CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE...
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Généralités UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES DE BIOCHIMIE OPTION : BIOTECHNOLOGIE/ MICROBIOLOGIE Présenté par : RAHARINJATO Fanja Hanitriniala Maître es Sciences Soutenu le : 28 décembre 2006 devant la commission d’examen composée de : Président : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette Rapporteur : Professeur ANDRIANARISOA Blandine Examinateurs : Docteur RAKOTO Danielle Doll Docteur : RAMAMONJISOA Daniel CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE, FONGICIDE ET LARVICIDE DE Cinnamosma madagascariensis
Transcript of CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE...
Généralités
UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT
DE
BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIESDE BIOCHIMIE
OPTION : BIOTECHNOLOGIE/ MICROBIOLOGIE
Présenté par :
RAHARINJATO Fanja HanitrinialaMaître es Sciences
Soutenu le : 28 décembre 2006 devant la commission d’examen composée de :
Président : Professeur RAZANAMPARANY Julia Louisette
Rapporteur : Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Examinateurs : Docteur RAKOTO Danielle Doll
Docteur : RAMAMONJISOA Daniel
CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES
BACTERICIDE, FONGICIDE ET LARVICIDE
DE
Cinnamosma madagascariensis
Remerciements i
REMERCIEMENTS
« Tout ce que vous faites, faites le de bon cœur comme pour le Seigneur » Colossiens 3 :22
Je remercie mes parents de leurs précieux conseils et encouragements tout au long de
mes études.
Je remercie également mon frère, ainsi que mes sœurs d’avoir porté dans leurs
prières la réalisation de ce travail.
« Confie ton activité au Seigneur et tu réalisera tes projets » proverbes 16 :3
Le présent travail a été réalisé dans les laboratoires de :
Biotechnologie et Microbiologie ; Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales,
Département de Biochimie Fondamentale et Appliquée, Faculté des Sciences
Microbiologie de l’environnement, au CNRE Tsimbazaza
Unité entomologie, à l’Institut Pasteur de Madagascar.
Je tiens à exprimer mes sincères remerciements aux honorables personnes qui ont voulu
de bonne grâce faire partie du Jury en qualité de :
Président : Professeur RAZANAMPARANY Louisette
Rapporteur : Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Examinateurs : Docteur RAKOTO Danielle Doll
Docteur RAMAMONJISOA Daniel
Remerciements ii
Je témoigne ma profonde gratitude plus particulièrement à:
Monsieur le Professeur JEANNODA Victor, Chef de département de Biochimie
Fondamentale et Appliquée, Responsable des formations en 3e cycle, de m’avoir
donner la permission de soutenir ce travail.
Madame le Professeur ANDRIANARISOA Blandine, chef des Laboratoires de
Biotechnologie et Microbiologie, notre encadreur, pour son soutien et ses conseils
permanent, malgré ses nombreuses responsabilités.
Madame le Professeur RAHARISOLOLALAO Amélie ,Directeur de Laboratoire de
Chimie des Substances Naturels et de Chimie organique, pour sa grande contribution à
la réalisation de ce travail.
Monsieur le Docteur Antoine TALARMIN, Directeur de l’Institut Pasteur de
Madagascar, de m’avoir permis à réaliser une partie de ce travail dans l’Unité
Entomologie.
Monsieur le Docteur Jocelyn RATOVONJATO et à toute l’équipe de l’unité
Entomologie, qui m’ont beaucoup aidée le long de mon stage.
Monsieur le Docteur HARINANTENAINA Liva, enseignant chercheur de
TOKUSHIMA BUNUI University, Faculty of pharmaceutical Sciences, JAPAN, pour la
proposition du sujet, sa franche collaboration et son encouragement dans la réalisation
de ce mémoire.
A toute l’équipe du Laboratoire de Microbiologie de l’environnement, en me faisant
bénéficier leur expérience et leur compétence.
A tous les enseignants et les personnels du Département de Biochimie Fondamentale et
Appliquée.
Je remercie également mes ami(e) s et tous ceux qui, ont contribué de près ou de loin à
l’élaboration de ce mémoire, vos prière m’ont beaucoup aidée.
Abreviations
ABREVIATIONS ET ACRONYMES
C/M/E : Chloroforme/Méthanol/ Eau
°C : Degré Celsius
CCM : Chromatographie sur couche mince
CL 99 : Concentration létale 99%
CL 50 : Concentration létale 50%
CMB : Concentration Minimale Bactéricide
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
C.N.R.E : Centre National de la Recherche sur l’Environnement
HCl : Acide chlorhydrique
IPM : Institut Pasteur de Madagascar
Min : Minute
NaCl : Chlorure de Sodium
pH : Potentiel d’hydrogène
p/p : Poids par poids
p/v : Poids par volume
UV : Ultrat-violet
v/v : volume par volume
µg : Microgramme
µl : Microlitre
iii
Glossaire
GLOSSAIRE
Anthropophile : qui vit dans un milieu fréquenté par l’homme
Cycle biologique de moustiques : La succession des stades pré-imaginaux aquatiques
(œuf, larves, nymphe) et du stade imaginal aérien
(adultes).
Gravide : Qui porte un embryon.
Imago : Insecte adulte arrivé à son complet développement et apte à
se reproduire
Otite : nom donné à toute inflammation de l’oreille
Stade larvaire : L’ensemble des phénomènes qui commencent à l’éclosion
de l’œuf jusqu’à la formation des nymphes
Septicémie : Infection générale grave de l’organisme, caractérisée par
des décharges importantes dans le sang des germes
pathogènes.
Suppuration : production de pus
iv
Liste des tableaux
LISTE DES FIGURES Pages
Figure 1: Photo de : Cinnamosma madagascariensis………………………………………..7
Figure 2: Distribution géographique et lieu de récolte de l’espèce……………………….…..8
Figure 3: Antibiogramme sur Staphylococcus aureus de 5 extraits issus des différentes
méthodes d’extraction………………………………………………………….....21
Figure4 : Schéma récapitulatif du procédé d’extraction et de fractionnement………………23
Figure 5: Chromatographie de E1 et des 5 fractions révélées avec la vanilline sulfurique…..24
Figure 6: Morphologie externe de la femelle de Anopheles gambiae et Aedes albopictus....43
Figure 7: Elevage des adultes………………………………………………………………..45
Figure 8: Cycle biologique de moustiques…………………………………………………..46
Figure 9: Elevage des larves………………………………………………………………....47
Figure10 : Observation après coloration Gram de Staphylococcus aureus
et Escherichia coli……………………………………………………………….48
Figure11:Antibiogramme……………………………………………………………………52
Figure 12: Staphylococcus aureus sur milieu Baird –Parker………………………………..52
Figure 13: Trichophyton rubrum sur milieu Sabouraud………………………………….....53
Figure 14: Bacillus cereus sur Selectif Cereus Agar………………………………………..54
Figure 15: Spectre d’activité de EB et ses 4 fractions sur Bacillus cereus………................55
Figure 16: Spectre d’activité de EB et ses 4 fractions sur Candidaalbicans………………..56
Figure 17: Détermination de la CMI sur milieu solide de F1 sur Bacillus Cereus………….58
Figure 18: Détermination de la CMI sur milieu solide de
Staphylococcus aureus………………………………………………………….59
Figure 19: Détermination de la CMI sur milieu solide de
Candida albicans………………………………………………………………..59
v
Liste des tableaux
LISTE DES TABLEAUX Pages
Tableau 1: Caractéristiques des extraits obtenus par les différentes
techniques d’extraction :…………………………………………………..19
Tableau 2: Effets des 5 extraits sur les germes tests………………………………………20
Tableau 3: Données qualitatives de EB avec ses différentes fractions semi- purifiée…….22
Tableau4: Résultats du criblage phytochimique de EB et ses fractions…………………..26
Tableau 5: Liste des souches microbiennes testées …………………………………...29-30
Tableau 6: Norme utilisée pour la lecture des résultats d’un antibiogramme…………….40
Tableau 7: Liste des antibiotiques recommandés pour les germes utilisés……………….42
Tableau 8: Les caractères morphologiques des souches bactériennes…………………….49
Tableau 9: Les caractères culturaux des souches………………………………………….50
Tableau 10: Les caractères biochimiques des bactéries à Gram –…………………………51
Tableau 11: Les caractères culturaux des 3 souches microbiennes sur milieux sélectifs….51
Tableau 12: Mesure du diamètre des halos d’inhibition de EB et ses fractions…………...54
Tableau 13: Détermination de la CMI sur milieu liquide de EB et la fraction F1
vis- à –vis de Bacillus cereus …………………………………...........................................56
Tableau 14: Détermination de la CMI sur milieu liquide de EB et la fraction F3
vis- à - vis de Staphylococcus aureus………………………………………………………57
Tableau 15: Détermination de la CMI sur milieu liquide de EB et la fraction F3
vis- à –vis de Candida albicans ……………………………………………………………57
Tableau 16: Concentration Minimale Bactéricide de EB et ses fractions………………….59
Tableau 17: Pourcentage de mortalité des larves Anopheles gambiae
en fonction de la concentration en EB………………………….…………..60
Tableau 18: Pourcentage de mortalité des larves Aedes albopictus
en fonction de la concentration en EB ……………………………………..60
Tableau 19: Résultats des CL 50 et CL 99 de l’EB sur les larves
de moustique……………………………………………………………..…61
vi
TABLE DES MATIERES
RemerciementsAbréviations et acronymesGlossaireListe des figuresListe des tableaux
INTRODUCTION………………………………………………………………… 1
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I- Les pesticides…………………………………………………………………… 3I-1 Définition………………………………………………………………. 3I-2 Classification…………………………………………………………... 3I-3 Insecticides……………………………………………………………... 3
II- Les canellaceae………………………………………………………………... 4II-1 Caractères généraux………………………………………………….... 4II-2 Le genre Cinnamosma madagascariensis…………………………….. 4
II-2-1 Classification………………………………………………… 4II-2-2 Utilisation…………………………………………………… 4
DEUXIEME PARTIE : ETUDES CHIMIQUES DES EXTRAITS DE LA PLANTE Cinnamosma madagascariensis
I- Introduction……………………………………………………………..…….. 5
II- Matériels et méthodes…………………………………………………...….... 5 II-1 Matériels………………………………………………………………..…… 5 II-1-1 Le matériel végétal…………………………………………………..…. 5
A- Description botanique………………………………………………….. 5B -Distribution géographique et lieu de récolte…………………………… 6C – Préparation du matériel végétal……………………………………….. 6
II- 1-2 Les produits chimiques………………………………………. 6
II-2 Méthodes……………………………………………………………………. 9 II-2-1 Méthodes d’extraction………………………………………………….. 9
A – Extraction à froid………………………………………………………. 9 A –1 Extraction aqueuse et hydroalcoolique à froid…………………….. 9 A- 2 Macération à l’éthanol absolu………………………………………. 9B – Extraction à chaud……………………………………………………… 9
II-2-2 Méthodes de purification ………………………………………………. 9A – Partage liquide – liquide……………………………………………….. 10B – Filtration sur charbon actif…………………………………………….. 10C – Précipitation par l’acétate neutre de plomb…………………………… 10
II-2-3 Méthode de concentration……………………………………………... 11 II -2-4 Détermination de la concentration et du Rendement……………… 11
II-2-5 Méthodes analytiques………………………………………………..... 11
A – Chromatographie sur couche mince………………………………….. 11 A -1 Principe…………………………………………………………….. 11 A-2 Technique…………………………………………………………… 11
B – Réaction de détection des familles chimiques………………………… 12 B -1 Les alcaloïdes……………………………………………………. 13
Test de Mayer, Wagner et Dragendorff…………………………… 13 B -2 Les tanins et les polyphenols…………………………………… 13
B -2 -1 Test à la gélatine…………………………………………… 14B -2 -2 Test à la gélatine salée…………………………………….. 14
B -3- 3 Test au chlorure ferrique………………………………………………….. 14 B- 3 Les triterpènes, stéroides, et les stérols insaturés……………… 14
B- 3- 1 Les stéroides et les tritèrpènes : test de Lieberman Burchard………………………………… 15
B- 3- 2 Les stérols insaturés : test de Salkowski……………………. 15 B - 4 Les anthraquinones : Test de Bornträger………………………... 15 B - 5 Les flavonoides et les leucoanthocyanes……………………….. 16
B -5 -1 Les flavonoïdes: test de Wilstater………………………….. 16B- 5- 2 Test de Bath- Smith………………………………………… 16
B - 6 Les saponines……………………………………………………. 16 B -7 Les desoxyoses : Test de Keller – Killiani……………………… 17 B - 8 Les iridoides……………………………………………………... 17
III – Résultats…………………………………………………………………….. 17 III - 1 Extraction…………………………………………………………………. 17 III - 2 Test Préliminaire…………………………………………………………. 18 III - 3 Purification………………………………………………………………... 20 III - 4 Etudes Analytiques………………………………………………………... 23 III - 4 -1 Chromatographie sur couche mince………………………………. 23 III - 4 -2 Criblage phytochimique……………………………………………… 24
IV – Discussions et conclusion…………………………………………………… 26
TROISIEME PARTIE : ETUDE BIOLOGIQUE
I- Introduction……………………………………………………………………. 27
II – Matériels et méthodes……………………………………………………….. 28
II-1 Matériels et méthodes pour l’étude des effets des extraits sur la croissance microbienne…………………………………………………………. 28
II -1-1-Matériels…………………………………………………………… 28A- Les microorganismes…………………………………………………………… 28B– Les milieux de cultures………………………………………………………….. 28
B -1 Les milieux utilisés pour l’étude des bactéries………………………… 28B - 2 Les milieux utilisés pour l’étude des souches
Fongiques………………………………………………….. 30C - Les disques pour antibiogramme……………………………………………… 31
D - La stérilisation………………………………………………………………… 31E - Les antibiotiques de références………………………………………………… 31
II -1 2 Méthodes………………………………………………………….. 31A – Identification des microorganismes………………………………………....... 31
