1. Introduction :Leau est llment le plus demand et le plus essentiel dans la vie. On lutilise quotidiennement pour diffrentes applications, par exemple lalimentation et le lavage des aliments ou de matriels Et pour ces buts ou dautres leau doit reprsente des qualits microbiologique et physico-chimiques satisfaisantes. Dans cette TP nous sommes plus intressants par le recherche dans lchelle microbiologique, lorientation de TP t vers : la ralisation des analyses sur leau, le rechercher des diffrents types des germes, la comparaison entre les germes prsent dans deux types deau (eau potable (de robinet) et leau pollu) en plus lidentification des germes. Notre groupe a t choisi pour les recherches dans leau pollu. Les germes viss pour la recherche sont : -les germes arobies msophiles et psychrophiles dans le milieu PCA glos : cette recherche indique plusieurs critres ; lorigine de cette eau, les traitements quil a subi. Cest dire une valuation de cette eau, un indicateur de la qualit gnrale et de la stabilit. La recherche des germes 20C indique la recherche des germes pathognes ou rsistants. -les coliformes totaux 30c dans le milieu BCPL : permet de signal une contamination fcale dorigine animale, c'est--dire une valuation de risque de prsence des germes pathognes. -les streptococcus type D dans le milieu Rothe : cest une recherche dun germe pathogne. Pour lvaluation des risques sanitaires de cette eau.

2. Matriel et mthodes :a.matriel : Les verreries : Tube essais, boite de ptri, des portoirs tubes, flacons, pipettes pasteur, pipettes 5ml et 1ml, des lames, des lamelles, cloche de Durham. (Tout le matriel doit tre strile). Les appareils : Microscopes, Compteur colonie, incubateur, bec bunsen. Les milieux de cultures utiliss : Reprsent dans lannexe I

Les indicateurs chimiques : Rouge de mthyle, ractif de Vogs-Proskauer, le ractif de Kovacs. 1

d. mthodes danalyse : 1. le premier jour : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a ralis des dilutions partir de la solution mre. Trois tubes contiennent 9 ml deau

physiologique strile prpares par lenseignant, avec une pipette strile de 1 ml on ajout 1 ml partir de flacon qui contient la solution mre et met dans le premier tube cest le tube de dilution (10-1) , aprs une homognisation t ralise. Avec la mm pipette on a prend 1 ml partir de tube de dilution (10-1) et met dans le deuxime tube cest le tube de dilution (10-2) . Avec la mm pipette on a prend 1 ml partir de tube de dilution (10-2) et met dans le troisime tube cest le tube de dilution (10-3) . Aprs On a met 1 ml de solution de dernier tube de dilution (10-3) dans chaque boites ptri. Aprs on a coll les boites par 10 15 ml de milieu PCA prpar et liquidifi par lenseignant et on a effectu des mouvements en forme de pour bien mlanger linoculum, aprs la solidification de milieu on a incub les boites 30C et 20C pendant 72 heures. (Selon le schma 1).

Eau analys 10-1 10-2 10-3

1 ml

1 ml

PCA PCA

Incubation 37C et 20C.

37C

10-2

20C

10-3

EP2

EP2

2

Pour la recherche des coliformes totaux : La mthode utilise cest 333 , dans la quelle, on a utilis neuf tubes remplies (9 ml) par le milieu BCPL et chaque tube contient une cloche de Durham prpar par lenseignant, par diffrents concentrations, trois tubes doubles concentrs (D/C) et six simple concentrs (S/C). Pour les trois tubes doubles concentrs on a ajout 10 ml deau partir de la solution analyse, On a ajout 1 ml de la mme solution dans trois tubes simples concentrs et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mre dans les trois tubes simples concentrs qui restes. Il faut bien mlanger les tubes et chasser le gaz dans les cloches. Aprs on a lincubation 37C pendant 24 48 h. (Selon le schma 2).

Eau analys

10 ml

1 ml

0.1 ml

Double concentr

simple concentr

simple concentr

Lincubation 37C pendant 24 48 h. Pour la recherche des streptococcus type D : La mthode utilise cest 511 , dans la quelle, on a utilis septe tubes remplies (9 ml) par le milieu Rothe prpar par lenseignant, par diffrents concentrations, cinq tubes doubles concentrs (D/C) et deux tubes sont simple concentrs (S/C).

3

Pour cinq tubes doubles concentrs on a ajout 10 ml deau partir de la solution analyse, On a ajout 1 ml de la mme solution dans un tube simple concentr et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mre dans un tube simple concentr qui reste. Aprs on a lincubation 30C pendant 24 48 h. (Selon le schma 3).

