Contrôle microbiologique des denrées alimentaires, des ... · Contrôle microbiologique des...

Contrôle microbiologiquedes denrées alimentaires,des boissons et des pro-duits pharmaceutiques

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La méthode avec membrane filtrante

DescriptionUne membrane filtrante de seuil de rétentionconnu est posée dans l’appareil de filtrationpuis l’échantillon est filtré. Les micro-orga-nismes présents sont récupérés sur la surfacede la membrane par le phénomène du tami-sage. Les substances inhibant ou retardant la croissance peuvent être éliminées en rinçantle filtre avec de l’eau stérile. Puis la membranefiltrante est posée sur un milieu de culture et mise à incuber. Il peut y avoir échange entre substances nutritives et produits dumétabolisme grâce au système poreux de la membrane filtrante. Les colonies qui se sontdéveloppées sur la surface de la membranesont comptées et leur évaluation se fait enfonction du volume de l’échantillon filtré.

Les avantages :• Comparativement à la méthode directe, de

plus grands volumes d’échantillons peuventêtre analysés. L’effet de concentrationaugmente l’exactitude du dénombrement.

• La membrane filtrante sur laquelle se sontdéveloppées les colonies constitue undocument que vous pouvez archiver, puisconsulter à tout moment.

• Il est possible d’évaluer les colonies qui sesont développées directement en fonctiondu volume.

• Les résultats sont quantitatifs.

Pas d’inhibiteursLes inhibiteurs tels que les huiles essentielles ou les désinfectants peuvent être rincés de lamembrane filtrante après la filtration.

Qualité BPFLes membranes filtrantes Sartorius sont fabri-quées conformément aux conditions BPF, cequi permet de garantir une qualité constanteet une reproductibilité élevée lot après lot et à l’intérieur même d’un lot.

Les milieux de cultureLes contaminations microbiennes peuventêtre analysées par différents procédés.

Les méthodes de dénombrement micro-scopique ou après culture permettent leurmise en évidence et les méthodes biochi-miques et sérologiques servent à caractériserprécisément la nature des micro-organismes.

Pour la mise en évidence par la culture, on se sert de milieux de culture liquides ousolides dans ou sur lesquels les micro-orga-nismes se multiplient, jusqu’à former descolonies visibles.

On ne peut faire d’appréciation quantitativequ’avec un milieu de culture solide car on peut alors compter les colonies qui sedéveloppent.

Pour la croissance de la colonie, on peut utili-ser les milieux de culture suivants :

• Les milieux de culture sur carton : Ils sont décrits à la page suivante et offrentcertainement la manière la plus facile d’appliquer la méthode avec membranesfiltrantes.

Les milieux de culture sur carton per-mettent une utilisation optimale de laméthode avec membrane filtrante.

Ils rationnalisent et standardisent lesprocédés de recherche microbiologique.

Ils réduisent et facilitent le travail en laboratoire.

Ils permettent les gains de temps et d’argent.

• Les disques de carton à imbiber avec unmilieu de culture liquide.

• Les milieux de culture avec agar ou géla-tine comme solidifiant, bouillon nutritif.

Introduction

Dans de très nombreux domaines, le contrôlemicrobiologique des produits constitue soit un impératif de sécurité comme dans lesdomaines pharmaceutiques, médicaux ou hos-pitaliers, soit plus simplement, un critère dequalité. Les établissements hospitaliers sonttenus de contrôler régulièrement la contami-nation microbiologique de leur eau ou de l’air.Ils peuvent aussi être amenés à effectuer des analyses microbiologiques de liquidesbiologiques.

De même, dans l’industrie pharmaceutique, lasécurité de la production impose de multiplescontrôles bactériologiques dans les différentssites de production, de stockage ainsi que sur les matières premières et les produits finis.

Les industries alimentaires doivent aussi faireface aux exigences toujours croissantes du consommateur en matière de qualité et deconservation des denrées alimentaires et desboissons. Ces branches de l’industrie ne peu-vent pas se limiter à un contrôle du produitfinal, c’est-à-dire de la boisson en bouteille oudu plat cuisiné ; au contraire, elles doivent, si elles veulent éviter les pertes financières et les réclamations, soumettre les matièrespremières à un contrôle constant et surveillerl’ensemble du processus de production. Lesexamens microbiologiques et hygiéniquesjouent alors un rôle prépondérant.

Les exigences auxquelles sont soumises lesméthodes d’examens microbiologiques ontpour résultat une excellente reproductibilitédes analyses concernant la présence et ledénombrement des germes recherchés ainsique l’optimisation des moyens mis en œuvreen routine. La méthode de dénombrement au moyen de membranes filtrantes satisfaittotalement à ces exigences.

Cette méthode a pour principe la concentra-tion des micro-organismes à partir de volumesd’échantillons importants sur la surface de lamembrane filtrante. La culture des germess’effectue sur des milieux de culture sur carton(NKS) ou sur agar nutritif.

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Méthode avec membrane filtrante standardLa membrane filtrante est rincée, posée sur un milieu de culture (a, b ou c) et mise à incuber.

Méthode avec membrane filtranteL’échantillon à analyser est filtré à travers unemembrane filtrante.

Méthodes de dénombrement des germes

Méthode directeL’échantillon à analyser est mis dans une boîte de Pétri avec une pipette…

…puis il est mélangé avec le milieu deculture et mis à incuber.