A -1 Etude des caractères morphologiques et culturaux……………........ 31 A -1 -1 Examen macroscopique……………………………………...... 31 a – Principe…………………………………………………………... 31 b – Mode opératoire…………………………………………………. 31 A -1- 2 Examen microscopique……………………………………....... 32 A -1-2 -1 Observation à l’état frais……………………. ………...... 32 a – Principe……………………. ………………………………......... 32 b – Mode opératoire…………………………………………………. 32 A – 1 -2 -2 Observation après coloration Gram……………………. 32 a – Principe………………………………………………………....... 32 b – Mode opératoire……………………. ………………………........ 33 A -2 Etude des caractères biochimiques…………………………….….... 34 A -3 Etude des germes sur milieu sélectif……………………………...... 36 A – 3- 1 Milieu Baird –Parker…………………………………….….... 36 a – Principe………………………………………………………....... 36 b – Mode opératoire……………………………………………......... 36 A – 3 -2 Milieu Cereus Sélectif Agar………………………….............. 36 a – Principe………………………………………………………....... 36 b – Mode opératoire……………………………………………….… 36 A -3 -3 Milieu Sabouraud…………………………………………….... 37 a – Principe…………………………………………………………... 37 b – Mode opératoire…………………………………………………. 37
B – Spectre d’activité anti – microbienne des extraits…………………………….. 37 B – 1 Le test d’antibiogramme……………………………………... …... 37 a- Principe………………………………………………………….... 37 b- Mode opératoire………………………………………………. …. 38 B – 2 Détermination de la CMI et de la CMB…………………………... 40 B -2-1 Détermination de la CMI………………………………………. 40 B – 2-1-1 Méthode de disque sur milieu solide……………….......... 40 B – 2-1-2 Méthode de disque sur milieu liquide………………….... 40 B -2-1 Détermination de la CMB…………………………………....... 40
II-2 Matériels et méthodes pour l’étude des effets de l’extrait sur les larves de moustique…………………………………………………………………………. 41
II -2-1-Matériels ………………………………………………………..... 42A- Les moustiques ………………………………………………………………… 42B- L’insectarium ………………………………………………………………….. 42
II -2 2-Méthodes ………………………………………………………… 43A – Collecte de moustiques ……………………………………………………..... 43
A-1 Anopheles gambiae ………………………………………………… 43 A-2 Aedes albopictus ……………………………………………………. 43
B- Technique d’élevage……………………………………………………………. 43 B-1 Elevage des adultes …………………………………………………. 43
B-2 Méthode de collecte des œufs ………………………………………. 44 B-3 Elevage des larves …………………………………………………. 44
C- Test de sensibilité aux larves de moustiques …………………..……………….. 45 C -1 Etablissement de la ligne de base ………………..………………….. 45 C- 2 Détermination de la CL 50 et CL 99………………..……………….. 46
III Résultats………………………………………………………………………… 47
III – 1 Effets des extraits sur les microorganismes………………..……………….. 47 III-1-1 Etude microbiologique…………………………………………………… 47A – Caractères morphologiques……………………………………………………… 47B – Caractères biochimiques des bactéries Gram -…………..………………………. 47C- Caractères culturaux sur milieu sélectif ………………………………………….. 51
III – 1 -2 Effets des extraits sur la croissance microbienne ………………… 53A –Test d’antibiogramme …………………………………………………………… 53B – Détermination de la CMI et de la CMB ……………………………………… 56
B-1 Détermination de la CMI …………………………………………….. 59 B-2 Détermination de la CMB…………………………………………….. 60
III -2 Effets des extraits sur les larves de moustiques……………………………… 60A- Etablissement de la ligne de base………………………………………………... 61B- Détermination de la CL 50 et CL 99 …………………………………………….. 61
IV- Discussions et conclusion ……………………………………………………… 62
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES……………………............. 64ANNEXESREFERENCES BIBLIOGRAPHIQUESRESUME
Introduction
Sur une population mondiale de plus de 6 milliards d’habitants, 2,2 milliards sont
exposés à des infections paludéennes dans quelques 90 pays. Selon les estimations les plus
récentes, il y aurait 400 à 500 millions de cas cliniques chaque année, dont plus de 90% dans
les pays de l’Afrique tropicale [3,49]. En outre, d’après la statistique de l’OMS, le paludisme
provoque chaque année dans le monde un nombre de décès qui se situe entre 1,4 à 2,6
millions, dont plus de 90% dans les pays tropicaux de l’hémisphère sud. Ce sont les
conditions climatiques de ces pays qui favorisent la prolifération des maladies transmises par
des moustiques comme le paludisme, la filariose et actuellement la dengue et la fièvre
chikungunya [31, 52]. Aussi, près des deux cinquièmes de la population mondiale dans 100
pays, sont menacés par des épidémies de dengue. Particulièrement à Madagascar, en Asie et
dans les Iles de l’Océan Indien, la fièvre chikungunya a récemment provoqué d’importantes
épidémies et est devenue un problème majeur de santé publique. Mais pour le moment il
n’existe aucun vaccin ni traitement de cette maladie. Ainsi, une des solutions pour enrayer
cette épidémie est la lutte antivectorielle [31,52].
Pour lutter contre les maladies vectorielles, des insecticides synthétiques tels que les
substances organophosphorées (fenitrothion, malathion) et organochlorées (DDT, lindane) ont
été employés mais ils se sont révélés toxiques pour l’environnement [24, 49,24]
Le DDT a pollué les nappes phréatiques et les glaces polaires,
Le lindane pourrait provoquer des cancers chez les agriculteurs et plus récemment le
friponil est suspecté d’engendrer des oedèmes chez les utilisateurs. Ainsi, l’utilisation
des produits chimiques peut à long terme nuire gravement à la santé publique par la
présence des résidus qui provoquent de nombreuses intoxications (allergies, effets
cancérigènes, pathologie du foie et du poumon, troubles hormonaux),
A cause du rythme de reproduction des insectes et leur exceptionnelle capacité de
s’adapter à l’environnement, des problèmes de résistance sont apparus et constituent l’une des
causes de l’échec des programmes d’éradication du paludisme [53, 54,55].
Malgré la production de nouveaux antibiotiques par les industries pharmaceutiques
pendant ces trois dernières décennies, l’utilisation répétée des agents antimicrobiens et
l’insuffisance des contrôles des maladies ont mené à la résistance des microorganismes aux
antibiotiques [45, 63].
1
Introduction
Face à ces problèmes, des substances naturelles d’origine animale, végétale ou
microbienne peuvent apporter des solutions pour diminuer la pollution de l’environnement,
ainsi que le problème de résistance et d’effets toxiques. On peut citer :
L’espèce Bacillus thuringiensis qui est les bio-insecticides le plus utilisé dans le
monde [4].
Le genre Bacculovirus, un virus exclusivement pathogène d’invertébrés qui a été exploité et
est classé maintenant parmi les bio-insecticides. A ce jour, deux préparations
(carpovirusine et Mamestrine) à base de Bacculovirus ont été homologuées, elles sont
produites par la Société NPP (Natural Plant Product) [4].
Des extraits de Dichtyota une algue marine tuent les larves d’Anopheles stephensi [10];
l’huile essentielle d’Ageratum conyzoides tue les larves de Aedes aegipti Le genre
Gambusia affinis, un poisson larvivore est considéré comme le moyen de lutte
antimoustique le plus efficace en Tunisie [22]. En outre, dans le domaine des cosmétiques,
différentes sortes d’huiles essentielles sont maintenant commercialisées pour entretenir la
peau.
Dans le cadre de la lutte antivectorielle, cette étude recherche l’activité larvicide et le
pouvoir antibactérien des extraits de Cinnamosma madagascariensis. Les enquêtes effectuées
auprès des guérisseurs et des tradi- praticiens avec les données bibliographiques ont indiqué
que cette plante a des vertus médicinales [7, 8, 58]. De plus, son endémicité et sa rareté sont
les raisons pour lesquelles nous l’avons choisie comme matériel d’étude.
La première partie de ce mémoire présente les généralités, la deuxième partie
concernera l’étude chimique des extraits de C. madagascariensis. La troisième partie
présentera les travaux biologiques réalisés sur les différents extraits. La conclusion générale et
les perspectives constituent la dernière partie
2
Etude chimique
PREMIERE PARTIE :
GENARALITE
Généralités
I- LES PESTICIDES
I-1 DEFINITIONLes pesticides sont des produits phytopharmaceutiques contenant des substances
naturelles ou synthétiques destinées à :
protéger les végétaux contre les organismes nuisibles
lutter contre les vecteurs de maladies humaines
détruire les animaux ravageurs de cultures
II-2 CLASSIFICATIONCes produits se repartissent en plusieurs classes [56]:
Les fongicides agissent sur les champignons
Les herbicides détruisent les mauvaises herbes
Les rodenticides combattent les rongeurs
Les bactéricides agissent sur les bactéries parasites
Les insecticides agissent sur les insectes.
II-3 INSECTICIDES [56]
Selon leurs origines, on peut les classer en 2 catégories:
Les insecticides biologiques :
Ce sont des insecticides préparés à partir d'organismes vivants ou des substances qu'ils
produisent. Ils sont produits sur le principe de la lutte biologique. Les bio-insecticides sont
très spécifiques : chacun n'est actif que sur un nombre limité d'espèces. Ils respectent donc les
autres espèces de l’écosystème.
Les insecticides chimiques:
Ce sont des insecticides de synthèse, ils se répartissent en 4 classes selon leur
composition chimique :
• Les organochlorés (DDT, HCH, Lindane,..)
• Les carbamates (Propoxur,..)
• Les organophosphorés (Malathion, Fenitrothion.)
• Les pyréthrinoïdes (Perméthrine, Deltaméthrine,..)
3
Généralités
II LES CANELLACEAEII-1 CARACTERES GENERAUXLa famille des Canellaceae appartient à l’embranchement des Angiospermes, à la
classe des Dicotylédones. Ce sont des arbres aromatiques et de saveur brûlante dans toutes ses
parties. Elle ne comporte que 9 espèces, groupés en 4 genres [9,33, 42].
Winteranna et Cinnamodendron sont endémiques de l’Amérique du Sud,
Warburgia est endémique de l’Afrique de l’Ouest
Cinnamosma, endémique et seul représentant de la famille à Madagascar.
Le genre Cinnamosma comprend 3 espèces :
Cinnamosma fragrans, colonisatrice des sables entre 0 et 800m d’altitude, pousse en
abondance dans la région Nord de Madagascar.
Cinnamosma macrocarpa dans la forêt orientale entre 0 à 300m
Cinnamosma madagascariensis qui pousse surtout dans la partie Est de l’île.
II- 2- LE GENRE C. madagascariensis :I -2-1Classification : [42]
Règne : VEGETAL
Embranchement : ANGIOSPERMES
Classe : DICOTYLEDONES
Super Ordre : MAGNOLIDAE
Ordre : MAGNOLIALE
Famille : CANELLACEAE
Genre : Cinnamosma
Espèce : madagascariensis
Noms vernaculaires : Sakaihazo, Hazomafana
I-2-2 Utilisation : [33, 58, 61]D’après la littérature et nos enquêtes sur terrain, outre son pouvoir mystique, les
guérisseurs l’emploient comme anti- diarrhéique, anti-tussif et pour lutter contre les maladies
vénériennes. Par son goût brûlant, on la fait boire sous forme de tisane aux femmes qui
viennent d’accoucher pour éviter la tranchée utérine.
4
Généralités
DEUXIEME PARTIE :ETUDES CHIMIQUES DES EXTRAITS DE LA PLANTE
5
Etude chimique
I- INTRODUCTION
Les données bibliographiques ont montré que les principaux constituants du principe
actif du genre Cinnamosma sont les sesquiterpenoides, les alcaloïdes et les flavonoïdes
[25, 70]
• Ferrari et Casagrande en 1969 ont identifié la structure de 3 sesquiterpenoides
(Cinnamolide, Cinnamosmolide et Cinnamodial) dans les extraits de C. fragrans
• Ferrari et Vecchietti en 1979 ont isolé 2 alcaloïdes dans les extraits de C.
madagascariensis
• L’huile essentielle de C .fragrans est connue pour ses vertus médicinales.
Pour notre part, nous avons étudié les extraits de C. madagascariensis.
II- MATERIELS ET METHODES
II-1 MATERIELSII-1-1 Le matériel végétal
A-DESCRIPTION BOTANIQUE [7, 9, 33]
Cinnamosma madagascariensis est un arbre qui peut atteindre une hauteur de 10 à
20m, rarement arbuste.
Les feuilles sont simples, alternes, ovales, lancéolées. Elles ont 4 à 8 cm de longueur et 2 à 4
cm de largeur. Généralement, elles sont plus ou moins coriaces, épaisses, vert foncé sur les
deux faces, d’aspect lisse luisant. Le pétiole est court et épais (lignifié). La nervure latérale est
souvent visible et peu saillante sur la face inférieure.
Les fleurs sont solitaires ou plus ou moins fasciculées par 3 à 5.
La figure 1 montre le genre Cinnamosma madagascariensis.
5
Figure 1 : Cinnamosma madagascariensis
B-DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE ET LIEU
DE RECOLTE [53, 58]
Cette plante est très fréquente dans des zones à climat humide du coté de versant
oriental de Madagascar, dans la forêt d’Analamazaotra, à Andasibe, dans la station forestière
de Lakato, et dans les environs de Fénérive Est. Au Sud de Madagascar, il apparaît depuis le
niveau de la mer à 50m d’altitude (Ste Luce et Fort –Dauphin). Au Nord, il se trouve dans la
forêt d’Analabe, dans la partie d’Ambodisatrana et Ampitiliantsambo. Au centre, il pousse
entre 950 à 1150m d’altitude dans la région de Ranomafana. La plante a été récoltée au mois
de Juillet 2005 dans la forêt de Lakato à Moramanga, Faritany de Toamasina.
La figure 2 montre le lieu de récolte et les points de localisation de C. madagascariensis
Figure 2: Point de localisation et lieu de récolte de Cinnamosma madagascariensis
C-PREPARATION DU MATERIEL VAGETAL
Les écorces de tige fraîche sont séchées à l’abri du soleil pendant deux semaines, puis
réduites en poudre à l’aide d’un microbroyeur CULATTI. La poudre ainsi obtenue constitue
notre matériel d’étude, elle est mise dans une boite stérile et conservée à la température
ambiante.
