ENZYMOLOGIE. 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs...
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ENZYMOLOGIE
Plan 3 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température. * 3.1.2. Le pH.
* 3.2. Influence de la concentration en enzyme.
* 3.3. Influence de la concentration en produit.
3.4. Effecteurs enzymatiques. * 3.4.1. I.N.C. (non compétitive) * 3.4.2. I.C. (compétitive)
* 3.4.5. Activateur.
* 3.5. Activation zymogène / enzyme.
* 3.4.3. I.A.C. (anti-compétitive) * 3.4.4. Inhibition irréversible.
3.1.1 Température
t
Pdt
10°C
30°C
50°C40°C
60°C
80°C
T
Vi
L'élévation de la température augmente la vitesse des réactions
L'élévation de la température
dénature l’enzyme
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température.
T optimale
T maximale
On effectue une série de cinétique à des températures croissantes.
On le fera enTP
On devine une relation complexe.
On trace Vi = f ( T ).
La présence de deux phases est
caractéristique de deux phénomènes distincts.
3.1.1 Température
t
Pdt
10°C
30°C
50°C40°C
60°C
80°C
T
Vi
L'élévation de la température augmente la vitesse des réactions
L'élévation de la température
dénature l’enzyme
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température.
T optimale
T maximale
La loi d'Arrhénius exprime la relation entre la constante de vitesse d'une réaction et de la
température.
1/T
LnVi
Ea = - a x R
k: constante de vitesseT: températureR: constante des gaz parfaits
(= 8,315 J.K-1.mol-1 )Ea: énergie d'activation
Elle ne quantifie pas la dénaturation de l'enzyme.
PLAN
3.1.2 pH
t
Pdt
pH 5
pH 5,5
pH 6.5pH 7
pH 6
pH 4
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température. * 3.1.2. Le pH.
Le pH agit sur l'état d'ionisation des fonctions
chimiques des chaînes latérales.
pH
Vol d'acide ajouté
-COOH
-NH3+
-COO-
-NH3+
-COO-
-NH2
Le pH agit sur la nature des liaisons de faible énergie
formées. Par conséquent, il agit sur:
la conformation de la protéine
les interactions avec le ligandpKa1
pKa2
- COOH -COO-
3.1.2 pH suite
t
Pdt
pH 5
pH 5,5
pH 6.5pH 7
pH 6
pH 4
pH
Vi
pKa de la fonction impliquée dans site actif
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.2. Le pH. Le pH agit sur l'état
d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales.
Attention !L'interprétation n'est pas si
simple. Le pH agit sur :
Les AA de contact.(interaction avec le ligand)
Les AA auxiliaires.(conformation du site actif)
Les AA collaborateurs.(conformation de la protéine et
du site actif?)
Il existe plein de variantes possibles.
3.1.2 pH suite
pH
Vi
pKa de la fonction impliquée dans site actif
PLAN 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.2. Le pH. Le pH agit sur l'état
d'ionisation des fonctions chimiques des chaînes latérales.
Attention !L'interprétation n'est pas si
simple. Le pH agit sur :
Les AA de contact.(interaction avec le ligand)
Les AA auxiliaires.(conformation du site actif)
Les AA collaborateurs.(conformation de la protéine et
du site actif?)
D'autres situations sont envisageables
2 AA impliqués dans le site actif
2 AA impliqués dans le site actif
plusieurs AA (collaborateurs)
impliqués
3.2 C Ez 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température. * 3.1.2. Le pH.
* 3.2. Influence de la concentration en enzyme.
La simple logique permet de prévoir l’influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de réaction.
WINNER
3.2 C Ez graphe * 3.2. Influence de la concentration en enzyme.
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
[ E ]
Vi
V = k.[ E ]
En fait, ce n'est pas si simple !
Le graphe est linéaire tant que
S >> E
Si la concentration en substrat est très faible
par rapport à l’enzyme, la réaction est presque
instantanée.
Si la concentration enzymatique dépasse un certain seuil, les
protéines précipitent et adieu la cinétique.
PLAN
Vm augmente
Km constant
Si la concentration enzymatique est
voisine de S:
On obtient une courbe type Michaélis.
On est en dessous du seuil de sensibilité des appareils
3.3 C pdt démo 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.1. Les facteurs physico-chimiques. * 3.1.1. La température. * 3.1.2. Le pH.
