’une lamelle ou d’une allumette, on fait un étalement mince en zigzag afind’obtenir des épaisseurs différentes.Il faut confectionner plusieurs lames pour chaque selle.(Au moins 3).Il ne faut pas laisser sécher le frottis, mais le fixer immédiatement.Bailenger recommande dans tous les cas, glaires y comprises, de délayer la parcellefécale avec une petite goute d’alginate de sodium (0.5 à 2 %) qui au contacte desfixateurs acides, forme une pellicule gélifiée adhérente au support, et de réaliserl’étalement à l’aide d’une lamelle, maintenue entre les doigts de la main droite, que l’onamène au contact de la lame, en avant de la goutte fécale.Celle – ci diffuse le long de la lamelle à laquelle on imprime un mouvement detranslation lent et uniforme, en la maintenant inclinée à 45 ° sur la lame, comme pour unfrottis sanguin.


GRANDS COURS IPA

27

B- La FixationC’est une étape commune aux 2 premiers groupes de méthodes.Il faut plonger la lame encore humide, dans l’un des fixateurs suivants : Schaudinn acétique :C’est probablement le meilleur fixateurLes frottis sont fixés au moins 1 Heure à la température du laboratoire (ou bien 10minutes à 60 °C). Immédiatement après on plonge le frottis dans de l’éthanol à 70 %additionné d’iode pendant 10 à 20 minutes pour enlever le sublimé en excès, puis dans 2bains d’éthanol à 70 %.Apres les avoir lavés dans de l’eau de robinet (15 minutes), les frottis sont prêts à êtrecolorés.

Bouin Picroformol :(Bouin 1897) :Fixer pendant 15 minutes au moins dans cette solution fraichement préparée.

Solution mère

Solution aqueuse saturée de sublimé (chlorure mercurique)…………600 ml Ethanol à 95 %.....................................................................................300 ml.

Verser l’éthanol sur la solution aqueuse saturée de chlorure de mercure et mélanger en agitantle flacon. La conservation est d’au moins 1 an.

Solution de travail :

Solution mère ………………………………100 ml Acide acétique glacial………………………5 ml

Verser l’acide acétique glacial sur la solution mère e Schaudinn, bienmélanger en agitant le flacon. La conservation est de 3 mois

Solution d’iode dans l’alcool :

Ethanol à 70 %.

Cristaux d’iode (quelques uns).

Plonger quelques cristaux d’iode dans l’alcool à 70 % , dans une petitefiole. Mélanger en rajoutant de l’iode jusqu'à obtenir une couleurombrée (couleur de thé fort) .la conservation est de 3 semaines.


GRANDS COURS IPA

28

Avant de colorer, enlever l’excès d’acide picrique par 2 bains d’alcool à 90 %, puis unbain d’alcool à 70 %, dans lequel on peut conserver les lames quelques jours. Puis laver àl’eau courante pour enlever tout l’alcool.

Picroformol acétique :Au moment de l’emploi, ajouter 5 % du volume d’acide acétique cristallisable. Laisser encontact pendant 30 minutes, puis laver par 2 bains successifs d’alcool à 90 % puis à l’eaucourante.

Bouin alcoolique = Duboscq-Brasil (1905).Cette solution doit être préparée au moment de l’emploi .elle fixe mieux les kystes. Ladurée de la fixation est de 30 minutes, puis on plonge les lames directement dans l’alcoolà 90 %.

Bouin Picroformol :

Solution aqueuse saturée d’acide picrique……………………………………..15 volumes Formol à 40 %.....................................................................................5 volumes

Acide acétique cristallisable…………………………………………………………….1 volume

Picroformol acétique

Formol à 40 %............................1 volume.

Eau …………………………………………3 volumes. Acide picrique………………………….A saturation.

Bouin alcoolique :

Alcool à 80 %.....................................150 ml. Formol à 40 %....................................60 ml. Acide acétique cristallisable………… …15 ml.

Acide picrique ………………………………….1 g


GRANDS COURS IPA

29

C-Colorations :

C1-Hématoxyline ferrique :L’hématoxyline est un colorant naturel qui ne possède pas de pouvoir de coloration maiselle s’oxyde, en présence d’air et de lumière en hématéine qui est le principal colorant(maturation).La coloration de Heidenhain est une technique histologique (la préparation ne doit passécher) régressive.Elle colore électivement les noyaux des amibes (le fer fixé sur les noyaux se combine àl’hématoxyline et forme une laque noire).1-Mordançage :Il faut d’abord mettre en contact les frottis avec une solution aqueuse d’alun de fer à 3 %à 37 ° pendant 30 mn à 12 heures.On effectue en fin d’amorçage un lavage à l’eau distillée.