II-1-2 Les produits chimiques:Les produits chimiques utilisés pour réaliser ce travail sont de qualité pour analyse, de
marque MERCK, PROLABO, LABOSI.
Des plaques de gel de silice 60F254 de dimensions 20x20cm, d’épaisseur 0,2mm sont
utilisées pour la chromatographie sur couche mince.
II- 2 METHODESII-2-1 Méthode d’extraction
A- EXTRACTION A FROID
A-1 Extraction aqueuse et hydroalcoolique à froid
La poudre végétale est mise en suspension dans le solvant d’extraction constitué par
de l’eau distillée ou de l’éthanol à 75%, suivant un rapport 1/10, c'est-à-dire 1g de poudre
dans 10ml de solvant. L’ensemble est soumis à une agitation magnétique pendant 3h à la
température ambiante, puis laissé macérer pendant une nuit à +4° C. Après une réagitation de
30min, le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze pour éliminer le résidu solide. Le filtrat
est ensuite centrifugé à 8000g pendant 30min. Le culot est éliminé et le surnageant est
récupéré et concentré par évaporation sous pression réduite. L’extrait concentré est ensuite
lyophilisé. La poudre obtenue constitue notre extrait aqueux ou hydroalcoolique brut à froid.
A-2 Macération à l’éthanol absolu :
La poudre végétale est macérée dans de l’éthanol dans un rapport 1/10 (p/v) pendant 3
jours à la température ambiante. Le macérat est filtré sur 4 épaisseurs de gaze pour éliminer
les tourteaux. Le filtrat est ensuite centrifugé à 8000g pendant 30mn. Le surnageant est
récupéré. La suite de la manipulation est identique à celle de l’extraction hydroalcoolique. La
poudre obtenue après lyophilisation constitue notre extrait éthanolique brut à froid.
B- EXTRACTION A CHAUD
La poudre végétale est délayée dans le solvant d’extraction (eau distillée ou éthanol),
suivant un rapport 1/10 (p/v). Le mélange obtenu est chauffé à reflux pendant 2h sous
agitation magnétique à la température ambiante, la décoctée est laissée macérer pendant une
nuit au réfrigérateur
+4 °C. La suite de la manipulation est la même que pour les extractions à froid. La poudre
obtenue après lyophilisation constitue notre extrait aqueux ou éthanolique brut à chaud.
L’extrait brut présentant le plus grand halo d’inhibition sur Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Candida albicans sera choisi pour la suite de notre expérience [43].
II-2-2 Méthode de purificationUn fractionnement suivant une polarité croissante est réalisé sur l’extrait brut EB.
Différentes étapes comme le traitement par la chaleur, la précipitation par l’acétate neutre de
plomb (ANP), la filtration sur charbon actif, ont été effectuées pour purifier le principe actif et
pour compléter les données sur ses propriétés physico- chimiques.
Cette purification partielle est guidée à la fois par des tests d’antibiogramme sur les souches
de Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Candida albicans, et par le test d’homogénéité
par chromatographie sur couche mince avec comme solvant le système
Chloroforme/Méthanol/Eau (17/6/1) (v/v).
A- PARTAGE LIQUIDE- LIQUIDE [15, 26, 27, 29, 67]
Il s’agit d’un fractionnement suivant une polarité croissante.
A -1 Principe :Le partage liquide –liquide est une technique de séparation basée sur la solubilité d’un
soluté entre 2 solvants non miscibles de polarités différentes.
A -2 technique:L’extrait brut est repris dans de l’eau distillée et introduit dans une ampoule à
décanter. Un égal volume d’hexane y est ajouté, et pour qu’il y ait plus de contact, une
agitation est effectuée. Le mélange est ensuite laissé au repos, puis par décantation 2 phases
sont obtenues: une phase hexanique (organique) supérieure et une phase aqueuse inférieure.
Cette dernière est soumise, de nouveau, à 2 autres fractionnements successifs avec l’hexane.
Toutes les fractions hexaniques sont rassemblées puis évaporées. Les traces d’hexane se
trouvant dans la phase aqueuse sont également évaporées. Cette fraction hexanique est notée
F1
Ensuite, un égal volume d’acétate d’éthyle est ajouté dans la phase aqueuse. Après agitation et
décantation la phase acétate éthylique est retirée tandis que la phase aqueuse va subir 2 autres
fractionnements successifs avec le même solvant. Toutes les fractions acétate éthylique sont
rassemblées. La fraction obtenue après évaporation est notée F2. La phase aqueuse est ensuite
traitée de la même manière que précédemment, mais cette fois ci avec le butanol. La fraction
butanolique est notée F3.
B- FILTRATION SUR CHARBON ACTIF [35]
B -1 Principe :Le charbon actif est un support chromatographique adsorbant des composés ayant
entre autres un noyau aromatique. Cette technique est utilisée pour décolorer les extraits
B -2 Méthode :Dans un entonnoir bouché avec des fibres de verre, une couche de charbon actif est
déposée (Jeannoda, 1986).
L’entonnoir est ensuite adapté à une fiole reliée à une pompe à vide. Après humidification
préalable de la couche de charbon actif avec de l’eau distillée, l’extrait à traiter est filtré sous
pression réduite. Enfin, une filtration sur papier filtre de l’extrait recueilli dans la fiole à vide
est nécessaire pour éliminer les fines particules de charbon.
C - PRECIPITATION PAR L’ACETATE NEUTRE DE
PLOMB (ANP)
0.1 Principe :L’ANP est un sel de métal lourd. Il permet d’éliminer diverses substances dont les
protéines, les acides nucléiques, les tanins et d’autres substances phénoliques.
0.2 Mode opératoireUne solution de 0,5ml d’acétate neutre de plomb (20% p/v) est versée goutte à goutte
dans 50ml d’extrait brut sous agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par
centrifugation de 10min à 27200g. L’excès de plomb est éliminé par précipitation à l’aide
d’une solution de phosphate disodique 10% (p/v). Le précipité éventuel est écarté par une
deuxième centrifugation.
II-2-3 Méthode de concentration
L’évaporation du solvant ou la concentration des différents extraits est effectuée à
50°C à l’aide d’un évaporateur rotatif HEIDOLPH. La pression est réduite à l’aide d’une
pompe à vide.
II-2-4 Détermination du rendement
Les différents extraits et la fraction obtenue lors de la purification sont évaporés à sec.
Le résidu est pesé afin de déterminer sa concentration et son rendement. Ce dernier a été
calculé d’après la relation :
R : rendement en Pourcentage (%)
Pv : poids du ballon vide (g)
Ps : poids du ballon avec le résidu sec (g)
Q : poids de la poudre de départ (g)
II-2-5 Méthodes analytiques
A-CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)
[5, 28, 57, 71, 72]
A-1 Principe :C’est une chromatographie liquide d’adsorption. La phase mobile est un mélange de
solvants, la phase fixe est un solide finement pulvérisé sur un support en verre ou plastique
doué de propriété adsorbante. Ainsi, la séparation des substances est en fonction de leur
affinité pour l’adsorbant (support de chromatographie) d’une part, et de leur solubilité dans le
Ps – P v
R= x 100
Q
système de solvants d’autre part. Généralement en CCM, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires.
A -2 Technique :o Dépôt de l’échantillon :
La plaque de verre de gel de silice est découpée aux dimensions voulues et réactivée
pendant 10mn à l’étuve à 100°C. Puis, des fins traits horizontaux de 7mm espacés de 6mm
sont tracés au crayon, à 2cm du bord inférieur et à 1,5cm de chaque bord latéral de la plaque.
Pour chaque extrait à chromatographier, 4 à 6 dépôts sont effectués sur chaque trait à l’aide
d’un capillaire de verre. Puis les dépôts sont séchés à l’aide d’un séchoir à main.
o Développement :
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque, il s’agit d’une
chromatographie ascendante. La plaque préalablement préparée est placée en position
verticale dans une cuve contenant le solvant qui monte par capillarité
Du papier filtre imbibé de solvant de migration est placé contre la paroi de la cuve pour
qu’elle soit saturée par les vapeurs d’éluant. Quand le front du solvant arrive à 0.5cm du bord
supérieur de la plaque, la chromatographie est arrêtée. La plaque est enfin retirée de la cuve et
séchée à l’aide d’un séchoir à main.
o Révélation du chromatogramme :
Le chromatogramme est révélé par 2 méthodes :
1 e méthode :
Les substances sont observées directement sous lumière ultra- violette aux longueurs
d’onde égale à 254nm et 366nm.
2 e méthode :
La plaque est pulvérisée avec le réactif à la vanilline sulfurique qui permet de
visualiser les constituants chimiques sous forme de taches. C’est un réactif universel pour
révéler les substances ayant des chaînes carbonées suffisamment longues.
B DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES [11, 12, 23]
Le criblage phytochimique est l’ensemble des tests physico- chimiques qui font
apparaître soit une précipitation, soit une coloration. C’est une méthode générale utilisée pour
faire l’inventaire des grandes familles chimiques (alcaloïdes, tanin..) présentes dans l’extrait
ou la fraction à analyser.
La détection de chaque famille chimique est réalisée à partir de 1ml d’extrait évaporé à sec.
B -1 ALCALOIDES [11, 12]
Ce sont des composés organiques d’origine naturelle, azotés, plus ou moins basiques,
doués à faible dose des propriétés pharmacologiques marquées (antibiotique, antipaludéenne).
Ils peuvent être précipiter par les métaux lourds, d’où leur caractérisation par les réactifs
suivants :
Réactif au mercure-ioduré de potassium (Mayer)
Réactif à l’iodobismuthite de potassium (Dragendorff)
Réactif iodo-ioduré (Wagner)
Déroulement des tests : Le résidu d’évaporation à sec est macéré dans 4 ml d’acide chlorhydrique 2N pendant
10mn. Le macérât est filtré sur papier filtre et la solution limpide est répartie dans 4 tubes à
essai :
Le 1e sert de témoin
Les 3 autres sont utilisés pour le test avec les réactifs de Mayer, Wagner, et
Dragendorff.
Quatre gouttes de chaque réactif sont additionnées dans chacun des 3 tubes. La
présence d’alcaloïdes est signalée par un précipité ou une floculation. Si ces derniers se
dissolvent après ajout d’éthanol à 80%, la présence d’alcaloïdes dans l’extrait est confirmée.
B -2 LES TANINS ET LES POLYPHENOLS
[11,12]
Ce sont des composés polyphénoliques, ayant parfois des propriétés antiseptiques et
antidiarrhéiques. Ils précipitent les protéines comme la gélatine.
On distingue 2 types de tanins :
Tanins hydrolysables
Tanins non hydrolysables ou tanins condensés
Déroulement des tests : Le résidu d’évaporation à sec est repris dans 4ml d’eau distillée chaude. La solution
est ensuite partagée dans 4 tubes à essai :
Le 1e tube sert de témoin
Les 3 autres pour la détection et l’identification des tanins, ainsi que des autres
composés polyphénoliques.
B -2-1 Test à la gélatine:Trois gouttes de gélatine 1% sont additionnées dans le 2e tube. Si l’extrait contient des
tanins hydrolysables de type catéchique, une floculation apparaît.
B -2-2 Test à la gélatine salée:
Trois gouttes de gélatine salée (10g de Na Cl dans 100ml de gélatine aqueuse à 1%)
sont mises dans le 3e tube. L’apparition d’un précipité montre la présence des tanins de type
pyrogallique.
B-2-3 Tests au chlorure ferrique:
Dans le 4e tube, 3 gouttes de chlorure ferrique en solution méthanolique sont
additionnées.
Si la solution devient vert –noir, l’extrait contient un tanin de type catéchique
Si la solution vire au bleu –noir, il s’agit d’un tanin de type pyrogallique.
Lorsque le test avec le chlorure ferrique est positif (apparition de couleur bleu – noir
ou vert – noir) mais celui avec la gélatine ou la gélatine salée est négatif, l’extrait contient un
ou des composés polyphénoliques autres que les tanins.
B -3 LES TRITERPENES, STEROIDES et les
STEROLS INSATURES [11, 12, 23]
Les triterpènes sont des composés polycycliques à 30 atomes de carbone. Les stéroïdes
sont des composés tétracycliques issus de triterpènes. Les stérols insaturés sont des alcools
secondaires, dérivés de triterpènes tetracycliques.
Les triterpènes et stéroïdes sont mis en évidence par le test de LIEBERMANN –
BURCHARD.
La présence de stérols insaturés est détectée par le test de Salkowski.
Déroulement des testsLe résidu sec est repris dans 4ml de chloroforme. Une agitation suivie d’une filtration
est effectuée. Ensuite, la solution est répartie dans 3 tubes à essai.
Le 1e tube sert de témoin ; les 2 autres serviront aux tests.
B -3-1 Les stéroïdes et triterpènes : test de LIEBERMANN BURCHARD
Quatre gouttes d’anhydride acétique sont additionnées dans le 2e tube. Après agitation,
3 gouttes d’acide sulfurique sont versées le long de sa paroi.
L’apparition d’un anneau rouge à l’interface des 2 phases signifie la présence des triterpènes,
mais le virage au vert de la phase supérieure prouve la présence des stéroïdes.
Ces 2 réactions peuvent être visualisées en même temps.
B -3-2 Les stérols insaturés : test de SALKOWSKI
Un volume de 1ml d’acide sulfurique concentré est versé le long da la paroi du 3e tube
incliné à 45° C. Un anneau rouge formé à l’interface signale la présence de stérols insaturés.
B -4 LES ANTHRAQUINONES [11,12]
Les anthraquinones sont caractérisées par la présence des composés phénoliques plus
ou moins oxydés. Elles font partie du groupe des quinones naturelles (Benzoquinone,
naphtoquinone, anthraquinone). Elles peuvent être sous forme libre ou héterosidique. Elles
sont détectées par le test de BORNTRÄGER.
