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ENZYMOLOGIE

INHIBITIONS ENZYMATIQUES

Notes de cours

Casimir BLONSKI

Institut de Chimie Molculaire et des Matriaux dOrsay - UMR 8182

Groupe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique

LabEx LERMIT

Universit Paris-Sud 11

Orsay

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Inhibition enzymatique

inactivation dune enzyme (ralentissement de la raction enzymatique) par la liaison dune petite molcule

diffrente que la dnaturation

Types dinhibition

rversible

comptitive

incomptitive

noncomptitive

irrversible

par marqueur daffinit

par inhibition suicide

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Leonor Michaelis (1875-1940) and Maud Leonora Menten (1879-1960) The kinetics of invertase activity

Biochemische Zeitschrift 49, 333 (1913)

Saturation curve for an enzyme showing the relation between the

concentration of substrate and rate.

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Inhibition comptitive la liaison de linhibiteur, lenzyme libre, empche la

liaison du substrat

Exemple de linhibition competitive lacide malonique ressemble lacide succinique et inhibe la dhydrognase de succinate lors de sa liaison :

S

Enz

SEnz

IEnz

I

E ES E + P k1, S k2

EI

ki, Ik

-1

k-i

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quations pour linhibition comp.

Graphique dinhibition comptitive

[S]

Vite

sse

, v

V ma

x / 2

KM

v = Vmax = kcat [E]0

KMapp

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

KMapp'

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition comptitive

++

=

iM

max

]I[1]S[

]S[

KK

Vv

6

7

Graphique dinhibition comptitive

1/[S]

1/v

0

pente = KM / Vmax

1

/ Vmax

-1

/ KM

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition comptitive

-1

/ KMapp'

-1

/ KMapp

[I] = 0

[I] = Ki

[I] = 2 Ki

Dtermination de Ki (comptitive)

maxmax

M 1S][1

]I[11

VVK

K

v

i +

+

=

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quation pour IC50 (comptitive) quations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 :

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Inhibition incomptitive linhibiteur est li par le complexe ES

Exemple de linhibition incomptitive inhibition de la phosphatase alkaline par la L-

phnylalanine:

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quations pour linhibition incomp.

Graphique dinhibition incomptitive

[S]

Vite

sse

, v

V ma

x / 2

KM

v = Vmax = kcat [E]0

KMapp

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

KMapp'

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incomptitive

V ma

xapp

/ 2

V ma

xapp

' / 2

+

+

+

=

i

M

i

max

]I[1]S[

]I[1]S[

K

KK

V

v

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Graphique dinhibition incomptitive

Dtermination de Ki (incomptitive)

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quation pour IC50 (incomptitive) quations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 :

Inhibition non-comptitive linhibiteur est li par lenzyme libre et par le complexe

ES

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Exemple de linhibition non-comp. inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :

quations pour linhibition noncomp.

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Inhibition non-comptitive simple laffinit de linhibiteur est indpendante de la

prsence de substrat (i.e. Ki = Ki') KM nest pas affect

Vmax est diminu par le facteur de

+

'

i

]I[1K

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Graphique dinhibition non-comptitive simple

[S]

Vite

sse

, v

V ma

x / 2

KM

v = Vmax = kcat [E]0

[I] = 2 Ki

[I] = Ki

[I] = 0

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncomptitive simple

V ma

xapp

' / 2

V ma

xapp

/ 2

M

i

max

]S[

]I[1]S[

KK

V

v+

+

=

Graphique dinhibition non-comptitive simple

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Dtermination de Ki (non-comptitive simple) quation pour la diminution de Vmax :

Inhibition non-comptitive mixte

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laffinit de linhibiteur dpend de la prsence de substrat (i.e. Ki Ki')

Vmax est toujours diminu par le facteur de KM est affect selon Ki et Ki'

Inhibition non-comptitive mixte lorsque Ki < Ki', KM augmente et linhibition ressemble

linhibition comptitive :

+

'

i

]I[1K

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Inhibition non-comptitive mixte lorsque Ki > Ki', KM diminue et linhibition ressemble

linhibition incomptitive :

Dtermination de Ki' (non-comptitive mixte) quation pour la diminution de Vmax :

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Dtermination de Ki (non-comptitive mixte) quation pour la variation de KM :

quation pour IC50 (non-comp. simple) quations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 :

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Inhibition irreversible pour des inhibiteurs rversibles, on utilise le Ki comme

un indice de lefficacit de linhibition

pour les inhibiteurs irrversibles, on utilise le kinact et le KI

il y a deux types dinhibiteurs irrversibles :

ractifs du site actif (marquage par affinit) inhibiteurs bass sur le mcanisme (substrats

suicide ) Marqueurs par affinit

dmontrent la spcificit envers un groupement fonctionnel des acides amins du site actif

analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans les site actif

comprennent aussi un groupement ractif (pharmacophore) typiquement un lectrophile qui ragit avec un nuclophile dans le site actif

possdent un seul site saturable et ragissent de manire stchiomtrique (1 mol de I/mol de E)

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Marquage par affinit lenzyme est protge contre cette inhibition par le

substrat (ou co-facteur) la perte dactivit suit une cintique de premier ordre,

parce que lenzyme est consomme comme un ractif pendant la raction

linhibition est accompagne de la modification covalente de lenzyme :

lenzyme demeure inactive aprs la sparation de lexcs de linhibiteur

linhibiteur reste li la protine aprs dialyse ou filtration sur gel (ou sur membrane) mme aprs la dnaturation de lenzyme

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Exemples de marquage par affinit TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)

ressemble un amide de la phnylalanine, mais le groupement chloromthyle ctone effectue lalkylation de la His57 de la chymotrypsine :

DIFP (diisopropyl phosphofluoridate) ragit avec le groupement hydroxyle des rsidus de

srine :

O

CH2Cl

NH

S OO

CH3

N NH

Enz

N N

O

CH2NH

S OO

CH3

Enz

Cl

H

EnzHO

P

O

F

OO

EnzO

P

O

OO

F

H

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PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)

utilis pour inhiber des protases et ragit aussi avec des rsidus de srine :

Exemples de marquage par affinit

EnzHO

F

H

CH2 S

O

F

O

EnzO

CH2 S

O

O

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Analyse cintique liaison rapide lquilibre de linhibiteur suivie de la

formation lente et irrversible dun complexe inactif :

la proportion denzyme sous forme EI augmente avec la concentration de I

EI sinactive suivant une cintique du premier ordre

k1 k

-1KI =

E I EI E I+k1k

-1

kinact

complexe covalentinactif

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Mesure de kinact kinact peut tre dtermine en mesurant la perte dactivit

en fonction du temps (kobs) diffrentes concentrations dinhibiteur :

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% ac

tivit

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Temps (min)

[I] = 0

[I] = 0.2 KI

[I] = 0.5 KI

[I] = 2 KI

[I] = KI

constante de vitesse = kobs

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