Cours Enzyme Complexe Substrat Etat Transition Stereospecificite Catalyse Enseignement Recherche...

13/3/2015 CoursenzymecomplexesubstratetattransitionstereospecificitecatalyseEnseignementrecherchebiochimieenzymologiebioinformatiqueEmma

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ENZYMOLOGIE

Historique - site actif - complexe enzyme/substrat - tat de transition - protases

41Jaime

1.Historique

2.Spcificitdel'association[protineligand]NotiondesiteactifClassesd'enzymes(E.C. X.X.X.X)

3.Lecomplexeenzymesubstrat

4.Etatdetransition,nergielibred'activationetnergielibredelaractionenzymatique

a.Gnralits

b.Facteursquiexpliquentlepassagedelastructuredusubstratdansl'tatdetransitionetl'acclrationdelaractionparfranchissementdelabarrired'activation.

c.voir une animation

5.Leseffetsdelasurpopulationintracellulairedesmacromolcules("Macromolecular crowding effects")

6.Illustrationdesprotases

a.Gnralits

b.Lesprotasessrine

7.Mcanismecatalytiquedesprotasessrine

Annexe:distinctionentreconcentrationsl'quilibreetl'tatstationnaire

1. Historique.

Lesorganismesvivantssontlesiged'ungrand nombre de ractions biochimiquestrsdiverses.

Cesractionss'effectuentdansdesconditionso,normalement,ellesnepourraientsefaire.Siellesontlieu,c'estparcequ'ellessontcatalysespardesmacromolculesbiologiques:lesenzymes.

Lepouvoirdecatalysedesenzymesestli,entreautre,latrs haute spcificit de reconnaissancedesmolculessurlesquellesellesagissent.

L'enzymologie est la partie de la biochimie qui tudie les proprits structurales et fonctionnelles desenzymes(relation structure - fonction).

Enparticulier,elles'appliquedcrire la vitesse des ractions catalyses par les enzymes.

Ilestdifficiledesituerexactementladcouvertedelanotiond'enzymeetsurtoutd'enzymeentantqueseulcatalyseurdesractionschimiquesquisedroulentdanslesorganismesvivants.

1783:Lazzaro Spallanzaniarapportquelaviandeestliqufieparunextraitgastrique.Ilanotgalementquelatempratureaungrandeffet.

1814:Constantin Kirchhoffobservaqu'uncomposant"glutineux"(commeill'aappell'poque)deblconvertitl'amidonensucre.

1833:Lapremiredcouverted'uneenzymeestd'habitudeattribueAnselme PayenetJean-FranoisPersoz[Payen A & Perzoz J (1833) "Mmoire sur la diastase, les principaux produits de ses ractions etleurs applications aux arts industriels" Annales de la chimie et de la physique 53, 73-92].

Ilsonttraitunextraitaqueuxdemaltl'thanolpuisprcipitunesubstancelabilelachaleurqui

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hydrolysel'amidon.Ilsontappelcettefraction"diastase"("sparation"enGrec)puisquecettefractionsparelesucresolubledel'amidoninsoluble.Onsaitmaintenantquecetteprparationtaitunesolutionnonpurified'amylase.

1834:Theodor Schwannaobtenulepremierunagentactifd'origineanimale(lapepsine)qu'ilapartiellementpurifieentraitantlaparoistomacaleparl'acide.

Ilestimportantdesoulignerqu'l'poquelespremiresobservationsd'activitenzymatiqueontprcdunenotionclaireetprcisedelacatalyse.Leconceptdecatalyseprovientdel'observationdel'actiondeladiastaseetdelapepsineparalllementcelledelalevurependantlafermentation:danstouslescas,une"substance tait change en une autre"sousl'influenced'unagentactif:lecatalyseur.

Al'poque,lalevuren'taitpasencoreconsidrecommeunecellulevivante.

1838:Charles Cagniard de Latourmontraqueleprocessusdefermentationestddesorganismesvivants.

18581871:LestravauxdeLouis Pasteurconfirmrentcetteide.Pasteurmitl'hypothservolutionnairequeleschangementschimiqueslorsdelafermentationrsultaientdesprocessusdelaviedesmicroorganismesimpliqusdanslafermentation.

Al'oppos,Justus von Liebigprivilgiaitunethoriepurementchimique:un"ferment"taitunesubstancechimiqueproduiteparunorganismeendcompositionetlesatomesdecefermenttaientsuppossenmouvementincessant.Cettatd'agitationlevtaittransmisauxatomesdelamolculedesucre(substratduferment)dontleslmentsdevaienttremaintenuspardesforcesfaibles.IlenrsultaitunescissiondusucreenCO2etthanoldontlesliaisonstaientplusfortes.

1860:Marcellin Berthelotfitmacrerdelalevureetobtintunefractionprcipitablel'alcoolcapabledeconvertirlesucroseenglucoseplusfructose.Ilconclutquel'invertase(nomqu'ildonnal'agentactifdecetextrait)taitl'undesmultiplesfermentsprsentsdanslalevure.L'invertaseestlafructofuranosidase(E.C. 3.2.1.26).

18761877:Wilhelm Khneadcouvertlatrypsinedansleliquidepancratiquedel'intestindeboeufaucoursdesestudessurladigestionintermdiairedesprotinesdansletractusgastrointestinal.Ilaconcluquelatrypsinetaitinitialementinactivepuisconvertieensaformeactive.Cetteobservationestlabasedelanotiondeprcurseurinactifdesprotasesquel'onappellezymogneetdel'activationdecezymognepar(auto)protolyse.

1878:Wilhelm Khneproposalenomd'enzyme("En-"et"zum",signifiant"dans le levain")pourqualifiercesferments.L'additiondussuffixe"ase"aunomdusubstratd'uneenzymepourdnommercetteenzymeftproposparEmile Duclauxen1898.

1896:Unchimisteallemand,Martin Hahn,tentaitd'isolerdesprotinesdelevure(Saccharomycescerevisiae)enbroyant ces levuresdansunmortieravecdusablefinetdeterredediatomes.Cependant,cetteprparationd'extraitdelevureseconservaitmal.

Hans BuchneretEduard Buchners'intressaientaussiauxextraitsdelevuredansunbutthrapeutique.Cesextraitstantdestinsl'hommenepouvaientcontenirdesbactricides.Sesouvenantquelesucrepermetdeconserverlesfruits,Hans Buchner,proposad'ajouterdusaccharosel'extraitdelevurepourleconserver.Eduard Buchnerobservaquel'adjonctiondesucreentranaitlaformationdebullesdanslemlange.Ilconclutlafermentation,processusdcritparLouis Pasteurcomme"la vie l'abris de l'air".

Enpubliantsesobservations,Eduard Buchnerconcluait:"La complexit de la levure n'est pasindispensable au droulement de ce processus. Le ferment actif du jus n'est probablement qu'une substancedissoute, sans aucun doute uneprotine : nous la baptiserons zymase".Pourcettedcouverte,EduardBuchnerreutlePrix Nobel en 1907.

Onsaitmaintenantquela"zymase"desextraitsdelevureestenfaitunmlanged'enzymesdontl'ensemblecatalyselesractionsdelaglycolyse.

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/5EntreeAutresOses/1EntreeAutOses.htmhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Justus_von_Liebighttp://en.wikipedia.org/wiki/Hans_Ernst_August_Buchnerhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/4Glycolyse/1Glycolyse.htmhttp://en.wikipedia.org/wiki/Wilhelm_K%C3%BChnehttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/1SV2H2/3GlycolysePFK/2CORRECTION/1Exercice1/6Anaerobie/1ANAEROBIE.htmhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Marcellin_Berthelothttp://fr.wikipedia.org/wiki/%C3%89mile_Duclauxhttp://www.universalis.fr/images/corpus/medias/v11/photo.jpg/ph995204.jpghttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/1Respiration/6Mobilisation/1Mobilisation.htmhttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/buchner-lecture.htmlhttp://fr.wikipedia.org/wiki/Charles_Cagniard_de_Latourhttp://en.wikipedia.org/wiki/Wilhelm_K%C3%BChnehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Theodor_Schwannhttp://www.magma.ca/~scimat/yeast.htmhttp://enzyme.expasy.org/EC/3.2.1.26http://fr.wikipedia.org/wiki/Louis_Pasteurhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htm#Zymogenhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/4Glycolyse/1Glycolyse.htm



1897:Lammeanne,Gabriel Bertrandobservaquecertainesenzymesrequirentdesfacteursdialysablespourleuractivit.Illesnommacoenzymes.

Audbutdu20sicle,degrostravauxfurententreprispourpurifier des enzymesetsurtoutdcrireleuractivit catalytique en termes mathmatiques.

