LES NUMERATIONS LES NUMERATIONS LES NUMERATIONS LES NUMERATIONS

GLOBULAIRESGLOBULAIRESGLOBULAIRESGLOBULAIRESGLOBULAIRESGLOBULAIRESGLOBULAIRESGLOBULAIRES

But de la numération

Déterminer la concentration sanguine en globules rouges, globules blancs et plaquettes.

• La numération est un paramètre étroitement régulé par l’hématopoïèse et le vieillissement cellulaire normal.

Le taux de dilution appliqué sera adapté au type cellulaire décompté

• Il y a donc des valeurs de référence par tranche d’âge et par sexe.

• Tout changement dans la numération traduira un phénomène pathologique en évolution.

Principe de la numération directe

• Échantillon de sang prélevé avec un anticoagulant

• Dilution taux adapté au type cellulaire dénombré1012/L pour GR dilution F : 20010 /L pour GR dilution F : 200109/L pour GB et Thr dilution F : 100

• Décompte au microscope : reconnaissance visuelle d’où numération directe : n cellules

• concentration cellulaire = n cellules/volume de décompte

Diluteur à usage unique- Réservoir hermétiquement bouché, contenant un volume précis de diluant

Matériel de dilution : unopette

capillaire

Réservoir

DiluantMicropipette

Capuchon- Capuchon

précis de diluant

- micropipette permettant de prélever un volume précis de sang

L’unopette sert à réaliser une dilution standardisée et précise du sang.

Il existe des unopettes pour hématies, leucocytes et plaquettes

Ce sont d’épaisses lames de verre, creusées de rigoles qui délimitent des plates-formes

Matériel de comptage : hématimètre

Il existe plusieurs types d’hématimètreils se différencient par leur quadrillage et leur volume total

Deux plates-formes

latérales élevées qui

supporteront une lamelle

épaisse et plane

une plate-forme centrale

légèrement abaissée, sur

laquelle sont gravés un

ou deux quadrillages

Le quadrillage de l’hématimètre de MALASSEZ

Le quadrillage est constitué d’un grand rectangle ( A’B’C’D’) de L = 2,5 mm et l = 2 mm

Il est divisé en 100 rectangles égauxde 250 µm × 200 µm

25 rectangles (ABCD) divisés en 25 rectangles (ABCD) divisés en petits carrés (abcd)25 rectangles clairs50 rectangles divisés en bandes

Lorsque la lamelle plane est fixée sur la plate-forme centrale, la profondeur ou distance entre le quadrillage et la lamelle est de

0,2 mm.

V = L x l x h= 2,5 x 2 x 0,2 = 1 mm3 = 1 µL= 1.10-6 L

Volume total de la chambre de comptage

de Malassez(grand rectangle A’B’C’D’)

Volume correspondant à chaque rectangle

ABCDV = 0,25 x 0,2 x 0,2

= 0,01 mm3 = 0,01 µL

Une chambre de comptage permet une numération directe précise grâce :

• au quadrillage • qui délimite une surface précise• qui donne le repère visuel et permet ne pas compter 2 fois la même cellulecompter 2 fois la même cellule

• à la profondeur précise (distance lamelle –quadrillage permet de disposer d’un volume exact

A faire avant de mettre les gants

Préparation de l’hématimètre

Par précaution :

-Rincer à l’eau distillée

- rincer à l’alcool

-Sécher sans frotter

Faire adhérer la lamelle sur les plates formes latérales en les humectant légèrement

Poser la lamelle sur les plateaux en prenant soin de ne pas la graisser avec les doigts.

En appuyant avec les deux

pouces sur cette lamelle au

niveau des plateaux latéraux,

exercer un mouvement de

va-et-vient jusqu’à perception

d’une résistance et apparition

de franges irisées, sans

appuyer sur la partie centraleappuyer sur la partie centrale

Poser l’hématimètre à plat sur

la paillasse

Placer sur la platine, faire la

mise au point au grossissement

100 (objectif 10)

Mettre des gants et les lunettes de sécurité

Réalisation de la dilution

Préparer le poste de travail

Perforer largement le réservoir de l’unopette avec le capuchon, enlever et jeter le capuchon

Bien homogénéiser le sang dans le tube

de prélèvement

Maintenir la micropipette horizontale et faire monter le sangpar capillarité.

