Plan
• Les pectines: définition et structure• Méthodes d'étude des pectines• Les pectines en tant qu'additifs• Les enzymes pectolytiques• Les pectines in situ: • Quelques exemples de nos travaux
– Modification des homogalacturonanes– Quelques mots sur les polyphénols– Extraction de polyphénols de marc de pomme– Extraction de jus par microondes
- Association spontanée et rapide polyphénols-paroi cellulaire
- Affinité entre les tannins et les pectines- Influences de DP (tannins) et de DM (pectines)- Modification de l’extractibilité des polysaccharides
- Possibilité de mesurer l’interaction par la Calorimétrie Isothermale de Titration
Interaction
Préparation d’homogalacturonanessubstitués
• Pour étudier leurs interactions avec les polyphénols
• Homogalacturonanes par hydrolyse acide
• Substitution par halogénures d’alkyles
• Test: calorimétrie isothermale de titration
Expériences et Résultats
1002,4221HG-TBA
71,34,6656,5HG
97,93,6994,9Pectates
/3,58/Pectines
Rendement en Gal-A (%)
Teneur en Gal-A (mmol/g)
Rendement pondéral
(%)
Pectines:Pectines:Pectines commerciales de pommesPectines commerciales de pommes
PectatesPectates
SaponificationSaponification
HomogalacturonanesHomogalacturonanes
Hydrolyse acideHydrolyse acide
HGHG--TBATBA
NeutralisationNeutralisation
HG HG modifimodifiééss
AlkylationAlkylation
Methylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1 10
Ratio molaire MeI/Gal-A
Deg
réde
mét
hyla
tion
(%)
Ethylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1
Ratio molaire EtBr/Gal-A
Deg
réd'
éthy
latio
n(%
)10
Buthylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1
Ratio molaire BuBr/Gal-A
10
Deg
réde
pro
pyla
tion
(%)
Deg
réde
but
hyla
tion
(%)
Propylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1
Ratio molaire ProBr/Gal-A10
Methylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1 10
Ratio molaire MeI/Gal-A
Deg
réde
mét
hyla
tion
(%)
Ethylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1
Ratio molaire EtBr/Gal-A
Deg
réd'
éthy
latio
n(%
)10
Buthylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1
Ratio molaire BuBr/Gal-A
10
Deg
réde
pro
pyla
tion
(%)
Deg
réde
but
hyla
tion
(%)
Propylation
0
20
40
60
80
100
0 0,25 0,5 0,75 1
Ratio molaire ProBr/Gal-A10
--
Efficacité de la substitution
• Influence de l’halogénure,
• Encombrement de la chaîne d’alkyle,
• Relation linéaire jusqu’au ratio 1 (alkylant/Gal-A),
• Insolubilité des molécules hautement substituées.
10,82,02//7,6686,3800,236PPH purifiés
10,90,160,141,970,8569,8222,899PPH Extraits acétonique
5,60,240,080,770,536,3/146,48Pomme
DHCAc. PCGAc. chlorECAT PCADP
Concentration (mg/g de matière sèche)RendtPCA (%)Quantité (g)
Poudre de pommes Poudre de pommes lyophilislyophilisééeses
PolyphPolyphéénols extraitsnols extraits
PolyphPolyphéénols purifinols purifiééss
Extraction Extraction
PurificationPurification
Analyse par HPLCAnalyse par HPLC
HexaneMéthanolEau-Acétone
SPE C18
Préparation des polyphénols
Mesure de l’interaction par ITC
microcalorimètre isothermale de titration
ITC; Résultat obtenu en 2008, Procyanidines DP 35, 3mM,Pectine DM 70, 1,5 mM
Pourquoi les polyphénols?