Eau analys

10 ml

1 ml

0.1 ml

Double concentr

simple concentr

Incubation 30C pendant 24 48 h 2. le deuxime jour : On a fait la lecture des rsultats et le dnombrement sur touts les milieux laide des tableaux de lindice NPP. On a essai dobserver les germes prsent dans le milieu Rothe laide de microscope photonique. A partir de milieu BCPL (seulement les tubes positifs et de prfrence les tubes doubles concentrs positifs) on a fait un repiquage sur le milieu BCPL glos pour but de sparer les colonies produites pour tre facile identifie, ce repiquage faite par culture en surface, on a met la pipette pasteur dans le milieu BCPL et faire des stries sur la glose coll dj sur les boites et refroidie, linoculum t ensemenc 30C pendant 24. (Selon le schma 4).

4

Tube +

BCPL

37C

EP2

Incubation 37C pendant 24h. 3. le troisime jour : On a essai une autre fois dobserver les germes prsent dans le milieu Rothe laide de microscope photonique. A partir de milieu BCPL glos on a prend une colonie par la pipette pasteur et met dans trois diffrents tubes par diffrent mode densemencement, le premier tube est coll par le milieu citrate de Simmons (solidifi en position incline) l ensemencement fait par des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur, le deuxime est coll par le milieu Kigler-Hajana (solidifi en position semi-incline) l ensemencement fait par piqure centre (dans le culot) aprs des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur, le troisime tube est remplis par le milieu Clark et Lubs (milieu liquide) l ensemencement fait par lentre de la pipettes pasteur dans le milieu, les trois tubes sont pour but didentification biochimique de la colonie slectionne, les trois tubes sont ensuite incubes 30C pendant 24h. (Selon le schma 5).

5

Milieu Citrate de Simmons

Milieu KiglerHajana

Milieu Clark et Lubs

Leau peptone

Incubation 37C pendant 24h. 4. le quatrime jour : On fait la lecture des rsultats sur le milieu PCA (lecture aprs 72h). La lecture directe de rsultat sur le milieu Citrate de Simmon et de milieu Kigler-Hajana. On a divis la culture de milieu Clark et Lubs dans deux tubes, dans le premier tube on a ajout des gouttes de solution rouge de mthyle, dans le deuxime tube on a ajout des goutte de naphtol(VP1) et des gouttes de solution de soude 16% (VP2). le principe de ces ractifs dans lannexe II.

4. Rsultat et discutions :Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a fait la lecture sur les boites qui contiennent le milieu PCA aprs 72h seulement la boite incube 30C contient des colonies, trop charg, pour facilite la lecture on a divis la boite en quatre, on a estime le nombre des colonies prsentent dun quart, il est de 145 colonies peut prs. Alors le nombre des bactries dans 1ml de solution gale : 6

N = (150 4) 102 = 60000 UFC/ml. Donc le nombre des bactries arobies msophiles totale prsentent dans cette eau gale 60000 bactries par un millilitre. (Schma 6).

150 colonies

PCA

37C

10-2

EP2

Pour le dnombrement des coliformes totaux : Le dnombrement se fait partir des tubes s tubes dits positives sont : Les tubes virage de couleur (couleur jaune). prsentent un dgagement de gaz (les cloches remplies par le gaz).

Par la mthode NPP on a estime le nombre des coliformes totaux prsentent dans leau, la mthode de calcule est la suivante : 310 D/C 31 S/C 30.1 S/C

+

+ 3

+

+

+ 37

+

+

+ 3

+

Le nombre 333 correspond > 1100 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactries calculs gale : (1100 10) = >11000 bactries dans 100ml. Lidentification biochimique des coliformes: Les souches pressentant dans le La boite appartient la famille dentrobactrie les tests suivants utiliss pour lidentification des genres de cette famille, notre colonie choisis prsente les caractres suivants : Indole Escherichia coli Enterobacter Klebsiella citrobacter + RM + + VP + + Citrate +

la raction d RM : cette raction rendre la teinture de milieu en rouge, montre que le pH de milieu est infrieur 4.5, Donc RM positive. La raction VP : dans notre cas cette raction ne produise pas une coloration rouge la surface de tube (la color t jaune fonc), indiqu labsence dactone. Donc VP ngative. Indole : lapparition dun anneau rouge en surface par lajout de ractif de Kovacs, indique la prsence dindole. Avec la colonie choisis lanneau rouge napparaisse pas. Donc indole ngatif. Citrate : lutilisation (dgradation) de citrate traduit par lalcalinisation de milieu et changement de couleur vers le bleu, notre milieu reste vert donc la souche slectionne nutilise pas le citrate. Donc elle est citrate ngatif.