1902:Victor HenrietAdrian Brownsuggrrentindpendammentquelaformationd'un complexeenzyme - substrat est un intermdiaire obligatoiredelaractionenzymatique.

Cettesuggestions'appuyaitsurlaformedelacourbeobtenuequandonreportelavitesseinitialedelaractionenfonctiondelaconcentrationensubstrat.AdrianBrownavaittudilavitessed'hydrolysedusucroseparla-fructofuranosidase,l'invertasedelalevure.Depluscettesuggestiontaitenaccordavecleconceptdereconnaissance enzyme - substrat dutype "cl - serrure"proposparEmil Fisheren1894.

Victor Henriftdonclepremierdcrirel'quationmathmatiquereliantl'effetdelaconcentration dusubstrat la vitesse de catalyse.

Article:V. Henri (1902) "Thorie gnrale de l'action de quelques diastases" C. R. Hebd. Sances Acad.Sci. 135, 916 - 919

1913:Entudiantlespropritscatalytiquesdel'invertase(sucrose==>fructose+glucose),MaudMentenetLeonor Michaelisredcouvrirentl'quationdeVictor Henriettablirentlarelationconnuesouslenomd'quation de Henri - Michaelis - Menten.Ilseninterprtrentcorrectementlasignificationdesconstantes.

Lepointimportantestquel'obtentiondecettequationreposesurl'hypothsequ'ils'tablitunquilibre rapide entre les concentrations de l'enzyme, du substrat et du complexe enzyme - substrat(E+SES).

Articles:

Michaelis & Menten (1913) "Die Kinetik der Invertinwirkung" Biochemische Zeitschrift 49, 333 - 369Johnson & Goody (2011) "The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-MentenPaper" Biochemistry 50, 8264 - 8269

1925:George BriggsetJohn Haldanegnralisrentl'quationprcdenteenintroduisantleconceptd'tat stationnairepourlaconcentrationducomplexeenzymesubstrat.

Article:Briggs & Haldane (1925) "A note on the kinetics of enzyme action" Biochem J. 19, 338 - 339

Lefaitquelesenzymes sont des protinesneftacceptqu'partirdelafindesannes20.

Denouvelles techniques chimiques et physiquesfurentemployespouranalyserlastructuredesprotines.

1926:James Sumner(PrixNobelen1946)cristallistl'urase.

Annes30:John Northrop(PrixNobelen1946)etsescollaborateurscristallisrentlepepsinogne,lapepsineetplusieursisoformesdelatrypsineetdelachymotrypsineetdmontrrentlapuretdescristauxobtenus.

Annes40et50:Descentainesd'enzymesfurentpurifiesetcristallisespermettantainsil'lucidationde dizaines de voies mtaboliques.

1955:Frdric Sanger(1erPrixNobelen1958)publialasquencecomplteenacidesaminsd'unepetiteprotine:l'insuline(massemolaire6000Da).

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1958/http://en.wikipedia.org/wiki/George_Edward_Briggshttp://nobelprize.org/chemistry/laureates/1902/fischer-bio.htmlhttp://en.wikipedia.org/wiki/J._B._S._Haldanehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Gabriel_Bertrandhttp://en.wikipedia.org/wiki/Victor_Henrihttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/2GLUCIDES/1Glucides.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/2GLUCIDES/1Glucides.htmhttp://en.wikipedia.org/wiki/Adrian_John_Brownhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/7ModuleS6BG3/8Insuline/1Insuline.htmhttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1946/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1259181/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/8ModuleL1CSG/4ConfBioPhysique/3PresHTMLbioPHYS/1ConfBioPHYS.htmhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3381512/http://www.expasy.ch/cgi-bin/show_thumbnails.plhttp://www.girlsandscience.org/famous.phphttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1946/http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/jbiosci.htm



1957:Lapremire structure cristallographique d'une protine(lamyoglobine),dduitedeladiffractiondesrayonsX,ftobtenueparJohn Kendrew(PrixNobelen1962avecMax Perutz).

Annes60:Lapremiresquenced'uneenzyme(laribonuclase,massemolaire13700Da)ftpublieen1960etlapremiresynthsechimique(galementdelaribonuclase)ftobtenueen1969.

Lesbiochimistesfocalisrentalorssurlemcanismedel'activitenzymatiqueetsonmodedergulation.

1958:Daniel Koshlandaproposlemodle de l'ajustement induit.Lesubstratinduitunchangementconformationneldusiteactifdel'enzyme.

1961:Christian Anfinsen(PrixNobelen1972)etsescollaborateursontmontrque,pourungrandnombredeprotines,c'estlasquence en acides amins qui dtermine le repliement de la chanepolypeptidiquedanssonunique conformation native donc active.Cetteconformationestlaplusstableparcequ'elleaunenergielibreminimale.

1963:William Wallace Clelandproposauneprocdureclaireetuniformepourcrirelesquationsdescintiquesdessystmesenzymatiquesplusieurssubstrats.

1965:Jacques Monod(PrixNobelen1965),JeffriesWymanetJeanPierreChangeuxproposrentunmodle cintique (modle MWC)pourlesenzymes allostriques(enzymesdontlacourbedevitesseenfonctiondelaconcentrationensubstratestunesigmodaleetnonunehyperbole).

1966:Daniel Koshland,Georges NemethyetD. Filmergnralisrentlemodleprcdent(modle KNF)enincluantlanotiond'ajustementinduitproposparKoshland.

Annes80nosjours:

L'hypothsedeChritian Anfinsen,vrifiepourungrandnombredeprotines(notammentdites"globulaires")estrestelongtempsl'undesdogmesdelabiologie.

Cependant,partirdesannes1980,2autresprocessusonttmisenvidence:

lesprotines chaperones(RonLaskey1978JohnEllis1987)aidentaurepliementdecertainesprotinesoulesmaintiennentdanslaconformationnativequandlacelluleestsoumisecertainsstress.Parmileschaperonnes,onpeutciter:

lesprotines de choc thermique("Heat Shock Protein"HSP)leschaperonineslesprotines LEA("Late Abundant Embryogenesis")

lesprotinesintrinsquement non structures:ellesn'ontpasdestructuretridimensionnellel'tatlibreetn'acquireleurstructurereplie,doncfonctionnelle,quequandellesinteragissentavecleurspartenairescellulaires.

Desapprochesplusrcentessontvenuescomplterlesconnaissancesacquisespendantplusd'unsicle:

ledveloppementdediversmodles du repliementdelachanepolypeptidique(exemple:"moltenglobule"Wada&Ohgushi,1983).

enparallle,lesmoyensinformatiquesdeplusenpluspuissantsontpermisdedvelopperdessimulationsutilisantlamodlisationmolculaire,lamcaniquemolculaireouladynamiquemolculaire(GROMACS,mthode de Monte-Carlo,mthodeab-initio,...).

denouveauxrepliementsonttdcouvertsetvrifisxprimentalement(dmarche"de novoprotein design"Rosetta)etdesprotines"artificielles"onttcres(exemple:TOP72003).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2222820/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/3ProteinStructure/1ProteinStructure.htm#Rosettahttp://www.nobel.se/medicine/laureates/1965/monod-bio.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/4StressLeaHsp/1StressLeaHsp.htmhttp://www.nobel.se/chemistry/laureates/1962/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/2ModelesEnzSub/1AjustementInduit.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/7ModuleS6BG3/1Exo14/1ExoHemoglobine.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/LaboThemEJ/2HSP22/2FIGURES/1TableauI.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/8IDP/1IDP.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/4Repliement/1Introduction.htmhttp://forge.info.univ-angers.fr/~gh/Leadb/index.phphttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1972/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/7AllosterieMWC/1INDEXMWC65.htmhttp://en.wikipedia.org/wiki/W._Wallace_Clelandhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/LaboThemEJ/2HSP22/1PRESENTATION.htmhttp://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9thode_de_Monte-Carlohttp://www.nobel.se/chemistry/laureates/1962/



desdisciplinesrcentespermettentdecomplterlesconnaissancesacquisesenenzymologie:lagnomiquestructurale,lagnomique fonctionnelle,laprotomique,lamtabolomique.

ledveloppementd'Internet,lacrationdebases de donnesdeplusenpluscompltesetspcialises,labioinformatiquesontdesoutilsmodernespourl'enzymologie.