Méthode avec membrane filtrante avec Biosart 100

Après la filtration, ajouter le milieu deculture par le haut et faire brièvementle vide (< 1 sec.). Fermer le fond du Biosart 100 avec le bouchon livré avecl’unité. Enlever l’entonnoir et assemblerle couvercle et le fond pour former une boîte de Pétri.

Méthodes de dénombrement des germes

a) Sur un milieu de culture surcarton (NKS)humidifié avecde l’eau stérile.

b) Sur un disque decarton imbibéavec un milieu de cultureliquide.

c) Sur un milieude cultureavec agar.

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Manipulation des micro-organismesLes cultures de micro-organismes doiventtoujours être manipulées avec extrêmementde précautions. L’utilisateur doit toujourspartir du principe qu’elles peuvent êtrepathogènes.

La manipulation de micro-organismes n’est pas dangereuse si l’on observe les règlesde sécurité suivantes :

Bien se laver les mains avant et après avoirtravaillé dans un laboratoire.

Ne pas manger ni boire dans un laboratoire.

Ne pas toucher les matières bactériennes avecles mains.

Ne jamais pipetter les suspensions bacté-riennes à la bouche. Toujours utiliser des aidesmécaniques (par ex. poire d’aspiration encaoutchouc).

Avant et après usage, il faut stériliser à laflamme les ensemenceurs et les aiguillesd’inoculation jusqu’à ce qu’ils soient chauffésau rouge.

Tous les instruments de laboratoire qui ontété en contact avec des bactéries doivent être stérilisés.

Afin de protéger les personnes et les animaux contre des maladies contagieuses oudes intoxications, il faut détruire les culturesvivantes avant de nettoyer ou de jeter lesrécipients. Il est par exemple possible de lesrecouvrir de produits désinfectants ou de les autoclaver dans des récipients appropriés.

Les avantages pour l’utilisateur

Les milieux de culture sur carton, aussi appelésNKS, sont utilisés avec succès depuis 20 ansdans la méthode avec membranes filtrantes. Ilssimplifient et facilitent de nombreux procédésd’examen microbiologique grâce à leur mani-pulation particulièrement aisée.

Les NKS sont des milieux stériles déshydratés.Pour les utiliser immédiatement, il suffit de les humidifier avec 3–3,5 ml d’eau stérile et déminéralisée.

Le taux d’humidité est optimal lorsqu’un excédent d’eau est visible autour du milieu de culture.

Tous les types de NKS sont vendus avec lesmembranes filtrantes correspondantes quisont également stériles et emballées indivi-duellement. Les membranes filtrantes, conçuespour répondre aux exigences spécifiques de lamise en évidence des germes, ont un diamètrede 47 ou 50 mm. Le paquet standard com-prend 100 milieux de culture sur carton (dixrangées de dix boites de Pétri contenantchacune un NKS stérile) et 100 membranesfiltrantes stériles en emballage individuel.

Economie

Finies les préparations de milieux • Une fois humidifiés avec 3,5 ml d’eau de culture (stérilisation, nettoyage, etc…) distillée, les NKS sont immédiatement longues et compliquées. prêts à l’emploi.

Manipulation aisée

Les NKS peuvent être utilisés dans les • N’importe quel opérateur peut utiliser laboratoires qui ne possèdent pas les NKS.d’équipement microbiologique complet. L’eau stérile pour l’humiditication est disponible sous forme d’unidoses prêtes à l’emploi.

Qualité constante

Au cours de la fabrication, les propriétés • Les NKS sont validés. Par rapport à l’agar favorisant la croissance de chaque lot dont la quantité et la hauteur peuvent de milieu de culture sur carton sont varier, les NKS fournissent toujours des comparées à l’agar correspondant. résultats constants.Cette procédure garantit une qualité constante et des résultats reproductibles.

Stockage

Les milieux de culture sur carton peuvent • Pas de gaspillage.être stockés pendant une période de 9 à 24 mois à température ambiante et dans un endroit sec et sans lumière.

Flexibilité

Les milieux de culture sur carton peuvent • Souplesse d’utilisation.être modifiés par des additifs mélangés à la solution d’imprégnation utilisée ; par exemple, des NKS moût ou sérum à l’orange imprégnés avec 5% d’éthanol favorisent la croissance de bactéries acétiques.

Procédure généraleAfin d’obtenir des résultats fiables lors descontrôles microbiologiques, il est nécessaire detravailler dans des conditions excluant toutecontamination provoquée par des micro-orga-nismes susceptibles de fausser les résultats.

C’est pourquoi vous devez travailler près de la flamme d’un bec Bunsen dans une pièceprotégée des courants d’air. Avant de com-mencer à travailler, il faut nettoyer la surfacede travail avec une solution désinfectante (par ex. alcool à 70°).

Avant l’emploi, il est nécessaire de stériliser les appareils de filtration, les pincettes et lesciseaux selon une des méthodes standard, par exemple à la flamme pour des travaux de routine.

Les milieux de culture sur carton (NKS)

Conseils d’utilisation

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Conseils d’utilisation des milieux de culture sur carton

Filtrer l’échantillon. Ensuite, rincer l’intérieur du support defiltre avec de l’eau stérile ou de l’eau salée physiologique.

Déposer le filtre sur le NKS en faisant attention qu’il n’y aitpas de bulles d’air.

Laisser les NKS incuber dans des boîtes de Pétri avec lecouvercle vers le haut.

Stériliser les pincettes à la flamme et les laisser légèrementrefroidir.