• Caractères organoleptiques– amertume et astringence– couleur : natifs, oxydés– relations structure/propriétés des polyphénols– rôle de la matrice
• Propriétés nutritionnelles• Evolution des polyphénols au cours des procédés
– transferts depuis le fruit– modifications des structures
• oxydations , condensations• enzymatiques, chimiques: échelles de temps
De la matière première au produit
Matière première
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
Pressage
Cidre
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO O
OH
OH
Clarifications
Fermentation
Broyage
Raffinage
Cuisson
Une démarche commune
• Observation– Une observation qui ne « cadre pas » avec la théorie
générale– Une question finalisée qui conduit à des interrogations
fondamentales• Modélisation
– Elle permet d'analyser des phénomènes réels et de prévoirdes résultats à partir de l'application d'une ou plusieurs théories à un niveau d'approximation donné.
– Modélisation « ad hoc »: boite noire (statistique), basée sur des modèles descriptifs ou théoriques
• Validation– Répéter l’observation initiale en faisant varier les leviers
identifiés par le modèle– Le modèle permet-il de prévoir l’effet des modifications du
procédé?
0 10 20 30 40 50
Temps de rétention (min)
Abs
orba
nce
280
nm
(-)-épicatéchine
benzylthioéther de (-)-épicatéchine
toluène-thiol
0 10 20 30 40Temps de rétention (min)
Abs
orba
nce
(280
nm
)
Procyanidols
Thiolyse(dépolymérisation)
1. Identification des unités constitutives
2. Détermination du degrémoyen de polymérisation
3. Quantification et estimation de la pureté
OHOH
HO O
OHOH
OHOH
HO O
OHOH
OHOH
HO O
OHOH
OHOH
HO O
OHOH
OH
OH
OH
OHO
HO 8
4
64
OHOH
HO O
OHOH
OHOH
HO O
OHOH
OHOH
HO O
OHOH
OHOH
HO O
OHOH
OH
OH
OH
OHO
HO 8
4
64
Pour la caractérisation de procyanidines
La réaction de thiolyse
Flavanyl-C4-carbocation
H+
O
OHOH
HO
OHOH
O
OHOH
HO
OHOH
SCH2
O
OHOH
HO
OHOH
O
OHOH
HO
OHOH
OHOH
HO
OHOH
O
SH
CH2
2extension
units
terminalunit terminal unit
(flavanol)
+
2
2O
OHOH
HO
OHOH
+
Benzylthioetheradduct
Procyanidin
(Adapted from Thompson et al., 1972)
Quantification par HPLC
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0 10 20 30 40 50Retention time (min)
Abs
orba
nce
(280
nm
)
1
7
6
5
4
3
2 A
X
X
X
X X X X
X
Beforethiolysis
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0 10 20 30 40 50Retention time (min)
Abs
orba
nce
(280
nm
)
1
2' 97
6
5'
4
2
10
Afterthiolysis
8
B
• Avant– Procyanidols– Acides hydroxycinnamiques
• Après– Flavanols et dérivés
benzylthioethers– Dérivés méthylés
Pourquoi le marc de pomme
• Un co-produit abondant et mal valorisé– France: 200 KT pommes à cidre– Marc: environ 5%– Utilisation: extraction des pectines, alimentation des
animaux
Conséquences de la cavitation
Implosion des bulles: micro-réacteuravec des conditions de T° et P extrèmes
Peut-on utiliser la cavitation en extractions?
