ADN proviral

Intégration

Transcription inverse

ARN viraux

Noyau

Traduction

des ARNm

Entrée

Assemblage

Bourgeonnement

Récepteur cellulaire

Phases précoces de l’infection

Phases tardives de l’infection

gag

pro-pol

env

5’ LTR 3’ LTRvif

vpr

R U5 tat

rev

nef

MA CA NC

PR RT INU3R

p6

SU TM

gag

pro-pol

env

vif

vpr

tat

rev

nef

MA CA NC

PR RT IN

p6

SU TMvpx

vpu

HIV-1

HIV-2, SIVsm, SIVmac

A

B

Figure 1: Structure génétique (A) et cycle réplicatif (B) des lentivirus. L'ARN génomique des lentivirus de primates est encadré par les LTR (long terminal repeat) et comprend les 3 gènes principaux gag, pro pol et env ainsi que les gènes régulateurs tat et rev et accessoires vif, vpr et nef. Certaines souches de lentivirus comme HIV-2, SIVsm (sooty mangabey) ou SIVmac (macaque) possèdent aussi le gène accessoire vpx.Le cycle réplicatif lentiviral débute par les phases précoces de l'infection: reconnaissance de la glycoprotéine d'enveloppe du virus avec le récepteur cellulaire, entrée du complexe nucléoprotéique dans le cytoplasme, tanscription inverse, import nucléaire de l'ADN proviral et intégration dans le génome cellulaire, puis les phases tardives permettent la transcription des ARN viraux et la traduction des protéines virales, leur assemblage et la formation de nouvelles particules virales libérées hors de la cellule.

PsiR

5’ LTR

R U5 PsiR

3’ LTR

U3R

vpx + vpr

vpr

vpr

vpx + vpr

vpr

Hu et al. 2003.

vpx + vpr

vpx + vpr

HIV-1 groupe O

HIV-1 groupe M

HIV-1 groupe N

Figure 2: Arbre phylogénétique des lentivirus de primates. (Hu et al 2003). Cet arbre a été construit par la méthode du maximum de vraisemblance à partir d'un fragment conservé du gène pol. Les lentivirus de primates actuellement connus sont divisés en 7 lignées (SIVsm/HIV-2, SIVagm, SIVcpz/HIV-1, SIVmnd, SIVdrl et SIVlhoest, le code de lettres minuscules indiquant l'espèce hôte) dont 4 possèdent le gène vpx (SIVsm/HIV-2, SIVrcm, SIVmnd et SIVdrl).

A

B

Figure 3: Vpx est nécessaire pour l'infection des cellules dendritiques humaines par SIV. Des cellules dendritiques (DCs) ou des macrophages humains ont été transduits par des vecteurs lentiviraux dérivés du SIV (A) ou du HIV-1 (B) dépourvus de gènes accessoires ou possédant la protéine accessoire Vpx du SIV (A) ou Vpr du HIV-1 (B) avec deux quantités de vecteurs (1x ou 10x) normalisés par leur contenu protéique. Le pourcentage de cellules transduites a été mesuré 3 jours plus tard par mesure de l'expression du gène rapporteur gfp apporté par les vecteurs viraux, par cytomérie de flux.