Déroulement du testLe résidu sec est redissous dans 5ml d’eau distillée, puis 5ml de benzène sont ajoutés.
Le tout est versé dans une ampoule à décanter et est agité énergiquement. La phase organique
est rassemblée et additionnée de 1ml d’ammoniaque 25%. Après agitation, le virage au rouge
de la solution indique la présence d’anthraquinone.
B -5 LES FLAVONOIDES et les
LEUCOANTHOCYANES [23]Ce sont des composés polyphénoliques largement distribués dans le règne végétal. Ils
sont formés par 2 noyaux benzéniques et une chaîne carbonée à 3 atomes de carbone. Le test
de WILSTATER est réalisé pour observer la présence de flavonoïdes et celui de BATE
SMITH pour les leucoanthocyanes.
Déroulement des tests Un volume de 7ml d’éthanol est versé dans le résidu d’évaporation. La solution ainsi
obtenue est répartie dans 4 tubes à essai, dont le premier sert de témoin et les 3 autres pour le
test.
B -5-1 Les flavonoïdes : test de WILSTATER
Dans le 2e tube, 1ml d’acide chlorhydrique 2N et 2 morceaux de tournure de
magnésium sont additionnés.
En plus des composants précédents, 1ml d’eau distillée et 1 ml d’alcool isoamylique sont
versés dans le 3e tube
La présence de flavonoïdes se traduit par un changement de couleur de la phase supérieure :
de l’orange au rouge pourpre pour les flavones
de rouge au pourpre pour les flavonoles (2e tube)
de l’orange au rouge violacé pour les flavonones (3e tube)
B -5-2 Les leucoanthocyanes: test de BATE SMITH
Le 4e tube est additionné de 1ml d’acide chlorhydrique 2N; l’ensemble est chauffé
pendant 30min dans un bain –marie à 100°C.
La présence de leucoanthocyanes est indiquée par le virage au rouge de la solution après
refroidissement.
B - 6 LES SAPONINES: indice de mousse
Les saponines sont des hétérosides à genine stéroidique ou triterpénoidique. Dans un
tube à essai de 1cm de diamètre, le résidu sec est agité énergiquement pendant 1mn avec 2ml
d’eau distillée. La formation d’une mousse persistante pendant 15min prouve la présence de
saponines.
B - 7 LES DESOXYOSES: test de KELLER
KILLIANI
Le résidu d’évaporation est dissous dans 2ml de solution aqueuse de chlorure ferrique
à 10%. La solution est ensuite transvasée dans un tube à essai et 4ml d’acide acétique glacial
y sont ajoutés. Après une brève agitation, le tube est incliné à 45° C et 0,5ml d’acide
sulfurique concentré y est ajouté.
B - 8 LES IRIDOIDES [11,12]
Le résidu d’évaporation à sec est redissous dans de l’eau distillée. Quatre gouttes
d’acide chlorhydrique concentré y sont ajoutées. Le mélange est mis dans un bain- marie
pendant 30min. L’apparition d’une coloration bleue après refroidissement indique la présence
d’iridoïdes.
III- RESULTATS
III - 1 Extraction
Les méthodes d’extraction à froid et à chaud effectuées sur la poudre de l’écorce ont
permis d’avoir 5 extraits:
2 aqueuses à froid et à chaud
2 à l’éthanol absolu à froid et à chaud et
1 hydroalcoolique 75% à froid
Leurs caractéristiques sont consignées dans le tableau 1
Tableau 1: Caractéristiques des extraits obtenus par les différentes techniques
d’extraction :
Caractéristiques
Extractions
COULEUR ASPECT GOUT C°
(mg/ml)
pH
Aqueuse à froid Brune Sirupeux Amer 60 5,79
Ethanol absolu à froid Jaune paille Visqueux Amer
piquant
78 4,70
Hydroalcoolique 75%à
froid
Jaune paille Sirupeux Amer
piquant
70,15 5,10
Aqueuse à chaud Brune Sirupeux Amer 88,72 5,18
Ethanol absolu à chaud Jaune paille Visqueux Amer
piquant
104,5 4,72
D’après ce tableau, les extraits aqueux sont en général de couleur brune, à aspect
sirupeux et ont un goût amer. Les extraits avec l’éthanol absolu et hydroalcoolique 75% ont
respectivement un aspect visqueux et sirupeux. Leur couleur est jaune paille et ils ont un goût
amer –piquant.
III -2 Test préliminaire
Des tests préliminaires d’antibiogramme sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
et Candida albicans ont été effectués.
Le tableau 2 donne les diamètres des halos d’inhibition en mm suivant le type d’extraction et
les germes-tests
Tableau 2: Effets des 5 extraits sur les germes-tests
Germes –tests
Types d’extraction
Escherichia
coli
Staphylococcus
aureus
Candida
albicans
Aqueuse à froid 6 9 10
Aqueuse à chaud 6 6 9
Hydroalcoolique 75% à froid 6 12 10
Ethanol absolu à froid 6 8 8
Ethanol absolu à chaud 6 7.5 9
En se référant aux normes décrites dans la partie 3, Etude biologique, le tableau
montre que Staphylococcus aureus et Candida albicans sont sensibles aux extraits avec un
halo d’inhibition de diamètre supérieur à 9mm, tandis que E.coli ne l’est pas, le diamètre du
halo d’inhibition etant inférieur à 7mm.
Pour l’extrait hydroalcoolique à froid, le diamètre du halo d’inhibition est de 12mm
avec Staphylococcus aureus et 10mm avec Candida albicans. Ainsi, il s’avère le plus actif
parmi les 5 extraits préparés. C’est la raison pour laquelle l’extrait hydroalcoolique à froid
noté maintenant EB (Extrait Brut) a été choisi pour la suite de notre expérience.
La figure 3 montre l’antibiogramme pour Staphylococcus aureus.
Figure 3 : Antibiogramme des différents extraits bruts sur Staphylococcus aureus
Légendes:
1 : Extrait éthanolique absolu à froid
2 : Extrait hydroalcoolique 75% à froid
3 : Extrait aqueux à froid
4 : Extrait éthanolique absolu à chaud
5 : Extrait aqueux à chaud
III -3 Purification
Plusieurs techniques ont été essayées en vue d’avoir un extrait partiellement purifié.
Le procédé présenté sur la figure 4, réalisé sur EB a permis d’avoir 4 fractions semi –
purifiées dont les caractéristiques sont rassemblées dans le tableau 3.
Extraction hydroalcoolique 75%
Hexane
1
Acétate- d’éthyle
2
Extrait brut (EB) 2.88g
Phase aqueuse
Phase aqueuse
Phase hexanique F1
297.28mg
Phase acétate éthylique F
2
820.8mg
Phase butanolique F3
547.2mg
Phase aqueuse 615.2mg
Poudre de l’écorce 25g
Butanol 3
1-2-3 : Fractionnement
Figure 4: Schéma récapitulatif des procédés d’extraction et de fractionnement
Tableau 3: Données qualitatives de EB avec ses différentes fractions semi- purifiées
Fractions
CaractéristiquesEB F1 F2 F3 F4
Couleur Jaune
Paille
Incolore Jaune
clair
Brune Brune
Aspect Opaque Transparent Translucide Transparent Opaque
pH 5,10 6,8 6,5 5,00 6,2
Rendement (%) 11,52 10,31 28,50 19,00 25,25
Légendes : EB : Extrait Brut
F1 : Fraction hexanique
F2 : Fraction acétate- éthylique
F3 : Fraction butanolique
F4 : Fraction aqueuse
Quatre fractions de polarités différentes sont issues du partage liquide – liquide de
EB : une fraction hexanique F1 incolore, transparent. Une fraction acétate éthylique de
couleur jaune clair, translucide. Une fraction butanolique et fraction aqueuse, de couleur
brune, à aspect respectivement transparent et opaque. Les pH de EB et ses fractions varient de
5 à 6,8.
Le ou les principes actifs sont adsorbés par le charbon actif car le traitement avec ce
dernier diminue l’activité de EB vis-à-vis de Staphylococcus aureus (diamètre du halo
d’inhibition de 8mm). Ils ne sont pas précipitables par l’ANP car EB traité garde son activité
vis-à-vis du germe-test. Ils sont détruits par la forte chaleur. Ce résultat est confirmé par la
faible performance de l’extrait aqueux à chaud lors du test préliminaire.
III -4 Etudes analytiquesIII- 4 -1 Chromatographie sur couche mince
Comme il a été indiqué plus haut (cf § II 2 6 p 11), une observation directe sous UV à
254 nm, 366nm suivie d’une
pulvérisation sur la plaque
de la vanilline sulfurique est
réalisée. Les résultats sont
illustrés sur la figure 5.
Figure 5 : CCM dans le système CME 17/6/1 de EB et les 4 fractions révélées avec
de la vanilline sulfurique.
Légendes : EB : Extrait Brut
F1 : Fraction hexanique
F2 : Fraction acétate- éthylique
F3 : Fraction butanolique
F4 : Fraction aqueuse
Sous UV à 254nm; l’EB montre 9 bandes majeures. La fraction hexanique F1 et
acétate éthylique F2 ont respectivement 4 et 5 bandes majeures ; 3 bandes sont détectées dans
la fraction F3 et la phase aqueuse F4 ne comporte que 2 bandes. La pulvérisation à la vanilline
sulfurique révèle les mêmes bandes de couleur vert, bleu violacé, bleu après chauffage à
l’étuve 120°C pendant 10min.
III -4-2 Criblage phytochimique
Le criblage phytochimique a été réalisé sur l’EB et ses 4 fractions, selon la méthode
décrite au paragraphe II- 2-5 (p 12). Les résultats sont donnés dans le tableau 4. Ce tableau
montre que les tanins, désoxyoses, iridoides, anthraquinones sont absents et la présence des
alcaloïdes n’est pas vérifiée lors de notre expérience. Les composés stéroidiques et
triterpèniques prédominent par rapport aux flavonoïdes. L’extrait contient des saponines,
Ainsi, l’activité de EB observée lors du test préliminaire pourrait être liée à la présence de ces
constituants.
Tableau 4 : Résultats du criblage phytochimique de EB et ses fractions
Familles chimiques Test EB F1 F2 F3 F4
ALCALOIDES
Mayer – – – – –Wagner – – – – –
Dragendorff – – – – –
FLAVONOIDES
LEUCOANTHOCYANES
Cyanidine + – + + +
Bate – Smith – – – – –
SAPONINES Indice de mousse
+ – – + +
TANINS et
POLYPHENOLS
Gélatine – – – – –Gélatine salée – – – – –
Chlorure ferrique – – – – –
ANTHRAQUINONES Bornträger + – + – –
STEROLS INSATURES Salkowski + + – – –
STEROIDES et
TRITERPENES
Liebermann
- Burchard
TRI + + – + –
STER + + – + –
DESOXYOSES Keller -Killiani – – – – –
IRIDOIDES – – – – –
Légendes : + : test positif– : Test négatif
IV- DISCUSSION ET CONCLUSION
Le test préliminaire avec les souches de référence montre que l’extrait hydroalcoolique
75% à froid présente le plus grand halo d’inhibition vis-à-vis de Staphylococcus aureus et
Candida. Ainsi, elle a été choisie et considérée comme la méthode d’extraction la plus
performante parmi les 5 testées.
L’application des tests phytochimiques et de la chromatographie sur couche mince sur
l’extrait brut et les fractions nous a donné des renseignements sur les constituants chimiques
de Cinnamosma madagascariensis. Ces 2 méthodes sont complémentaires et elles ont permis
de mettre en évidence la prédominance dans EB des produits stéroidique, triterpènoidique, des
saponines. Ainsi, l’activité de l’extrait hydroalcoolique serait liée à la présence de ces
métabolites secondaires.
Cet extrait brut EB est de couleur jaune paille, à aspect opaque, au goût amer – piquant
avec une concentration de 70,15mg/ml. Son pH est de 5,10 et son rendement par rapport à la
poudre de départ est 11,52%.
Le ou les principes actifs ne sont pas précipitables par l’ANP, il(s) sont adsorbé(s) par
le charbon actif.
Le fractionnement par partage liquide – liquide a permis de séparer les composés peu
polaires et polaires contenus dans l’extrait total. Cette technique est donc efficace pour
séparer les composés de polarités différentes, ce qui confirme la règle de similitude dans la
technique d’extraction adoptée. En effet, « Les produits se solubilisent à polarité semblable ».
Aussi 4 fractions partiellement purifiées ont été obtenues : une fraction hexanique apolaire
caractérisée par la présence des triterpènes et stéroïdes, une fraction moyennement polaire F2
dans laquelle se trouve les flavonoïdes, les stéroïdes et les anthraquinones, une fraction
butanolique polaire constituée par des saponines et des triterpènes.
Du point de vue rendement, par rapport à l’extrait brut la phase acétate éthylique et
butanolique ont un rendement plus élevé (28,50 et 19) que la fraction hexanique (10,31). Les
composés polaires et moyennement polaires sont donc majoritaires. On peut dire que le
rendement total du fractionnement est élevé.
TROISIEME PARTIE :ETUDE BIOLOGIQUE
Etude biologique
I- INTRODUCTIONAprès les études phytochimiques de EB et les fractions, nous avons recherché les
activités bactéricide et fongicide des différentes fractions. En outre, nous avons étudié les
effets de EB sur les larves de moustiques.
II- MATERIELS ET METHODES :
II-1 MATERIELS ET METHODES POUR L’ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LA CROISSANCE MICROBIENNE
II-1-1 Matériels : A- LES MICRO-ORGANISMES
Les souches microbiennes utilisées pendant cette manipulation sont des souches
disponibles au laboratoire de microbiologie de l’Environnement (LME). Elles sont constituées
de :
6 souches de bactérie à Gram négatif
3 bactéries à Gram positif
2 levures et 1 champignon
Leur liste est donnée dans le tableau 5.
B- LES MILIEUX DE CULTURE
Les milieux sont tous pour analyse et sont fournis par le LME, ils sont de marque
MERCK, BIOMERIEUX. Leurs compositions sont données en annexe 3.