Quelques bases de donnes ddies aux enzymes

Enzyme Nomenclature

ExPASy (Expert Protein Analysis System)

ENZYME - Enzyme nomenclature database

UniProt

Protein Data Bank

BRENDA

ExplorEnz - The Enzyme Database

KEGG LIGAND Database

2. Spcificit de l'association [protine - ligand] - Notion de site actif

a. Toutes les protines(sauflesprotinesintrinsquementnonstructures)se replient dans uneconformation dite native et c'est dans cette conformation qu'elles acquirent leur activit biologique(leurpouvoirdecatalyseurdanslecasdesenzymes).

Cerepliementaboutitunestructuretridimensionnellefonctionnelleuniquedelaprotine.

b.Cettestructureglobaledelamacromolculepermetunergionparticulire,le site actif(souventenfouiauseindelaprotine),d'adopterelleaussiunestructurespatialequiestreconnueparle ligandspcifique de la protine(et,lecaschant,parunpetitnombredemolculesdontlastructureestprochedecelleduligand).

Onpeutciterdiverstypesd'associationentreuneprotineetunligand:

lescomplexesenzymesubstratenzymergulateur(inhibiteur,activateur,coenzymes,...)antigneanticorpshistonesADNrcepteurshormoneshmoglobine - oxgne

Sielleestrversible,l'associationprotineligandcorrespondl'quilibresuivant:

k1PLP+Lk1

*k1etk1sontdesconstantesdevitesse(constantesmicroscopiques).

*k1:constantedevitessedusecondordre(ractionbimolculaire).Units:mol.L1.s1ouM.s1

*k1:constantedevitessedupremierordre(ractionmonomolculaire).Units:s1

Ondfinitlaconstantede [P]x[L]k11

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/8Immunoglobulines/1Immunoglobulin.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/6ModuleS5BG2/4Metabolomique/1Metabolomique.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/BIOINFORMATIQUE/7ModuleBioInfoJMGE/1ModLibBioInfo.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/9ModulGenFoncVeg/1PageDepModGFV.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/9ModulGenFoncVeg/6Proteomique/1Proteomiq.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/1SiteActif/111Chymotrypsine.htmhttp://www.genome.jp/kegg/ligand.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htmhttp://forge.info.univ-angers.fr/~gh/Leadb/index.phphttp://www.expasy.ch/http://www.rcsb.org/pdb/home/home.dohttp://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/http://www.uniprot.org/http://www.brenda-enzymes.org/http://www.enzyme-database.org/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/5Signalisation/4RCPGetProteinesG/1RCPGetProtG.htmhttp://www.expasy.ch/enzyme/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/2LicenceUE1/HEMOGLOBINE/3CorrectionOXY/0IndexCorrecOXY.htm



dissociation(constantemacroscopique)quilielaconcentrationdescompossimpliqusdanslaraction:

Kdissociation===[PL]k1Kassociation

L'nergie libre de Gibbsdeformationdescomplexesesttrsvariablecommelemontreletableausuivant:

Protine Ligand Kdissociation (M) G(kcal.mol1)

Carboxypeptidase phnylpropionate 5103 3,2

Trypsine butylamine 103 4,2Phosphofructokinase(2

conformations) adnosinediphosphate(ADP) 1032105 4,26,5

Homosrinedshydrognase NADPH 3107 9

MthionineARNt synthtase mthionyladnylate 2109 12

Histone ADN 1011 15

Apohmoglobine hme 1013 18

Source : "Biochimie" Chapeville, Clauser et al. (1974) Ed. Hermann

c.Lesite actifestconstitud'un petitnombre d'acides aminsquileplussouventnesontpascontigusdansl'enchanementdelachanepolypeptidique.

Cesacidesaminssontcaractrissparunechane latraledontlafoislanaturechimique(groupementionisableoupolarisable)etlastructure(encombrementstrique)sontspcifiquementadaptslareconnaissancedu(oudes)ligand(s).

Lastrochimiequirsultedecetagencementuniquedesacidesaminsquiconstituentlesite actifestlacausedelastrospcificit de reconnaissanceentrecesacidesaminsetle(oules)ligand(s).

Source : Enzyme Mechanisms

d.Lesenzymesnefixentpasseulementunligand(quidanscecass'appelleunsubstrat).Ellesletransformentenunproduitlorsd'uneractionchimique.Certainsacidesaminsdusiteactifontpourfonction,nonpasdefixerlesubstrat,maisdefournirlesgroupementschimiquesncessaireslaractioncatalyseparl'enzyme.

Danslecasdesenzymes,ondistinguedoncauseindusite actif:

lesacidesaminsquiconstituentlesite de fixation(cesacidesaminsn'ontpasdefonctionchimiqueimpliquesdanslaraction)

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/2LicenceUE1/HEMOGLOBINE/3CorrectionOXY/0IndexCorrecOXY.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htm#StructureNADPhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/3MetabolismGlucose/1RegulGlycolyse/1RegulGLYCOLYSE.htm#PFKhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/1SiteActif/111Chymotrypsine.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/2Deshydrogenase/3RelSFGluDH.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/7ModuleS6BG3/6HIRUDINE/1EtudeStructPrimHirudin/1StructPrimHirudin.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htmhttp://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/1VELATP.htm/111VELATP.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/5CytochromeC/1CytochromeC.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/2Epigenetics/1Epigenetics.htm



lesacidesaminsquiconstituentlesite catalytique

Les diffrentes classes d'enzymes

Laclassificationtablieparlacommissiondesenzymesdel'UnionInternationaledeBiochimieetdeBiologieMolculaire(sigleanglais"IUBMB")attabliesurdescritresdespcificit.

Lanomenclaturedesenzymess'critdemaniregnralesouslaforme:E.C. X.X.X.X(E.C.:"Enzyme Commission").

Lalistedetouteslesenzymes,leurnomenclatureetleuridentifiantECestdisponibledanslabasededonnes: Enzyme Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions

Lepremier"X"correspondaux6typesderactionscatalysesparlesenzymes.

1erX Ractioncatalyse exempledecoenzymeimpliquX=1:oxydorductases(E.

C.1.X.X.X) oxydorduction NAD(P)+

X=2:transfrases(E.C.2.X.X.X) transfertdegroupes phosphatedepyridoxal

X=3:hydrolases(E.C.3.X.X.X) hydrolyse aucun

X=4:lyases(E.C.4.X.X.X)

additiondegroupedesatomesengagsdansdesdoublesliaisons

pyrophosphatedethiamine

X=5:isomrases(E.C.5.X.X.X)

isomrisation(depositiondegroupeoudefonction) phosphatedepyridoxal

X=6:ligases(E.C.6.X.X.X) condensationdedeuxmolcules ATP

Remarque : dans les banques de donnes, on trouve une catgorie "Autres" exemples : kinases,phosphoprotines, "Mutator transposons".

Considronslegroupe 1 desoxydorductases:

le2me"X"permetunclassementsupplmentaireenfonctiondelanaturedugroupedudonneurd'lectronssurlequell'enzymeagit.

2meX l'enzymeagitsur:

X=1:E.C.1.1.X.X legroupeCHOHdudonneurd'lectrons

X=2:E.C.1.2.X.X lafonctionaldhydeouoxodudonneurd'lectrons

X=3:E.C.1.3.X.X legroupeCHCHdudonneurd'lectronsetc...

X=19:E.C.1.19.X.X laflavodoxinerduite

X=97:E.C.1.97.X.X autresoxydorductases

Considronslegroupe1.4desoxydorductasesquiagissentsurlegroupeCHNH2dudonneurd'lectrons:

le3me"X"permetunclassementsupplmentaireenfonctiondelanaturedugroupeaccepteurd'lectronssurlequell'enzymeagit.

3meX l'accepteurd'lectronsest:

X=1:E.C.1.4.1.X NAD+ouNADP+

X=2:E.C.1.4.2.X uncytochrome

X=3:E.C.1.4.3.X l'oxygne

X=4:E.C.1.4.4.X ungroupedisulfure

X=7:E.C.1.4.7.X uneprotinefersoufre

X=99:E.C.1.4.99.X autresaccepteurs

Remarque : il n'y a pas de classe E. C. 1.4.5.X et E. C. 1.4.6.X

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/2OxRedNAD.htm/222OxydoRedNAD.htmhttp://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/http://www.expasy.ch/enzyme/



Considronslegroupe1.4.1desoxydorductasesquiutilisentleNAD+ouleNADP+commeaccepteurd'lectrons:

le4me"X"permetunclassementsupplmentaireenfonctiondusubstratsurlequell'enzymeagit.

4meX Nomdel'enzyme

X=1:E.C.1.4.1.1 alaninedshydrognase

X=2:E.C.1.4.1.2 glutamatedshydrognase

X=3:E.C.1.4.1.3 glutamatedshydrognase(NAD(P)+)

X=4:E.C.1.4.1.4 glutamatedshydrognase(NAD(P)+)etc...