Retirer la membrane de son emballage. Mettre le filtre sur le fritté du support de filtre et jeter le papier jaune (pas représenté ici).

Stériliser à la flamme l’entonnoir en acier inoxydable. Stériliser le fritté à la flamme. Stériliser le couvercle et l’intérieur de l’entonnoir.

Désinfecter la surface de travail. Découper le sachet pour l’ouvrir et prendre le nombre demilieux de culture nécessaire.

Humidifier les NKS avec 3,5 ml d’eau stérile et distillée ou déminéralisée.

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Exemples d’applications

Produit Détection/Détermination de… Type de milieu de culture

Aliments Bactéries mésophiles Glucose tryptoneet sporulants thermophiles

Germes totaux Standard TTC, Standard, Caso

Entérobactéries Endo, Teepol, M-FC, Tergitol TTC, ECD, MacConkey, Chromocult

Levures et moisissures Moût, extrait de malt

Pseudomonas aeruginosa Cétrimide

Salmonelles Sulfite de bismuth

Staphylocoques Chapman

Streptocoques Azide

Bière Levures et moisissures Moût, extrait de malt

Levures sauvages Lysine

Pédiocoques et lactobacilles VLB-S7-S

Boissons non alcoolisées Bactéries lactiques VLB-S7-S, Sérum Orange

Bactéries favorisant les dépôts Wemanmucilagineux (leuconostoc)

Germes totaux Standard, Standard TTC

Germes acido-tolérants Sérum Orange

Levures et moisissures Moût, Schaufus-Pottinger, extrait de malt

Eau Germes totaux Standard TTC, Standard, R2A, extrait de levure

E. coli et coliformes Endo, Tergitol TTC, Teepol, M-FC, ECD


Streptocoques fécaux Azide

Lait E. coli et coliformes Endo

Salmonelles Sulfite de bismuth

Streptocoques Azide

Produits pharmaceutiques et cosmétiques Candida albicans Sabouraud

Germes totaux Caso, R2A

Entérobactéries MacConkey


Staphylococcus aureus Chapman

Streptocoques fécaux Azide

Sucre Bactéries favorisant les dépôts Weman mucilagineux (leuconostoc)

Bactéries mésophiles et sporulants Glucose tryptonethermophiles


Vin Acétobacter Moût, Sérum Orange, tous les deux imprégnés avec de l’éthanol à 3-5%

Bactéries lactiques Sérum Orange

Bactéries lactiques Jus de tomate(particulièrement leuconostoc oenos)


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Flore totale

Bacillus subtilis

Différentes colonies d’une eau de puits

Escherichia coli Staphylococcus aureus

Différentes colonies d’une eau de processDifférentes colonies d’eau de boisson

Description et exemples de résultats

NKS Standard TTCRéférence 14055

Milieu à l’extrait de viande et peptones, modi-fié par l’adjonction de TTC pour la numérationdes germes totaux, selon «Trinkwasser-VO» et«Standard Methods for the Examination ofWater and Wastewater» – 1998.

Membrane filtranteRéf. 13806 (0,45 micron ; verte quadrillée vert foncé)

Conditions d’incubation48 heures à 30°C. Suivant la nature del’échantillon, le temps d’incubation et latempérature peuvent varier.

InterprétationSur ce milieu de culture poussent en majoritédes bactéries. Les colonies réduisant le TTCsont colorées en rouge.

NKS StandardRéférence 14064

Milieu à l’extrait de viande et peptones pour la numération des germes totaux, selon«Standard Methods for the Examination ofWater and Wastewater» – 1998.


Conditions d’incubation48 heures à 30°C. Suivant la nature del’échantillon, le temps d’incubation ainsi que la température peuvent varier.

InterprétationSur ce milieu de culture poussent en majoritédes bactéries qui présentent des colonies deformes et de couleurs variées.

NKS-CasoRéférence 14063

Milieu à la peptone de caséine et soja pour la recherche et le dénombrement des germestotaux selon l’USP.


Conditions d’incubation24–72 heures à 30–37°C, suivant l’échantillonanalysé.

InterprétationEn fonction du but recherché, on pourrachanger le milieu de culture en remplaçant lasolution d’imprégnation par une solution à10% de sérum sur laquelle se développe touteune gamme de bactéries pathogènes, parexemple, des bactéries de la famille des Pneu-mococcus, Neisseria, Streptococcus, Coryne-bacterium, Erysipelothrix et Brucella.

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Escherichia coli

Différentes colonies d’eau de boisson

NKS R2ARéférence 14084

Milieu pour le dénombrement des germestotaux de micro-organismes hétérotrophes etpour la subculture de bactéries dans de l’eaude boisson, selon «Standard Methods for theExamination of Water and Wastewater» –1998. La croissance optimale pour des bacté-ries qui sont adaptées à des conditionsambiantes dans de l’eau extrêmement pauvreen substances nutritives.


Conditions d’incubation72 heures à 35°C ; 5 jours à 20°C ou à 28°C

InterprétationSur ce milieu de culture poussent en majoritédes colonies de bactéries de différentes tailles et de différentes couleurs, qui sonttoutefois surtout blanches ou incolores et d’un diamètre inférieur à 1 mm.

Escherichia coli

Différentes colonies d’eau de boisson

NKS Extrait de levureRéférence 14090

Milieu à l’extrait de levure et de peptone pourle dénombrement des germes totaux dansl’eau, selon «Trinkwasser VO» et EN ISO 6222.