• Extraction – à partir de marc de pomme industriel– par des solvants compatibles alimentaire
• Dosage – Polyphénols totaux (Folin)– Polyphénols spécifiques (HPLC après thiolyse)
1. Sans ultrasons2. Avec ultrasons
Maximum50% EtOH/H2O (v/v)
TPC (ECatechin g/L) = f (% EtOH)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
0% 20% 40% 60% 80% 100%EtOH
TPC Eq.catechin
(g/L)
Essais préliminaires- 1
• Solvant (ratio Ethanol / H2O)– 10g marc/ 100mL solvant
Rapport liquide / solideConcentration
Volume récupérée
Quantité effective d’extrait
X
Solids and Liquids volumes recovered after filtration step function of solid/liqui ratio
y = 617,22xR2 = 0,9989
y = 396,83x2 - 325,24x + 99,698R2 = 0,988
0,00
20,0040,0060,00
80,00100,00120,00
140,00160,00180,00
200,00
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%
Ratio S/L
Volu
me
(mL)
LiquidSolid
TPC Ecatechin (g/L) = f (ratio S/L)y = -8,1354x2 + 8,1092x
R2 = 0,9984
00,20,40,60,8
11,21,41,61,8
2
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%Ratio S/L
TPC Eq.catechin (g/L)
Quantity of extract recoveredR2 = 0,9986
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35%ratio S/L
Eq. Catechin (g)
=
Rapport choisi15% (w/v)
Extraction assistée par ultrasons
• Conditions fixées– EtOH/H2O (50/50, v/v)– Ratio S/L (w/v): 15%– Ultrasonic bath: PEX 3
• (REUS, Contes, France)
• Plan d’expérience– Puissanced des US (W/g)– Température (°C)– Durée d’extraction
Plan d’expérience
Box-Wilson (composite centré)
• 6 expériences au centre
• 8 expériences aux « coins »
• 6 expériences en étoile
20 expériences au total
00 + 1+ 1-- 11
-- 11
+ 1+ 1
00
00
-- 11
+ 1+ 1
Valeurs utilisées et résultat PPT
- α- 1
0+ 1+ α
Niveau
9,916,025,034,040,1
Temp.(°C)
515304555
Durée (min)
0,0580,0750,1000,1250,142
Puissance US
(W/g)
Variables et leurs niveaux
0,87100020
0,84800019
0,83200018
0,83800017
0,86900016
0,80100015
0,9701,681790014
0,658-1,681790013
1,17501,68179012
0,6330-1,68179011
0,985001,6817910
0,84300-1,681799
1,1041118
1,05611-17
0,7691-116
0,7831-1-15
0,865-1114
0,897-11-13
0,673-1-112
0,626-1-1-11
Eq.Catechin[g/L]
Duréemin
Temp.°C
PuissanceW/g
No.
Exploitation des résultats
• Modèle statistique – Modèle linéaire généralisé– Equation prennant en compte des effets linéaires,
quadratiques et interactions
• Equation– TPC = 0.844 + 0.021 P + 0.145 T + 0.086 t + 0.018 P2 +
0.015 T2 – 0.017 t2- 0.002 P.T + 0.002 P.t + 0.018 T.tAvec, P: Puissance US
T: Températuret: durée d’extraction
– Calcul des conditions optimales45 min40.1°C0.142 W/g
DuréeTemp.Puissance US
Pour une concentration en PPT maximale
Exploitation graphique
• Graphique de Pareto– Choix des variables
• Calcul des surfaces de réponse
p = 0.05
Polyphénols spécifiques
• Mêmes extractions– Dosage des polyphénols dans les extraits par LC-DAD après
thiolyse– Quantification aux différentes longueurs d’onde
• Flavanols: 280 nm (fluo)• Dihydrochalcones: 280 nm• Acides hydroxycinnamiques: 320 nm• Flavonols : 350 nm
– Calcul des équations et surfaces de réponse
0,1620,0273,9700,1960,22500020
0,1500,0233,9730,1950,22300019
0,1600,0253,7060,2020,23200018
0,1620,0253,7270,1990,22700017
0,1590,0263,8750,1990,22800016
0,1510,0233,9430,1930,22000015
0,1800,0294,2260,2530,2831,681790014
0,1340,0193,5560,1320,154-1,681790013
0,1760,0274,3220,2810,31801,68179012
0,1520,0222,9260,1380,1620-1,68179011
0,1620,0243,8190,1940,224001,6817910
0,1530,0243,9600,1940,22000-1,681799
0,1750,0314,0090,2970,3281118
0,1540,0304,2670,2740,30311-17
0,1440,0233,9340,1710,1961-116
0,1450,0233,8980,1720,2001-1-15
0,1480,0214,6180,1650,195-1114
0,1530,0233,7700,2120,239-11-13
0,1380,0193,4020,1260,149-1-112
0,1440,0212,8660,1430,169-1-1-11
PhloridzinPhloretin
Xyloglucoside
DP° PCAPolymericFlavan-3-ols
MonomericFlavan-3-ols
Extraction timeTemp.US
PowerNo.