X=19:E.C.1.4.1.19 tryptophanedshydrognase

X=20:E.C.1.4.1.20 phnylalaninedshydrognase

L'exempledelaglutamate dshydrognase(E.C.1.4.1.2,E.C.1.4.1.3etE.C.1.4.1.4)metenvidencelanotiond'isoenzymesoud'isoformesdela"mme"enzyme.

Voirlabasededonnes:ExplorEnz - The Enzyme Database

Voirl'article:Sorokina et al. (2014) "Profiling the orphan enzymes" Biology Direct 9, 10

3. Le complexe enzyme - substrat

Laformationinitialed'uncomplexe [enzyme - substrat] ES ou complexe de Michaelis-Menten-Henri,NON covalent,ftsuggred'aprslesobservationssuivantes:

Lehautdegrdespcificit de la reconnaissance d'un substrat par le site actif d'une enzyme.Pourl'expliquer,Emil Fishersuggraen1894quecettereconnaissancersulted'unetrsfortecomplmentaritdesstructures(maisaussidelanaturechimiquedesgroupementsractionnels)dusubstratetdel'enzymequilefixe,commelesontunecletlaserruredanslaquelleelleentre.

La forme de la courbe dite de saturation(voirhistoriquecidessus:VictorHenri,1902etAdrianBrown,1902):vitesseinitialedelaractionenzymatiqueenfonctiondelaconcentrationensubstratouvi=f([S]).

Lefaitquelessubstratsprotgentsouventlesenzymesdel'inactivation(O'Sullivan&Tompson,1890).

L'hypothse"clserrure",bienqu'extrmementsatisfaisante,ne peut rendre compte de certainesobservations:

Parexemple,certainscompossquiressemblentchimiquementunsubstratmaisquiontdesgroupementsmoinsvolumineuxnesontpascatalyss,bienqu'ilsdoiventencoremieuxs'insrerdanslesiteactif.

Ilexisteunmcanismeenzymatiquedeuxsubstratsappel"fixation ordonne"pourlequelunsubstratBnepeutsefixerquesilesubstratAl'estdj.Or,selonl'hypothse"clserrure",lesubstratBdevraitsefixerd'emble.

Nature des forces dans les associations [enzyme - substrat]

forces d'interactions lectrostatiques:entreatomesougroupesd'atomesquipossdentunechargelectriquepermanente.Interactionsentre2ions,1ionet1dipleouentre2diplespermanents.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4084501/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/LaboThemEJ/indexRechEJ.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/22FormCourbSAT/1CaracCoubSAT.htmhttp://nobelprize.org/chemistry/laureates/1902/fischer-bio.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/4DeuxSUBSTRATS/1Cours2SUBSTRATS.htmhttp://www.enzyme-database.org/



forces d'induction:rsultentdel'inductiond'undipledansungroupenonpolairesoumisauchamplectrostatiqued'unechargepermanente.Ondistinguelesinteractionsentreunionetundipleinduitouentreundiplepermanentetundipleinduit.CesinteractionssontclassesdanslesinteractionsdeVanderWaalsoudanslesinteractionslectrostatiques.interactions lectrocintiques ou forces de dispersion de London:interactionsentregroupesnonpolairesduesl'inductionmutuelledediplesquifluctuent.rpulsions courtes distances:rpulsionslectrostatiquesentreleslectronsparsuitedurecouvrementdesnuageslectroniquesde2atomes.liaisons hydrogne:seformententre2atomeslectrongatifsrelisparunatomed'hydrogne.Ellessontdenaturelectrostatique.interactions hydrophobes:interactionsentregroupementsnonpolairesdansl'eau.Ellesrsultentdelarorganisationdelastructuredel'eauenprsenced'uncomposnonpolaire.Lesmolculesd'eauautourd'uncomposnonpolairesontorganisesdemaniretablir lemaximum de liaisons hydrogneautourd'elles.L'accroissementd'entropiedladsorganisationdelastructuredurseaudemolculesd'eauconstituelacontributionmajeurel'nergiedesinteractionshydrophobes.liaison covalente:partaged'unepaired'lectronsentre2atomes.Cetypedeliaisonestparfoisimpliqudanslescomplexes[enzymesubstrat](exemples:acyl-enzymeouphosphorylenzyme):elleintervientalorsdansunetapeconscutivelaformationducomplexedeMichaelisMentenHenriquiestnoncovalent.

SiKS est la constante de dissociationducomplexe[enzymesubstrat],l'nergielibredeGibbsdeformationducomplexeest:G=RTLn(1/KS).

LesvaleursdeGpourlaformation du complexe deMichaelis-Menten-Henrisontgnralementassezfaiblesettoujoursngatives.

End'autrestermes,laformationdupremiercomplexes'accompagned'unediminutiondel'nergielibredeGibbsdusystme:c'estdoncunprocessusspontan.

Exemples de valeurs de paramtres thermodynamiques de l'association [enzyme - substrat] ou [enzyme -inhibiteur]

Enzyme Substratouinhibiteur G(kcal.mol1) H(kcal.mol1) S(u.e.)

Chymotrypsinemthylhydrocinnamate

benzoylLtyrosinethylesterbenzoylLtyrosine

1,93,30,9

5,38,49,9

11,417,130,0

Carboxypeptidase

carboxybenzoxyLtryptophanecarboxybenzoxyglycylL

phnylalaninecarboxybenzoxyglycylL

tryptophane

3,42,53,4

50,40

28,07,011,5

carboxybenzoxyLglutamylLtyrosinethylester 4,7 1,4 20,6

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/2Cours2/1Cours2.html#HypotheseQuasiEquilibrehttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htm#AcylEnzymehttp://fr.wikipedia.org/wiki/Forces_de_Londonhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/1EAU/1H2O.htm#B1



Pepsine carboxybenzoxyLglutamylLtyrosine

4,3 3,0 24,4

Urase ure 3,2 2,9 0,9

ATPase ATP 7,5 8 52Source : "Enzymologie molculaire et cellulaire" J. Yon-Kahn & G. Herv (2005) Coll. Grenoble Sciences

(EDP Sciences)

Lavariationd'entropiersultede3 contributions:

laformationd'unemolcule(lecomplexe)partirde2molcules(enzymeetsubstratouenzymeetinhibiteur)quis'accompagned'unediminutiond'entropie(S10)les2facteursprcdentssontinsuffisantspourrendrecomptedesvariationsd'entropieobserves.La3mecontributionestlieauxvariationsdelaconformationdelaprotinelorsdel'associationaveclesubstrat(S30)

Diverses thoriesonttproposespourexpliquerlesmodificationsstructuralesdusubstratet/oudel'enzymelorsdeleurassociation.

a. Henry EyringetRufus Lumry(1954)ontproposle modle appel "rack"(traduction:chevaletdetorturetourmenter).

C'estlesubstrat qui subit un changement conformationnel,lastructuredel'enzymetantconsidrecommerigide.

Lersultatestunaccroissementdelalabilitdesliaisonsrompredanslamolculedesubstratpuisqueceluici,bienquefixdemanirelche,subitdestensionsdanssesliaisonsquil'amnentdansuneconfigurationprochedecelledel'tatdetransition.

b.En1958,Daniel Koshlandaproposlemodle dynamique de l'ajustement induit("induced fit").

Lesubstratinduit un changement conformationnel du site actifdel'enzyme.Lesorbitalesdesgroupementscatalytiquesetdugroupementractionneldusubstratsontalignesdemanireoptimalepourl'actecatalytique.

Al'inverse,desmolculesquiontunestructureanaloguecelledusubstratpeuventsefixermaisl'orientationspatialedesgroupementsnepermetpasl'actecatalytique.

Article:Koshland D.E. (1958) "Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis" PNAS44, 98.

Danslemodledel'ajustementinduit(figure ci-contre):

E:formeinactivedel'enzymeE':formeactiveprdominante en prsence du substratmaisnonsignificativementexistanteensonabsenceK11doncK2>K3c'estdireG2>G3.

http://en.wikipedia.org/wiki/Daniel_E._Koshland,_Jr.http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/2ModelesEnzSub/1AjustementInduit.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/2ModelesEnzSub/3ModeleRack.htmhttp://www.enzyme-database.org/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/7Transports/1Transports.htm#ActifPRIMhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/2N2NH3aaetUree/1N2NH3AAetUree.htm#DevenirCarbonhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/2ModelesEnzSub/3ModeleRack.htmhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC335371/



Puisque:K1.K2=K3.K4alorsK4>K1.Conclusion:enprsencedesubstratlaformeE'Sestfavorise.