0,1

1

10

100

1x 10x

0,1

1

10

100

1x 10x

0,1

1

10

100

1x 10x

0,1

1

10

100

1x 10x

Cellules dendritiques Macrophages

HIV-1

+ Vpr- Vpr

SIVMAC

+ Vpx- Vpx

Cellules dendritiques Macrophages

% d

'infe

ctio

n%

d'in

fect

ion

VPX : VPX S I V MAC 1 MSDPRERI PP G NSGEETVGE A FEWLNRTVE EI NREAVNHL P RELI FQVWQ VPX S I V S M660 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - R VPX S I V S MPBJ 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - D—D- - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - R VPX SI V H U 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - - - D- - - A- - - - - - - - - - - - - - - VPX HI V2 ROD 1 - T- - - - TV- - - - - - - - - I - - - - A- - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - - - - - - VPX S I V R CM 1 - AERAPEV- T –AGEA- FGP. . . . - - RDML- KV- L- - RL- F HP- F- - RL- R VPX S I V MAC 51 RSWEYWHDEQ GMSQSYVKYR Y LCLI QKALF MHCKKGCRCL G EGHGAGGWR VPX S I V S M660 51 - - - - - - R- - M - - - E- - T-- - - - - - - - - - - - V- - - R- - - - - - - E- - - - - - - VPX S I V S MPBJ 51 - - - - - - - - - M - - - V- - T-- - - - - - - - - - M- - - - - - - - - - - - GE- - - - - - - VPX S I V H U 51 - - - - - - - G- M - - - E- - T-- - - - - - - - - - M- - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - VPX HI V2 ROD 51 - - - R- - - - - - - - - E- - T-- - - - - - - - - - VY - - VR- - - T- - - R- - - P- - - - VPX S I V R CM 47 TCV- H- - - VH - R- LEYAA- - - - L- M- - - - - I - - QT- - SQ. . . . . . . . . . R VPX S I V MAC 101 PGPPPPPP. . . . . . . PGLA VPX S I V S M660 101 S- - - - - - - . . . . . . . - - -- VPX S I V S MPBJ 101 - - - - - - - - . . . . . . . - - -- VPX S I V H U 101 S- - - - - - - . . . . . . . - - -- VPX HI V2 ROD 101 - - - - - - - - . . . . . . . - - - V VPX S I V R CM 87 H- - N- RAVGE R I TI L- - M.

VPR: VPR H I V1 NL43 1 M. EQ. . . . . . . . . . . . . APE D QGPQ. . . . . . . . . . . REPY N EWTLELLEE VPR H I V1 BCF 1 - . - - . . . . . . . . . . . . . -- - - - - - A. . . . . . . . . . . - - - F - - - - - - - - - - VPR S I V MAC 1 - E- R. . . . . . . . . . . . . P- - NE- - Q. . . . . . . . . . . - - - W D- - VV- V- - - VPR S I V A GM 1 - ASGGWLPPY G GDPPKDP- K NPREEI PGWL ETWDLP- - - F D- - LRDM- QD VPR H I V1 NL43 26 LKSEAVRHFP R I WLHNLGRH I YET. . . . YG DT. WAGVEAI I RI LQQLPFI VPR H I V1 BCF 26 - - T- - - - - - - - P- - MS- - QY - - D- . . . . - - - - . - V- - M- - - - - - - L- L- A VPR S I V MAC 27 - - E- - LK- - D PRL- TA- - N- - - NR. . . . H- - - . LE- AGEL - - - - - RALFM VPR S I V A GM 51 - N- - - QC- - - - NL- FR- WWN –V- EPAI DH- Q- RLE- WYKY C - - - - KAL- V VPR H I V1 NL43 71 HFRI GCRHSR I GV. . . . .. . . . . . TRQRRA RNGASR. . . . . . . . . VPR H I V1 BCF 71 - - - - - - Q- - - - - I . . . . .. . N PSN- - - - GR - - - S- - P. . . . . . . . VPR SI V MAC 72 - - - G- - N- - - - - G. . . PGGG NPLS- I PPS. . . . . . . . . . . . . . . . VPR S I V A GM 101 - MKGR- CKPK T HPAYGPGAG GP. . . . PPGL G. - - - GGAAS A APGL

Figure 4 : Alignement des protéines Vpx et des protéines Vpr des souches utilisées ( Vpx du SIVmac251, SIVsm660, SIVsmPBj, SIVhu, HIV-2ROD, SIVrcm, Vpr du HIV-1 NL4-3, HIV-1BCF, SIVmac251, SIVagm).