DihydrochalconesFlavan-3-ols
280 nmVariables-
0,1010,0090,04800020
0,0960,0070,04300019
0,1010,0080,05100018
0,0980,0080,05000017
0,0990,0080,04400016
0,0960,0070,04200015
0,1080,0090,0611,681790014
0,0780,0070,039-1,681790013
0,1110,0090,05801,68179012
0,0780,0100,0370-1,68179011
0,0900,0070,055001,6817910
0,0710,0080,04600-1,681799
0,1150,0080,0541118
0,1100,0080,04711-17
0,0880,0070,0391-116
0,0880,0060,0371-1-15
0,1040,0070,049-1114
0,0940,0080,048-11-13
0,0780,0070,040-1-112
0,0750,0120,049-1-1-11
Flavo-nolsp-coumaroyl-quinic Acid
ChlorogenicAcid
Extraction timeTemp.US PowerNo.
350 nm325 nmVariables-
Variables d’influence
0.75070.11
0.52830.43
0.35020.96
0.47710.55
0.78990.07
0.001021.28
0.000139.42
0.000087.30
0.01089.75
p-valueF-ratioFlavonols
350 nm
0.04825.06
0.04825.06
0.35770.93
0.88180.02
0.12442.81
0.46340.58
0.69580.16
0.52440.44
0.13132.70
p-valueF-ratio
p-Coumaroyl-quinic acid
0.34161.00
0.34161.00
0.39900.78
0.79520.07
0.77710.08
0.71330.14
0.23671.58
0.01189.43
0.48490.53
p-valueF-ratioChlorogenic acid
325 nm
0.01239.29
0.19591.92
0.78730.08
0.32531.07
0.62220.26
0.32531.07
0.000071.34
0.000233.80
0.53880.40
p-valueF-ratio
PhloretinXyloglucoside
0.42190.70
0.24461.53
0.38060.84
0.38450.83
0.88350.02
0.42390.70
0.006411.76
0.01269.20
0.47820.54
p-valueF-ratioPhloridzin
0.005012.85
0.006411.80
0.97000.00
0.67080.19
0.11422.99
0.67940.18
0.001817.83
0.000064.67
0.16092.29
p-valueF-ratioDP° Procyanidins
0.00020.2393
0.002516.07
0.78540.08
0.23931.57
0.10943.09
0.34750.97
0.0000283.02
0.0000423.10
0.16492.25
p-valueF-ratio
Polymeric Flavan-3-ols
0.000624.61
0.005312.56
0.83910.04
0.14352.52
0.09953.30
0.32571.07
0.0000246.42
0.0000383.05
0.27401.34
p-valueF-ratio
MonomericFlavan-3-ols
280 nm
0.69070.17
0.69720.16
0.79230.07
0.39670.78
0.43350.67
0.63780.24
1.19691.91
0.05814.58
0.10943.09
p-valueF-ratioYield
0.23581.59
0.87200.03
0.88540.02
0.13872.59
0.20291.86
0.12132.87
0.000061.27
0.0000174.20
0.08433.67
p-valueF-ratioTPC
X2X3X1X3X1X2X3²X2²X1²X3X2X1
Interaction effectsQuadratic effectsMain effectsVariables
Exemple des flavonols
• Graphique de Pareto
• Equation et conditions optimales:Flavonols = 0.098 + 0.004 P + 0.011 T + 0.007 t – 0.005 P2
+ 0.002 P.T – 0.001 P.t – 0.001 T2 + 0.001 T.t – 0.001 t2
55 min37.8°C0.117 W/g
DuréeTemperatureUS Power
Comparaison avec / sans US
• Dans les conditions optimalesComparison of extraction methods
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00time (min)
TPC Eq.Catechin
(g/L)
> 20%
Mécanisme
• Déstruction des structures – cavitation sur les surfaces exposées
• Exemple (carvi)
Initial seedConventionnal Extraction 300 min. 69°C – Yield 1,6%
Sono-extraction 30 min. 20°C - Yield = 1,7%
Fruits frais et non transforméplacés dans le micro-onde
Chauffage par micro onde de l’eau intrinsèque des fruits
Génération d’un phénomène d’hydrodiffusion de l’intérieur
l’extérieur du fruitLe jus atteint l’extérieur du
fruit et tombe par gravitéRécupération directe du jus
sans étape supplémentaire
Reflex
« Easy Wave »
Computer
Graduatedcylinder
PTFE grid
Microwaveoven
Fruits
TemperatureSensor
Chronograph
Column
Fruit juice
Ovenopening
Oven opening
Principe
Est-ce que ça se boit?
