Caractérisation d’arène dioxygénases impliquées dans la ......hydrocarbures aromatiques...

CaractCaractéérisation drisation d’’ararèène ne dioxygdioxygéénasesnases impliquimpliquéées dans la es dans la

biodbiodéégradation des gradation des hydrocarbures aromatiques hydrocarbures aromatiques

polycycliques chez polycycliques chez MycobacteriumMycobacteriumspsp. 6PY1. 6PY1

ThThèèse prse préésentsentéée par Sylvain e par Sylvain KuonyKuony

Directeur de thDirecteur de thèèse : Yves se : Yves JouanneauJouanneau

BBSI BBSI –– CEA GrenobleCEA Grenoble

PlanPlan

IntroductionIntroductionLes HAP, les dioxygLes HAP, les dioxygéénases, nases, Mycobacterium Mycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1

Clonage de gClonage de gèènes de dnes de déégradation des HAPgradation des HAP3 loci, analyse des s3 loci, analyse des sééquencesquences

PropriPropriééttéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2Etude de lEtude de l’’activitactivitéé et de la set de la séélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2

Surexpression et purification de Pdo1 et Pdo2Surexpression et purification de Pdo1 et Pdo2RRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives

PlanPlan




Surexpression et purificationSurexpression et purificationRRéégulation de lgulation de l’’expressionexpressionConclusions et perspectivesConclusions et perspectives

HAP: Hydrocarbures Aromatiques HAP: Hydrocarbures Aromatiques PolycycliquesPolycycliques

• combustion incomplète de matière organique fossile ou pyrolyse

• très stables

• peu volatils

• hydrophobes

• ubiquitaires

• toxiques : risques de cancers

HAP Légers

HAP Lourds

BiodBiodéégradation bactgradation bactéériennerienne

Utilisation des HAP comme sources de carbone Utilisation des HAP comme sources de carbone et det d’é’énergienergieHAP HAP àà 2 ou 3 cycles:2 ou 3 cycles:

EspEspèèces du genre ces du genre PseudomonasPseudomonasGGèènes, protnes, protééines et rines et réégulation gulation éétuditudiééss

HAP HAP àà 4 cycles ou plus4 cycles ou plusEspEspèèces des genres ces des genres MycobacteriumMycobacterium ou ou SphingomonasSphingomonasGGèènes, protnes, protééines et rines et réégulation gulation àà éétudiertudier

BiodBiodéégradation des HAP par les bactgradation des HAP par les bactééries :ries :cas du naphtalcas du naphtalèène et du phne et du phéénanthrnanthrèènene

• Etape initiale catalysée par une enzyme de type dioxygénase

• La voie de dégradation du phénanthrène rejoint celle du naphtalène

• Gènes organisés en clusters• Opérons nah et sal

• Minéralisation complète

BiodBiodéégradation des HAP par les bactgradation des HAP par les bactééries :ries :cas du pyrcas du pyrèènene

OH

OH

HH

OHOH COOH

COOH COOHOH

OH

H

CO2H

OHOH

OHOH

H

HO COOH

OH

O

COOH

OH OH

CHO

OH

COOH

COOH

COOH

O

COOH

CHOCOOH

COOH

Pyrène

Phénanthrène

Pyrènecis-4,5-dihydrodiol

3,4-Dihydroxyphénanthrène

Phénanthrènecis-3,4-dihydrodiol

Acide Phtalique

1 2 3 4 5

6

7 8 9 10

11

12

131415

Le systLe systèème dioxygme dioxygéénasenase

e-

NAD(P)H, H+

NAD(P)+Réductase

FADe-

Fe-S

Ferrédoxine

O2

OH

OH

HH

[2fe-2S]

Fe

Dioxygénase

Structure de la naphtalStructure de la naphtalèène ne dioxygdioxygéénasenase

Kauppi et al. Structure (1998)

MycobacteriumMycobacterium sp. 6PY1sp. 6PY1

Bacille, GramBacille, Gram++, actinomyc, actinomycèèteteIsolIsoléée pour sa capacite pour sa capacitéé àà crocroîître sur pyrtre sur pyrèène comme ne comme unique source de carbone et dunique source de carbone et d’é’énergienergie

Capable de croCapable de croîître sur phtre sur phéénanthrnanthrèène, benzoate et ne, benzoate et acacéétatetate

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6 8 10 12

Pyre

ne (m

g/m

l)

Temps (Jours)

[pyrene]

Densité bactérienne

InductibilitInductibilitéé de lde l’’activitactivitéé de de minminééralisation du pyrralisation du pyrèènene

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10min

eral

isat

ion

du p

yrèn

e (n

mol

/mg

prot

éine

)

Temps (h)