Figureadaptede"Enzymologie molculaire et cellulaire" Yon-Kahn & Herv (2005)

Exemplesenfaveurdechangementsconformationnelsdel'enzymeconscutiveslafixationdusubstrat:

Danslecasd'unmcanisme ordonn 2 substrats,lafixationdupremierinduitunchangementdeconformationquirvlelesitedefixationdusecondsubstrat.Parexemple,l'hexokinasedelevuresereplieendeuxdomainesstructurauxrelisparunergionflexibleappele"charnire".Cetteenzymecatalyselaphosphorylation(parl'ATP)duglucoseenglucose6phosphate.Quandellefixeleglucose,l'hexokinasesubitunprofondchangementdeconformation:lesdeuxdomainesserapprochentl'undel'autreparunmouvementd'environ12,cequiaugmentel'hydrophobicitdusiteactifetprvientl'hydrolysedel'ATP.

L'inhibition non comptitive:uninhibiteurnoncomptitifnesefixepassurlesiteactifdonclecomplexe[enzymeinhibiteur]nedevraitpasperdresonactivitsil'enzymenechangeaitpasdeconformation.

c.En1966,Williams Jenksaproposlemodleappel"strain"(tensiondformation).

C'estunecombinaisondesdeuxthoriesquiprcdent.Leschangementsdeconformationdel'enzymeentranentdescontraintesdanslastructuredusubstrat.

d. Ajustement induit ou slection induite ?

Unequestioncentraleestdesavoir:

sileligandinduitlechangementdeconformationdel'enzyme("induced-fit")aprss'trefixousileligandstabilise/favorise(enlaslectionnant)uneconformationdel'enzymecomplmentaireduligandparmiunensembled'tatsfondamentauxetexcitsdel'enzymepr-existants("selected-fit"ou"conformational selection")

Lafigure ci-contreillustrelesdeuxmodles:

Enabsencedeligand:E1estlaconformationdel'tatfondamentaldel'enzymeetE2estlaconformationdel'tatexcitQuandleligandLestfix:E2Lestlaconformationde

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/4DeuxSUBSTRATS/1Cours2SUBSTRATS.htm#Ordonnehttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/4Glycolyse/1Glycolyse.htm#Hexokinasehttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htm



l'tatfondamentaletE1Lestlaconformationdel'tatexcit

Modle"induced-fit":leligandsefixesurlaconformationdel'tatfondamentalE1Modle"selected-fit":leligandsefixesurlaconformationdel'tatexcitE2

Ku:KunboundKb:Kbound

Source :Weikl & Deuster (2009) Proteins75, 104-110

4. Etat de transition, nergie libre d'activation et nergie libre de la raction enzymatiquevoir uneanimation

a. Gnralit

Commetoutesmolcules,unsubstratetunproduitd'uneractionenzymatiquesontcaractrisspardesliaisons chimiques.

Aucoursd'uneraction,deschangesd'nergieaveclemilieuenvironnantontlieu:certainesliaisonsdusubstratsontrompuesenabsorbantdel'nergieetlesliaisonsduproduitsontformesenlibrantdel'nergie.

Danslecasd'uneractionexergonique,l'nergiencessairepourromprelesliaisonsdusubstratestinfrieurel'nergielibrelorsdelaformationdesliaisonsduproduit.L'nergierequisepourquelaractionaitlieu(l'nergiencessairepourquelesliaisonsdusubstratsoientrompues)s'appellel'nergie libre d'activation : G#.

Lorsdel'absorptiondecettenergie,lavitessedesmolculesdesubstratsaugmenteetdonclafrquenceetlenombredecollisionsentremolculesdesubstratsetd'enzymeaugmententaussi.Paralllement,l'augmentationdel'agitationthermiquefragiliselesliaisonsquisontdoncplusfacilesrompre.

Eyring a propos la thorie de l'tat de transitionen1935:quandtoutel'nergied'activationestabsorbe,lamolculedesubstratestdansl'tatdetransition(lesanglesetleslongueursdesliaisonschimiquesdusubstratsontdistordues).C'estl'tat le plus nergtique, donc le plus instable.Laractionvoluespontanmentversuntatnergtiqueplusfaible,laformationduproduitdelaraction.

Poursapart,ladiffrenced'nergielibredeGibbsentrelesproduitsetlessubstratsestlavariationd'nergie libre de Gibbs de la raction:Graction.

Ilfautnoterquemmedanslecasd'uneractionexergonique,lessubstratsdoiventfranchirlabarrired'activation.Cettebarrireestessentiellepourlavie:sanselle,lesmacromolcules(protines,acidesnucliques...)fortpotentielnergtiquesedcomposeraientspontanment.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18798570http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/1VELATPOxRedNAD/1VELATP.htm/111VELATP.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/3AnimEnerActiv/EnergieActivation.htm



Danslesconditionsdelaviecellulaire,peudemolculepeuventfranchirlabarrired'activationdansunlapsdetempscompatibleaveclesprocessusbiologiques.Parexemple,ledemitempsdedsaminationdel'adnosine20CetpH7estd'environ20.000ans!

Seulel'interventiond'uncatalyseurbiologique,uneenzyme,lepermet.

Uneenzyme augmente la vitesse de la raction en abaissant l'nergie d'activation:lammetemprature,lessubstratsfranchissentplusfacilementetdoncplusfrquemmentlabarrired'activation.

Enconclusion:

lesenzymesne modifient pas la variation d'nergie libre de Gibbsdelaraction:laconstanted'quilibrededissociation(Kdissociation)d'uneractionn'estpasmodifie.enrevanche,lesconstantes de vitessemicroscopiques(k1etk1)sontmodifiesdanslemmerapport.

b. Facteurs qui expliquent le passage de la structure du substrat dans l'tat de transition et l'acclrationde la raction par franchissement de la barrire d'activation.

Voiruntrsboncours:Enzyme Mechanisms

L'tatdetransitionestunarrangementdeliaisonschimiquesentraindeseformeretdeseromprepuisquec'estunestructureintermdiaireentrecelledusubstratdontilestissuetcelleduproduitqu'ilvaformer.

L'tatdetransitionestdoncunestructurehautementnergtiquedoncinstable.Surleplanthermodynamique,l'undesfacteursessentielsdel'efficacitcatalytiqueestlacomplmentaritdel'enzymepourl'tatdetransitiondusubstratetnonpoursontatfondamental.

Parailleurs,lavitessed'uneractionenzymatiquedpenddel'efficacit de la rencontre / collisionentrelesmolculesquivontformerl'tatdetransition.

Cetteefficacitdpendlafois:

del'orientationdesmolculesl'uneparrapportl'autred'unenergieminimalerequiseappelenergie d'activation

1er facteur : les deux grands types chimiques de mcanismes catalytiques

.La catalyse acide-base gnrale:c'estlemcanismelepluscourantdelacatalyseenzymatique.L'acclration de la ractionrsultedutransfert d'un proton.

Parexemple,ceprotonpeutprovenirducouple[imidazole/imidazolium]delachanelatraledel'histidinepuisqu'elleaunpKasituentre6et7etconstitueaupHphysiologiqueungroupe[donneur/accepteur]deproton.

L'activitcatalytiquedesenzymesdecetypeestlargementinfluence par le pH.

Exemplesdegroupesfonctionnelsd'acides aminsquipeuventagirentantquecatalyseuracide/base:

groupementimidazoledelachainelatraledeHisgroupementamingroupementcarboxyliquegroupementthioldeCysgroupementcarboxyliquedeGluetAspgroupementamindeLysgroupementphnoldeTyrgroupementguanidinodeArg

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/3CatAcBaseCovalente/1CatAcideBase.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.html



.La catalyse par covalence(aussiappelecatalysenuclophile):elleconcerneessentiellementlesractionsenzymatiquesoplusieurssubstratssontimpliqus(environ20%desenzymesettouteslesenzymesquicatalysentunmcanisme2 substratsdetype"ping-pong").

Unepartiedupremiersubstratesttransfrel'enzymevialaformationd'uneliaison covalentepuiscettepartiedusubstratesttransfreausecondsubstrat.

2me facteur : l'effet devoisinage

Lafixationd'unemolculedesubstratausiteactifd'uneenzymeaugmentelaconcentrationeffectivedusubstratparrapportsaconcentrationl'tatlibreensolution.

Lesmolculesnesontplusassujettiesauhasarddecollisionssuffisammentnergtiques.

Cetaccroissementdeconcentrationaugmente lafrquence de formation del'tat de transition.