2-Coloration :Les frottis sont colorés dans de l’hématoxyline à 1 % pendant 30 minutes à 12 heures,puis lavés à l’eau distillée.

Mordançage et coloration sont accélérées à l’étuve à 50- 60° C, les réactifs ne sont alorsplus réutilisables.3-Différenciation :La différenciation se ait au microscope avec d l’alun de fer de 1 à 3 % et consiste àenlever l’excés de laque ferrique.

Solution aqueuse d’alun de fer à 3 % :

Alun de fer………………….3 g Eau distillé………………….100 ml.

Hématoxyline à 1 % :

Hématoxyline à 10 % (dans de l’alcool à 90 %)…………………10 ml.

Eau distillé……………………………………………………………………….90 ml.


GRANDS COURS IPA

30

Pour cela on doit placer la lame dans une boite de pétri contenant une tige en verrecoudée, le frottis au dessus.La boite de pétri est placée sur une platine de microscope dont on aura ôté le chariot.La mise au point faite sur une zone riche en protozoaires au faible grossissement, ondéverse quelques gouttes du différenciateur et on suit la différenciation.Quant les structures nucléaires deviennent bien visibles, on lave la lame à l’eau distillée.(Si la différenciation est trop poussée, on pourra colorer le frottis à l’hématoxyline etreprocéder à la différenciation).

Coloration à l'hématoxyline ferrique (Heidenhain). Formevégétative d'E. histolytica / E. dispar Obj. x 100.

Coloration à l'hématoxyline ferrique (Heidenhain). Trois formes végétatives d'E. histolytica dontDeux contiennent des hématies. Obj. X 100. (Préparation W.B. Boeck, 1924, malade K).


GRANDS COURS IPA

31

C2-Trichrome de Wheatley :Avec cette coloration le cytoplasme est coloré en vert et la chromatine en rouge.Elle est indiquée en fait surtout pour les flagellés.Apres une coloration de 30 minutes, on rince les frottis dans de l’alcool acétique pendant20 à 30 mn.

C3-Méthode de Kohn :Pour cette technique, fixation et coloration se font en une seule étape par le noirchlorazol pendant 12 heures environ (temps à adapter au niveau de chaque laboratoireen fonction de sa propre expérience).Sur fond gris, les structures nucléaires se colorent en noir et le cytoplasme est incolore.

Trichrome :

Chromotrope 2R…………………..0.6 g

Vert lumière…………………………0.3g Acide phosphotungstique………0.7 g

Acide acétique……………………...1 ml

Eau distillée…………………………..100 ml

Acide acétique :

Alcool à 90 %....................10 ml.

Acide acétique ……………..1 goutte

Colorant de Kohn :

Noir chlorazol………………………………..…0.5 g

Alcool éthylique…………………………….…17 ml. Alcool méthylique…………………………...16 ml.

Acide acétique………………………………….2 ml. Phénol cristallisé fondu…………………….1.2 ml.

Acide phosphotungstique à 1 %........100 ml.

Faire la préparation dans un mortier et laisser murir plusieurs semaines à la lumière.


GRANDS COURS IPA

32

D-Montage des préparationsAprès avoir coloré des frottis humides, on doit procéder au montage, comme pour lespréparations histologiques.Pour cela il faut déshydrater les frottis de selles (dans des tubes de Borrel) par unegamme montante d’alcool (alcool à 60 °, 70 °,80°,90° et absolue), éliminer l’alcool par lexylène ou le toluène, puis monter au baume de canada (mettre une goutte de baume surle frottis et déposer par-dessus une lamelle).

Coloration au noir chlorazol (Kohn). Kyste ovalaire de Giardiaintestinalis. Obj. X 100.


GRANDS COURS IPA

33

VI.2.3-Coloration d’un frottis sec :

Méthode de Brook et Goldman (1947) :Utilise le fixateur polyvinylique.Une goute de matière fécale est mélangée sur une lame porte objet à une ou deuxgouttes de fixateurs. On place la lame à l’étuve à 37 ° pendant une nuitLa lame pourra alors être conservée plusieurs mois.La coloration du frottis se fait soit par l’hématoxyline ferrique soit au trichrome deWheatley.VI.2.4-Colorations spécifiques :

A-Coloration des cryptosporidies :Parmi les techniques pouvant être utilisées : Le Ziehl Neelsen modifié, le Heine, Latechnique de Koster, et la coloration au Giemsa.Méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henricksen et Pohlenz (1981) :Sur une lame dégraissée, un étalement de selles à partir d’un culot de centrifugationd’une méthode de concentration (Ritchie) , séché par agitation et fixé pendant 5 mn auméthanol est coloré dans de la fuchsine phéniquée pendant 1 heure à froid.Apres rinçage à l’eau du robinet , on asse la lame dans un bain d’acide sulfurique à 2 %pendant 20 secondes en agitant , puis après un nouveau rinçage, on pratique une autrecoloration pendant 5 mn dans du vert malachite à 5%.Les préparations rincées et séchés sont lues à l’immersion X100.Les Oocystes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur fond vert.