Conditions d’incubation44 ±4 heures à 36 ±2°C ; 68 ±4 heures à 22 ±2°C selon EN ISO 6222

InterprétationDes bactéries, des levures et des moisissurespeuvent pousser sur ce milieu de culture.Comme il n’y a pas de colorant, la plupart descolonies, surtout les bactéries, sont incolores.

Escherichia coli

Différentes colonies d’eau de rivière

Flore totale E. coli et Coliformes

NKS ChromocultRéférence 14087

Milieu pour le dénombrement de coliformestotaux et de E. coli dans de l’eau et desdenrées alimentaires.

Membrane filtranteRéf. 13706 (0,45 micron ; blanche quadrillée noire)

Conditions d’incubation24 heures à 36 ±1°C ; une durée d’incubationplus longue gène le comptage des colonies

InterprétationE. coli pousse sous forme de colonies bleufoncé à violettes. Les coliformes forment descolonies roses-rouges. D’autres colonies gramnégatif sont incolores, quelques-unes avecune activité bêta-glucuronidase sont bleuclair à turquoise. Pour confirmer E. coli, il fautajouter une goutte de réactif d’Erlich Kovacssur les colonies bleu foncé à violettes. Lescolonies E. coli deviennent rouge cerise.

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E. coli et Coliformes

Escherichia coli

E. coli et Coliformes dans une eau de rivière

NKS-M-FCRéférence 14068

Met en évidence E. coli et les coliformesfécaux (dans des boîtes de Pétri ferméeshermétiquement) d’après Geldreich et al.,recommandé par «Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater» –1998.

Membrane filtranteRéf. 13906 (0,45 micron ; blanche quadrilléeverte)

Conditions d’incubation20 ±4 heures à 37°C dans l’étuve ou à 44,5°Cau bain-marie

InterprétationE. coli et coliformes fécaux poussent encolonies bleues d’un diamètre de 1–2 mm. Lescolonies d’une autre couleur ne seront pasprises en considération.

Escherichia coli

E. coli et Coliformes d’une eau résiduaire

Escherichia coli


NKS EndoRéférence 14053

Milieu sélectif pour la mise en évidence d’E. coli et des bactéries coliformes selon«Trinkwasser-VO» du 31.1.1975 et «StandardMethods for the Examination of Water and Wastewater» – 1998.


Conditions d’incubation24 heures à 37°C

InterprétationE. coli et coliformes se développent sousforme de colonies rouge sombre au contourfortement marqué. E. coli ont un éclat métal-lique vert châtoyant (reflet de la fuchsine). Au dos de la membrane filtrante, on voit un point rouge violacé. Pour un diagnosticparfait, il faudra soumettre les coloniesdouteuses à un examen biochimique plusapprofondi.

NKS-TeepolRéférence 14067

Mise en évidence d’E. coli et coliformesfécaux d’après Burman, N.P. (1967).


Conditions d’incubation18–24 heures à 37°C

InterprétationE. coli forme des colonies jaunes de 1 à 2 mmavec un halo jaune. Les bactéries qui ne fer-mentent pas le lactose ainsi que les germescoliformes se développent sous forme decolonies rouge foncé de différents diamètres.

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E. coli et Coliformes

NKS Tergitol TTCRéférence 14056

Met en évidence les bactéries coliformes et E. Coli d’après Pollard, modifié Chapman(ISO 9308-1).


Conditions d’incubation21 ±3 heures à 36°C ± 2°C ou44 ±4 heures à 36°C ± 2°C possibilité d’incubation à 44°C

InterprétationLes coliformes forment des colonies rougesavec ou sans halo jaune. Les colonies d’E. coliet Enterobacter aérogènes sont oranges àjaunes avec un halo jaune. Ce milieu empêchela prolifération des Proteus.

NKS-ECDRéférence 14082

Milieu de culture sélectif pour la détection et l’identification de E. coli.


Conditions d’incubation18 ± 24 heures à 37°C

InterprétationLes sels biliaires inhibent la croissance desgermes gram positif ou non adaptés au milieuintestinal. Les colonies d’E. coli fluorescent en bleu clair sous UV. La coloration rougeavec le réactif d’Erlich Kovacs donne laconfirmation (indole +) de la présence d’E. coli.

Escherichia coli


Escherichia coli

E. coli et Coliformes d’une eau de rivière

Escherichia coli

Colonies fluorescentes d’E. coli sous lampe UV

NKS-MAC CONKEYRéférence 14097

Pour l’isolement et la différenciation desentérobactéries d’après le DAB 10, EP II etl’USP XXV et le paragraphe 35 LMBG.


Conditions d’incubation18 ± 24 heures à 37°C

InterprétationE. coli pousse sous forme de grosses coloniesrouges à rougeâtres. Les coliformes apparais-sent sous forme de grosses colonies roses et visqueuses. Les entérobactéries lactosenégatif sont incolores. La prolifération des germes gram positif est fortement ralen-tie par la présence de sels biliaires et de cristal violet.

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Levures et moisissures

NKS MoûtRéférence 14058

Permet de mettre en évidence les levures etmoisissures selon la pharmacopée allemande.Ce milieu pourra être utilisé entre autres pourle contrôle de la qualité et de la productiondans l’industrie alimentaire, pharmaceutique et cosmétique.

Membrane filtranteRéf. 13005 (0,65 micron ; grise quadrilléeblanche)

Conditions d’incubation2–3 jours à 25°C

InterprétationLa plupart des levures forment des colonieslisses blanches ou légérement teintées. La plupart des moisissures forment des colo-nies veloutées ou cotonneuses, celles-ci sont blanches au début, puis peuvent prendre différentes couleurs après formationdes conidies.

