단백질의 정제 (Protein Purification)

여러 단백질 중 특정 단백질을 분리하여 순도를 높이는 과정 구조적 연구,단백질 기능규명 , 단백질간 상호작용 규명, 항체 조제등에 사용.

Chap 5 : 구 Interchapter A

a) 정제 준비 : 대상, 용도, 필요량, 순도, 안정화 방법, assay 방법 등 설정

- 단백질 안정화:

glycerol 5~20%, 환원제 (DTT, b-ME, TCEP),

protease inhibitor(also EDTA)

detergents (계면활성제 ),

낮은 온도 (4oC)

b) 단백질 순도 측정 : - SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-poly

acrylamide gel electrophoresis)

(SDS : CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-Na+)

AA(CH2=CH-CO-NH2) + (APS, TEMED: 촉매)

---> polyacrylamide

- mass-spec.

- HPLC....

단백질의 정제 (Protein Purification)

단백질의 정제 (Protein Purification)

크기에 의한 분리

a) dialysis (반투막) : 막 구경, 삼투압

b) micro-filteration : 막 구경 (Mw cut-off)

c) gel-filteraton : 다공성 bead (큰 분자 먼저 용출)

순도 및 크기확인( electrophoresis (전기영동) :

PAGE - SDS-PAGE (+SDS, 변성)

- native-PAGE (-SDS, 자연)

- 2D-gel (isoelectric points->molecular weight) --> mass spec.

- Isoelectrofocusing ( pI값)

cf) staining : commassie vs silver staining

cf) blotting : Western (Protein), Southern(DNA), Northern(RNA) 확인

SDS-PAGE

staining

단백질 분리 : low pressure chromatography 방법

– Size exclusion

(Gel filtration);

– Affinity

chromatography;

– Ion exchange

chromatography;

– Hydrophobic

Interaction

chromatography;

Purification schemes

LC columns

Sizing Column :GPC ( Gel-permeation Chromatography)

(다공성의 beads :크기에 의한 분리;큰 것 먼저 용출)

- molecular shieve, adsorption : cross-linked dextran (연한 망상구조-Poly AA)

Charged Columns : IC ( Ion-exchange Chromatography) :

- Anionic exchange column ( 자체 (+), (-)하전-capture)

DEAE (Diethyl amino ethyl cellullose ) ; (-CH2)2-N+-(CH2CH3)2

- Cationic exchange column ( 자체 (-), (+)하전-capture)

phosphocellulose(PC) ; -O-PO3- ;

CMC ( carboxymethyl cellulose) ; CH3-COO-

Affinity Columns : (Affinity Chromatography)

(특정 결합의 특이성을 이용하여 분리)

(예) (PFK)-ATP 칼럼, (hexokinase-glucose 칼럼), His-tag column, GST-column

Hydrophobic column :소수성 interaction 이용하여 단백질 잡아냄.

⇒ alkyl sepharose 소수성: C-8〈< C-10 <〈 C-12 < C-18 columns

phenyl sepharose columns

Gel Permeation Chromatography (GPC) : 분자량에 의한 분리

분자량이 서로 다른 구형 단백질의 분리에 사용된다.

구형 단백질의 경우 분자의 크기는 분자량(Mw)에 비례한다.

GPC (혹은 GFC)의 경우 칼럼 내에 다공성인 bead를 통과하는 단백질의 이동 특성에 따라 분리한다.

분자량이 작은 경우는 bead의 모든 구멍(pore)를 통과해 나오므로 천천히 칼럼을 통과하게 되고,

분자량이 큰 경우는 bead pore를 통과하지 못하므로 (크기 때문에), 더 빨리 용출된다

Ion Exchange chromatography (IC):

단백질 하전(Surface Charge )에 의한 분리

단백질은 특정 pH에서 각 아미노산들의 하전에

의해서 음 혹은 양의 총 하전을 띄게 된다

(단 pI 에서는 중성). IC는 특정 pH에서 하전을

갖는 단백질의 특성을 이용하여 정제한다.

음이온 교환칼럼(anionic exchange column):

자신은 양하전(+), 결합하는 단백질은 음하전(-)을 띈다.

예) DEAE Cellulose column : O (CH2)2-NH+-(CH2CH3)2

양이온 교환 칼럼 (cationic exchange column)

자신은 음하전((-), 결합하는 단백질은 양하전(+)을 띈다.