Virus original

gagpro-pol

env

LTR 5'

Gfp

Transfection des 3 ADNs

Transduction

LTR 3'

PsipCMV

gène rapporteur LTR 5' LTR 3'pCMV VSV-G gag pro-pol

pCMV

Vecteur Enveloppe

eGFP

Vecteur auxiliaire

Lentivecteur

Cellule productrice du vecteur

A

B

Figure 5: Principe des lentivecteurs. A: La séquence du génome viral est répartie sur 3 plamides différents: l'un joue le rôle de génome et comporte les séquences cis permettant sa mobilisation, ainsi qu'une casette contenant un gène rapporteur (ici l'eGFP: enhanced Green Fluorescent Protein) sous le contrôle du promoteur CMV. Un deuxième plasmide contient un gène d'enveloppe (ici la protéine G du VSV permettant un large tropisme cellulaire). Enfin un troisième plasmide code les gènes gag et pro-pol des protéines de structure et des enzymes virales respectivement.B: La transfection de ces 3 plasmides dans une lignée cellulaire productrice de vecteurs permet la formation de particules contenant toutes les protéines virales présentes chez le virus sauvage alors que le génome encapsidé ne code que le gène rappoteur. Les cellules cibles transduites par les vecteurs produits expriment donc uniquement le gène rapporteur.

Cellule cible

Plasmides

Expression du transgène

Lentivecteur

Vecteur

Enveloppe

Vecteur auxiliaire

Mesure de la GFP.Calcul du nombre de particules infectieuses par ml de préparation.

vpx

cellule 293T

1. Transfection 3. Normalisation des vecteurs par titre infectieux

cellule HeLaP4

2. Purification des vecteurs produits sur double coussin de sucrose

génome

enveloppe pantropique VSV-G

gag pol

DCMonocyte

IL-4GM-CSF

4 jours

4. Transduction des DCs à MOI 5

Mesure de la GFP

Figure 6: Représentation schématique des étapes de la production des lentivecteurs et de la transduction des DCs. Les plasmides sont cotransfectés dans des cellules 293T. Deux jours plus tard le surnageant des cellules est centrifugé sur double coussin de sucrose afin de purifier les lentivecteurs produits. Les lentivecteurs sont ensuite titrés sur cellules HeLaP4 puis normalisés par titre infectieux pour transduire des DCs différenciées à partir de monocytes du sang cultivés 4 jours en présence d'IL4 et de GM-CSF à une MOI (multiplicity of infection ou nombre de particules infectieuses par cellule cible) déterminée.

Plasmides

Tableau 1: ADNs utilisés pour le clonage des gènes vpx des souches SIVsmBPj, SIVsm660, SIVhu, SIVrcm, HIV-2

ROD et des gènes vpr des souches SIVagm et HIV-1bcf. Une PCR a été réalisée avec chaque couple d'amorce sur une

matrice d'ADN proviral plasmidique lorsqu'il était disponible ou d'ADN obtenu après transcription inverse de l'ARN viral. Les produits de PCR ont ensuite été digérés par les couples d'enzymes correspondants et introduits dans le plasmide pcDNA3+ (Invitrogen). La séquence de chacun des gènes amplifiés a été vérifiée.

Amorce SéquenceSite de

restrictionsens GCGCGAATTCACCATGTCAGATCCCAGAGAGAG EcoRI

antisens CGCGCTCGAGTTATGCTAGTCCTGGAGGGG XhoIvpx SIVrcm sens GCGCGAATTCACCATGGCAGAAAGAGCCCCCG EcoRI

antisens CGCGCTCGAGTTACATCCCCGGTAGGATGG XhoIvpx HIV-2 sens GCGCGAATTCACCATGACAGACCCCAGAGAGAC EcoRI

antisens TTGGCTCGAG TTAGACCAGA CCTGGAGG XhoIvpr SIVagm sens GCGCGGTACCATGGCCTCAGGAGGGTGGC KpnI

antisens CGCGCTCGAGTCACAGGCCTGGAGCGGCCG XhoIvpr HIV-1bcf sens GCGCGAATTCACCATGGAACAAGCACCTGAGG EcoRI