* 3.2. Influence de la concentration en enzyme.
* 3.3. Influence de la concentration en produit.
L’enzyme catalyse la réaction dans les deux sens. Elle
reconnaît le produit comme le réactif (ce sont deux
substrats).On parlera d’inhibition compétitive.
PLAN
3.4.1 INC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.4. Effecteurs enzymatiques. * 3.4.1. I.N.C.
Le site actif présente une conformation
précise.
Elle permet un « emboitage » optimale avec le substrat (ici un dipeptide possédant un
AA aromatique)
Certaines molécules se fixent sur des sites
spécifiques... ...et modifient la conformation de
l’enzyme.
On sent que ça ballotte !
L’activité catalytique devient plus difficile et, par
conséquent, plus lente.
Le substrat n’a aucune difficulté pour se fixer dans le
site de reconnaissance.
Ca, c’est la version officielle. La théorie est simple, élégante, mais
présente une bonne dose de mauvaise foi.
3.4.1 INC graphe
1/S
1/Vi E + INC
E seuleVm diminue
Km constant
PLAN 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.4. Effecteurs enzymatiques. * 3.4.1. INC. Ce phénomène influence l’activité de l’enzyme
par rapport à la concentration de substrat.
L’activité de l’enzyme est moins efficace en
présence d’inhibiteur. C’est logique !
On a vu ce qu’il faut en penser !
3.4.2 IC 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.4. Effecteurs enzymatiques.
* 3.4.2. I.C.
Un inhibiteur compétitif est une molécule qui ressemble
au substrat(analogue de substrat).Il est complémentaire du site actif
mais ne subit pas la réaction.
Il bloque le fonctionnementde l’enzyme.
Si l’enzyme fixe le substrat, elle se comporte normalement:
Vm normal
Si l’enzyme fixe l’I.C., elle est totalement bloquée:
Vm = 0TPCK
N-tosyl-L-phénylalaniyl-chlorométhylcétone
3.4.2 IC
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.4. Effecteurs enzymatiques. * 3.4.2. I.C.
E + I.C.
E seuleVm constant
Km augmente
PLAN
L’activité globale de l’enzyme dépend de la proportion d’enzyme ayant fixé
le substrat et l’inhibiteur.
Elle dépend donc de la proportion entre les concentrations de substrat
et d’inhibiteur.
Si [S] >> [IC] (S très grand): globalement le comportement de l’enzyme est normal.
Si [S] > [IC] (S normal):globalement l’enzyme est ralentie. La probabilité qu’elle fixe S diminue.
S infini, V normalVm normal.
1/S
1/Vi
Km augmente.
3.4.3 IAC
* 3.4.3. I.A.C.
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.4. Effecteurs enzymatiques.
L’inhibiteur anti-compétitif se fixe exclusivement sur le
complexe ES.
L’I.A.C. bloque le substrat dans le site de reconnaissance. le complexe est plus stable.
Km diminue.
L’I.A.C. bloque la réaction.Vm diminue.
Ce qui est étonnant pour un inhibiteur !
Là, c’est normal !
3.4.3 IAC
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique. 3.4. Effecteurs enzymatiques. * 3.4.3. I.A.C.
E + I.A.C.
E seule
Vm diminue
Km diminue
PLAN
1/S
1/Vi
L’IAC est assez peu répandue. On l’observe cependant chez les enzymes à deux substrats. Un IC du premier peut jouer le rôle d’IAC pour le deuxième.
L’ion lithium est un IAC de l’inositol-1-Phosphatase. Cela pourrait expliquer en partie son rôle dans le traitement
des troubles bipolaires.
En ce moment, c’est la mode les troubles
bipolaires !
3.4.3 I irrev 3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.4. Effecteurs enzymatiques.
Un inhibiteur irréversible se comporte comme un inhibiteur
classique... sauf qu’il est irréversible.
* 3.4.4. Inhibition irréversible.
Il se fixe de façon covalente.
Agent alkylant.
I-CH2-COO-
Iodoacétate
--S
Inhibiteur suicide.
Ils sont reconnus comme des substrats.
Il réagit avec les fonctions réactives des sites actifs.
Inhibiteur des protéines métaboliques.