B -1 Les milieux utilisés pour l’étude des
bactéries [13, 38, 40, 43, 44, 46, 47, 48, 51]Bouillon nutritif :
C’est un milieu liquide électif utilisé pour le relancement des souches, pour la
recherche des activités anti- microbiennes en milieu liquide d’un produit.
Gélose nutritive :
C’est un milieu solide électif, elle est utilisée pour la purification et la conservation des
souches bactériennes.
27
Etude biologique
Milieu de Müeller Hinton :
Ce milieu synthétique est utilisé pour déterminer in vitro la sensibilité des micro-
organismes aux agents antimicrobiens
Tableau 5 : Liste des souches microbiennes testées
SOUCHES A TESTER
DESCRIPTION
Escherichia coli
Bacille à Gram négatif, un hôte normal de la flore
intestinale de l’homme. Cependant, c’est un agent responsable
de diarrhées, de gastro- entérites, de méningites et de
septicémies [13]
Klebsiella oxytoca
Bactérie à Gram négatif ubiquiste, présente dans les eaux
usées, des effluents industriels, du sol, des aliments. Chez
l’homme, elle est responsable d’infections diverses (infection
suppurative, urinaire, respiratoire) [13]
Shigella boydii
Bacille à Gram négatif qui ne fait pas partie de la flore
normale du tube digestif, il est le responsable de la dysenterie
bacillaire, des nausées, des selles liquides sanglantes.
Pseudomonas aeruginosa
Bactérie à Gram négatif ubiquiste, qui vit dans l’eau, dans
le sol et sur les végétaux. C’est une bactérie pathogène
opportuniste résistante à de nombreuses infections chez les
sujets immuno déprimés [39].
Salmonella typhi
Bacille à Gram négatif. Il est présent dans le sol et plus
fréquemment dans les milieux aquatiques pollués. C’est une
bactérie pathogène responsable de gastro- entérites, de toxi-
infection alimentaire et de fièvre typhoïde chez l’homme [13].
Entrobacter cloacea
Bactérie à Gram négatif responsable d’infection
respiratoire, des surinfections des plaies, d’infection urinaire, de
septicémie et de méningite [13].
28
Etude biologique
Staphylococcus aureus
Bactérie à Gram positif, c’est un agent responsable
d’infection suppurative, cutano-muqueuses (impétigo, furoncle,
anthrax). Elle peut être responsable de septicémie, de meningite
Streptococcus pneumoniae Coque à Gram positif. Il est fréquemment responsable
d’otite et de sinusites, de méningites, des infections broncho-
pulmonaires, d’abcès.
Bacillus cereus
Bacille à Gram positif, très largement répandu dans la
nature, c’est un pathogène de toxi- infection alimentaire
collectif (responsable de diarrhées). Chez l’homme, il est
responsable des infections respiratoires (pneumonie nécrosant,
abcès), des infections du système nerveux central (méningite,
encéphalite..), des surinfections des plaies [20,74].
Trichophyton rubrum
Champignon filamenteux anthropophile, il provoque
surtout des lésions interdigito - plantaires, et des onyxis des
pieds, des intertrigos. Il peut simuler de nombreuses affections
dermatologiques comme l’acné, la furonculose [30, 50].
Candida albicans Levure commensale et opportuniste dans le tube digestif
et les voies génitales de l’homme et de la femme, responsable
des candidoses [14, 32].
Cryptococcus néoformans
Champignon lévuriforme saprophyte dans le milieu
extérieur, la contamination est aérienne, par voie pulmonaire.
C’est l’agent de cryptococcose (mycose cosmopolite) qui atteint
le plus souvent les patients immuno –déprimés [2, 30].
Pour l’étude des caractères biochimiques des bactéries à Gram négatif, 5 milieux
différentiels sont utilisés [38, 40]. Ce sont :
Milieu de Hajna –Kligler :
29
Etude biologique
Ce milieu solide synthétique, permet de rechercher la fermentation du lactose, celle du
glucose et la production de sulfure d’hydrogène par les bactéries.
Milieu Mannitol –Mobilité – Nitrate :
Un milieu solide synthétique, il sert à détecter simultanément la mobilité des bactéries,
la fermentation du mannitol, et la production de nitrate réductase.
Milieu de Simmons :
Un milieu solide synthétique, il permet de rechercher l’utilisation du citrate de sodium
comme seule source de carbone.
Milieu Lysine –Fer :
C’est un milieu solide. Il détecte la production de sulfure d’hydrogène et la
fermentation du glucose par les bactéries.
Milieu Urée –Indole :
Un milieu liquide synthétique, il met en évidence la présence d’uréase, de tryptophane
désaminase (TDA) et la production d’indole.
2 milieux sélectifs ont été utilisés pour identifier 2 bactéries à Gram positif [44, 64].
Milieu de Baird – Parker :
Ce milieu est sélectif pour Staphylococcus aureus.
Cereus Selectif Agar (CSA) MOSSEL :
C’est un milieu sélectif pour la croissance de Bacillus cereus.
B -2 Les milieux utilisés pour l’étude des
souches fongiques [2, 13, 14]
• Milieu de Sabouraud liquide :
Il est utilisé pour le relancement des souches de levure et de champignon.
• Milieu de Sabouraud solide :
Ce milieu classique est utilisé pour la culture, l’isolement et l’identification des
levures, des champignons saprophytes ou pathogènes.
C-LES DISQUES POUR ANTIBIOGRAMME
30
Etude biologique
Ce sont des disques stériles de 6 mm de diamètre produits par Biorad, disponibles au
laboratoire de microbiologie de l’environnement.
A-LA STERILISATION
Les milieux de culture, les disques pour antibiogramme, les cônes de micropipettes
sont stérilisés pendant 20 min à l’autoclave, STERICLAV à 121° C sous une pression de
1 bar. La stérilisation des verreries et pinces est effectuée à l’étuve MEMMERT à 180° C
pendant 30mn.
B-LES ANTIBIOTIQUES DE REFERENCE
[6, 16, 38, 41]
Ce sont des disques stériles imprégnés avec une quantité précise et connue
d’antibiotique dont la liste est présentée dans le tableau n° 7.
II- 1-2 Méthodes :Avant de procéder à l’identification et au test proprement dit, les souches conservées
sous forme lyophilisée à +4°C sont relancées dans du bouillon nutritif. Puis, elles sont
ensemencées sur gélose nutritive coulée en boite. Après incubation à 37° C pendant 24 h, la
présence de colonies uniformes indique la pureté de la souche. Si la souche n’est pas pure, le
repiquage devrait être répété jusqu’à l’obtention d’une souche pure nécessaire pour
l’identification et le test d’antibiogramme.
A- IDENTIFICATION DES MICRO-ORGANISMES
A-1 Etude des caractères morphologiques et
culturaux :
A 1- 1 Examen
macroscopique [38, 36, 43]
o Principe :
L’observation à l’œil nu d’une colonie obtenue lors d’une culture microbienne permet
d’avoir une idée générale sur ses caractères morphologiques : forme, aspect, taille, couleur.
31
Etude biologique
o Mode opératoire :
Les souches bactériennes sont ensemencées en strie sur gélose nutritive en boîte. Elles
sont ensuite incubées à 37° C pendant 24 h.
Les souches fongiques sont repiquées en strie sur milieu Sabouraud solide. Elles sont placées
à l’étuve à 30° C pendant 48 h.
Les caractères morphologiques (taille, forme, consistance) des souches microbiennes seront
observés après incubation.
A-1 -2 Examen
microscopique [38, 40, 47]L’examen microscopique se fait en 2 étapes :
Une observation à l’état frais
Une observation après coloration Gram.
A -1 -2 -1 Examen à l’état frais :
a -Principe :
L’examen à l’état frais des colonies est l’observation des bactéries en absence de toute
coloration. Il contribue à l’étude de la morphologie, du mode de regroupement et surtout de la
mobilité des bactéries.
b - Mode opératoire :
Une öese de colonie bactérienne est étalée en couche fine sur quelques gouttes d’eau
distillée déposée sur une lame stérile. Ensuite, le frottis est recouvert d’une lamelle
préalablement stérilisée. La préparation est observée sous microscope avec l’objectif x 100.
Ainsi, la morphologie, le mode de regroupement et surtout la mobilité des bactéries seront
notés.
A -1 -2 -2 Observation après coloration Gram :
La coloration Gram permet non seulement de distinguer les 2 groupes de germes :
germes Gram positif et germe Gram négatif, mais aussi de confirmer la forme et le mode de
regroupement de la souche bactérienne.
32
Etude biologique
a -
Principe :
Cette technique de coloration repose sur les caractéristiques membranaires des
bactéries aptes ou non à fixer le violet de gentiane. Les bactéries Gram positif possèdent une
paroi riche en peptidoglycane empêchant l’alcool d’emporter le violet de gentiane et gardent
la coloration violette. Mais les bactéries Gram négatif dont la paroi n’est pas alcoolo-
résistante sont recolorées en rose par la fushine.
b - Mode
opératoir
e :
La coloration Gram s’effectue en 4 étapes :
• Réalisation d’un frottis :
Une colonie isolée à partir de la culture sur gélose nutritive est prélevée avec une oese
stérile. Elle est ensuite étalée uniformément en frottis dans une goutte d’eau distillée déposée
sur une lame porte objet. Puis la lame est fixée par passage 2 à 3 fois sur la flamme d’un bec
bunsen.
• Coloration au violet de gentiane et mordançage
Le frottis ainsi préparé est coloré par le violet de gentiane pendant 20 à 30 s. La lame
est ensuite traitée pendant 1mn au lugol servant de mordant, c'est-à-dire fixateur de la
coloration.
• Différenciation :
La lame est ensuite décolorée à l’alcool pendant 15 à 20 s, puis rincée à l’eau du
robinet pour éliminer l’excès de l’alcool.
• Coloration à la fushine :
Le frottis ainsi traité est recoloré avec de la fushine pendant 1mn. L’excès de colorant
est éliminé par rinçage à l’eau. Après séchage de la lame entre 2 papiers buvards, la
préparation est recouverte d’une huile d’immersion avant d’être observée au microscope à
l’objectif x 100.
Selon leurs colorations, les bactéries se divisent en 2 groupes :
Les bactéries à Gram positif gardent la coloration violette
33
Etude biologique
Les bactéries à Gram négatif apparaîtront en rose.
La composition des réactifs utilisés pour cette coloration est donnée en annexe 4.
A -2 Etude des caractères biochimiques [38, 47,
48]
L’étude des caractères biochimiques de quelques bactéries à Gram négatif se fait dans
une galerie Api 20 composé de 5 milieux. Elle consiste à rechercher les changements ou non
du milieu de cultures provoqués par le métabolisme bactérien.
A-2 -1 Milieu de Hajna-Kligler :
C’est un milieu composé de 2 parties : le culot (glucose) et la pente (lactose).
L’indicateur de pH est le rouge de phénol.
a-
principe
:
L’utilisation du glucose par les bactéries acidifie le milieu; ceci se manifeste par le
virage au jaune du culot. Cette fermentation est accompagnée d’une production de gaz qui est
marquée par la présence soit de bulle, soit de poche gazeuse.
L’utilisation du lactose se traduit par le virage au jaune de la pente.
La production de SH2 suite à la réduction du sulfate par les bactéries ayant le thiosulfate
réductase se traduit par le noircissement du culot à la pente.
b- Mode
opératoi
re :
Le milieu est préparé sous forme de gélose inclinée en tube. L’ensemencement se fait
par une simple piqûre dans le culot et en surface par des stries serrées de manière à avoir une
culture abondante. Les résultats sont observés après 24h d’incubation à 37°C.
34
Etude biologique
A-2 -2 Milieu Mannitol- mobilité :
a- Principe :
Si les bactéries fermentent le mannitol, le milieu devient acide et il y a virage au jaune
de l’indicateur coloré qui est le rouge de phénol.
Les bactéries immobiles se multiplient juste au niveau de la piqûre d’ensemencement tandis
que les bactéries mobiles peuvent se déplacer dans la gélose et entraîneront ainsi un trouble
plus ou moins net.
b- Mode
opératoir
e :
Le milieu est ensemencé par piqûre centrale à l’aide d’un oëse qui s’arrête à 1cm du
fond du tube. Les résultats sont notés après incubation à 37° C pendant 24h.
A-2 -3 Milieu citrate
de Simmons
C’est un milieu solide en pente de couleur
verte.
a-
Principe :
La présence de citrate perméase chez les bactéries leur permet d’utiliser le citrate
comme seule source de carbone. Ainsi, l’alcalinisation du milieu due à l’augmentation du pH
entraîne le virage de la coloration du vert au bleu brillant. Aussi, les bactéries sont dites citrate
positif.
b- Mode
opératoire :
A l’aide d’une oese, une suspension bactérienne en eau physiologique ou en eau
distillée est ensemencée en strie longitudinale du fond vers l’ouverture du tube. Après 24h
d’incubation à 37° C, les résultats sont observés.
A -2-4 Milieu Lysine –fer :
C’est un milieu solide composé par le culot et la pente de couleur violette.
35
Etude biologique
a-
Principe
:
L’utilisation du glucose comme seule source de carbone provoque le virage au jaune
de l’indicateur de pH qui est le bromocrésol.
La production de SH2 est due à la dégradation des composés soufrés par le thiosulfate
réductase. Elle se traduit par le noircissement du milieu.
b- Mode
opératoi
re :
L’ensemencement se fait par piqûre centrale du culot suivie d’une strie sur la pente. La
fermentation du glucose et la production de SH2 seront notés après 24h d’incubation à 37° C.
A -2 -5 Le Milieu urée –
Indole :
C’est un milieu liquide contenant de l’urée et du tryptophane. L’indicateur de pH est le
rouge de phénol.
a- Principe :
Ce milieu permet la mise en évidence de l’uréase et la production d’indole.
La présence d’uréase chez les bactéries provoque la dégradation de l’urée en carbonate
d’ammonium qui à son tour augmente le pH. Ainsi, le milieu devient rouge cerise.
Les bactéries dégradent le tryptophane en indole sous l’action de la tryptophane désaminase.
