architecture

Échanges

renouvellement

Composition structure

cellulaire

Frottis vaginal Papanicolaou x800

Épithélium exocol x128 APS

Tissus conjonctif hématéine / éosine

Types d’étude

Cellules vivantes

Cellules entières fixées

Culture cellulaire

Coupe de tissus après fixation et inclusion

Celld.com viabilité bleu trypan

CHU Angers MGG

Futura sciences neurones dopaminergiques vert

différenciés à partir de cellules souches en rougeHistologie MEDSI coloration APS

1- prélèvement

Autolyse cellulaire rapide

signes de souffrance cellulaire

maintien de l ’architecture tissulaire

prélèvement

Biopsie

Pièces opératoires

exérèse

2-la fixation

* Stabilisation des tissus

le fixateur provoque la formation d’un réseau

intermoléculaire stabilisé par des liaisons covalentes

* maintien des caractéristiques physico-chimiques et

d’organisation

pas blocage des groupements chimiques particuliers qui

pourraient faire l’objet d’une coloration histochimique

Fixation physique• La congélation - 20 à -180 °C

empêche l ’autolysedurcit le prélèvement coupe rapide possiblemeilleur système pour une biopsie

• La cryodessiccationcongélation et évaporation complète sous videutile lors de la recherche de petites molécules facilement hydrolysables dans le tissus

fixateurs chimiques:L’éthanol: fixe les glucides mais solvant des lipides. Durcit les tissus.

Utilisé pour les frottis mais non pour les pièces histologiques.

Le formol (formaldéhyde=méthanal en solution aqueuse):

ponts méthyléniques inter et intraprotéines, blocage de la cytolyse

tue les éventuelles bactéries qui pourraient dégrader le tissu. Bon pouvoir de pénétration.

Manipulation précautionneuse (risques pour l’utilisateur: irritation des muqueuses…).

Utilisé pour les pièces histologiques, convient pour celles de grande taille.

Le Liquide de Bouin: mélange de formol, d’acide picrique en solution dans l’eau ou l’éthanol (coagulation

des protéines) et d’acide acétique (bon fixateur nucléaire, mais altère collagène et mitochondries).

Utilisé pour les pièces histologiques, de petite taille préférentiellement en première intention (pénétration

lente). Convient à la microscopie optique uniquement.

Liquide de Carnoy: mélange d’alcool + chloroforme + acide acétique. Fixe bien les noyaux.

Utilisé pour les très petites pièces histologiques.

L’acide osmique (OsO4): stabilise bien les lipides mais perte de 20% des protéines.

Utilisé pour les tissus nerveux surtout, convient à la microscopie électronique

• Préparer le fixateur en milieu tamponné.

Un volume correspondant à 50x celui de la pièce à fixer est nécessaire.

• Prélever l’échantillon par biopsie ou dissection, le laver à l ’eau physiologique

(NaCl à 9g/L d’eau stérile, pas d’éclatement des cellules).

• Couper en tranche de 5 mm à 2 à 3 cm.

• Immerger rapidement dans le fixateur.

• Identifier le flacon, le fermer hermétiquement et laisser de quelques heures à

plusieurs jours.

Les organes prélevés (ovaires à gauche

et testicules à droite) sont fixés par un

bain dans le liquide de Bouin.

Photo F Jauzein INRP

Rq: un colorant

(éosine…) peut être

ajouté au fixateur

pour repérer les

petites pièces.

Le rôle du technicien/du médecin dans l’étape

d’analyse des pièces histologiques

Autolyse cellulaire rapide

=> passer rapidement à

l’étape suivante.

• Les échantillons sont décrits

macroscopiquement puis des

fragments à étudier au niveau

histologique sont préparés.

• Les fragments d’organe doivent

être orientés par rapport à la

pièce initiale

• Les tissus doivent être découpés

proprement pour maintenir

l’architecture tissulaire.

3 la déshydratation/

substitution• Étape préalable à

l ’inclusion

• permet de chasser l ’eau

des tissus et de préparer

ainsi le remplacement par

des produit hydrophobes

• se fait par passages

successifs dans des bains

d ’alcool de degré

croissant (10 heures)la clarification: bain de toluène

solvant de l’alcool absolu et de la

paraffine (3 heures)

4- inclusion/ imprégnation• Permet d ’obtenir des pièces rigides autorisant une

coupe fine 2 à 10 µm pour la microscopie optique

• le produit d’inclusion va remplacer l ’eau des

tissus

• mélange d’hydrocarbures hydrophobes

ex: paraffine

Passage à l ’étuve à 56 °C

4 heures

Réalisation de coupes de 1 à 25µm en

général, autorisant l’observation en

microscopie.