Ce sont des IC dont la constante de dissociation est extrêmement faible (10-14 mol.L-1)
H3C H CH3
CH3C O CH O P = OH3C FOH
HOH
di-isopropylfluorophosphate DIFP
PLAN
3.4.5 Activ
E seule
E + activateurKm
constant
3. Les facteurs qui influencent l'activité enzymatique.
3.4. Effecteurs enzymatiques.
* 3.4.3. Activateur.
1/S
1/ViChangement du site catalytique
Vm augmente.
Changement du site de reconnaissanceKm constant (ou diminue ou augmente).
La fixation d'une molécule (activateur) sur un site spécifique induit un changement de conformation du
site actif et améliore la catalyse de la réaction.
Vm augmente
WINNER
PLAN
3.5 maturation acinus
REG
appareil de Golgi
granule de zymogène
lumière
synthèse du chymotrypsinogène
stockage
exocytose du chymotrysinogène
chymotrypsinogènerecouvert d’une
membrane
1 245S --S S --S S ------S
S ---------------------------S S --------------S
1 245S --S S --S S ------S
S ---------------------------S S --------------S
1 15 16 245S --S S --S S ------S
S ---------------------------S S --------------S
1 15 16 245S --S S --S S ------S
S ---------------------------S S --------------S
1 13 16 146 149 245S --S S --S S ------S
S ---------------------------S S --------------S
chymotrypsinogèneinactif
p-chymotrypsineactif
a-chymotrypsineactif
trypsine
chymotrypsine
* 3.5. Activation zymogène / enzyme.
Un grand nombre d’enzymes, en particulier les enzymes de
dégradation (hydrolases), sont dangereuses pour l’intégrité des
cellules qui les produisent.
Elles sont produites sous forme d’un précurseur inactif (pro-enzyme ou zymogène) qui est
activé par clivage interne sur le lieu de dégradation.
L’activation de la chymotrypsine se déroule dans la lumière de
l’intestin sous l’action des enzymes de digestion.
plan 4 4 . Enzymes complexes.
4.1. Complexe multi-enzymatique.
* 4.1.2. Chaîne respiratoire.
4.2. Allostérie.
* 4.2.1. Manifestation de l’allostérie.
* 4.2.2. Intérêt physiologique de l’allostérie.
* 4.2.3. Contrôle de l’activité enzymatique.
* 4.1.1. Pyruvate déshydrogénase.
4.1.1 * 4.1.1. Pyruvate déshydrogénase.
PLAN
4.1.2
Complexe NADH-Q réductase
Complexe QH2-cytc réductase
Complexe cytc
oxydase
* 4.1.2. Chaîne respiratoire.
4.1.2 suite
Complexe FADH2-Q réductase
Complexe QH2-cytc réductase
Complexe cytc
oxydase
* 4.1.2. Chaîne respiratoire.
4.1.2 fin* 4.1.2. Chaîne respiratoire.
PLAN
4.2.1 allostCertaines enzymes clés des voies métaboliques ne présentent pas de comportement Michaelien.
0 5 10 15 20 25 300
20
40
60
80
100
120
140
160
S (en mmol.L-1)
Vi (en mmol.mn-1)
Cette différence est mise en évidence grâce à la relation:
Vi = f ( S )
Agrandissement du début de la courbe
(S petit)
* 4.2.1. Manifestation de l’allostérie.
Phosphofructokinase
4.2.1 suite
0 5 10 15 20 25 300
20
40
60
80
100
120
140
160
S (en mmol.L-1)
Vi (en mmol.mn-1)
0 5 10 15 20 25 300
20
40
60
80
100
120
140
160
F1,6dP
S (en mmol.L-1)
Vm (en mmol.mn-1)
phase IEnzyme
peu efficace
phase IIEnzyme
très efficace
phase IIIsaturation
forme TKm >
forme RKm <
PLAN * 4.2.1. Manifestation de l’allostérie.
Modèle de Monod, Wyman et Changeux (1965)
4.2.2 O2
L’hémoglobine est untransporteur d’oxygène au comportement allostérique.
Ce n’est pas vraimentune enzyme (quoique...) mais c’est un bon modèle de fonctionnement
allostérique.
Forme tendue (T)
O2
Forme relâchée (R)
O2
O2
* 4.2.2. Intérêt physiologique de l’allostérie.