Cette production est mise en évidence par ajout du réactif de KOVACS dans le milieu. Ainsi,
un anneau rouge apparaît à l’interface.
b- Mode
opératoi
re :
La recherche de l’uréase se fait par l’ensemencement d’une suspension de la souche à
étudier dans le milieu urée- indole. Les résultats sont notés après 24h d’incubation à 37°C.
Le test d’indole est effectué par addition du réactif de KOVACS dans le milieu ensemencé.
Le résultat est observé après une légère agitation.
36
Etude biologique
A - 3 ETUDE DES GERMES SUR MILIEUX
SELECTIFS
A-3 -1 Milieu de BAIRD-
PARKER [1, 13, 64]
a-
Principe
:
C’est un milieu solide, sélectif de couleur jaune. Il contient des accélérateurs de
croissance (pyruvate de sodium et glycocolle) pour les Staphylocoques. En plus, le chlorure
de lithium et la forte concentration en glycine agissent comme inhibiteur de la croissance des
bactéries de la flore secondaire.
b- Mode
opératoi
re :
Le milieu est ensemencé en surface par strie. L’observation des résultats est effectuée
après 24h d’incubation à 37°C. Staphylococcus aureus forme une colonie blanche sur un
milieu de BAIRD- PARKER sans tellurite.
A-3 -2 Milieu de MOSSEL
(Cereus Selectif Agar)
[13, 20, 46]a-
Principe
:
C’est un milieu solide de couleur rouge, sélectif pour Bacillus cereus. Il contient de la
polymixine qui inhibe la croissance d’autres germes. En outre, la teneur en mannitol permet
de séparer la flore secondaire mannitol + qui est mise en évidence par le virage au jaune du
rouge de phénol, indicateur de pH.
b- Mode
opératoi
re:
37
Etude biologique
La boite est ensemencée par la technique de strie. Après incubation à 32°C pendant
24 h, Bacillus cereus (mannitol -) se présente sous forme de colonie rugueuse, sèche avec un
fond coloré de rouge à pourpre.
A-3 -3 Milieu de
SABOURAUD [ 1, 32, ,50]a-
Principe
:
C’est un milieu solide
recommandé essentiellement pour
la culture des moisissures en vue
de réaliser leur identification. Sur
ce milieu, trichophyton se
présente sous forme d’une colonie
blanche duveteuse à pigment
jaune au verso.
b- Mode
opératoi
re :
Le milieu est ensemencé en strie. Le résultat est observé après incubation à 30°C
pendant 4 à 6 jours.
B - SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES
EXTRAITS
Le but de l’antibiogramme est de déterminer la sensibilité et la concentration minimale
inhibitrice (CMI) d’une souche bactérienne vis – à vis d’un agent antimicrobien.
B - 1 Le test d’antibiogramme
[6, 16, 17, 19, 21, 36 37, 41, 65, 67]La méthode de disque ou méthode de diffusion sur gélose est utilisée pour apprécier la
sensibilité des souches à nos extraits.
38
Etude biologique
a-
Principe
:
Des disques imprégnés d’antibiotique sont déposés à la surface d’un milieu gélosé
préalablement ensemencé avec le germe à étudier. L’antibiotique diffuse de manière radiale à
partir du disque, créant ainsi une zone d’inhibition dont le diamètre varie avec le degré de
sensibilité de la bactérie à l’antibiotique.
b- Mode
opératoi
re :
Le test est réalisé pendant 3 jours successifs.
Premier jour:
Le relancement de la culture, c'est-à-dire : l’ensemencement de chaque souche pure
dans du bouillon nutritif suivi d’une incubation à 37° C pendant 24h.
Deuxième jour:
Chaque culture obtenue après incubation est de nouveau repiquée sur bouillon nutritif
et incubée à 37°C pendant 4h pour avoir une concentration bactérienne égale à
103 cellules /ml : c’est l’inoculum. Un volume de 5 ml de cette préparation est ensemencé
suivant une technique d’inondation dans une boite contenant le milieu solide de Müller
Hinton. L’excès de suspension microbienne est ensuite aspiré à l’aide d’une pipette, puis les
boites sont laissées à l’étuve 37°C pendant 15 min pour être séchées. Les disques stériles de 6
mm de diamètre ont été imprégnés de 20µl d’extrait et ils sont déposés à la surface du milieu
ensemencé. Après 30 min, la boite renversée est incubée.
Troisième jour:
C’est la lecture des résultats par la mesure du diamètre du halo d’inhibition apparu
autour de chaque disque.
Le tableau 6 donne les normes utilisées dans l’expression des résultats, et le tableau 7 résume
les conditions d’utilisation des antibiotiques de références pour chaque souche à tester.
Tableau 6: Norme utilisée pour la lecture des résultats d’un Antibiogramme
39
Etude biologique
B - 2
Tableau 7 : Liste des antibiotiques recommandés pour les germes utilisés
SOUCHES BACTERIENNES ANTIBIOTIQUES
Escherichia coli TRIMETHOPRIME 5µg
Klebsiella oxytoca CHLORAMPHENICOL 30 µg
Shigella boydii RIFAMPICINE
Pseudomonas aeruginosa CEFOTAXIME 30 µg
Salmonella typhi TRIMETHOPRIME 5µg
Entrobacter cloacea TETRACYCLINE
Staphylococcus aureus VANCOMYCINE 30 µg
Diamètre du halo
(X)
Degré de sensibilité du
germe
Symbole
X <7 mm
7mm ≤ X < 8 mm
8mm ≤ X < 9 mm
X ≥ 9mm
Insensible
Assez sensible
Sensible
Très sensible
-
+
++
+++
40
Etude biologique
Streptococcus pneumoniae VANCOMYCINE 30 µg
Bacillus cereus VANCOMYCINE
Trichophyton rubrum DERIVES IMIDAZOLES
Candida albicans DERIVES IMIDAZOLES
Cryptococus neoformans DERIVES IMIDAZOLES
B-2 Détermination de la Concentration Minimale
Inhibitrice (CMI) et de la Concentration
Minimale Bactéricide (CMB) [6, 16, 17, 19, 21,
65]
B -2-1 Détermination de
la CMI
La CMI ou Concentration Minimale Inhibitrice est la plus faible concentration
d’extrait capable d’inhiber toute croissance microbienne. Elle peut être déterminée par 2
méthodes :
• La méthode de disque sur milieu solide
• La méthode de dilution sur milieu liquide
B -2 -1 -1 Méthode de disque sur milieu solide
a-
Principe
:
41
Etude biologique
En milieu solide, la CMI correspond à la plus faible concentration d’extrait qui permet
l’apparition d’un halo d’inhibition de diamètre compris entre 7 à 8 mm.
b- Mode
opératoi
re :
La technique est identique à celle de la méthode de diffusion sur gélose. Mais, pour
pouvoir déterminer la CMI, une gamme de concentrations de l’extrait à étudier est préparée
suivant une progression géométrique de raison 0,5.
B -2 - 1- 2 Méthode de macrodilution en milieu liquide
a-
Principe :
En milieu liquide, la croissance microbienne se manifeste par la turbidité du milieu
ensemencé. Ainsi, la CMI correspond à la plus petite concentration d’un produit
antimicrobien avec lequel la culture reste limpide.
b- Mode
opératoire :
Cette méthode est basée sur la dilution successive du milieu de culture.
0,8ml de milieu de Müeller Hinton liquide est ajouté dans chacun des 10 tubes à hémolyse
préalablement stérilisés. Deux d’entre eux servent de témoins, le premier contient un milieu
non inoculé utilisé comme témoin positif (pour la présence d’activité antimicrobienne) et le
second est un milieu inoculé, mais dépourvu d’extrait servant de témoin négatif. Ainsi le test
se fait dans les tubes n°1 à 8.
1ml d’extrait à étudier à concentration connue est ajouté dans le tube n°1, après
homogénéisation, une dilution successive est effectuée jusqu’au tube n°8, 1ml de ce dernier
est donc à rejeter.
A la fin, 0,2 ml d’inoculum préalablement préparé est ajouté dans chacun des 8 milieux.
42
Etude biologique
La croissance microbienne est notée après 24h d’incubation à 37°C. Aussi, la CMI correspond
à la plus faible concentration pour laquelle le milieu ne présente pas de trouble.
C-2 -2 Détermination de
la CMB
La CMB ou concentration minimale bactéricide, c’est la plus faible concentration d’un
produit antimicrobien pour laquelle aucune bactérie ne survit.
a-
Principe
:
La culture d’une souche microbienne sur milieu solide favorable forme une colonie.
Ainsi, l’extrait ayant une concentration déterminée est dite bactéricide vis- vis d’un germe si
après incubation, aucune colonie ou au plus 0,1% des bactéries survivent dans le milieu de
culture.
b- Mode
opératoi
re :
Après la détermination de la CMI, un prélèvement de 10µl de culture de chacun des
tubes ne présentant aucune culture visible est ensemencé sur le milieu gélosé de Müeller
Hinton.
La CMB est déterminée après incubation à 37°C pendant 24h.
II – 2- MATERIELS ET METHODES POUR L’ETUDE DES EFFETS DE L’EXTRAIT SUR Anopheles gambiae et Aedes albopictus
II – 2-1 Matériels
43
Etude biologique
A- LES MOUSTIQUES [52, 53]
2 espèces ont été testées pendant cette étude :
Aedes albopictus : qui est généralement connu comme vecteur de l’arbovirus qui
est le virus de la dengue et celui de la fièvre chikungunya
Anopheles gambiae : qui est le principal vecteur du paludisme.
La figure 6 montre la femelle des 2 espèces.
Figure 6 : Morphologie externe de la femelle de Anopheles gambiae et de Aedes alopictus (Source IPM).
B- L’INSECTARIUM
L’insectarium est une salle composée d’une grande pièce pour l’élevage des larves et
imagos et une petite pièce servant pour les tests. La température et l’hygrométrie de cette salle
doivent être compris respectivement entre 26 à 28°C et 70 à 80%. Pour remplir ces
conditions, un radiateur est installé pour maintenir la température de la salle à la valeur
voulue. L’humidité relative est stabilisée à l’aide d’un humidificateur. Pour amplifier
l’hygrométrie, un canal rempli d’eau a été installé.
Un thermo-hygromètre est utilisé pour vérifier et enregistrer tous les matins la température et
l’humidité.
II-2 -2 Méthodes
A- COLLECTE DE MOUSTIQUES
A-1 Anopheles gambiae
44
Anopheles gambiae Aedes albopictus
Etude biologique
La capture de l’espèce Anopheles gambiae adulte a été effectuée dans une étable à
Ambohimanambola en Avril 2006. Un aspirateur à bouche recommandé par l’OMS est utilisé
pour cette collecte, c’est un tube souple en plastique de 80 à 100cm de longueur, l’une des
extrémités sert à aspirer les moustiques et un filtre se trouve au milieu de ce tuyau pour garder
les moustiques dans le tube collecteur et éviter de les aspirer dans la cavité buccale. Les
moustiques capturés sont ensuite transférés dans une cage de 30cm de coté enveloppée d’un
tulle moustiquaire puis transportés immédiatement à l’insectarium.
A-2 Aedes albopictus :Les larves de Aedes albopictus ont été collectées dans des gîtes larvaires temporaires
(haie de bambou, pneu, vieux récipients) dans les quartiers urbains de Tamatave en
Février 2006.
B- TECHNIQUE D’ELEVAGE
B - 1 Elevage des adultes :Les moustiques adultes sont élevés à l’insectarium dans la cage à moustiquaire. Cette
dernière présente un manchon servirant à diverses manipulations Pour nourrir les imagos, du
coton imbibé d’eau glucosée est placé dans un récipient et est introduit dans chaque cage.
Pour éviter la formation des champignons, cette solution est changée régulièrement 2 fois par
semaine. Un lapin est attaché pendant 3 heures sur le toit de la cage pour fournir du sang frais
aux femelles gravides. Les 2 espèces sont élevées dans des cages différentes.
B -2 Méthode de collecte des œufs Après le repas de sang, un pondoir est placé dans chaque cage. Pour A.gambiae, il
s’agit d’une boite de pétri humidifiée par du coton et couvert avec du papier filtre. Tandis que
pour Aedes albopictus, c’est un récipient cylindrique contenant de l’eau et tapissé avec du
papier filtre. Après une ou plusieurs pontes, les œufs sont mis en eau dans un bac d’élevage
contenant de l’eau déchlorée. Ils sont répartis dans les bacs d’élevage à raison de 50 oeufs
environ par bac pour éviter la surpopulation.
45
Etude biologique
Figure 7 : Elevage des adultes
B - 3 Elevage des larves Les larves de stade 1 récoltées après leur éclosion sont transférées dans un autre bac et
nourris avec une poudre riche en protéine et en substance minérale (feed –mill). La nourriture
est approximativement proportionnelle à leur taille et à leur nombre. L’eau d’élevage est
renouvelée tous les 2 jours. Les larves arrivant au stade nymphal sont transférées dans la cage
pour l’élevage des adultes.
Pour Anopheles gambiae le stade pré-imaginal est environ 7 à 20 jours tandis que pour
Aedes albopictus, il est de 6 à 13. Ainsi Anophèles et Aedes ont chacune leurs bacs d’élevage.
Le cycle biologique de moustiques est présenté sur la figure 8 et la figure 9 montres l’élevage
des larves.
46
Etude biologique
LarvesOeufs
Nymphes
Emergence
Stades aquatiques
Stade aerien (imago)
Ponte a la surface de l’eau
Repas de sang de la femelle
Figure 8 : Cycle biologique de moustiquesSource IPM
C- TEST DE SENSIBILITE AUX LARVES DE
MOUSTIQUES
Le travail se déroule dans une pièce réservée aux expérimentations à l’insectarium où
la température est maintenue entre 26 à 28°C et l’hygrométrie entre 70 à 80.
C - 1 Etablissement de la ligne de base Pour pouvoir déterminer la concentration létale 50% (CL 50) de l’extrait, une gamme
d’au moins 4 concentrations doivent être testées : C’est l’établissement de la ligne de base.