Préparation du bloc de paraffine:

5- La coupe

Le microtome

Ruban de coupes

Objectif:

Fixer les coupes sur des lames de verre. Eviter toute cassure, tout pli.

Protocole:

-Goutte d’une solution de collage = d’étalement (albumine dans l’eau, albumine

glycérinée ou eau gélatinée) sur la lame.

-Placer une bonne coupe sur la lame face brillante contre le verre.

-Lame déposée sur une plaque chauffante => la paraffine ramollit sans fondre =>

déplissage.

-1 à 2h dans une étuve à 37°C => évaporation de l’excédent d’eau.

6- le collage

7- déparaffinage et

réhydratation

• Il faut éliminer la paraffine

( hydrophobe) pour rendre

les tissus perméables aux

colorants ( solutions

aqueuses ou alcooliques)

• technique: des bains

successifs de xylène puis

d ’alcools de degré

décroissant jusqu’à l ’eau

courante

8- la coloration

La coloration à l ’APS acide périodique -Schiff

• Objectif: coloration des glucides de réserve ( glycogène amidon), glucides de

soutien , mucoplosaccharides (chaînes d ’hexosamines des sécrétions

visqueuses), glycolipides et glycoprotéines

• principe

1° temps : oxydation par l ’acide périodique des polysaccharides ( formation des

aldéhydes)

2° temps : réaction des aldéhydes avec le réactif de Schiff ( fuchsine décolorée)

coloration rouge-violacée

APS x320 glande endocrine folliculaire

thyroïde

Épithélium d’une villosité intestinale x320.

Structures colorées par l’APS:

1- Mucus des cellules

caliciformes.

2- Glycoprotéines et

mucopolysaccharides recouvrant les

microvillosité des entérocytes.

Villosité intestinale x320

HE APS/hématoxyline

ferrique/orange G

La coloration HE hémalun éosine ( safran)

• coloration trichromique

• coloration par hémalun ,coloration progressive,

noyaux bleus

• coloration par l ’éosine, coloration régressive,

cytoplasmes roses

• coloration par le safran ou l ’orange

fibres de collagène orange

HE épiderme x100

Jonction dermo-épidermique, coloration HES x320

Le trichrome de Masson

Coloration trichromique:

-Coloration en bleu sombre des noyaux par l’hémalun.

-Coloration en rouge-rosé des cytoplasmes par le ponceau-fuschine.

-Coloration en bleu-vert des fibres conjonctives par le bleu d’aniline.

Jonction dermo-épidermique, peau du doigt face palmaire, trichrome de Masson.

Bleu/

noirbleurose

Hématoxyline, ponceau /

fuchine, bleu d’aniline

Trichrome

Masson

bleubleu (avec le

RE)

Thionine (ou toluidine ou

violet de crésyle)Nissl

Polysaccharides :

violet-rougebleu

Hématoxyline, acide

periodique, réactif de

Schiff

PAS

Lipides en

orange

Colorant soluble dans

les lipidesSudan III

noirbleu

rouge

(érythrocyte

orange)

Orange G, méthylblue,

fuchsine acide,

hématoxyline

Ladewig

rouge- (parfois

rose)bleurougeAzocarmine, bleu anilineAzan

brun-violetRésorcine, fuchsineElastica

noir-vertrougeHématoxyline, acide de

fuchsine, LichtgrünGoldner

noir- (parfois

rose)rougejaune

Hématoxyline, fuchsine

et acide picrique

van

Gieson

bleu/

noirrouge

rouge/rose

jaune)rouge/rose

Hématoxyline,

érythrosine (safran)

Hémalun-

Eosine

AutresADNÉlastineCollagèneCytoplasmeComposantsColoration

http://fr.wikipedia.org/wiki/Coloration_%28histologie%29

9 - la déshydratation• Étape préalable au montage avec des

produits de type hydrocarbure

10 - le montage

• Recouvrement de la préparation par une lame

protectrice en utilisant une « colle » le baume ou

résine de montage

• pour une conservation longue on utilise le baume

du Canada ou l ’Eukitt

indice de réfraction proche du verre baume 1.525 verre 1.52 huile à immersion 1.516

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