antisens CGCGCTCGAGTCAGGGTCTACTGGATCCATTTC XhoI

vpx SIVsmPBj, vpx SIVsm660, vpx SIVhu

64,248,837,1

19,4

25,9

14,8

aucu

n V

px

Vpx

SIV

mac

Vpx

SIV

sm66

0

Vpx

SIV

sm P

Bj

Vpx

SIV

hu

Vpx

HIV

-2

Vpx

SIV

rcm

Figure 7: Restauration dela transduction des DCs par un vecteur SIVmac en présence de Vpx ou Vpr de différentes souches de lentivirus. Des DCs humaines ont été transduites à une MOI de 5 par des vecteurs SIVmac minimaux auquels ont été apportés en trans l'un des Vpx (A) ou des Vpr (B) des souches de lentivirus indiquées. Dans les deux cas un contrôle a été réalisé avec un vecteur SIVmac minimal. Le pourcentage de restauration de la transduction des DCs est indiqué pour chaque Vpx, par rapport à Vpx de SIVmac servant de référence.B et D: Analyse de l'incorporation des Vpx (B) ou Vpr (D) dans les particules virales SIVmac par empreinte western réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par rest d'activité transcriptase inverse exogène. Les anticoprs utilisés sont dirigés contre la protéine p27 de la capside (CA) du SIVmac, contre Vpx du HIV-2 (B) ou contre Vpr du HIV-1 (D).

BA

Vpx

CD

CA

kDa

37,1

19,4

25,9

14,8

kDaau

cun

Vpr

Vpr

SIV

mac

Vpr

SIV

agm

CA

aucu

n V

px

Vpx

SIV

mac

Vpx

SIV

sm66

0

Vpx

SIV

sm P

Bj

Vpx

SIV

hu

Vpx

HIV

-2

Vpx

SIV

rcm

aucu

n V

pr

Vpr

SIV

mac

Vpr

SIV

agm

Vpx

SIV

mac

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% de restauration de la transduction des DCs

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% de restauration de la transduction des DCs

HIV

-2 s

auva

ge

HIV-2 délété

aucu

n V

px

Vpx

HIV

-2

Vpx

SIV

mac

Figure 8: Défaut de transduction des DCs humaines par un vecteur HIV-2 délété et restauration de la transduction par l'apport de Vpx du SIVmac. Des DCs humaines ont été transduites à des MOI de 5 ou 25 par un lentivecteur HIV-2 contenant tous les gènes accessoires (A, HIV-2 sauvage), ou possédant une délétion touchant vpx et vif (A, HIV-2 délété, aucun Vpx), auquel ont été apportées en trans les protéines Vpx du HIV-2 ou du SIVmac. (B) Une empreinte western a été réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par titre infectieux sur cellules HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un anticorps dirigé contre Vpx du HIV-2.

37,1

25,919,4

14,8

HIV

-2 s

auva

ge

aucun Vpx

VpxHIV-2

VpxSIVmac

HIV-2 délété

CA

Vpx

BA

0,1

1

10

100

% de transduction des DCs

MOI 5MOI 25

Figure 9: Le vecteur HIV-1MVP

peut trasduire les DCs sans gène accessoire. A: Des DCs humaines ont été

transduites à des MOI de 5 ou 25 par les lentivecteurs minimaux HIV-1 8.91 ou HIV-1MVP

auquel a pu être

apporté en trans la protéine Vpr du HIV-1BCF

, appartenant comme HIV-1MVP

au groupe O du HIV-1. B: Une

empreinte western a été réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par titre infectieux sur cellules HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un anticorps dirigé contre Vpr du HIV-1.

aucu

n V

pr

Vpr

HIV

-1B

CF

HIV-1MVP

HIV-1 8.91

aucu

n V

pr

Vpr

HIV

-1

bcf

HIV-1MVP

64,248,837,1

19,4

25,9

14,8

kDa

82,2

CA

A B

0,1

1

10

100

% de transduction des DCs

MOI 5MOI 25