예) CM Cellulose column : O-CH2-COO- phospho cellulose(PC) ;-OPO3-

Ion chromatography : resin

Affinity chromatography : 단백질의 Biological Activity나 기능에 의한 분리

단백질-기질 결합의 특이성 이용 (kd ~ 10-12); 예) hexokinase-glucose 결합

glucose (small dark blue molecule) hexokinase (large enzyme).

1) affinity column 제조 : support + spacer + substrate(inhibitor)

2) Specific Binding to column resign, 불순물은 buffer로 닦아냄

3) 결합된 효소나 단백질의 용출 (기질 사용)

4) 결합된 기질은 투석(dialysis)나 gel-filteration으로 제거. 순수한 단백질 분리

Affinity chromatography : his-tag purification

Ni2+

CaM cloning with his-tag

Columns made from matrices having mildly hydrophobic surfaces bind proteins

at high ionic strength by interacting with hydrophobic patches on the protein surface.

Generally such columns are loaded in very high salt (e.g. 2M (NH4)2SO4),

and after loading a reverse salt gradient is run (down to buffer without added salt).

In lower ionic strength buffers, the hydrophobic forces holding the protein to

the matrix weaken, and the protein elutes at some point in the gradient.

Hydrophobic interaction chromatography (HIC):

•Hydrophobic group bound to solid phase

•Binding

–high salt (increases water surface tension, decreases available water molecules, increases hydrophobic interactions)

•Elution

–decrease salt

–add detergent

–decrease polarity

of mobile phase

UV a

bso

rbance

V0 Vi Vt

Larger Protein

Smaller Protein

UV a

bso

rbance

Free ligand concentration U

V a

bso

rbance

Increasing salt concentration

decreasing salt concentration

UV a

bso

rbance

Hydrophobic Column Ion exchange Column

Affinity Column GPC Column

칼럼별 분리방법

정제: 세포에서 단백질의 분리 과정

- homogenization : 세포 파괴

* grinding, sonication, freezing/thawing (lysozyme)

-differential centrifugation

-Salting out (ammonium sulfate precipitation, (NH4)2SO4)

differential centrifugation

정제: 단백질의 선택적 침전

- (NH4)2SO4 Fractionation : 단백질의 선택적 침전 (물과 이온-dipole 결합), 저온에서 잘녹음

a) salting in : 적정선 까지 첨가시 (solublization)

b) salting out : 적정선 초과시 ↓( salt out , 침전)

(NH4)2SO4 의 첨가의 경우:

protein-solvent(water)의 안정성이 지속되다가 salt 첨가 후

salt-solvent 상호작용 (이온-dipole)으로 단백질의 물제거로 안정화 저해

- 단백질 : PI 부분에서 불안정, 반경축소, charge balance 상실->침전

salt/pH에 의한 단백질 용해도 변화. b) salt에 의한 단백질 용해도 변화 (salting in/out).

순도분석 : Electrophoresis (전기영동)

SDS-PAGE를 이용한 순도 확인 과정 (주로 단백질에 사용)

((SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,

SDS : CH3(CH2)10CH2OSO3-Na+)

Agarose gel electrophoresis

(주로 DNA)

SDS-PAGE 전기영동 순서

- apply protein to gel

well에 넣기 전에 단백질은 변성 시킴 (+DTT, +SDS, + heat)

AA gel에도 (+SDS, + DTT)

- apply voltage : 100 ~ 200 v (약 1 ~ 2 시간) : 분자량에 의한 분리

- staining with dye

-표준 단백질의 분자량과 비교하여 미지 단백질의 순도/분자량 결정.

단백질 전기영동 : 단백질 순도분석/분자량 유추

Decr

easi

ng m

ole

cula

r w

eig

ht

+

- - - - - - - - -

+ + + + + + + +

NATIVE PAGE : 단백질의 Native한 상태의 Mw 및 순도 결정

- SDS; -DTT; -열변성

SDS-PAGE와는 대조적으로 SDS, DTT와 열변성 과정 등이 생략되어서

단백질의 자연상태의 분자량 측정에 이용된다. 단백질 자체가 +하전을 갖는 경우는

이동하지 않아 사용할 수 없다.

Native 분자량의 결정 : GPC gel permeation chromatography (GPC);

native-PAGE , analytical ultracentrifuge

GPC에 의한 native Mw 결정 : subunit 결정에 도움.