Lactose, glucose, H2S, gaz : la lecture directe sur le milieu aprs 24h dincubation, donne les rsultats suivantes : dans le culot, le virage au jaune traduit par une acidification due lutilisation du glucose (glucose+), lapparition de bulles dans le culot traduit par la production de gaz (gaz+), un noircissement du la formation de sulfure de fer (H2S+), dans la pente le virage au jaune due la persistante de lacidification( la souche utilise le glucose qui est en faible quantit, aprs elle utilise le lactose), donc lactose (+).

partir de ces rsultats les caractres de cette souche sont similaires avec sels dEscherichia coli, donc on peut dire que la souche choisis est Escherichia coli.

8

Recherche des streptococcus groupe D: Les tubes dits positifs sont les tubes prsentant un trouble microbien La lecture sur le milieu Rothe aprs 24h 30C est la suivante : 510 D/C 11 S/C 10.1 S/C

+

+

+ 4

+

_

_ 0

_ 0

Le nombre 400 correspond 15 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactries gale : 15 bactries dans 100ml.

5. Conclusion :A partir des analyses quon les fait, on peut valuer la qualit de cette eau. Le nombre norme de FAMT indique que cette eau ne subi aucun traitement. Encore les rsultats danalyses de coliformes confirment la pollution et la contamination (dorigine animale) de cette eau, lidentification de genre E.coli et la prsence des streptococcus affirme la prsence des germes pathognes dans leau. La conclusion des analyses induisent que leau analys est impropre la consommation par ce que il est contamin, donc il faut prend des prcautions lors de la manipulation de cette eau. Autre information sont acquises dans cette TP par exemple : Lapplication des certains techniques tel que le prlvement, lensemencement, le collage des boites, lincubation, le repiquage, la ralisation des tests biochimiques et quelques techniques de lavage et de strilisation des matriels. Aussi lvaluation des risques sur le manipulateur.

9

Annexe I : Tableau reprsente les milieux de cultures utilises et leurs compositions.

Le milieu La composition Milieu PCA glos Peptone (plate count Extrait de levure agar) Glucose Glose Milieu BCPL (bouillon lactos au pourpre de bromocrsol) Milieu Rothe (bouillon) Peptone Extrait de viande Lactose Pourpre de bromocrsol Peptone Glucose Chlorure de sodium Phosphate bipotassique Phosphate monopotassique Azide de sodium Sulfate de magnsium Phosphate monoammonique Phosphate dipotassique Citrate de sodium Chlorure de sodium Bleu de bromothymol glose Peptone Extrait de viande Extrait de levure Lactose Glucose Sulfate ferreux Chlorure de sodium Hyposulfite de sodium Rouge de phnl glose Peptone Phosphate dipotassique Glucose Peptone exempte dindole Chlorure de sodium

pH 5g 2.5 g 1g 15g 5g 3g 10 g 25 mg 20 g 5g 5g 2.7 g 2.7 g 0.2 g 0.2g 1g 1g 2g 5g 80mg 12g 20g 3g 3g 10g 1g 0.3g 5g 0.3g 2.5mg 15g 10g 2g 5g 15g 5g 7.2

Remarque

7

7

Milieu Simmons (glose au citrate de Simmons)

6.8

Solidifier en position incline

Milieu KliglerHajana (milieu lactose-glucoseSH2 de KliglerHajana)

7.4

Solidifi en position semiincline

Milieu Clark et Lubs Leau peptone

7

7.2

Annexe II : le principe des milieux didentification.10

Milieu Simmons :

Cest un milieu glos inclin contenant un indicateur color (Bleu de bromothymol). Le citrate est la seule source de carbone, la croissance cellulaire est accompagner frquemment dune alcalisation qui se traduit par le virage de milieu au bleu, donc citrate(+).Recherche dindole :

Lindole est issu de lhydrolyse du tryptophane. Aprs culture de 24h sur leau peptone, lindole est caractris par le ractif de Kovacs. Quelques gouttes de ractif sont ajoutes au milieu : aprs agitation, la prsence dindole se manifeste par apparition dun anneau rouge en surface.Milieu Kligler-Hajana :

Cest un milieu glos semi-inclin, combin, il permet la lecture des plusieurs caractres : utilisation du glucose, avec ou sans gaz, utilisation du lactose, production de H2S. Les principaux rsultats :Zone du tube Culot (anarobiose) Pente (arobiose) lactose Caractre recherch glucose aspect Inchang Jaune Jaune rose Culot ou jonction culotpente H2S Gaz en glucose bulle Inchang Noir Inchang Milieu Clark et Lubs : Conclusion Glucose Glucose + Lactose Lactose + Gaz + Gaz H2S + H2S -

Permet dtablir la voie de fermentation subie par le germe cultiv. Soit la fermentation dacides mixtes ou la fermentation butane-indole. Les ractions sont suivis par les deux ractifs ; Rouge de mthyle et de Vogs-Proskauer. La lecture des rsultats :La raction RM teinte Rouge jaune VP Rouge aucune Lindication pH6 Prsence dactone Absence dactone Rsultat RM+ RM+ VP+ VP-

11

12