3me facteur : lafixationprfrentielle del'tat detransition

L'enzyme fixeplus fortementl'tat detransitionquelesubstratouleproduitpourdesraisonsde

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/3CatAcBaseCovalente/1CatAcideBase.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/4DeuxSUBSTRATS/1Cours2SUBSTRATS.htm



contrainteoudedistorsion.

L'tatdetransitions'ajustemieuxettablitdavantagedecontactsaveclesrsidusd'acidesaminsdusiteactif.

C'esttrsprobablementl'enzymequisubitdeschangementsdeconformation(voirajustementinduit)carilestpeuprobablequ'ilyaitsuffisamentd'nergiedanslafixationdusubstratpourencontraindrelastructure.

4me facteur : la stabilisation de l'tat de transition

Quandlecomplexe[enzymesubstrat]estform,ilestenquilibreavecsaformeactive,c'estdirelecomplexe[enzymetatdetransition]ouES#.

Lastabilisationdel'tatdetransitiondplacel'quilibreenfaveurdeES#etenmmetempsabaissel'nergied'activation.

Ilestimportantdenoterquecephnomneexigeunefixation lche du substrat(attention:pasunefixationlchedel'tatdetransition)l'enzymecarunefixationtropforteiraitl'encontredelacatalyse.

L'enzymedoitdoncmaintenirlesubstratenplacetantquel'tatdetransitionn'estpasatteintmaissansl'immobiliser.Siteltaitlecas,lecomplexeESformseraittropstablepouratteindresaconfigurationdel'tatdetransition(ES#).

5me facteur : la catalyse lectrostatique

Uneprotinepossdedenombreuseschargesainsiquedesdiplesquicrentdeschampslectrostatiquesdontl'intensitesttrsvariableselonlesendroitsdelaprotine.Deplusceschargesfluctuentenfonctiondeschangementsdeconformationdelaprotine.

Quandlesubstratsefixel'enzyme,lesmolculesd'eausontdemaniregnrale"exclues"dusiteactif(effetdedsolvatation).

Laconstantedilectrique"locale"estdoncabaissecequiaccroitlesforcesd'interactionlectrostatiquesauniveaudusiteactif.

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/2ModelesEnzSub/1AjustementInduit.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/4EtatTransitionES/1EtatTrans.htm



Cetteexclusionprotgelesgroupementsractifsderactionsparalllesavecl'eau.

Ainsi,leschampslectrostatiquescrsparlaprotineauniveaudusiteactifsontcomplmentairesdeladistributiondeschargesdusubstratdansl'tatdetransition.

Uncas particulierestl'eauquiagitcommesubstrat(exempledesprotases srine).

L'ensembledecesfacteursrendcomptedesvaleurs d'acclrationcourammentobservesaveclesenzymescommel'indiqueletableausuivant:

Enzyme Vitesse non enzymatique (s-

1)Vitesse enzymatique (s-1)

Facteurd'accroissement

Chymotrypsine 4109 4102 107

Lysozyme 3109 5101 2108

Triose phosphate isomrase 6107 2103 3109

Fumarase 2108 2103 1011

Urase 31010 3104 1014

Dsaminased'adnosine 1012 102 1014

Phosphatasealcaline 1015 102 1017

Source : "Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn, Scrimgeour (1994), Ed. DeBoecK Universits

5. Les effets de la sur-population intracellulaire des macromolcules ("Macromolecular crowding effects")

Lesconditions"idales"d'tudedescintiquesenzymatiquesnerefltentpaslaralitcellulaire.

Lemilieuintracellulairen'estpasrempliqued'eauetd'ions:ilcontientunetrsgrandevaritdepetitesmolculesetdemacromolcules(protines,acidesnucliques,oligosaccharides,acidesgras,mtabolites,...).

Laconcentrationdesmacromolculespeutvarierde200400mg/mlselonl'organismeetlestypesdecellules:

chezEscherichia coli,laconcentrationintracellulairedesmtabolitesestvalue300mM(100millionsdemolculesdemtabolites/cellule)laconcentrationdelaprotinecristallineatteint500mg/mldanslescellulesdelalentillelaconcentrationdel'hmoglobinedansleshmatiesestenviron350mg/mllespolysaccharidescontribuentgalementcetencombrement,enparticulierdanslamatriceextracellulaire

Source : McGuffee & Elcock (2010)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2832674/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/1Lysozyme/1Lysozyme.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/4Glycolyse/1Glycolyse.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/3CoursdeBiochSTRUCT/1EAU/1H2O.htm



Sionconsidreuncubede100nmd'arte,levolumeducytoplasmedeEscherichia colicorrespond600cubesdecettetaille.

Dansundecescubes,coexistent:30ribosomesavecplusde100facteursprotiques,30aminoacyl-ARNt synthtases,340ARNdetransfert,23ARNmessagers,6ARNpolymrases,330protines(dont130enzymesdelaglycolyseet100enzymesducycle de Krebs),300autresmolcules,30.000petitesmolcules(H20,cofacteurs,prcurseursetmtabolites)et50.000ions.

ChezlesEucaryotes,lemilieuintracellulairecontientenplusl'ensembledesprotinesquiconstituentlecytosquelette.

Dansuneexpriencein vitro,cemmecubenecontientqu'une molcule d'enzyme, les sels du tampon etles molcules d'eau.

Leseffets de la sur-population intracellulaire sont non linaires:pluslamacromolculeaunemasse(doncbiensouventunetaille)importante,pluselleensubitleseffets.Ceseffetssontdoncnettementmoinsimportantspourlespetitsmtabolitesetlesions.

Aucuneespcemacromolculairen'estprsenteforteconcentrationindividuellement.Mais,ensemble,lesmacromolculesoccupentunefractionimportanteduvolumetotal:de 20 30 %.

Cettefractionduvolumeintracellulairen'estdoncphysiquementpasdisponiblepourd'autresmolcules.Cetteexclusion striqueadesconsquencesconsidrablesdupointdevuenergtique:

laconcentrationeffectivedesmacromolcules(plusprcismentleuractivit chimique)estaugmente:celmodifieconsidrablementlesvitessesdesractions,donclesconstantesd'quilibredesractionsin vivo.lasurpopulationintracellulairefavoriselerepliement des protines,l'autoassociationdemonomres(ladimrisationestaugmented'unfacteur840pourunmonomrede40kDa)etlesassociations[protinesprotines]et[protinesautrescomposantsdelacellule].l'augmentationdesinteractionsentreprotinesaune incidencesurlaconformationdesenzymesetdoncsurleuractivit enzymatique.l'augmentationdelastabilitdesprotinesdansdesconditionsdesurpopulationdesmacromolculesrsulted'unediminutiondel'entropiedeladnaturationdesprotinessanschangementassocidel'enthalpie.uneautreconsquencecapitaledelasurpopulationintracellulaireestlaforte limitation(d'unfacteur1020,enmoyenne)deladiffusiondesmolcules:in vivo,ilfaut2suneprotinede160kDapourparcourirunedistancede10nmalorsqu'ilneluifautque2nsdansunesolutionhomogne.

Effets de la sur-population intracellulaire sur l'activit enzymatique

Lemilieuintracellulairediffredoncconsidrablementd'unesolutionhomogne(conditionsin vitro)danslaquellelesmacromolculesbiologiquessontdisperses(trsdilues):lesconcentrations desenzymesin vivosontdel'ordrede105104M,valeurs trs suprieuresauxconcentrationsdesenzymesin vitro(del'ordrede1010107M).

UnetudedumtabolomedeEscherichia coliamontrquelaconcentrationdesmtabolitesestsuprieurelavaleurdeleurKMpourlagrandemajoritdesenzymes.

Exemples d'effets de la sur-population intracellulaire sur les paramtres cintiques de la catalyse parquelques enzymes

Lasurpopulationintracellulaireestsimulein vitroparl'addition,danslemilieudemesuredel'activitenzymatique,d'agentstelsquelepolythylne glycol(PEG),leFicoll,ledextranoul'albuminede srum bovin(BSA).

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/1Respiration/Z999suite/2CycleKREBS/1CycleKrebs.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/2Biochimie/1SyntheseProteines/1SyntheseProt.htm#AARNtSynthhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/2Cours2/1Cours2.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/4Repliement/1Introduction.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/7ModuleS6BG3/4ExoBSA12/1ExoBSA.htm



L'activitenzymatiqueaugmentepuisdiminueavecl'augmentationdelaconcentrationenprotines.L'activitenzymatiquediminuedefaonmonotoneavecl'augmentationdelaconcentrationdepolymres.