NKS SabouraudRéférence 14069

Il permet la culture de levures et moisissures,bactéries acido-tolérantes et acidophiles. De plus, il met en évidence les levures etmoisissures dans les boissons et jus de fruits,lors du contrôle de stérilité en industriepharmaceutique, et lors de l’isolement deschampignons et des levures pathogènes de lapeau (USP XXV).


Conditions d’incubation2–5 jours à 25–30°C

InterprétationLa plupart des levures forment des colonieslisses, blanches ou colorées. La plupart desmoisissures forment des colonies veloutées ou cotonneuses.

NKS Schaufus-Pottingera) Référence 14070 c) Référence 14080b) Référence 14072 d) Référence 14083

Permet de mettre en évidence et de dénom-brer les levures et moisissures dans les boissons et les sirops, d’après Schaufus et Pottinger.

Membrane filtrantea) Réf. 13905 (0,65 micron ; blanche quadrillée verte)b) Réf. 13903 (1,2 micron ; blanche quadrilléeverte)c) Réf. 13004 (0,8 micron ; grise quadrilléeblanche)d) Réf. 13005 (0,65 micron ; grise quadrilléeblanche)


InterprétationLes moisissures se développent sous forme decolonies veloutées ou sous forme de tamponde ouate blanchâtre ou verdâtre qui, aprèsformation de conidies, peuvent prendredifférentes couleurs. Les levures et les coloniesbactériennes ont une surface lisse. La couleurdes bactéries qui fermentent le sucre et quifavorisent les dépots d’acide varie du blan-châtre au jaunâtre. En revanche, la couleurdes bactéries qui ne favorisent pas les dépotsd’acide varie du verdâtre au bleu verdâtre.

Saccharomyces cerevisiae

Levures et moisissures des bières dégradées

Alternaria humicola

Levures et moisissures d’un sirop pour la toux

Torula lipolytica

Différentes colonies provenant d’une limonade

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NKS AzideRéférence 14051

Met en évidence les entérocoques d’aprèsSlanetz et Bartley. Les entérocoques sont lesgermes indicateurs d’une contaminationd’origine fécale. Du fait qu’il sont moinssensibles aux produits chimiques qu’E. coli, ils sont détectables plus longtemps dans leseaux résiduaires et les eaux chlorées.



InterprétationLes entérocoques apparaissent sous forme de petites colonies (1 mm de diamètre) rougesà rouge marron et à bord lisse.

NKS Sulfite de bismuthRéférence 14057

Milieu de culture sélectif pour mettre en éviden-ce les salmonelles dans l’eau, dans les denréesalimentaires et dans la nourriture pour animauxd’après Wilson and Blair, recommandé par l’USP 25. Si une très légère contamination à lasalmonelle est suspectée, il est conseillé depréparer une culture enrichie avec du bouillonau sélénite ou au tétrathionate de potassium etensuite d’étaler (stries avec un ensemenceur)l’échantillon sur la membrane filtrante du NKS.

Membrane filtranteRéf. 13806 (0,45 micron ; verte quadrilléeverte)


InterprétationLa plupart des salmonelles forment des colo-nies légèrement colorées avec un centre mar-ron à noir entouré d’une auréole noire avec unreflet métallique («œil de poisson»). Certainesespèces de salmonelles se développent unifor-mément sous forme de colonies marron foncéà noires où l’auréole peut manquer.

Streptococcus faecalis

Streptocoques d’une eau résiduaire

Salmonella typhosa, stries

Salmonelles d’une eau résiduaire

NKS Extrait de maltRéférence 14086

Milieu pour la détermination des levures et des moisissures, recommandé par l’AOAC et l’APHA. Spécialement pour l’utilisationdans le secteur des boissons et des denrées alimentaires.


Conditions d’incubation2–3 jours à 25–30°C, ou modifié en fonctionde la détermination

InterprétationLes levures se développent habituellementsous forme de colonies blanches, rarementcolorées. Les moisissures forment générale-ment au début des colonies blanches velou-tées ou cotonneuses qui ensuite peuventprendre différentes couleurs après formationdes conidies. La faible valeur de pH empêchela croissance de bactéries.

Saccharomyces cerevisiae

Différentes colonies de Saccharomyces et de Rhodutorula


Levures et moisissures Contaminants fécaux

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Contaminants divers

NKS VLB-S7-SRéférence 14059

Permet de mettre en évidence les pédio-coques et lactobacilles pour le contrôlemicrobiologique en brasserie d’après Emeis,modifié Rinck et Wackerbauer.

Membrane filtranteRéf. 13906 (0,45 micron ; blanche quadrillée verte)

Conditions d’incubationAnaérobie (microaérophilie) 2–3 jours à25–28°C pour la mise en évidence rapide desmicrocolonies (dénombrement au micro-scope), 5–7 jours pour le développement decolonies macroscopiques.

InterprétationLes pédiocoques forment de petites coloniesrondes (1 mm de diamètre) à contour net et de couleur vert pâle. Les lactobacilles seprésentent sous forme de colonies vert clairau début puis vert foncé. Leur diamètre estd’environ 2 mm. Leur contour est irrégulier et frippé.