Phenanthrene

Pyrene

Benzoate

Acetate + CΑΜ

Les enzymes de dégradation du pyrène sont induites par les HAP et le benzoate

Induction de protInduction de protééines par le pyrines par le pyrèènene

P20/21

P8P6

22 polypeptides induits sur pyrène, absents sur acétate

PlanPlan





StratStratéégie de clonagegie de clonage

Oligonucléotides dégénérés

Séquence polypeptidiqueN-terminale et interne

Amplification parPCR

Séquençage

Construction d'unebanque d'ADN

génomique

Criblage

Analyse desséquencesSéquençage

GGèènes codant des nes codant des dioxygdioxygéénasesnases dans dans le gle géénome de 6PY1nome de 6PY1

pdoB1 pdoA1

pdoF pdoA2 pdoB2 ORF1

pdoB3 pdoA3pdoD pdoC

Locus pdo1

Locus pdo2

Locus pdo3

SouthernSouthern blots avec sondes blots avec sondes pdoA1 pdoA1 et et pdoB1pdoB1

23 kb

9,4 kb

6,5 kb

4,3 kb

2,3 kb

PM 1 2 3 4 5 6

pdoA1

23 kb

9,4 kb

6,5 kb

4,3 kb

2,3 kb

PM 1 2 3 4 5 6

pdoB1

Similitudes des gSimilitudes des gèènes de nes de dioxygdioxygéénasesnases chez les mycobactchez les mycobactééries ries

Mycobacterium sp. 6PY1pdoB3 pdoA3pdoD pdoC

Mycobacterium sp. S65nidA nidC nidH ORF 1 nidX

pdoB pdoA pdoC pdoH CDS 1 pdoX

Mycobacterium sp. PYR-1nidB2 ORF 3 nidD nidB nidA nidC

Comparaison du locus Comparaison du locus pdo2 pdo2 avec les avec les ggèènes nes phdphd de de NocardioidesNocardioides spsp. KP7. KP7

6PY1

pdoF pdoA2 pdoB2 ORF1

phdE

phdF

orf131

phdA phdB

orf72

phdG

phdH

phdC phdD

KP7

Arbre phylogArbre phylogéénnéétique de soustique de sous--unitunitéés s αα de de dioxygdioxygéénasesnases

BiphényleMono-aromatiques

HAP

Alignement des sousAlignement des sous--unitunitéés s αα de de Pdo1, Pdo2 et Pdo3 avec Pdo1, Pdo2 et Pdo3 avec NdoBNdoB

Acides aminAcides aminéés ligands du centre s ligands du centre FerFer--Soufre et du fer ferreuxSoufre et du fer ferreux

Le centre [2Fe-2S] d’une sous-unité α serait connecté au centre catalytique de la sous-unité α adjacente par l’intermédiaire de Asp205

PlanPlan





Mesure de lMesure de l’’activitactivitéé dioxygdioxygéénasenasein vivoin vivo

Induction Dépôt phase aqueuse sur colonne C18USlavage

Culture en M9 + huilede silicone avec HAP

Incubation 6h

Culture en LB

020000400006000080000

100000120000140000

Temps-->

Abondance

Analyse par CPG-SMen mode SIM

ActivitActivitéé dioxygdioxygéénasenase de Pdo1de Pdo1

Construction

3,4 phénanthrène dihydrodiol9,10 phénanthrène dihydrodiol

pdoB1pdoA1PT7

phnA3phnA4PT7

pdoB1pdoA1Ptac

pdoB1pdoA1PT7

phdDphdCPT7

pdoB1pdoA1Ptac

ActivitéProtéines produites

Pdo1

Pdo1+ PhdC+ PhdD

Pdo1

Pdo1+ PhnA3+ PhnA4

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Phénanthrène 3,4-phénanthrène dihydrodiol + 9,10-phénanthrène dihydrodiol

3,4 phénanthrène dihydrodiol9,10 phénanthrène dihydrodiol

0 0,1 0,2 0,3dihydrodiols (ppm)

SSéélectivitlectivitéé de Pdo1de Pdo1

0,0% 5,1%

69,0%

100,0%

19,1%

0,4%0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

120,0%

Benzo-

a-pyrè

neFluo

ranthè

ne

Pyrène

Phéna

nthrèn

e

Anthrac

ène

Naphta

lène

5 cycles 4 cycles 3 cycles 2 cycles

Pdo1 oxyde préférentiellement des HAP à 3 ou 4 cycles

ActivitActivitéé dioxygdioxygéénasenase de Pdo2de Pdo2Construction Protéines produites Activité