L'additiondePEG400020.000:

augmentel'activitdelaDNaseI(KMn'estpasmodifipasVMaxestaugmented'unfacteur20)etdelanuclaseS1

nemodifiepassignificativementl'activitdel'exonuclaseIII

diminuel'activitdel'exonuclaseI

L'activitspcifiquedel'uraseaugmentejusqu'10foisenprsenced'uneconcentrationd'hmoglobinede30%(enpoids).LePEG6000augmentel'activitdel'enzymeAspPdeEscherichia coli:uneconcentrationdePEG50mg/mLdiminueKMd'unfacteur4etaugmenteVMaxd'unfacteur6.Ledextran70.000,leFicoll70.000oulePEG6000augmentel'activitenzymatiquedel'isochorismatesynthase:uneconcentrationde25%del'undecesadditifs,diminueKMd'unfacteur23.

L'activitspcifiquedel'hexokinasediminuedesconcentrationslevesdeBSA:uneconcentrationdeBSAde250mg/mLdiminuekcatde33%etdiminueKMde25%.

LeseffetsdespetitsosmolytesetdesconcentrationslevesdeBSAsurl'activitdel'hexokinasesontadditifs.

6. Illustration des protases

Voir un cours sur les protases.

a. Gnralits

Lesprotinesoulespeptidessonthydrolyses enfragmentspeptidiquespardesprotases.Ilenexisteplusieursfamillesconstituesd'untrsgrandnombred'enzymes:

protases srine mtallo-protases aspartyl-protases protases cystineprotases thronine

trypsine(EC3.4.21.4)LysCthrombinechymotrypsinelastasesubtilisinecathepsinekallikrineprostasinegranzymefacteursVIIa,IXa,XaetXIIadelacoagulation

etbiend'autres...

aminopeptidasesA,B,N,OcarboxypeptidasesA1A6,B,E,M,N,Uangiotensin-converting-enzyme 2peptidases(hydrolysedepeptidestelsquedesneurotransmetteurs)

etbiend'autres...

pepsinesA,A4,A5retropepsinesdedertroviruschymosinerninecathepsinesD,E

etbiend'autres...

cathepsinesB,F,H,K,L,O,S,V,W,Xcalpanes115caspases110ubiquitinylhydrolasesubiquitinylspcifiquespeptidases154secernine

etbiend'autres

sous-unitscatalytiquesduprotasometaspaseasparaginase

etbiend'autres...

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htmhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7683654http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/7Ubiquitinylation/1Ubiquitinylation.htm#DESUBhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/7Ubiquitinylation/1Ubiquitinylation.htm#Proteasome20Shttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/2Cours2/1Cours2.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10700378http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/4Glycolyse/1Glycolyse.htm#Hexokinasehttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/Zsuite/3BiochMetab/7Ubiquitinylation/1Ubiquitinylation.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/2LicenceUE1/HEMOGLOBINE/1Hb.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/TexteTD/7ModuleS6BG3/6HIRUDINE/3ActivationRecepteur/1ActivRecepteur.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/2N2NH3aaetUree/1N2NH3AAetUree.htm#DesamiDationhttp://www.expasy.ch/enzyme/3.4.21.4



...

Touteslesinformationsfonctionnelles(spcificitdessubstrats,inhibiteurs,squencesetautres)etstructuralessontrecensesdansdesbasesdedonnestellesque:

The Proteolysis MapThe MEROPS database

b. Les protases srine

Lesdeuxfamillesdeprotases srine("chymotrypsin-like"et"subtilisin-like")contiennententreautres:latrypsine,lachymotrypsine,l'lastase,lasubtilisine(voir tableau ci-dessus).

Chymotrypsine:en1901,H.M.Vernonaproposquelesprparationsdepancrascontiennentunactivateurintrinsquesespropresenzymes.Cetteideneftacceptequ'en1934quandMosesKunitzetJohn Howard Northropontconfirmlaprsenced'uneenzymeenplusdelatrypsine:ilsl'ontnommechymotrypsine.Ilsl'ontcristallisedemmequesonprcurseurinactif,lechymotrypsinogne.

En1938,M.Kunitzaisoldiffrentesformesactivesdelachymotrypsineenlesappelantalpha,btaetgamma.En1947,Jacobsenaidentifidesformessupplmentairesdelachymotrypsineenlesappelantdeltaetpi.

LedomaineprotiqueappelKunitz(oudomaineinhibiteurdeprotasesdetypeKunitz)estundomainequiinhibelesprotases.Ilestrelativementpetit(5060acidesamins).Exemple:l'aprotinineouinhibiteurdelatrypsinepancratiquebovine(BPTI).

En1954,lapremirepreuvedumcanismecatalytiqueen3tapesdel'hydrolysedesubstratsamideetesterparlachymotrypsineatapporteparBrian HartleyetB. Kilby.Ilsontmisl'hypothsed'uneformeacylenzymeintermdiaire,cequifutdmontrultrieurementparHendersonen1970.Lachymotrypsinesuitunmcanisme gnral de type "ping-pong".

En1955,Michael Laskowski Jr.aobtenuunedeuximeformecristallineduchymotrypsinogne(chymotrypsinogneB).

Trypsine:en18761877,Wilhelm Khneadcouvertlatrypsinedansleliquidepancratiquedel'intestindeboeufaucoursdesestudessurladigestionintermdiairedesprotinesdansletractusgastrointestinal.Ilaconcluquelatrypsinetaitinitialementinactivepuisconvertieensaformeactive.Cetteobservationestlabasedelanotiondeprcurseurinactifdesprotasesquel'onappellezymogneetdel'activationdecezymognepar(auto)protolyse.

En1931,J.H.NorthropetM.Kunitzontcristallislatrypsineaprslapremirepurificationdelapepsineen1930.

En1974lastructuretridimensionnelledelatrypsineatdtermineetaservideprototypepourlafamilledesendopeptidases srine de type S1laquellelatrypsineappartient.

De19871992,destudesdemutagnsedirige(trypsinerecombinante)ontpermisdedterminerlerled'acidesaminsparticulier.

Latrypsineestutilisedanslesprotocolesdeculturesdecellulesetdetissus,dansl'identificationdesprotinesparsquenagedepeptides(protomique et spectromtrie de masse).Latrypsineestuneprotasetrstudiedansdiversdomainesmdicaux:lamutationR117Hempchesonautolyseetprovoquelapancratite.Latrypsineatutilisepourmodliserladcompositionducartilagearticulairedansl'ostoarthrite.

Elastase:onattribueChristiaan Eijkmanlespremirestudesdel'lastaseen1904,commeproduitdes

http://persos.estat.com/statistiques/audience/20900984735http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/9ModulGenFoncVeg/6Proteomique/1Proteomiq.htmhttp://en.wikipedia.org/wiki/Wilhelm_K%C3%BChnehttp://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1929/eijkman-bio.htmlhttp://merops.sanger.ac.uk/http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htmhttp://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1946/northrop-bio.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/6Proteases/2Proteases/1Proteases.htm#Zymogenhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/4DeuxSUBSTRATS/1Cours2SUBSTRATS.htmhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10700378http://www.proteolysis.org/proteases



bactries.IlafalluattendrelestudesdeJ. BaloetI. Bangaen1949pourdmontrerqu'elleestuneenzymeprotolytiquedupancrascommelatrypsineetlachymotrypsine.

En1968,David ShottonetBrian Hartleyontobtenulespremierscristauxd'lastaseporcine.Lerledel'lastasedansl'emphysme,l'athrosclroseetlapancratiteaiguhmorragiqueattudientre1968et1974.

En1974,W.Ardeltadcouvertundeuximetyped'lastaseappelelastasepancratiqueII.

Lesprotases srinesontprobablementlesenzymes les plus tudiestantdupointdevuedumcanismecatalytique(voir ci-dessous)avecuntrsgrandnombred'inhibiteursdetoutessortes,quedupointdevuestructural.Parexemple,ondnombreplusde900 structures cristallographiqueslieslatrypsine(trypsine,trypsinogne,Kunitz trypsin inhibitor,...).

Lesprotases srine:

sontbiosynthtisessourformed'unprcurseurinactif,lezymogne,quiestactivparcoupureprotolytiquepardesprotasessrine.sontessentiellementdesendopeptidases.hydrolysentlaliaisonpeptidiqueenfonctiondelanaturedecertainsacidesamins.

Parexemple,latrypsinehydrolyselaliaison peptidiqueaprs(ctCterminal)lesacidesaminslysineetargininesaufsicesacidesaminssontsuivisparuneproline.

Cependantlesprotases srinepeuventavoirunespcificit trscomplexe.

Voirlelogiciel"PeptideCutter"Expasy.

Allerlapage"MS-Digest"dulogiciel"Prospector".Cliquersur"perform digest"pouravoirunaperud'unrsultatd'hydrolysein silicod'uneprotine.