Lactobacillus pastorianus

Lactobacilles et pédiocoques provenant de sédiment, stries

NKS Sérum Orangea) Référence 14062b) Référence 14096 (pH 3,2)

Met en évidence les germes acido-tolérants,d’après «Methods for the MicrobiologicalExamination of Foods (1966) de l’APHA».


Conditions d’incubationEn aérobie ou anaérobie (microaérophilie), 2–3 jours à 25–28°C

InterprétationCe milieu permet de faire une culture spéci-fique des germes acido-tolérants telle que la microflore des jus de fruits. Les micro-organismes les plus fréquents sont les lacto-bacilles, Leuconostoc, Bacillus, levures et moisissures.

Rhodotorula spec.

Différentes colonies provenant d’un jus de fruit

NKS LysineRéférence 14061

Milieu sélectif pour la mise en évidence des«levures sauvages» en brasseries selon Morriset Eddy.


Conditions d’incubationEn aérobie, 2–5 jours à 25–28°C

InterprétationSeules les «levures sauvages» dégradant lalysine peuvent se développer sur ce milieu.Elles forment pour la plupart des coloniesblanches ou crème.

Torulopsis spec.

«Levures sauvages» de bière stockée

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Contaminants divers

NKS Jus de tomateRéférence 14079

Permet de mettre en évidence les bactéries(lactobacilles, leuconostoc, pédiocoques entreautres) causant l’altération du vin et des jusde fruits d’après Dubois, Bindan et Lafon-Lafourcade.


Conditions d’incubationMicrocérophilie 4–6 jours à 25–30°C (uncontrôle supplémentaire après 10 jours estnécessaire pour pouvoir également dénom-brer les bactéries qui se développent pluslentement).

InterprétationLes lactobacilles forment des colonies com-pactes, de couleur blanche à jaune pâle d’undiamètre de 1 à 3 mm. Les pédiocoques sontlégèrement plus petites d’environ 1 mm dediamètre, et de couleur blanchâtre à marronpâle. Leuconostoc oenos forme des coloniesincolores à blanches de diamètre inférieur à 1 mm.

Bactéries lactiques, stries

Leuconostoc oenos provenant de vin

NKS Glucose tryptoneRéférence 14066

Permet la recherche et le dénombrement desgermes mésophiles et thermophiles sporulantsdans les denrées alimentaires d’aprèsWilliams. On utilisera des boîtes de Petri her-métiquement closes. Ce milieu est recom-mandé par la NCA (National Canners Asso-ciation, USA 1956) et l’ICUMSA (InternationalCommission for Uniform Methods of Sugar,1974).

Membrane filtranteRéf. 13906 (0,45 micron ; banche quadrillée verte)

Conditions d’incubationGermes mésophiles : 2–3 jours à 28–30°C.Germes thermophiles sporulants : 1–2 jours à 55°C

InterprétationLes germes qui fermentent le glucose etforment de l’acide, se développent sous formede colonies jaunes à vertes. Les coloniestypiques «Flat sour» (Bacillus coagulans,Bacillus stearothermophilus) ont un diamètrede 2–5 mm, sont rondes avec un bord lisse, de couleur jaune verdâtre avec halo jaune.

NKS WemanRéférence 14065

Permet la recherche et le dénombrement descolonies de bactéries mésophiles favorisantles dépots mucilagineux, selon Wemann,modifié (Lorenz, S., 1961 : Zucker, 14).



InterprétationUne partie des colonies de bactéries méso-philes favorisant les dépots mucilagineux ontun diamètre supérieur à 5 mm, elles sontlisses, rondes et souvent incolores, transpa-rentes ou translucides.

Bacillus coagulans

Différentes colonies d’une conserve de légumes

Leuconostoc mesenteroides

Différentes colonies à partir d’un sirop de sucre

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Staphylococcus aureus

Différents types de staphylocoques

Pseudomonas aeruginosa

Différents types de Pseudomonas


Contaminants non fécaux

Chapman-NKSRéférence 14074

Milieu au mannitol-chlorure de sodium-rougede phénol qui met en évidence les staphylo-coques pathogènes dans les denrées alimen-taires et autres produits selon Chapman(1945), modifié. Recommandé par l’USP etl’APHA.

Membrane filtranteRéf. 13906 (0,45 micron ; blanche quadrillée verte)


InterprétationLes Staphylococcus aureus forment des colo-nies dont la couleur varie entre le jaune d’or et l’orange avec un halo jaune (mannitol positif). Les Staphylococcus epidermidisforment des colonies blanchâtres.

NKS CétrimideRéférence 14075

Permet la recherche et le dénombrement des Pseudomonas aeruginosa selon Lowbury(1951). Ce milieu suit les recommandations de l’USP et de l’APHA.

Membrane filtranteRéf. 13906 (0,45 micron ; banche quadrillée verte)


InterprétationLes Pseudomonas aeruginosa forment engénéral des colonies de couleur bleue de 1 à 2 mm de diamètre avec un halo bleu. Il arrive qu’il y ait des colonies bleu gris, jaunevert ou incolores. D’autres Pseudomonasforment des colonies blanchâtres.

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Les erreurs possibles

De mauvaises manipulations peuvent fausserles résultats.

1. Pousse inhibée, petites colonies : le disqueen carton n’a pas été suffisamment imbibé :le volume d’eau nécessaire à l’humidifica-tion du carton est insuffisant.

2. Colonies noyées : carton trop humidifié,film d’eau sur la membrane. Le volumed’eau est trop important sur le NKS. Les colonies de germes mobiles (Bacillus,Proteus, etc. …) s’écoulent souvent, même avec une humidification correcte. Un enrichissement en NaCl (émulsifiant)empêche ce phénomène.