분자량을 아는 표준물질 (단백질)과 미지 시료를 GPC에 건 후

Mw와 retention time (용출 부피)의 상관 그래프에서 미지 시료의 분자량을 결정한다.

단점 : 대략적인 분자량 값만 결정된다.

분자량은 분자의 형태에 의존된다.

(asymmetric/symmetric)'

정확한 분자량은 analytical ultracentrifuge

등에 의해 결정될 수 있다.

-equilibrium sedimentation

- velocity sedimentation

-mass-spec (MALDI-TOF)

단백질 정제의 예 : - UMP synthase :

- specific acivity = total activity units /

total protein (예, 40.4/11,700 = 0.0034)

- unit : total amount of enzyme activity

- % recovery = 단계별 total activcity units × 100 (%)

----------------------------------

초기 activity total unit

단백질 정제의 다른 예

Specific activity : total activity /total protein Percent recovery : (activity/initial activity) * 100%

단백질의 1차 구조 (순서) 결정

단백질 성분 결정 단백질 순서결정

- 고 순도의 단백질 준비

(순수할수록 좋음, 적어도 >95%, )

- Amino Acid Composition 결정

(6 M HCl, 100~110oC 36 hrs –

acid hydrolysis->HPLC) polypeptide(protein)

--> AAs(펩타이드 결합 절단)

단백질의 성분 (amino acid composition) 결정

polypeptide가 각각의 amino acid로 잘라져서 나옴

*주의 사항 : 3개 아미노산

Asn(N) ---> Asp (D) : N과 D는 N+D D로 나옴

Gln(Q) ---> Glu (E) : Q와 E는 Q+E E로 나옴

Trp (W) --> destroyed : spectroscopically 결정 (Trp, 흡광상수)

Dansyl에 의한 N-말단 유도화 반응 : N-말단확인

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 : N-말단 결정

N- and C-terminal 결정

- N-terminal 결정

: N-말단의 유도체화

-fluorodinitrobenzene

- dansyl chloride

- C-terminal 결정 )

- carboxypeptidase 효소 처리

(C-말단에서 부터 순차적 절단

: 시간조절 중요)

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 : C-말단 결정

-digestion (protease or chemicals) :

작은 펩타이드로 나눔

(짧은 펩타이드가 Edman

degradation 반응에서 신뢰도가

높으므로!)

효소사용 절단: 특정한 아미노산

순서 인식 및 절단

-효소 절단부위

pepsin F ,W or Y 전

trypsin K or R 후

chymotrypsin F, Y or W 후

papain K or L, R &G 후

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 : 효소에 의한 절단

- BNPS-skatole ; C-terminal W

- NH2OH ; N-G bond (아스파라긴-글라이신 결합 절단) -분리 : separation (HPLC or TLC...)

-절편 된 각 펩타이드들의 순서 결정

- 전체 순서 결정 (disulfide bond 위치 포함) :

overlapping되는 펩타이드간의 상관 관계에 의해 분석

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 : 화합물에 의한 절단

chemical 사용 절단

- BrCN : M 다음 절단 peptide + BrCN--> N-homoserine lactone + C-terminal + CH3SCN

NH

CH

C

CH2

H2C

S

H3C

HN

O

O

R'

Br

C

N NH

CH

C

CH2

H2C

S

H3C

HN

O

O

R'

C N

displacement of Br

NH

CH

C

H2C

H2

C

S

H3C

N

OC N

+

+

Methyl thiocyanate

NH

CH

C

H2C

H2

C

O

O

H2O

C-terminal Peptide +

Homoserine lactone

• Correct sequence: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K

• Trypsin cleavage: A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K

• Chymotrypsin Cleavage: L-V-G-K-A-E-F S-G-I-T-P-K

• Edman degradation: L

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 연습

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 연습 :insulin B chain의 순서

예

N-terminal residue+ phenylisothiocyanate

--> phenylthiocarbamoyl-peptide (1)

(1) + HCl (or trifluoroacetic acid (F3CCOOH))

--> phenyllthiohydantoin 유도체 + (n-1)-peptide

(N-말단쪽 절단)

(Edman degradation)

Edman degradation : 짧게 잘린 펩타이드의 순서결정

N-&C- Terminal Protein Sequencer

Hewlett Packard(USA)

단백질 순서결정의 중요성

- 동종 단백질 간의 일차 순서 비교 : 중요 domain 발견, 단백질 기능 유추

(하나 단백질 전체 순서는 주로 DNA 순서에서 결정된다)