Fuchsine phéniquée

Solution A………………………10 ml.

Eau phéniquée à 5 %........90 ml

Solution A

Fuchsine……………….15 g

Ethanol à 95 %.........100 ml.


GRANDS COURS IPA

34

B-Coloration des microsporidies :2 méthodes de coloration classique (Trichrome de Weber, et Trichrome de Gomorimodifié par Deluol et Mahoun), et une coloration utilisant un microscope à fluorescencesont utilisées :Méthode de Trichrome de Gomori modifiée par Deluol et Mahoun :Un frottis fécale est réalisé après dilution de la selle au 1 / 3 dans du formol.La coloration se fait pendant 3 heures et après rinçage à l’eau acétique à 0.2 %, on contrecolore 30 secondes par du vert malachite à 1 %.Apres rinçage et séchage la lecture se fait à l’immersion X 100.Les spores de 1 à 1.5 um sont colorées en rose sur fond vert.

Coloration par Uvitex 2B : Fluorescence directe :En utilisant un fluorochrome à affinité sélective pour la chitine, on pourra mettre enévidence les microsporidies dans les selles par une coloration à l’Uvitex.La lecture se fait à l’objectif 100 au microscope à fluorescence.On obtient une fluorescence bleue pale sur fond noir.

Acide sulfurique à 2 % :

Acide sulfurique…………………..2 ml.

Eau distillée…………………………98 ml.

Vert malachite à 5 %

Vert malachite……………………5 g.

Eau distillée……………………….100 ml.

Colorant

Chromotrope……………………….2R.

Acide acétique cristallisé………1 ml.Apres 30 mn, on ajoute :

Acide phosphotungstique……2,6 g.

Eau distillée…………………………100 ml.


GRANDS COURS IPA

35

Il faudra toujours confirmer par une technique de coloration.C-Numération des œufs d’helminthes :La numération permet :

D’apprécier l’intensité du parasitisme :A partir du nombre d’oeufs par grammesde selles on déduit d’une manière approximative le nombre d’adultes présentsdans l’organisme.Exemple : 50 œufs de necator americanus correspondent à 2 adultes.100 œufs d’ascaris lumbricoides sont produits par 2 adultes.On pourra alors rattacher une anémie à son origine parasitaire (300 œufs /gramme de selles pour necator et 1000 œufs / gramme pour ankylostoma). D’évaluer l’efficacité é d’un traitement anti helminthique. D’avoir une idée sur l’infestation dans une collectivité humaine.Plusieurs méthodes existent, dont :

Méthode de Stoll :Une dilution de la selle est pratiquée dans de la soude caustique à 0.4 %On dilue 4 g de selles à compléter jusqu’à 60 ml de soude.Après homogénéisation on compte les œufs contenus dans 0.15 ml de liquide dedilution.Le nombre d’œufs contenus dans 1 gramme de selle =Méthode de Brumpt :C’est la méthode de Stoll simplifiée :1 à 5 gammes de selles sont dilués au 1 /10ou 1 / 20 (d) dans de la soude déci normale(0.1N).On compte le nombre de gouttes dans 1 ml de cette dilution (n),et le nombre d’œufscontenus dans 1 goutte (N).Le nombre d’œufs contenus dans 1 g de selle =Méthode de Kato-Katz :C’est la même technique que celle de Kato mais elle devient quantitative par le fait que lepoids de l’échantillon de selle à examiner est connu.On utilise pour cela une plaque perforée dont le diamètre et la profondeur sont connus.


GRANDS COURS IPA

36

On tamise la selle, on rempli le trou de a plaque appliquée sur la lame, on retire laplaque et on écrase la selle par la cellophane imbibée au préalable de solution de Kato.Il existe des plaques calibrées différentes (OMS) :6 mm de diamètre et 1 mm d’épaisseur= 50 mg6.5 mm de diamètre et 0.5 mm d’épaisseur = 20 mg.6 mm de diamètre et 1.5 mm d’épaisseur = 41.7 mg.


GRANDS COURS IPA

37


GRANDS COURS IPA

38


GRANDS COURS IPA

39

COPROLOGIE PARASITAIRE

Documents

Transcript of COPROLOGIE PARASITAIRE