3. Contamination par le bas : pousse descolonies inhibée, trouble de l’excédentd’eau, changement fréquent de couleur du disque en carton :

a) Face quadrillée posée vers le bas.

b) Non stérilité de la solution d’humidifi-cation.

c) Infection pendant la préparation (infec-tion par l’air ou par contact).

d) Contamination de la membrane filtrantepar des germes qui n’ont pas été totale-ment aspirés à la fin de la filtration ou àcause d’une boîte de Petri inclinée.

e) Support filtre non stérile.

f) Pinces brucelles non stériles.

4. Pousse partielle : position inclinée de laboîte de Pétri dans l’incubateur.

5. Répartition des germes sur la membranetrop dense ou trop faible (optimum entre20 et 200 germes par filtre) : mauvaisedilution ou mauvais choix de la quantité à filtrer.

6. Répartition non uniforme sur lamembrane : échantillon de moins de 5 mlfiltré sans addition d’un diluant ou mélangeinsuffisant avec le diluant stérile.

Membrane en mélange d’esters Membrane en mélange d’esters

Membrane Sartorius en nitrate de cellulose

Une variation trop importante dans la répartition de la taille des pores peut limiterl’apport en substances nutritives.

Croissance de E. coli sur NKS endo

E. coli ne présente pas de reflet métallique sur la membrane en mélange d’esters. Dans cecas, il est très difficile de faire la différenceentre E. coli et des coliformes sans tests supplémentaires. La couleur rouge du filtremontre que les colonies se répandent. Uneconclusion quantitative est difficile.

Comparaison de croissance

La taille des pores n’est pas uniquement uncritère significatif. Un essai comparatif de lamembrane en nitrate de cellulose avec unemembrane en mélange d’esters révèle desdifférences de croissance significatives.

Croissance de Pseudomonas aeruginosa sur NKS cétrimide

Les Pseudomonas se développent sous formede colonies bleues avec un halo bleu facile à reconnaître sur la membrane Sartorius ennitrate de cellulose. Sur la membrane enmélange d’esters, on constate qu’il y a moinsde colonies qui se forment et qu’en grandepartie elles n’ont pas de halo bleu. Une varia-tion trop importante dans la répartition de la taille des pores peut limiter l’apport ensubstances nutritives. Cela peut entraîner desrésultats faussement négatifs.

Membrane Sartorius en nitrate de cellulose

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Préfiltres en nitrate de celluloseLa membrane filtrante blanche Réf. 11301avec des pores de 8 µm sert de préfiltre lorsde recherches bactériologiques et est placéedans un accessoire spécial (Réf. 16807). Cettemembrane filtrante, qui retient les grossesparticules, laisse passer les micro-organismes.Ces derniers seront arrêtés par la membranefiltrante qui se trouve en dessous.

Pour la détection de bactéries dans desmilieux contenant des colorants.

Vous obtiendrez un contraste optimal pour lescolonies de bactéries claires ou transparenteslors du dénombrement des germes.

Mise en évidence de levures et de moisissures.

Membranes filtrantes pour l’utilisation sur milieux nutritifs gélosés ou sur NKS

Si, à la place des NKS, vous utilisez des milieuxgélosés ou des disques de carton à imbiberavec des milieux de culture liquides, nousvous recommandons de vous servir des typesde membranes suivants. Il ne doit évidem-ment pas y avoir de germes sur les mem-branes que vous utilisez. Vous pourrez donc,soit les faire bouillir, soit les autoclaver. Il estcependant plus facile et plus pratique de seservir de membranes pré-stérilisées et embal-lées individuellement (voir le tableau).

Taille des pores Couleur de la Couleur du Référence des membranes en emballage individuel stérile*membrane quadrillage Paquet de 100 unités Paquet de 1000 unités

0,45 µm blanche verte 13906-050 ACR**

0,45 µm verte vert foncé 13806-050 ACN** 13806-050 ACR**

0,45 µm verte blanche 13006-050 ACN** 13006-050 ACR**

0,65 µm grise blanche 13005-050 ACN** 13005-050 ACR

0,8 µm grise blanche 13004-050 ACN** –

8 µm blanche – 11301-050 ACN** –

* Egalement disponible en emballage, non stérile.Référence identique. Cependant : pour les paquets de 100, remplacer ACN par N, pour les paquets de 1000, remplacer ACR par R.

** Egalement disponible en diamètre 47 mm.

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Accessoires

Référence : 16757 MD8 AirPort pour le contrôle microbiologique de l’air

Référence : 16746 MD8 Airscan pour le contrôle microbiologique de l’air

Référence : 16671 Incubateur anaérobie

Référence : FDIEAUSTERI134N Eau stérile Référence : 17649 Stylo compteur de colonies Référence : 15410-47-ALR Cartons adsorbants

Référence : 16842 Rampe 3 postes en acier inoxydable16401-47-06-K Biosart 100

Référence : 16842 Rampe 3 postes en acier inoxydable16407—25-ALK Biosart 250

Référence : 16843 Rampe 6 postes en acier inoxydable

Référence : 16201 Support de filtre16692 Pompe à vide

Référence : 16612 Pompe à vide16610 Flacon de Woulff

Référence : 16807 Entonnoir en acier inoxydable avecdispositif de préfiltration

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Guide d’achat

* 1 = AFNORAssociation Française de Normalisation 2 = AOACAssociation of Official Analytical Chemists3 = APHAAmerican Public Health Association4 = BSBritish Standards5 = DABDeutsches Arzneibuch6 = DINDeutsches Institut für Normung7 = EBCEuropean Brewery Community8 = EPAEnvironmental Protection Agency