Je n’aime pas J’aime
0 9
Test par les membres du laboratoire (7 femmes, 6 hommes, 21-55 ans)
Raisin5.5
Prune 5.4
Abricot 3.3
Augmentation de la puissance appliquée: Extraction plus rapide mais rendement plus faible.Le facteur limitant est la surchauffe des fruits
1.5 W.g-1
1 W.g-1
0.5 W.g-1
0
200
400
600
0 5 10 15 20Time (min)
Yie
ld(m
l.kg-
1)Impact de la puissance appliquée
Une formule adaptée: y=a/(1+(x/x0)^b) décrit bien la forme de l’extractionLes coefficients:
b=trouvé à environ –2, forme généralea= plateau: volume maximal extraitx0=point d’inflexion: point où la vitesse maximale est atteinte
0
100
200
300
0 200 400 600 8000
5
10
15
20 Coef x0 manip2Coef a manip1Coef a manip2
Coef x0 manip1
Le modèle permet de mieux quantifier les impact des modifications de la puissance appliquée sur l’extraction.On devrait extraire plus et plus vite, or on extrait moins: surchauffe.
puissance
Coef a Coef xo
Modélisation de l’extraction
Observation du phénomène
• Extraction à partir de fruits frais
Time (min)
160
0
40
80
120
0 10 20 30
Volume (ml) & Temperature (°C)
0
4
8
12
16Vitesse maximale
Hydrodiffusion
Vitesse (ml/min)
12 34
• Extraction à partir de fruits congelés
-50
0
50
100
150
200
10 20 300
4
8
12
16
-50
Temps (minutes)
0
50
200
10 20 300
4
8
12
16
Formation de points chaudsFonte de la glace
Hydrodiffusion
Volume (ml) & Temperature (°C) Vitesse (ml/min)
12
3
Que se passe-t’il avec des fruits initialement congelés?
Composition des produits
4
0
1
2
3
Prune Abricot Raisin
4
0
1
2
3
Prune Abricot Raisin 0
10
20
30
40
Prune Abricot Raisin0
10
20
30
40
Prune Abricot Raisin
Polyphénols (g/L) Anthocyanes (mg/L)
0
40
80
120
160
200
Prune Abricot Raisin
Sucres (g/L)
0
40
80
120
160
200
Prune Abricot Raisin
Sucres (g/L)
0
4
8
12
16
Prune Abricot Raisin
Acides (g/L)
0
4
8
12
16
Prune Abricot Raisin
Acides (g/L)
Des comportements différents des polyphénolsselon leur répartition dans le fruit
Polyphénols de la chair (flavanols, acides hydroxycinnamiques)
Polyphénols de l’épiderme (anthocyanes et flavonols)
0
0,5
1
1,5
2
0 50 100 150 200 250Juice fraction (ml)
0
0,5
1
1,5
2
0 50 100 150 200 250Juice fraction (ml)
Rat
io o
f con
cent
ratio
n
0
0,5
1
1,5
2
0 50 100 150 200 250
Rat
io o
f con
cent
ratio
n
Juice fraction
Extraction microonde
• Mécanismes d’extraction– Frais: chauffage du centre vers l’extérieur, moteur de
l’hydrodiffusion– Congelé:
• déstructuration liée à la formation de cristaux de glace• Fonte (points chauds puis conduction thermique)• Hydrodiffusion après décongélation
• Des questions en suspens:– Volume de vapeur produites (en fonction de la puissance
appliquée)– Optimisation des rendements: éviter la surchauffe?– Oxydation enzymatique: oui, non, quelles conditions?
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