Aussi, nous avons préparés 4 concentrations différentes de EB dont les valeurs sont 0.1; 0.4;
0.8;1.6mg/ml. Ainsi, le test suit le protocole standard de l’OMS.
47
Etude biologique
a-
Prépara
tion des
4
concentr
ations
de
l’extrait
La préparation des extraits est
présentée dans l’annexe 5.
b- Test
Un lot de 20 larves de 3éme stade ou au début de 4éme stade est introduit dans chaque
concentration d’extrait préparée préalablement. Le test est répété en 4 exemplaires (soit 80
larves pour chaque concentration). 2 lots dépourvus d’extrait (1 ml d’éthanol + 249 ml d’eau
distillée) servent de témoin. Après 24h, le dénombrement des larves mortes est effectué en
additionnant le nombre de larves moribondes et celui de larves mortes.
Lorsque la mortalité des témoins atteint ou dépasse 20%, le test est invalide et sera
recommencé.
48
Figure 9 : Elevage des larves
Etude biologique
C - 2 Détermination de la concentration létale 50% et 99%Pour pouvoir déterminer la CL50 et CL99, les résultats sont traités sur les logiciels
Log PROBIT
III- RESULTATS
III- 1 Effets des extraits sur les microorganismes
III -1- 1 Etude microbiologiqueA- CARACTERES MORPHOLOGIQUES
Les observations macroscopiques et microscopiques sont résumées dans les tableaux 8
et 9 et la figure 10 montre Staphylococcus aureus et Escherichia coli après coloration Gram.
Figure10 : Staphylococcus aureus et Escherichia coli après coloration Gram.
49
Staphylococcus aureus (Gram+) Escherichia coli (Gram-)
Etude biologique
B- CARACTERES BIOCHIMIQUES DES BACTERIES
GRAM – :
Les caractères biochimiques des bactéries Gram négatif sont résumés dans le tableau
10 et illustrés sur la figure 11.
Tableau 8 : Les Caractères morphologiques des souches microbiennes étudiées
Caractères
Germes
MORPHOLOGIE
Observation microscopiqueà l’état frais
Morphologie Mobilité
Observationmicroscopique
après Coloration Gram
Escherichia coliBacille Mobile -
Klebsiella oxytocaBacille Immobile -
Shigella boydii Bacille Mobile-
Pseudomonas aeruginosa Bacille Mobile
-
Salmonella typhi Bacille Mobile-
Entrobacter cloacea Bacille Mobile-
Staphylococcus aureus Coque Immobile+
50
Etude biologique
Streptococcus pneumoniae Coque
+
Bacillus cereus Coque Mobile+
Trichophyton rubrum Moisissure
Candida albicans Levure
Cryptococcus néoformans
Levure
Tableau 9 : Caractères
culturaux des souches
microbiennes étudiées
51
Etude biologique
Tableau 10: Les
caractères
biochimiques des
bactéries à Gram –
Milieux
Souches
Glucose Gaz Lactose SH2 Utilisation
du Citrate
Mobilité
Utilisation
du Mannitol Uréase TDA Indole
Escherichia coli
+ + + _ _ + + _ _ +
Klebsiella oxytoca + + + _ + _ + _ _ _
Shigella boydii + _ _ _ _ _ + _ _ _
Pseudomonas
aeruginosa
+ _ + _ + + + _ _ _
Salmonella sp
+ + _ + + + + _ _ _
Enterobacter
cloacea
+ + _ _ + + + _ _ _
Caractères
Germes
CULTURAUX
Observation macroscopique
Escherichia coli
Forme irrégulière Relief bombé
Couleur Blanche Aspect lisse
Klebsiella oxytoca Forme irrégulière Relief bombé
Couleur blanche Aspect visqueux
Shigella boydii
Forme irrégulière Relief plat
Couleur blanche Aspect lisse
Pseudomonas aeruginosaForme irrégulière Relief bombé
Couleur blanche Aspect lisse
Salmonella spForme irrégulière Relief plat
Couleur blanche Aspect rugueux
Entrobacter cloacea Forme irrégulière Relief bombéCouleur blanche Aspect lisse
Staphylococcus aureusForme circulaire Relief bombé
Couleur blanche Aspect brillant
Streptococcus pneumoniaeForme circulaire Relief bombé
Couleur blanche Aspect translucide
Bacillus cereusForme circulaire Relief Bombé
Couleur blanche Aspect crémeux
Candida albicans Colonie blanche, circulaire et crémeuse
Cryptococus neoformans Levure ronde, légèrement ocre
52
Etude biologique 53
Figure 11 Escherichia coli et Salmonella sp cultivées sur milieux Hajna-Kligler et
mannitol-mobilité-nitrate
C- CARACTERES CULTURAUX SUR MILIEUX
SELECTIFS :
Les caractères culturaux des quelques souches étudiées sur milieux sélectifs sont
donnés dans le tableau 11et illustrés sur les figures 12, 13, 14.
Tableau 11 : Les caractères culturaux des 3 souches microbiennes sur milieux
sélectifs
SOUCHES CARACTERES CULTURAUX
Staphylococcus aureus Colonie blanche sur milieu Baird Parker
Bacillus cereus Colonie blanche sur milieu Cereus Selectif Agar
T1 :Escherichia coli sur milieu HAJNA- KLIGLER : Glucose +, lactose +, gaz +, SH2-T2 : Milieu de HAJNA- KLIGLER non ensemencéT3 : Salmonella sp sur milieu MANNITOL- MOBILITE – NITRATE : Mannitol +, mobili té +T4 : Milieu MANNITOL- MOBILITE – NITRATE non ensemencé
Etude biologique 54
Trichophyton rubrum Colonie blanche duveteuse à pigment jaune rouille au verso
Figure 12 : Staphylococcus aureus sur milieu Baird Parker
Etude biologique 55
Figure 13 : Trichophyton sur milieu Sabouraud
Figure 14 : Bacillus cereus sur Cereus Selectif Agar
L’étude des caractères morphologiques, culturaux et biochimique des souches a
permis de confirmer leur identité.
III- 1- 2 Effets des extraits sur la croissance microbienne
A- TEST D’ANTIBIOGRAMME
Les résultats du spectre d’activité de l’EB avec les fractions purifiées présentés dans le
tableau 12 et illustré sur les figures 15 et 16 montrent que EB est actif vis-à-vis de
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Bacillus cereus et Candida albicans.
Néanmoins, Bacillus cereus est le plus sensible avec un halo de 13mm.
Concernant les fractions partiellement purifiées :
• F1 est à la fois active vis- à vis de Bacillus cereus et Candida albicans
• Staphylococcus aureus et Streptococcus pneumoniae sont tous les deux sensibles à la
fraction F2.
Etude biologique 56
• La fraction butanolique F3 possède une activité sur Candida albicans et Streptococcus
pneumoniae.
• La fraction aqueuse F4 est inactive à tous les microorganismes.
Tableau 12 : Mesures du diamètre des halos d’inhibition de EB et ses
fractions partiellement purifiées
Extraits
Souches
EB F1 F2 F3 F4
Staphylococcus aureus 12 7 11 7 7
Escherichia coli 6 6 6 6 6
Pseudomonas aeruginosa
6 6 6 6 6
Candida albicans 12 9 6 12 7
Bacillus cereus 13 12 9 8 6
Streptococcus pneumoniae 8 6 8 8 6
Klebsiella oxytoca 6.5 6.5 6 6.5 6
Enterobacter cloacea
6 6 6 6 6
Cryptococcus
neoformans 6 6 6 6 6
Trichophyton rubrum 7 7 6 6 6
Shigella boydii 6 6 6 6 6
Etude biologique 57
Salmonella typhi 6.5 6 6 6 6
Figure 15 : Spectre d’activité de EB et les 4 fractions sur Bacillus cereus
Figure 16 : Spectre d’activité de EB et les 4 fractions sur Candida albicans
: 1 : EB : Extrait brut
2 : F1 : Fraction hexanique
3 : F2 : Fraction acétate éthylique
Etude biologique 58
4 : F3 : Fraction butanolique
5 : F4 : Fraction aqueuse
B- DETERMINATION DE LA CMI ET DE LA CMB
La CMI et la CMB de EB et de ses fractions actives sont déterminées sur les 3
souches : Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Candida albicans
B - 1 Détermination de la CMI :Les résultats de la détermination de la CMI en milieu liquide des extraits sont
présentés dans les tableaux 13, 14 et 15.
Tableau 13: Détermination de la CMI en milieu liquide de EB et la
fraction F1 vis-à vis de Bacillus cereus.
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10C°EB
(mg/ml) 70.15 35.07
CMI
17.53 8.76 4.38 2.19 1.09 0.54 Témoin
1
Témoin 2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide TroubleC°F1
(mg/ml) 40 20 10 5
CMI
2.5 1.25 0.62 0.31 Témoin
1
Témoin 2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
F1 : Fraction hexanique
EB : Extrait Brut
C°: Concentration (mg/ml)
Etude biologique 59
Tableau 14: Détermination de la CMI en milieu liquide de EB et la fraction F2 vis- à –
vis de Staphylococcus aureus
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C° EB
(mg/ml)
70.15 35.07 17.53 8.76
CMI
4.38 2.19 1.09 0.54 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
C°F2
(mg/ml)
40 20 10 5
CMI
2.5 1.25 0.625 0.312 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
F2: Fraction éthylique
Tableau 15: Détermination de la CMI sur milieu liquide de EB et la fraction F3 vis- à –
vis de Candida albicans.
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C° EB
(mg/ml)
70.15
CMI
35.07 17.53 8.76 4.38 2.19 1.09 0.54 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
C°F3
(mg/ml)
40 20
CMI
10 5 2.5 1.25 0.625 0.312 Témoin
1
Témoin
2
Aspect LIMPIDE TROUBLE Limpide Trouble
F3: Fraction butanolique
Les résultats montrent que les valeurs de la CMI de EB vis-à-vis de Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus et Candida albicans sont respectivement de 17,53 ; 4,38 et 35,07
Etude biologique 60
(mg/ml). Les figures 17, 18, 19 montrent la CMI déterminée en milieu solide. Les valeurs
sont identiques à celles déterminées en milieu liquide.
Figure 17 : Détermination de la CMI de F1 sur Bacillus cereus.
1: 0.62l mg/ml 3: CMI= 2.5 mg/ml 5: 10 mg/ml
2: 1.25 mg/ml 4: 5 mg/ml) 6: 20 mg/ml
Figure 18 : Détermination de la CMI de EB sur Staphylococcus aureus
1: 2.19 mg/ml 3: 8.76 mg/ml 5: 35.07 mg/ml
2: CMI= 4.38 mg/ml 4: 17.53 mg/ml
Etude biologique 61
Figure 19 : Détermination de la CMI de F3 sur Candida albicans
1: 0.625 mg/ml 3: 2.5 mg/ml 5: CMI= 10 mg/ml
2: 1.25 mg/ml 4: 5 mg/ml
B - 2 Détermination de la CMB :
Les CMB de EB et ses fractions sont notées dans le tableau 16.
Tableau 16: Concentration minimale bactéricide (mg/ml) de EB et ses fractions
Extraits
Germes EB F1 F2 F3
Bacillus cereus 35.07 10
Staphylococcus aureus 70.15 40
Candida albicans 70.15 40
Pour Bacillus cereus, les valeurs de la CMB de EB et de F1 sont respectivement de
35.07 mg/ml et 10 mg/ml. Pour Staphylococcus aureus et Candida albicans, la CMB est égale
à 70.15 mg/ml pour EB et 40 mg/ml pour F2 et F3.
III- 2 Effets des extraits sur les larves de moustiqueA- ETABLISSEMENT DE LA LIGNE DE BASE
Etude biologique 62
Le test est réalisé selon la méthode décrite au paragraphe C-1 (p. 45). Les résultats
sont résumés dans les tableaux 17 et 18.
Tableau 17: Pourcentage de mortalité des larves Anopheles gambia en fonction de
la concentration en EB
Extrait (mg /ml) Temps de contact (heure)
nombre testé Nombres de morts
% morts
Controle éthanol24 40 2 5,00
1.6 24 80 7792,50
0.8 24 80 6277,50
0.4 24 80 1113,75
0.1 24 80 7 8,75
Tableau 18: Pourcentage de mortalité des larves Aedes albopictus en fonction de la
concentration en EB
Extrait (mg /ml)
Temps de contact (heure)
nombre testéNombres de morts
% morts
Controle éthanol 24 24 2 5.00
1.6 24 80 79 98,75
0.8 24 80 65 81,25
0.4 24 80 26 32,50
0.1 24 80 2 2,50
La concentration de l’extrait varie de 0.1 à 1.6 (mg/ml). Plus la concentration augmente, plus
le pourcentage des larves mortes augmente.
Etude biologique 63
B-
DETERMINATION
DE LA CL50 ET CL99
Après l’analyse des résultats sur le Logiciel log Probit, l’estimation de la CL50 (24h) et
CL 99 est donné dans le tableau 19.
Tableau 19 : Résultat des CL 50 et CL 99 de l’EB sur les larves de moustiques
CL
Espèces CL 50 (mg/ml) CL 99 (mg/ml)
Aedes albopictus 0,473 2,07
Anopheles gambiae 0,696 1,576
CL : Concentration létale
Les valeurs de la CL50 sont respectivement de 0,473 et 0,696 pour Aedes albopictus et
Anopheles gambiae. Les larves de ces 2 espèces sont donc sensibles à EB. La performance de
l’extrait est mesurée par la CL 50, Plus cette valeur est faible, plus l’extrait est actif.
IV- DISCUSSION ET CONCLUSION :
Etude biologique 64
L’étude microbiologique nous a permis de confirmer l’identité de chaque souche à
tester.
L’Extrait brut (EB) est actif vis-à-vis de Staphylococcus aureus, de Bacillus cereus, de
Streptococcus pneumoniae et de Candida albicans. Pour Bacillus cereus la valeur de la CMI
est égale à 17,53mg/ml. Ainsi, EB est plus performant que les extraits de Phyllarthron
madagascariensis (IBRAHIM, 2005) et Gambeya boiviniana (RASOATAHINA, 2005) dont
les CMI sont respectivement de 37,5mg/ml et 50mg/ml.