9 = EPEuropean Pharmacopeia10 = FDAFederal Drug Administration11 = ICUMSAInternational Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis12 = IDFInternational Dairy Federation13 = IFU14 = ISOInternational Standards Organisation15 = LMBGLebensmittel- und Bedarfsgegenstände-gesetz der Bundesrepublik Deutschland,Bundesgesundheitsamt

16 = MEBAKMitteleuropäische Brauereitechnische Analysenkommission17 = SMWWStandard Methods for the Examination of Water and Wastewater18 = USDAUS Department of Agriculture19 = USPUS Pharmacopeia20 = TVOVerordnung über Trinkwasser und über Wasser für Lebensmittelbetriebe

Type de NKS Référence Pour la détermination de… Types de membrane Références(Seuil de rétention,Couleur/quadrillage)

Azide 14051-47 N Entérocoques 0,45 µm, vert/vert *3, 20Caso 14063-47 N Dénombrement des germes totaux 0,45 µm, vert/vert *2, 3, 5, 9, 10, 12, 18, 19, 20Cétrimide 14075-47 N Pseudomonas aeruginosa 0,45 µm, vert/vert *5, 6, 9, 10, 19, 20Chapman 14074-47 N Staphylococcus aureaus 0,45 µm, blanc/vert *3, 10, 19Chromocult 14087-47 N E. coli et bactéries coliformes 0,45 µm, blanc/noirECD 14082-47 N Escherichia coli 0,45 µm, blanc/vert *3, 6, 15, 18Endo 14053-47 N Escherichia coli et coliformes 0,45 µm, blanc/vert *3, 14, 18Extrait de levure 14790-47 N Dénombrement des germes totaux 0,45 µm, vert/vert *3Extrait de malt 14086-47 N Levures et moisissures 0,8 µm, gris/blanc *2, 3, 13Glucose tryptone 14066-47 N Bactéries mésophiles et bactéries 0,45 µm, blanc/vert *2, 11, 13

thermophiles sporulantesJus de tomate 14079-47 N Bactéries causant une altération 0,45 µm vert/vertLysine 14061-47 N Levures sauvages 0,65 µm, vert/vertMac Conkey 14097-47 N Entérobactéries 0,45 µm, blanc/vert *2, 3, 5, 9, 15, 18, 19Moût 14058-47 N Levures et moisissures 0,65 µm, gris/blancM-FC 14068-47 N E. coli et bactéries coliformes 0,45 µm, blanc/vert *3, 10, 14, 18Sérum à l’orange 14062-47 N Micro-organismes acido-tolérants 0,45 µm, vert/vert *3, 13, 17Sérum à l’orange pH 3,2 14096-47 N Micro-organismes acido-tolérants 0,45 µm, vert/vertR2A 14084-47 N Dénombrement des germes totaux 0,45 µm, vert/vert *3, 9Sabouraud 14069-47 N Levures et moisissures 0,65 µm, gris/blanc *3, 9, 19, 20Schaufus Pottinger 14070-47 N Levures et moisissures 0,65 µm, blanc/vert *19

14072-47 N Levures et moisissures 1,2 µm, blanc/vert *1914080-50 N Levures et moisissures 0,8 µm, gris/blanc *1914083-47 N Levures et moisissures 0,65 µm, gris/blanc *19

Standard 14064-47 N Dénombrement des germes totaux 0,45 µm, vert/vert *3Standard TTC 14055-47 N Dénombrement des germes totaux 0,45 µm vert/vert *3Sulfite de bismuth 14057-47 N Salmonelles 0,45 µm, vert/vert *1, 2, 3, 6, 10, 12, 14, 18, 19, 20Teepol 14067-47 N E. coli et bactéries coliformes 0,45 µm, blanc/vert *1, 2, 4, 8, 10, 14, 18, 19Tergitol TTC 14056-47 N E. coli et bactéries coliformes 0,45 µm, blanc/vert *14, 20VLB-S7-S 14059-47 N Lactobacilles et pédiocoques 0,45 µm, vert/vert *7, 16Weman 14065-47 N Bactéries mucilagineuses 0,45 µm, vert/vert *11

Références NKS

Un paquet standard contient 100 milieux de culture sur carton stériles, 10 sachets de10 boîtes de Pétri, et 100 membranes enemballage individuel stérile.

Les milieux de culture sur carton sont desmilieux de culture déshydratés stériles d’undiamètre de 50 mm. Dès qu’ils sont humidifiésavec 3–3,5 ml d’eau stérile déminéralisée oudistillée, ils sont prêts à l’emploi.

Les membranes filtrantes sont conçues pourrépondre aux exigences particulières de ladétection microbiologique. Elles sont dispo-nibles avec un diamètre de 50 mm (voir tableauci-dessous) ou de 47 mm (même référence quepour 50 mm, mais remplacer 50N par 47N).

Sous réserve de modifications techniques. Imprimé en Allemagne sur papier non blanchi au chlore. W/sart-119a · GN° de publication : SM-4017-f03111Référence : 85030-519-46

Sartorius S.A.4, rue Emile Baudot91127 Palaiseau, France

Phone +33.1.69192100 Fax +33.1.69200922

www.sartorius.com

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