La fixation du premier O2 sur l’hème induit un
changement de conformation de l’ensemble des sous-unités
(tendue ------> relâchée)
Il existe plusieurs modèles d’allostéries avec changement
de conformation simultanéou progressif…
4.2.2 suite
* 4.2.2. Intérêt physiologique de l’allostérie.
L’hémoglobine n’est pas l’unique transporteur de dioxygène de l’organisme.
Hémoglobine. Myoglobine.
tétramère a2b2 monomère
allostérique michaëlien
4.2.2 fin
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200
20
40
60
80
100
120
140
160
Hb
Mb
PO2 (en kPa)
qt O2 fixé en g.L-1)
Domaine d’échange
70 g.L-1
15 g.L-1
PLAN
allostérique michaëlien
* 4.2.2. Intérêt physiologique de l’allostérie.
L’hémoglobine fixe moins bien
O2 que la myoglobine.
L’hémoglobine est plus apte à
échanger son O2 dans les
conditions physiologiques.
P tissulaire P alvéolaire
Hémoglobine. Myoglobine.
4.2.3Cas de la phosphofructo kinase
ATP
ATP
ATP
ATP
0 5 10 15 20 25 300
20
40
60
80
100
120
140
160
S (en mmol.L-1)
Vm (en mmol.mn-1)
La glycolyse dépend du taux d’ATP
Niveau de référence
Excès d’ATP
Enzyme moins efficace:ralentissement du métabolisme
Manque d’ATP
Enzyme plus efficace:accélération du métabolisme
(allure michaëlienne)
* 4.2.3. Contrôle de l’activité enzymatique.
hydrolyse
production
plan 5
* 5.2. Immobilisation.
5.3. Biocapteur.
* 5.3.1. Nature et rôle des biocapteurs.
5.3.2. Montage. * 5.3.2.1. Biorécepteur.
5.3.2.2. Transducteur.
* 5.3.3. Caractéristiques. 5.3.3.1. Spécificité.
5.3.3.2. Sensibilité.
5.3.3.3. Temps de réaction.
5.3.3.4. Type d’électrode.
5.3.3.5. Interférence.
* Electrode de Clark.
* Electrode à CO2.
* Types de transducteurs.
5. Enzymes: outil de production.
* 5.1. Instrument d’analyse.
5.1 dos Ez
Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude.Elles font partie des réactifs permettant
la révélation du substrat à doser. * 5.1. Instrument d’analyse.
Tous les renseignements sont disponibles dans la fiche technique.
Encore faut-il savoir l’utiliser !
Cette partie indique l’intérêt du test.
C’est plutôt le domaine des ABM !
Certaines parties n’ont qu’un intérêt pratique.
D’autres permettent de juger la qualité des résultats.
Ce n’est pas notre propos aujourd’hui.
Analysons les parties
restantes.
51 dos Ez suite
Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude.Elles font partie des réactifs permettant
la révélation du substrat à doser.
* 5.1. Instrument d’analyse.
Analysons les parties
restantes.
triglycérides quinonéimine
5.1 dos Ez suite
Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude.Elles font partie des réactifs permettant
la révélation du substrat à doser.
Analysons les parties
restantes.
Analysons les parties
restantes.
Conditions optimales pour l’enzyme. - pH
- force ionique - substrat (coloration) - coenzyme (Mg2+)
Milieu permettant la réaction: - enzymes
- Co-Enzyme (ATP)
* 5.1. Instrument d’analyse.
5.1 dos Ez fin
* 5.1. Instrument d’analyse.Les enzymes ne sont pas le sujet d’étude.Elles font partie des réactifs permettant
la révélation du substrat à doser.
Analysons les parties
restantes.
Analysons les parties
restantes.
Sans commentaire.
Le protocole.
Pas trop compliqué?
Ca, c’est pour les flémards.
La terminologie DO n’est plus valable depuis 1974 !
Il est obligatoire d’utiliser Abs.
1/0,875 = 1,114on est bien avancé !
C = r x M
C.10-3= r x n
C = r x M = r x n.103
n = M.10-3
D’où vient
cette valeur?