0 2 4 6 8 10

dihydrodiols (ppm)

pdoB2pdoA2PT7 Pdo2

pdoB2pdoA2PT7

phdDphdCPT7

Pdo2+ PhdC+ PhdD

0 2 4 6 8 10

pdoB2pdoA2Ptac Pdo2

pdoB2pdoA2Ptac

phdDphdCPT7

Pdo2+ PhdC+ PhdD

ActivitActivitéés catalytiques de Pdo1 et Pdo2s catalytiques de Pdo1 et Pdo2

0

2

4

6

8

10

Pdo1 Pdo2D

ihyd

rodi

olfo

rmés

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Pdo1 Pdo2

Dih

ydro

diol

form

és

OHH

H

OH

OH

HO

H

H

Pdo1

H OH

H

OH

Pdo1

pyrène Pyrène-4,5-dihydrodiol

phénanthrène Phénanthrène-3,4-dihydrodiol

Phénanthrène-9,10-dihydrodiol

SSéélectivitlectivitéé de Pdo2de Pdo2

0,0% 0,1% 3,4%

100,0%

63,4%

82,1%

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

120,0%

Benzo

-a-py

rène

Fluoran

thène

Pyrène

Phéna

nthrèn

e

Anthrac

ène

Naphta

lène

5 cycles 4 cycles 3 cycles 2 cycles

Pdo2 oxyde préférentiellement des HAP à 2 ou 3 cycles

PlanPlan





Purification de Pdo1Purification de Pdo1

pdoA1 pdoB1Ptac rbs rbs

pPDO1

MM 1 2 3 4

α

β

1. Fraction soluble2. DEAE Cellulose3. Sulfate d’ammonium 1M4. Q-HyperD

Purification de HisPurification de His66--Pdo2Pdo2

pdoA2 pdoB2Ptac rbs

pVDO2(His)6

M 1 2 3 4

50 kDa

20 kDa

1. DEAE Cellulose2. TALON3. DEAE Cellulose4. Q-HyperD

Spectre dSpectre d’’absorption UVabsorption UV--visiblevisiblede Pdo2de Pdo2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

300 400 500 600 700

Protéine réduite

Protéine oxydée

longueur d'onde

Abs

orba

nce

Masse molMasse molééculaire de Pdo2culaire de Pdo2

4

4,5

5

5,5

1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2Ve/Vo

MM = 198 kDa

Pdo2 est un Pdo2 est un hhééttéérohexamrohexamèèrere de type de type αα33ββ33

PlanPlan





RRéégulation de la synthgulation de la synthèèse des se des dioxygdioxygéénasesnases Pdo1 et Pdo2Pdo1 et Pdo2

Cultures de Cultures de MycobacteriumMycobacterium spsp. 6PY1 sur ac. 6PY1 sur acéétate, benzoate, tate, benzoate, phphéénanthrnanthrèène ou pyrne ou pyrèèneneAnalyse par Analyse par immunoimmuno--ddéétection de Pdo1 et Pdo2tection de Pdo1 et Pdo2

AcétateBenzoate

Phénanthrène

PyrènePdo2

PdoA1

PdoA2

PlanPlan





Catabolisme du pyrCatabolisme du pyrèèneneIdentification des enzymes des premiIdentification des enzymes des premièères res éétapes tapes

de la dde la déégradationgradation

1

OH

OH

HH

OHOH COOH

COOH COOHOH

OH

H

CO2H

1

OHOH

H

H

OHOH O COOH

OH

O

COOHOH OH

CHO

OH

COOH

COOHCOOH

O

COOH

CHOCOOH

COOH

Pdo1

pdoA1B1

Pdo2

pdoA2B2

P23

phdE pdoF

P15

phdG

phdHP22

P18P13

phdIphdJ

? ? ? ?

?

?

?

SSéélectivitlectivitéé de Pdo1 et Pdo2de Pdo1 et Pdo2

Phén

anth

rène

Fluo

rant

hène

Pdo1

0,0%

20,0%

40,0%

60,0%

80,0%

100,0%

Pdo2

Naph

talè

neAn

thra

cène

Pyrè

ne

Benz

o-a-

pyrè

ne2 cycles

3 cycles4 cycles

5 cycles

SSéélectivitlectivitéé des des dioxygdioxygéénasesnasesRôle des rRôle des réésidus de la poche de liaison du substratsidus de la poche de liaison du substrat

ISPα

[2Fe-2S]

201 202 204 205 206 208 209 224 251 253 260 295 297 307 310 352 358

NdoB N F G D A H V F G L V H N L S F WPdoA1/A3 N F G D A H T - G L Y F N P M F FPdoA2 N F G D S H T - G L Y F N P F F F

158 aa

RRéégulationgulation

Etude de la transcription des gEtude de la transcription des gèènes codant les nes codant les dioxygdioxygéénasesnases::

NorthernNorthern blot, RTblot, RT--PCRPCRLocalisation des promoteursLocalisation des promoteurs

Construction de fusions Construction de fusions transcriptionnellestranscriptionnelles avec des avec des ggèènes rapporteursnes rapporteurs

Recherche de protRecherche de protééines de rines de réégulationgulationExpExpéériences de retards sur gelriences de retards sur gelIsolement de mutants de rIsolement de mutants de réégulationgulation

RemerciementsRemerciements

Membres du juryMembres du juryYves Yves JouanneauJouanneauEquipe Equipe «« HAPHAP »»Michel Michel SatreSatreStagiaires, doctorants et postStagiaires, doctorants et post--doctorantsdoctorantsLaboratoire BBSILaboratoire BBSI

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