- cloning을 위한 정보 제공 (primer design) :

AAs--> DNA primer--> PCR에 의한 full-sequence DNA clone fishing

- 짧은 펩타이드의 경우 구조 결정의 보완 자료로 사용 가능

NMR (solution) or X-Ray (solid)

• Amino Acid Analysis yielded: Asn, Gly, Leu, Lys, Met, Tyr, Trp

• Trypsin had no effect;

• Edman degradation yielded PTH-Tyr;

• CNBr treatment yielded a tetrapeptide of positive charge and a tripeptide of zero charge at pH 7.0;

• Brief chymotrypsin (cleaved at Trp) yielded a dipeptide and a pentapeptide which contains Gly, Leu,Asn, Lys, and Met;

• NH2OH 처리 : dipeptide (G, K) + pentapeptide (나머지)

• What is the sequence of the peptide?

단백질의 1차 구조 (순서) 결정 연습

다음에 답하시오.

A mixture of three proteins (A, B, and C, see below) can be theoretically separated by ion exchange

chromatography using cellulose coated with diethylaminoethyl (DEAE) groups followed by a gel filtration

column. In the first step, the mixture was applied to the resin at pH 8.0 and washed with the same buffer

to elute proteins that did not bind. The resin was then washed with a buffer pH 6.0 in order to elute the

protein that bound to the column.

Protein A is a homodimer with a molecular weight = 50,000 Daltons and a pI=5.00

Protein B is a homotetramer with a molecular weight =160,000 Daltons and pI = 7.0

Protein C is a monomer with a molecular weight = 75,000 Daltons and pI = 9.0

Questions:

A). When one analyzes the mixture of the three proteins on a SDS-PAGE & native PAGE gels, where would each of

the protein stop on the those two gels (draw schematic gel pictures and label each band with name of the

protein)?

B). Which protein(s) is initially bound to the DEAE column?

C). Which protein(s) is eluted from DEAE at pH 6.0?

D).The DEAE column is further washed with a NaCl gradient. Is there more protein eluted and which one?

E). Eluted proteins from both steps C) and D) are combined and subjected to a gel filtration

procedure. Draw the elution profile of the gel filtration procedure and label each peak with their names.

연습문제 (계속…)

다음 펩타이드 순서를 보고 답하시오.

A-E-K-F-V-C-Y-M-G-F

1) Trypsin digestion의 산물?

2) +Succinic anydride + trypsin?

3) +ethyleneimine + trypsin?

4) +Chymotrypsin?

5) +CNBr?

Hint : Lys (K) + succinic anhydride trypsin resistant

Cys(C) + ethyleneimine lysine like (trypsin subtrate)

단백질의 정제 (Protein Purification)

Liquid Chromatography

- HPLC (High-Performance Liquid Chromatography :약 5 atm 이상 적용 가능

정지상과 이동상의 분배, 흡수력 차 : 용출 순서 차이.

주로 유기용매 사용, 펩타이드 등의 분리에 적합 (단백질은 변성-유기용매,.

pressure ;100 psi = 100 lb/in2 (1atm = 760Torr = 14.7 lb/in2)

(peptide : 주로 reverse phase column 사용)

- LPC (Low Pressure Chromatography) ; 1~2 atm (open column)

- FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography, 자연) : less pressure than HPLC

ex) AKTA purifier (Pharmacia)

정성분석 : LC-MS

예) Shimadzu LC/MS 2010

(분리-질량분석 ( ~ 2000))

단백질 특성 분석 기기

Circular Dichroism (CD) : 2차 구조 MALDI-TOF : 질량분석 (150 ~ 1,000,000 Da or up)

분석용 (XL-A) : 분광기기 ( 중합상태 분석) 분취용 :시료분리

최소 10 rpm to 최대 60,000 rpm (약 250,000 x g).

Analytical Ultracentrifuge (초원심 분석기)

단백질 특성 분석 기기 : 4차구조, 분자량

고 분해능 구조 분석 장비 400MHz NMR XRD

고 분해능 형태 분석 장비 SEM

목포대학교 공동실습관 생체고분자 분석 Facility

질량분석 MALDI-TOF

시료 정제 LC, FPLC

중합상태 판정 XL-A

이차구조 판정 CD

자연상태 상호결합 연구 XL-A

저 분해능 구조-성능 분석 형광기

Primitive analysis

Advanced analysis

분석 의뢰