Bi 231: Ingénierie des Protéines

cours 5

Plan Général

• I. Introduction et rappels.• II. Purification des protéines.• III. Surexpression d'une protéine.• IV. Mutagenèse: techniques et applications. • V. L'insuline : exemple d'une stratégie.• VI. Analyse d'articles.

V. L'insuline : exemple d'une stratégie.

• 51 –Introduction

• 52 –Historique : de Banting à Sanger

• 53 –Les stratégies utilisées.

51 –Introduction : Rôles, fonctionnement, structure et enjeux

médicaux.

Insuline : • hormone sécrétée par le pancréas. • sécrétée dans le sang après

ingestion de sucres.• provoque absorption du sucre par

les cellules (médiée par des récepteurs spé).

Régulation de la glycémie chez les

mammifères :

Rôle + du glucagon relargage par le foie

Rôle – de l'insuline Absorption cellulaire du glucose notamment

par adipocytes

Diabète :déficience en insuline

• sans insuline problèmes majeurs d'assimilation du glucose au niveau cellulaire.

• Diabète de type I : déficit de production de l'insuline.

• Diabète de type II : problème de transduction du signal sur cellules réceptrices.

Diabète de type I

• Due à réaction auto-immune :

Ac ilôts de Langerhans

hyperglycémie

coma

mort

• 10% des diabétiques• Apparition favorisée

par infection par certains virus (EBV,...), traitement médicaux,

chirurgicaux.

Traitement : injection régulière d'insuline.

Diabète de type II• Due à mauvaise

alimentation + terrain génétique.

hyperglycémie chronique

problèmes cardiaques,

visuels,rénaux, neurologiques, ...

• 90% des diabétiques.•Chez sujets adultes,

agés• Apparition

multifactorielle :génétique, alimentaire,

autoimmune (Ac insuline-recepteur),...

Traitement : régime alimentaire, hygiène de vie +traitement médicamenteux.

Les différents types d'insuline disponibles : Analogues d'insuline :

action rapide action prolongée Biphasique

Onset: 10-20 minutesMaximum effect: 1-3 hoursDuration: 3-5 hours

Onset: 1 hourDuration: 24 hours

Onset: 10-20 minutesMaximum effect: 1-4 hoursDuration: up to 24 hours

Insuline humaine:action rapide action intermédiaire prémixée

Onset: within 30 minutesMaximum effect: 1-3 hoursDuration: 8 hours indication : 30 min after meal

Onset: within 1.5 hoursMaximum effect: 4-12 hoursDuration: 24 hours

Onset: within 30 minutesMaximum effect: 2-8 hoursDuration: 24 hours composition : 30% rapid, 70% isophane

http://www.novonordisk.com/diabetes/public/diabetestools/insulins/default.asphttp://www.novonordisk.com/diabetes/public/diabetestools/handsoninsulin/default.asp

Structure de l'insuline

• Formée de 2 chaînes, A et B

• synthétisée sous forme de proinsuline

Séquence de l'insuline Préproinsuline humaine

peptide B :31 aa peptide A : 20 aapeptide signal peptide C

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT D fSL

RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRHL

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN L

accumulation de proinsuline (FS diabète de type II)

Comparaison avec autres insulines animales

V. L'insuline : exemple d'une stratégie.

• 51 –Introduction sur Insuline : Rôles, fonctionnement, structure, enjeux médicaux.

• 52 –Historique : de Banting à Sanger

• 53 –Les stratégies utilisées.

52 –Historique : de Banting à Sanger.

• 1889 : Ablation du pancréas induit un diabète chez le chien.

• 1908 : Restauration de la glycémie par injection d'extrait de pancréas chez chien sans pancréas.

• 1921 : Extraction d'une hormone antidiabétique simultanément par 2 équipes : Bucarest (Paulesco)

Toronto (Banting & Macleod).• 1922 : premiers patients traités et sauvés à Toronto• 1923 : Banting & Macleod : prix Nobel de médecine• 1925-1970 : amélioration de la pureté et des formulations

(1ère insuline retard par ajout de Zn, protamine)

52 –Historique : de Banting à Sanger.

• 1926 :cristallisation de l'insuline• 1958 : détermination de la structure chimique de

l'insuline (1ère protéine séquencée): prix Nobel de chimie pour Sanger.

• 1967 : Séquence de la proinsuline.• 1969 : Structure 3D de l'insuline.• 197n : "humanisation" de l'insuline porcine.• 1982 : production d'insuline recombinante.• 1983 Amélioration du procédé

V. L'insuline : exemple d'une stratégie.

• 51 –Introduction sur Insuline : Rôles, fonctionnement, structure, enjeux médicaux.

• 52 –Historique : de Banting à Sanger

• 53 –Les stratégies utilisées.

53 –Les stratégies de purifications utilisées.

• A partir de pancréas : extraction acide dans éthanol et précipitation / sels.

• Conversion d'insuline porcine.

• Surproduction d'insuline.

• Surproduction de proinsuline.

A partir de pancréas

• Le pancréas est découpé en morceaux,• Suspendu dans ethanol à pH 2 (inactivation de

la trypsine),

• neutralisation / CaCO3,

• précipitation par sels (KCl, NaCl, SO4(NH4)2, ...),

• resuspension dans eau et précipitation par acidification

• + chromatographie : Gel filtration et/ou échangeuse d'ions

Conversion d'insuline porcine.

= remplacement AlaThr

• purification insuline (cf précédent),• conversion : insuline (porc) + Trypsine +

thréonine ester dans eau+solvant organique (diminue activité peptidase de trypsine et favorise la réaction inverse),

rendement <97 %• Purification par chromatographie(s)

Surproduction d'insuline.

• Production séparée des chaînes A et B chez E. coli. Les peptides étaient co-exprimés avec autre protéine (-gal, TrpE, ...).

• séparation /protéolyse

• 2A +1B sulfoné (cys-SO2) + mercaptoethanol, 24H

60 % rendemment.• purification / chromatographie

phase inverse

Surproduction de proinsuline.sur expression chez E. coli (1982)• insertion du cDNA de la préproinsuline dans une

vecteur bactérien.• surproduction avec protéine de fusion (idem).• coupure / protéase proinsuline• oxydation des cystéines• repliement de la protéine en présence de

réducteurs.• coupure par protéase spécifique• purification par chromatographie

Surproduction de proinsuline.

sur expression chez S. cerevisiae (1988)• insertion du cDNA de la préproinsuline dans une

vecteur de levure.• surproduction avec protéine de fusion (idem).• coupure / protéase proinsuline insuline• purification par chromatographies