La CMI de EB sur Staphylococcus aureus est égale à 4,38mg/ml. EB est donc plus actif que
l’extrait de l’espèce codée THL (TSIRINIRINDRAVO 2004), mais moins performant que
l’extrait de Pittosporum (RAZAFITSALAMA 2006) dont les valeurs de CMI sont
respectivement 12,73 et 1,2 mg/ml.
Concernant les fractions, la fraction hexanique est à la fois active vis-à-vis de Bacillus
cereus et Candida albicans
Streptococcus pneumoniae est assez sensible à la fraction acétate éthylique F2, et à la fraction
butanolique. F3 La fraction F2 est aussi active sur Staphylococcus aureus.
La fraction butanolique F3 inhibe la croissance de Candida albicans.
Bien que les fractions soient partiellement purifiées, les résultats indiquent que leur activité
dépend des principes actifs présents.
En se référant au tableau 7 (p.39), liste des antibiotiques spécifiques des germes
utilisés, il apparaît que le mode d’action des fractions F1 et F2 est semblable à celui de la
vancomycine qui est l’antibiotique de référence pour les 3 bactéries Gram positif. Il est
possible que l’extrait et ses 2 fractions agissent au niveau de la synthèse protéique par
provocation d’anomalie lors de la lecture du code génétique. Si c’est le cas, ces extraits
pourraient être bactériostatiques.
Candida albicans est sensible à EB et la fraction butanolique F3. Les dérivés
imidazolés qui perturbent l’étape essentielle de la synthèse de la membrane cellulaire
(Ergostérol) sont recommandés pour traiter les dermatophytes et les levures. Aussi, le mode
d’action de la fraction F3 semblerait identique à celle des dérivés imidazolés qui possèdent à
la fois des propriétés anti- bactériennes et anti – fongiques.
Les résultats de l’activité larvicide ont montré que EB est actif vis- à vis de Anopheles
gambiae et Aedes albopictus avec des CL50 respectivement de 0,696 et 0,473 mg/ml.
Etude biologique 65
A titre comparatif, EB est moins actif que l’extrait hexanique de tige de Mundulea sericea,
(CL100 égale à 1mg/ml), mais il est plus performant que l’extrait de plante codée THL dont
la CL 50 sur les larves de l’espèce Anopheles gambiae est égal à 15,16mg/ml.
L’activité larvicide de notre EB est comparable à celle de l’insecticide de référence
(MALATHION) proposé par l’OMS.
Jusqu’à présent, aucune référence bibliographique n’a mentionné le pouvoir larvicide
d’extrait de Cinnamosma madagascariensis. Cette étude constitue la première expérience sur
les larves de Aedes albopictus à notre connaissance.
CONCLUSION
GENERALE ET
PERSPECTIVES
Etude biologique 64
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Cette étude effectuée sur les extraits de Cinnamosma madagascariensis, bien que
préliminaire nous a permis de :
fournir un plus d’informations sur les propriétés physico-chimiques des principes
actifs ;
mettre en évidence les métabolites secondaires dans les extraits;
déterminer le pouvoir anti- microbien de EB et des extraits semi-purifiés
se familiariser avec les techniques d’élevage de moustique et de donner les premières
informations sur la propriété larvicide contre Anopheles gambiae et Aedes albopictus.
Dans l’avenir, nous envisageons :
d’améliorer les différentes méthodes d’extraction et de purification des principes actifs;
de déterminer la structure de ces principes actifs;
de déterminer le pouvoir larvicide de chaque fraction,
d’approfondir l’activité larvicide des fractions purifiées
de déterminer l’activité imagocide de EB et des fractions purifiées.
Annexes
ANNEXESAnnexe 1:Composition des réactifs pour la révélation des chromatogrammes
Réactif à la vanilline sulfurique
Vanilline ………………………………….0.5g
Acide sulfurique concentré………………100ml
Annexe 2 :Composition des réactifs pour les tests des alcaloïdes
Réactif de MAYER :Chlorure mercurique…………………13.5g
Iodure de potassium……………………50g
Eau distillée …………………………1000ml
Réactif de WAGNER :Iodure de potassium…………………………2g
Iode………………………………………1.47g
Eau distillée……………………………..1000ml
Réactif de DRAGENDORFF :Solution A :
Silicate de Bismuth…………………………..1.7g
Acide tartrique concentré……………………..20g
Eau distillée……………………………………..30ml
Solution B :
Iodure de potassium…………………………………10g
Eau distillée………………………………………40ml
Un volume de solution A est mélangé à un volume de solution B.10g d’acide tartrique et
100ml d’eau distillée est ensuite ajouté à ce mélange.
Annexes
Annexe 3 :Composition des différents milieux de cultures microbienne.
Milieux de culture pour l’étude des souches microbiennesMilieux d’isolement
Milieu bouillon nutritif
Nutrient broth………………………….. 8g
Extrait de levure…………………………..4g
Glucose…………………………………….5g
Eau distillée………………………………..1000ml
Milieu Gélose nutritive
Extrait de viande………………………………….3g
Peptone……………………………………………10g
Agar………………………………………………..7g
Eau distillée ………………………………………..1000ml
pH = 7.2
Milieu Sabouraud pour les levures et champignon:
Tryptone ………………………………………2g
Glucose ………………………………………..8g
Eau distillée…………………………………….200ml
Milieu Gélose Sabouraud pour les levures et champignon
Tryptone ………………………………………2g
Glucose ………………………………………..8g
Agar……………………………………………. 4g
Eau distillée…………………………………….200ml
Milieux d’identification de quelques bactéries Gram- (galeries
biochimique)
Milieu de HAJNA- KLIGLER
Peptone……………………………………………….15g
Annexes
Extrait de viande………………………………………3g
Extrait de levure………………………………………3g
Peptone pepsique de viande……………………………5g
Chlorure de sodium ……………………………………5g
Sulfate ferreux………………………………………..0.2g
Thiosulfate de sodium ………………………………..0.3g
Lactose………………………………………………… 10g
Glucose…………………………………………………..1g
Rouge de phénol…………………………………….. 0.024g
Agar ……………………………………………………. 11g
Eau distillée………………………………………… 1000ml
pH= 7.5
Milieu MANNITOL- MOBILITE – NITRATE
Hydrolysat trypsique de caséine …………………………10g
Nitrate de potassium…………………………………….. 1g
Mannitol …………………………………………………8.5g
Rouge de Phénol ………………………………………… 0.04g
Agar ………………………………………………………. 3.5g
Eau distillée ………………………………………….. 1000ml
pH= 7.6
Milieu de SIMMONS
Citrate de sodium ………………………………………….. 1g
Chlorure de sodium ………………………………………… 5g
Sulfate de magnésium ……………………………………… 0.2g
Phosphate mono ammoniaque ………………………………... 1g
Phosphate potassique…………………………………………. 1g
Bleu de bromothymol ……………………………………… 0.08g
Agar……………………………………………………………15g
Eau distillée………………………………………………… 1000ml
pH= 7.1
Milieu LYSINE – FER
Annexes
Peptone bactériologique ……………………………………….. 5g
Extrait de levure…………………………………………………3g
Glucose………………………………………………………… 1g
L-lysine ……………………………………………………… 10g
Citrate de fer ammoniacal …………………………………… 0.5g
Thiosulfate de sodium …………………………………… 0.04g
Pourpre de bromocresol …………………………………… 0.02g
Gélose …………………………………… ………………. 14.5g
Eau distillée ………………………………………………… 1000ml
pH= 6.7
Milieu UREE-INDOLE
L- tryptophane ……………………………………… 0.3g
Phosphate monopotassique ……………………… 0.1g
Phosphate dipotassique ……………………… 0.1g
Chlorure de sodium ……………………………. 0.5g
Urée ………………………………………… 2g
Alcool à 90°C …………………………. 1ml
Rouge de phénol à 1% ………………………. 0.25ml
Eau distillée ……………………… …………….... 100ml
Les Milieux séléctifsMilieu Cereus Selectif Agar
- Extrait de viande ………………………. 1g
- Peptones de caséine ………………………. 10 g
- D (-)mannitol ………………………. 10 g
- chlorure de sodium ……………………… 0g
- Emulsion de jaune d’oeuf ……………………… 100 ml
- Agar-agar ……………………… 12 g
- Eau ……………………… 1000 ml
Sulfate de polymyxine-B ……………………… 0,01 à 0,1 g
Rouge de phénol ……………………… 0,025 g
pH = 7,2 ± 0,2
Annexes
Milieu de Baird Parker
Extrait de viande ……………………… 5g
Peptone de caséine ……………………… 10g
Extrait de levure ……………………… 1g
Pyruvate de sodium ……………………… 10g
Glycine ……………………… 12g
Chlorure de lithium ……………………… 5g
Agar ……………………… 15g
Eau distillée ……………………… 1000ml
Le Milieux pour le test d’antibiogrammeMilieu de MULLER- HINTON
Infusion de viande de bœuf déshydraté ……………………… 300g
Hydrolysat acide de caséine ……………………… 17.5g
Amidon de maïs ……………………… 1.5g
Agar ……………………… 10g
Eau distillée ……………………… 1000ml
pH= 7.4
Annexe 4 :Composition des réactifs pour la coloration Gram
Violet de gentiane
Violet cristal ……………………… 1g
Alcool à 95° ……………………… 10ml
Acide phenique ……………………… 2g
Eau distillée ……………………… 100ml
Lugol
Iode ……………………… 3g
Iodure de potassium ……………………… 9g
Eau distillée ……………………… 900ml
Fushine de Ziehl
Fushine basique ……………………… 0.3g
Annexes
Alcool 95° ……………………… 10ml
Phénol cristallisé ……………………… 5g
Eau distillée ……………………… 95ml
Annexe 5 :Tableau 1 : Préparation des
extraits pour le test sur les
larves de moustiques
249
249
249
249
Références bibliographiques
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Nom : RAHARINJATO
Prénom : Fanja Hanitriniala
Titre de Mémoire: CONTRIBUTION A L’ETUDE DES ACTIVITES BACTERICIDE,
FONGICIDE ET LARVICIDE DE cinnamosma madagascariensis (CANELLACEAE)
RESUME
Cinnamosma madagascariensis, endémique et une des 3 espèces représentant
de la famille des Canellaceae a fait l’objet de notre étude.
Différents types d’extraits ont été réalisés avec la poudre de l’écorce. Le test
d’antibiogramme effectué avec E.coli, Staphylococcus aureus et Candida albicans a
montré que l’extrait hydroalcoolique noté EB avec une concentration de 70,15mg/ml est
le plus performant parmi les extraits préparés.
Les principes actifs de EB sont adsorbés par le charbon actif, ils perdent leur
activité à une température supérieure à 60°C. Le criblage phytochimique a montré que
cet extrait contient des stéroides et triterpènes, des flavonoides, des leucoanthocyanes
et des saponines.
Après fractionnement, 4 fractions contenant des substances de polarité
différentes ont été obtenues.
La révélation du chromatogramme avec de la vanilline sulfurique montre 9
bandes majeures pour EB, respectivement 4 et 5 bandes pour la fraction hexanique F1
et la fraction acétate éthylique F2, 3 bandes pour la fraction butanolique F3, et 2 bandes
pour la fraction aqueuse F4.
D’après les tests microbiens, il a été remarqué que F1 est actif vis-à-vis de
Bacillus cereus avec une CMI=2,5 mg/ml et une CMB=10mg/ml. Candida albicans est
sensible à F3 avec une CMI=10 mg/ml et une CMB =40 mg/ml.
Concernant l’activité larvicide, EB tue les larves de Anopheles gambiae avec un
CL50=0,696 mg/ml et CL99=1,576 mg/ml. Pour Aedes albopictus ces valeurs sont
respectivement de 0,473 et 2,07mg/ml.
Mots clés : Canellaceae, Cinnamosma madagascariensis, CCM, CMI, CMB, bactéricide,
larvicide, Anopheles gambiae, Aedes albopictusEncadreur :
Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Nom : RAHARINJATO
Prénom : Fanja Hanitriniala
Titre de Mémoire: Contribution to the study of the antimicrobial and larvicidal activity of
Cinnamosma madagascariensis (CANELLACEAE)
ABSTRACTOur study deals with Cinnamosma madagascariensis, one of the three plant
species of the genus Cinnamosma (Canellaceae), endemic of Madagascar,
Different extracts were prepared by using the powder of the bark. The
antimicrobial tests against E.coli, Staphylococcus aureus and Candida albicans strains
showed that the hydroalcolic (EB, 70.15mg/ml) exhibited the strongest activity among
the extracts prepared.
Also, our results showed that activity decreases when the temperature is more than
60°C. Interestingly, the active principles of the EB were absorbed by active carbon.
Steroids, triterpenes, flavonoids, leucoanthocyans, and saponins were the familly
of compounds detected by the phytochemical screening.
Fractionation of the active extract (EB) afforded four fractions with different
polarities (F1, F2, F3, and F4). The thin layer chromatography (TLC) displayed 9 major
spots for the EB, 4 and 5 spots for the hexane and ethyl acetate fractions (F1 and F2,
respectively), 3 spots for the n-butanol (F3), and 2 spots for the aqueous fraction (F4) by
using sulfuric vanillin as spraying reagent..
Among the fractions, F1 exhibited antimicrobial activity against Bacillus cereus
(CMI= 2.5mg/ml and CMB= 10 mg/ml), while Candida albicans was sensitive to F3
(CMI= 10mg/ml and CMB = 40mg/ml)
Concerning the larvicidal activity, EB eliminated the Anopheles gambiae and Aedes
albopictus larvae at CL50= 0.696 mg/ml and CL99= 1.576 mg/ml, and 0.473 and
2.07mg/ml, respectively.
Keywords: Canellaceae. Cinnamosma madagascariensis. Antimicrobial activity. TLC.
larvicidal activity. Anopheles gambiae. Aedes albopictus.
Supervisor: Professeur ANDRIANARISOA Blandine