PLANBeer Lambert
Absét = e.Cét.lAbséch = e.Céch.l
Absét = Cét
Abséch C éch
Céch = Cét x Abséch
Absét
5.2 immobil
* 5.2. Immobilisation.par inclusion
physique(confinement)
dans un gel
par introduction dans des fibres
creuses
lors de la fabrication de
fibres
par d’autres techniques
(membranes,...)
Inclusion dans
l’alginate
Alginate + Ca2+
Enzyme
Enzyme
Membrane de dialyse
5.2 immobil suite
* 5.2. Immobilisation.
par inclusion physique
(confinement)
par fixation par des liaisons...
covalentes non covalentes
support préexistant
lors de la création du
support
ioniques Van der Waals
support préexistant
Enzyme
protéine de charge(BSA)
CHO
(CH2)3
CHO
agent bifonctionel(réticulant)
échangeur anionique:
DEAE cellulose
échangeur cationique: carboxyméthyl cellulose
PLAN
5.3.1 rôle biocapt
5.3. Biocapteur.
* 5.3.1. Nature et rôle des biocapteurs.
système permettant une identification spécifique
une réutilisation des enzymes
une identification qualitative et quantitative
Suppriment les opérations de
prélèvement et d’analyse.
Réduisent les interventions
humaines.
Permettent l’automatisation.
Améliorent fiabilité
dosages en continu suivi en ligne de plusieurs étapes d’un
même processus
PLAN
5.3.2.1 Montage
BIORECEPTEUR
Ez
S
P + a+
TRANSDUCTEUR
électrodese-
a+-----> a
signal électrique
AMPLIFICATEUR
* 5.3.2.1. Biorécepteur.
Principe de fonctionnement.
5.3.2.1 Biorécepteur
Capteur à glucose
glucose
gluconolactone
acidegluconique
FAD
FADH2
O2
H2O2
GOD2.e-
signalélectrique
PLAN* 5.3.2.1. Biorécepteur. Principe de fonctionnement.
Electrode Clark
membrane hydrophobe(téflon ou polypropylène)
joint torique
anode (de référence)Ag / AgCl
Ag -----> Ag+ + e-
Ag+ + Cl- -----> AgCl
cathode (indicatrice)Pt
O2 + e- + 4H+-----> 2 H2O
O2
électrolyte KCl
e-H2O
signal électrique
PLAN
Electrode de Clark.
Electrode à CO2
membrane hydrophobe perméable aux gaz CO2
CO2 + H2O -----> H2CO3
H+ + HCO3-
électrode indicatrice pH électrode de référence au calomel
électrolyte
PLAN
* Electrode à CO2.
types transducteurs
mV
capteur potentiométrique
générateur
capteur ampérométrique
µA
PLAN
* Types de transducteurs.
électrolyte
électrode
Création d’un courant électrique (tension imposée).
L’intensité de courant résultante est la somme des
deux courants(générateur + électrodes)
5.3.3.1 caract 5.3.3.1. Spécificité.
Capteur est une enzyme -----> la reconnaissance de la molécule possède la spécificité enzymatique:
-----> glucose dans mélange de sucres -----> énantiomère d'AA dans un mélange
5.3.3.3. Sensibilité.
5.3.3.2. Temps de réaction.
Il s’agit du temps nécessaire pour obtenir signal stable.
En général il est de 15 s à 2 mn
5.3.3. Caractéristiques.
5.3.3.3 caract
E (mV)
C (mmol.L-1)
méthode potentiométrique
zone de linéarité
limite de détection
pente = sensibilité
sensibilité= DE / DC
méthode ampérométrique
sensibilité= DI / Dlog C
limite de linéarité
5.3.3. Caractéristiques.
I (mA)
log C
pente = sensibilité
5.3.3.3. Sensibilité.
5.3.3.4 caract5.2.3. Caractéristiques.
5.2.3.4. Electrodes multiples.
Dosage unique ou multiple: -----> électrode permettant un seul type de substrat
-----> électrode permettant dosages de plusieurs substrats (ou plusieurs produits)
Dans ce cas, le système possède plusieurs sensibilités différentes. La sensibilité globale correspond à la sensibilité la plus faible (limitante).
5.2.3.5. Interférences.
Certaines molécules peuvent réagir avec les électrodes et fausser mesures. - métaux lourds
- hypochlorite de Na+ - acide ascorbique
etc...
