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architecture
Échanges
renouvellement
Composition structure
cellulaire
Frottis vaginal Papanicolaou x800
Épithélium exocol x128 APS
Tissus conjonctif hématéine / éosine
Types d’étude
Cellules vivantes
Cellules entières fixées
Culture cellulaire
Coupe de tissus après fixation et inclusion
Celld.com viabilité bleu trypan
CHU Angers MGG
Futura sciences neurones dopaminergiques vert
différenciés à partir de cellules souches en rougeHistologie MEDSI coloration APS
1- prélèvement
Autolyse cellulaire rapide
signes de souffrance cellulaire
maintien de l ’architecture tissulaire
prélèvement
Biopsie
Pièces opératoires
exérèse
2-la fixation
* Stabilisation des tissus
le fixateur provoque la formation d’un réseau
intermoléculaire stabilisé par des liaisons covalentes
* maintien des caractéristiques physico-chimiques et
d’organisation
pas blocage des groupements chimiques particuliers qui
pourraient faire l’objet d’une coloration histochimique
Fixation physique• La congélation - 20 à -180 °C
empêche l ’autolysedurcit le prélèvement coupe rapide possiblemeilleur système pour une biopsie
• La cryodessiccationcongélation et évaporation complète sous videutile lors de la recherche de petites molécules facilement hydrolysables dans le tissus
fixateurs chimiques:L’éthanol: fixe les glucides mais solvant des lipides. Durcit les tissus.
Utilisé pour les frottis mais non pour les pièces histologiques.
Le formol (formaldéhyde=méthanal en solution aqueuse):
ponts méthyléniques inter et intraprotéines, blocage de la cytolyse
tue les éventuelles bactéries qui pourraient dégrader le tissu. Bon pouvoir de pénétration.
Manipulation précautionneuse (risques pour l’utilisateur: irritation des muqueuses…).
Utilisé pour les pièces histologiques, convient pour celles de grande taille.
Le Liquide de Bouin: mélange de formol, d’acide picrique en solution dans l’eau ou l’éthanol (coagulation
des protéines) et d’acide acétique (bon fixateur nucléaire, mais altère collagène et mitochondries).
Utilisé pour les pièces histologiques, de petite taille préférentiellement en première intention (pénétration
lente). Convient à la microscopie optique uniquement.
Liquide de Carnoy: mélange d’alcool + chloroforme + acide acétique. Fixe bien les noyaux.
Utilisé pour les très petites pièces histologiques.
L’acide osmique (OsO4): stabilise bien les lipides mais perte de 20% des protéines.
Utilisé pour les tissus nerveux surtout, convient à la microscopie électronique
• Préparer le fixateur en milieu tamponné.
Un volume correspondant à 50x celui de la pièce à fixer est nécessaire.
• Prélever l’échantillon par biopsie ou dissection, le laver à l ’eau physiologique
(NaCl à 9g/L d’eau stérile, pas d’éclatement des cellules).
• Couper en tranche de 5 mm à 2 à 3 cm.
• Immerger rapidement dans le fixateur.
• Identifier le flacon, le fermer hermétiquement et laisser de quelques heures à
plusieurs jours.
Les organes prélevés (ovaires à gauche
et testicules à droite) sont fixés par un
bain dans le liquide de Bouin.
Photo F Jauzein INRP
Rq: un colorant
(éosine…) peut être
ajouté au fixateur
pour repérer les
petites pièces.
Le rôle du technicien/du médecin dans l’étape
d’analyse des pièces histologiques
Autolyse cellulaire rapide
=> passer rapidement à
l’étape suivante.
• Les échantillons sont décrits
macroscopiquement puis des
fragments à étudier au niveau
histologique sont préparés.
• Les fragments d’organe doivent
être orientés par rapport à la
pièce initiale
• Les tissus doivent être découpés
proprement pour maintenir
l’architecture tissulaire.