Voirlalistedecertainesprotasesetleurspcificit:"Expasy".

c. Les acides amins du site catalytique des protases srine : la "triade" catalytique

Lesprotases srinepossdentunesrine 195 ractivedansleursiteactif.

Deuxautresacidesaminssontimpliqusdanslacatalyseparlesprotases srine:l'histidine 57etl'aspartate 102.

Lesprotases srineutilisentlesdeux types de catalyse:

l'histidine 57sertdecatalyseur acide-base.Onestimequelesacidesaminsmisenjeudanslacatalyseacidebaseacclrentde10 100 foislesractionsenzymatiquesparrapportlavitessedelammeractionnoncatalyseparuneenzyme.

lasrine 195sertdecatalyseur par covalenceavecuncarbonedelaliaisonpeptidiquequivatreclive.L'acclrationparlacatalysecovalenteestdu mme ordre de grandeur.

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/3AcidesAmines/1AcidAmine.htmhttp://www.expasy.org/tools/peptidecutter/peptidecutter_enzymes.htmlhttp://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigesthttp://www.rcsb.org/pdb/home/home.dohttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/1Introduction.htmhttp://www.expasy.ch/tools/peptidecutter/http://www.expasy.org/cgi-bin/aldente/help.pl?peptide.html%23enzyme



Figure ci-contre:les3acidesaminsHis57,Asp102etSer195formentlatriadecatalytique.

Source :E.Jaspard(2011) -

Imageralise

avecCHIMERA

- UCSF

Visualisation de la triadecatalytique dans la formeacyl-enzyme de l'lastasepancratique une rsolutionde 0,95 .

CodePDB:1GVK

PourfaireapparatredemultiplesfonctionsdumenuJmol:

clicsur"Jmol"(Mac)

YoudonothaveJavaappletsenabledinyourwebbrowser,oryourbrowserisblockingthisapplet.

Checkthewarningmessagefromyourbrowserand/orenableJavaappletsin

yourwebbrowserpreferences,orinstalltheJavaRuntimeEnvironmentfromwww.java.com

http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/http://www.java.com/http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1GVKhttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/



clicdroitsur"Jmol"(PC)

RotationNtermHis57Asp102Ser195CtermEnveloppeelectrostatiqueMoleculesd'eau

7. Mcanisme catalytique des protases srine

Voiruntrsboncours:Enzyme Mechanisms

1ere tape : formation du complexeenzyme-substrat (ES)

Laprotasefixelesubstrat(protineoupeptide)dontellehydrolyselaliaison peptidiqueauniveaud'acidesaminsspcifiquesde la protase considre.

LachanelatraleR1del'acideaminimpliqudansl'hydrolysedelaliaisonpeptidiqueestdenaturearomatique ou encombrante(danslecasdelatrypsine)maisdetouteautrenaturepourd'autrestypesdeprotases.

Cettechanelatralesefixedansunendroitparticulierdusiteactifdelaprotaseappelepoche despcificit("specificity pocket")decaractrehydrophobe.

Cettefixationoptimise l'orientationstrochimiquedelaliaisonpeptidiqueafinqu'ellesoithydrolyseductC-terminal(carboxyle)dursidud'acideamin.

Lesquelettecarbondu

http://web.expasy.org/peptide_cutter/peptidecutter_enzymes.htmlhttp://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/ENZYMES/enzyme_mechanism.htmlhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/7RelStructFonction/3Structure/1StructPrimQuat/1Introduction.htmhttp://web.expasy.org/peptide_cutter/peptidecutter_enzymes.html



polypeptidesubstratformeuncourt feuillet aveclesquelettecarbondel'enzymeauniveaudusiteactif(non montr dans lafigure).

L'oxygnedugroupementcarbonyledusubstratformeuneliaisonhydrogneavecungroupementNH(amide)dusquelettecarbondel'enzyme(non montr dans la figure).

Lecomplexeenzyme-substrat (ES)estainsiform.

2me tape : acylation / formationdu premier intermdiairettrahdrique

L'oxygnedugroupementOHdelaSer 195 du site actifestactivenformantuneliaisonhydrogneavecl'azoteN:dunoyauimidazoledel'His 57.His57agitcommeunaccepteurdeprotondeSer195,selonunmcanismedecatalyse basegnrale,etdevientHis-H+.

Enmmetemps,l'oxygneSerOdevientnuclophileetattaqueleCdugroupementcarbonyledelaliaisonpetidiquehydrolyser.Uneliaisoncovalenteestainsiformeselonlemcanismedecatalyse par covalence.

Asp 102apourrlelemaintiend'unarrangementstrospcifiqueidaldurseaudeliaisonshydrognetabliesentreHis57etSer195.IlstabiliseaussilaformeHisH+parinteractionlectrostatique,cequifaciliteletransfertdu

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/3CatAcBaseCovalente/1CatAcideBase.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/3CatAcBaseCovalente/1CatAcideBase.htm



proton.

Lersultatdecettetapedited'acylationestlaformationdupremierintermdiairettrahdriquedontlastructureestprobablementsemblablecelledel'tat de transition(ES#)avecunoxygnecarbonylengatifappell'oxyanion.Lesite actiffixe plus fortement l'oxyanionqu'ilnefixelegroupementcarbonyleoriginaldusubstrat:l'tatdetransitionestainsistabilis.

Uneautreliaisonhydrogneesttablieentrel'oxyanionetungroupementNHdusquelettecarbondel'enzyme(auniveaudeGly 193)situdansunergionappele"trou oxyanion".

3me tape : acylation (formation del'acyl-enzyme) / libration duproduit P1

Laliaisonpeptidiqueoriginelleestclive:HisH+cdeunprotonlamoiti"amino"dusubstratd'origineetagitselonunmcanismedecatalyse acidegnrale.

Cettepartieamineestdissociedusiteactifetleproduit P1 (R2-NH2) est libr.

L'oxyanionredevientC=OquiresteattachdemanirecovalenteSer 195.

C'estl'intermdiaireacyl-enzymefixparuneliaisonesterentrelamoiti"carbonyle"dusubstratd'origineetl'oxygnedelafonctionalcooldeSer 195.

4me tape : dsacylation /formation du secondintermdiaire ttrahdrique

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/3CatAcBaseCovalente/1CatAcideBase.htmhttp://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/4EtatTransitionES/1EtatTrans.htm



Lesecondsubstrat,lamolcule d'eau,formeuneliaisonhydrogneavecHisN:etHis57agitdenouveauselonunmcanismedecatalyse basegnrale,etdevientHis-H+.

L'oxygnedel'eauestactivcequilerendnuclophile:ilattaqueleCdugroupecarbonyledel'acylenzyme(catalyse parcovalence).

Asp 102apourrlelemaintiend'unarrangementstrospcifiqueidaldurseaudeliaisonshydrognetabliesentreHis57etSer195.IlstabiliseaussilaformeHisH+parinteractionlectrostatiquecequifaciliteletransfertduproton.

Lersultatdecettetapeestlaformationdusecondintermdiaire ttrahdrique(groupementOHaulieud'ungroupementamidedanslecasdupremier)dontlastructureestprobablementsemblablecelledel'tat de transition(ES#)avecunoxygnecarbonylengatif(oxyanion).

Lesite actif fixe plusfortement l'oxyanionqu'ilnefixelegroupementcarbonyleoriginaldusubstrat:l'tatdetransitionestainsistabilis.

Denouveau,uneautreliaisonhydrogneesttablieentrel'oxyanionetungroupementNHdeGly193situdansle"trouoxyanion".

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/1COURS1/2FIGURES/4EtatTransitionES/1EtatTrans.htm



5me tape : dsacylation /libration de P2 /reformation de E

His-H+redonnesonprotonl'oxygnedelafonctionalcooldeSer 195 del'acyl-enzyme.

Laliaisonesterestclive,librantleproduit P2:R1-COOHquicorrespondlapartieN-terminaledusubstratd'origine.

Les3acidesaminsdelatriade catalytiqueretrouventleurtatinitial.

L'enzymeestdenouveausouslaformeE:elleestprtecatalyserdenouveaularaction.

Schmas raliss avec ChemBioDraw.

Figure ci-contre:mcanismesd'inhibitionpardiffrentscompossquiformentunintermdiairettrahdrique.

Cescompossontpermisd'identifierlasrine195dusiteactifdesprotasessrine.

http://biochimej.univ-angers.fr/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/1CoursInhibition.htmhttp://www.cambridgesoft.com/software/ChemBioDraw/



http://biochimej.univ-angers.fr/FluxRss.xmlhttp://validator.w3.org/check?uri=referer

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