Le dispositif est calibré de telle sorte que le sang s’arrêtera tout

seul et le volume prélevé sera juste si la micropipette est bien

horizontale

Essuyer soigneusement le sang à l’extérieur de la micropipette à l’aide de papier filtre

Il faut enlever le sang qui est sur la paroi extérieure du capillaire ( erreur par excès)

• Incliner légèrement le capillaire vers l’arrière pour faire

descendre le sang de quelques millimètres

• Boucher avec l’index l’extremité de la micropipette

• Essuyer soigneusement avec un papier sec

• Faire attention à ne pas aspirer le sang contenu dans le capillaire

- Maintenir le réservoir fortement comprimé

- Maintenir l’index sur la micropipette

- Introduire jusqu’au blocage la micropipette dans le réservoir

- Relâcher la pression au niveau du

Presser et relâcher 2 à 3 fois les parois du réservoir pour rincer la micropipette sans déborder , agiter pour homogénéiser.

- Relâcher la pression au niveau du réservoir puis enlever l’index

(le vide créé aspire le sang)

• Attendre 15 minutes pour les leucocytes et les thrombocytes avant de mettre en hématimètretemps de lyse des hématies et de turgescence des plaquettesturgescence des plaquettes

• Pas de temps d’attente pour la numération des hématies

• Homogénéiser la dilution

• Sortir la micropipette

délicatement la retourner et la

Mise en hématimètreMettre les lunettes de sécurité

délicatement la retourner et la

positionner sur le réservoir

• Jeter les premières gouttes de

dilution

Placer l’extrémité de la

Attention: Ne pas toucher la lamelle avec le capillaire

���� Décollement de la lamelle

���� Bris du capillaire

Placer l’extrémité de la micropipette, légèrement inclinée, sur le plateau central près de la lamelle et remplir par capillarité la chambre de l’hématimètre

Sans débordement dans les rigoles et sans bulles d’air.

Le plateau quadrillé doit être rempli en entier en 1 fois

Le remplissage doit être rapide, réalisé en une seule fois, sans

Laisser sédimenter, l’hématimètre bien horizontal

sur la platine du microscope

10 minutes pour les hématies

20 minutes pour les thrombocytes et les leucocytes

�Vérifier à x 10 l’homogénéité de répartition(sinon nettoyer et recommencer la mise en hématimètre)

���� mettre à x 40 (1 rectangle ABCD occupe un champ entier)

Décompte

�Compter les cellules

pour les GR : 4 rectangles quadrillés dans des zones différentespour les GB : toute la chambre de comptage (100 rectangles)pour les Thr : trois bandes complètes ( 30 rectangles)

Dans les cas des érythrocytes on obtient n1, n2, n3 et n4

La dispersion entre les 4 rectangles est :

n fort-n faible

nmoyenX 100

nmoyen

Ce pourcentage ne doit pas dépasser 10%

Compter avec un parcours méthodique

Compter les cellules présente dans chaque carrée élémentaire (A’B’C’D’)

La répartition des cellules sur le quadrillage entraine une erreur technique dans la numération

Il ne faut compter que la moitié des bords pour limiter cette erreurOn comptera toutes les cellules chevauchant en haut et à droite

Calcul

N=X. F. 106

n.V

X = somme des cellules comptées dans l’ensemble des X = somme des cellules comptées dans l’ensemble des rectangles pris en compte

F = facteur de dilution

n = nombre de rectangles comptés

V = volume d’un rectangle = 0,01 µL = 0,01 mm3

106 pour obtenir le résultat par litre de sang

Expression du résultat

Le résultat s’exprimera sous la forme :

N +/- 2uc

uc = 0,1.1012/L pour les érythrocytes

uc = 0,2.109/L pour les leucocytes

uc = 30.109/L pour les thrombocytes

Dès la fin du décompte

���� Faire tremper l’hématimètre 10 minutes en RBS 2% ���� Mettre des gants���� Récupérer à la main l’hématimètre et sa lamelle���� Faire tremper 15 minutes dans de l’eau de javel 1,2° chlorométrique

Rangement

���� Faire tremper 15 minutes dans de l’eau de javel 1,2° chlorométrique���� Récupérer à la main l’hématimètre et sa lamelle���� Rincer abondamment à l’eau distillée���� Rincer à l’alcool pour améliorer le séchage���� Éponger sans frotter avec du papier joseph

Ranger l’hématimètre avec sa lamelle ( lamelle sous l’hématimètre)