3 la déshydratation/
substitution• Étape préalable à
l ’inclusion
• permet de chasser l ’eau
des tissus et de préparer
ainsi le remplacement par
des produit hydrophobes
• se fait par passages
successifs dans des bains
d ’alcool de degré
croissant (10 heures)la clarification: bain de toluène
solvant de l’alcool absolu et de la
paraffine (3 heures)
4- inclusion/ imprégnation• Permet d ’obtenir des pièces rigides autorisant une
coupe fine 2 à 10 µm pour la microscopie optique
• le produit d’inclusion va remplacer l ’eau des
tissus
• mélange d’hydrocarbures hydrophobes
ex: paraffine
Réalisation de coupes de 1 à 25µm en
général, autorisant l’observation en
microscopie.
Préparation du bloc de paraffine:
5- La coupe
Objectif:
Fixer les coupes sur des lames de verre. Eviter toute cassure, tout pli.
Protocole:
-Goutte d’une solution de collage = d’étalement (albumine dans l’eau, albumine
glycérinée ou eau gélatinée) sur la lame.
-Placer une bonne coupe sur la lame face brillante contre le verre.
-Lame déposée sur une plaque chauffante => la paraffine ramollit sans fondre =>
déplissage.
-1 à 2h dans une étuve à 37°C => évaporation de l’excédent d’eau.
6- le collage
7- déparaffinage et
réhydratation
• Il faut éliminer la paraffine
( hydrophobe) pour rendre
les tissus perméables aux
colorants ( solutions
aqueuses ou alcooliques)
• technique: des bains
successifs de xylène puis
d ’alcools de degré
décroissant jusqu’à l ’eau
courante
La coloration à l ’APS acide périodique -Schiff
• Objectif: coloration des glucides de réserve ( glycogène amidon), glucides de
soutien , mucoplosaccharides (chaînes d ’hexosamines des sécrétions
visqueuses), glycolipides et glycoprotéines
• principe
1° temps : oxydation par l ’acide périodique des polysaccharides ( formation des
aldéhydes)
2° temps : réaction des aldéhydes avec le réactif de Schiff ( fuchsine décolorée)
coloration rouge-violacée
Épithélium d’une villosité intestinale x320.
Structures colorées par l’APS:
1- Mucus des cellules
caliciformes.
2- Glycoprotéines et
mucopolysaccharides recouvrant les
microvillosité des entérocytes.
La coloration HE hémalun éosine ( safran)
• coloration trichromique
• coloration par hémalun ,coloration progressive,
noyaux bleus
• coloration par l ’éosine, coloration régressive,
cytoplasmes roses
• coloration par le safran ou l ’orange
fibres de collagène orange
Le trichrome de Masson
Coloration trichromique:
-Coloration en bleu sombre des noyaux par l’hémalun.
-Coloration en rouge-rosé des cytoplasmes par le ponceau-fuschine.
-Coloration en bleu-vert des fibres conjonctives par le bleu d’aniline.
Jonction dermo-épidermique, peau du doigt face palmaire, trichrome de Masson.
Bleu/
noirbleurose
Hématoxyline, ponceau /
fuchine, bleu d’aniline
Trichrome
Masson
bleubleu (avec le
RE)
Thionine (ou toluidine ou
violet de crésyle)Nissl
Polysaccharides :
violet-rougebleu
Hématoxyline, acide
periodique, réactif de
Schiff
PAS
Lipides en
orange
Colorant soluble dans
les lipidesSudan III
noirbleu
rouge
(érythrocyte
orange)
Orange G, méthylblue,
fuchsine acide,
hématoxyline
Ladewig
rouge- (parfois
rose)bleurougeAzocarmine, bleu anilineAzan
brun-violetRésorcine, fuchsineElastica
noir-vertrougeHématoxyline, acide de
fuchsine, LichtgrünGoldner
noir- (parfois
rose)rougejaune
Hématoxyline, fuchsine
et acide picrique
van
Gieson
bleu/
noirrouge
rouge/rose
jaune)rouge/rose
Hématoxyline,
érythrosine (safran)
Hémalun-
Eosine
AutresADNÉlastineCollagèneCytoplasmeComposantsColoration
http://fr.wikipedia.org/wiki/Coloration_%28histologie%29
10 - le montage
• Recouvrement de la préparation par une lame
protectrice en utilisant une « colle » le baume ou
résine de montage
• pour une conservation longue on utilise le baume
du Canada ou l ’Eukitt
indice de réfraction proche du verre baume 1.525 verre 1.52 huile à immersion 1.516