ADN proviral
Intégration
Transcription inverse
ARN viraux
Noyau
Traduction
des ARNm
Entrée
Assemblage
Bourgeonnement
Récepteur cellulaire
Phases précoces de l’infection
Phases tardives de l’infection
gag
pro-pol
env
5’ LTR 3’ LTRvif
vpr
R U5 tat
rev
nef
MA CA NC
PR RT INU3R
p6
SU TM
gag
pro-pol
env
vif
vpr
tat
rev
nef
MA CA NC
PR RT IN
p6
SU TMvpx
vpu
HIV-1
HIV-2, SIVsm, SIVmac
A
B
Figure 1: Structure génétique (A) et cycle réplicatif (B) des lentivirus. L'ARN génomique des lentivirus de primates est encadré par les LTR (long terminal repeat) et comprend les 3 gènes principaux gag, pro pol et env ainsi que les gènes régulateurs tat et rev et accessoires vif, vpr et nef. Certaines souches de lentivirus comme HIV-2, SIVsm (sooty mangabey) ou SIVmac (macaque) possèdent aussi le gène accessoire vpx.Le cycle réplicatif lentiviral débute par les phases précoces de l'infection: reconnaissance de la glycoprotéine d'enveloppe du virus avec le récepteur cellulaire, entrée du complexe nucléoprotéique dans le cytoplasme, tanscription inverse, import nucléaire de l'ADN proviral et intégration dans le génome cellulaire, puis les phases tardives permettent la transcription des ARN viraux et la traduction des protéines virales, leur assemblage et la formation de nouvelles particules virales libérées hors de la cellule.
PsiR
5’ LTR
R U5 PsiR
3’ LTR
U3R
vpx + vpr
vpr
vpr
vpx + vpr
vpr
Hu et al. 2003.
vpx + vpr
vpx + vpr
HIV-1 groupe O
HIV-1 groupe M
HIV-1 groupe N
Figure 2: Arbre phylogénétique des lentivirus de primates. (Hu et al 2003). Cet arbre a été construit par la méthode du maximum de vraisemblance à partir d'un fragment conservé du gène pol. Les lentivirus de primates actuellement connus sont divisés en 7 lignées (SIVsm/HIV-2, SIVagm, SIVcpz/HIV-1, SIVmnd, SIVdrl et SIVlhoest, le code de lettres minuscules indiquant l'espèce hôte) dont 4 possèdent le gène vpx (SIVsm/HIV-2, SIVrcm, SIVmnd et SIVdrl).
A
B
Figure 3: Vpx est nécessaire pour l'infection des cellules dendritiques humaines par SIV. Des cellules dendritiques (DCs) ou des macrophages humains ont été transduits par des vecteurs lentiviraux dérivés du SIV (A) ou du HIV-1 (B) dépourvus de gènes accessoires ou possédant la protéine accessoire Vpx du SIV (A) ou Vpr du HIV-1 (B) avec deux quantités de vecteurs (1x ou 10x) normalisés par leur contenu protéique. Le pourcentage de cellules transduites a été mesuré 3 jours plus tard par mesure de l'expression du gène rapporteur gfp apporté par les vecteurs viraux, par cytomérie de flux.
0,1
1
10
100
1x 10x
0,1
1
10
100
1x 10x
0,1
1
10
100
1x 10x
0,1
1
10
100
1x 10x
Cellules dendritiques Macrophages
HIV-1
+ Vpr- Vpr
SIVMAC
+ Vpx- Vpx
Cellules dendritiques Macrophages
% d
'infe
ctio
n%
d'in
fect
ion
VPX : VPX S I V MAC 1 MSDPRERI PP G NSGEETVGE A FEWLNRTVE EI NREAVNHL P RELI FQVWQ VPX S I V S M660 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - R VPX S I V S MPBJ 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - D—D- - - - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - R VPX SI V H U 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - I - - - - - - - - - - - - D- - - A- - - - - - - - - - - - - - - VPX HI V2 ROD 1 - T- - - - TV- - - - - - - - - I - - - - A- - - - - - - A- - - - - - - - - - - - - - - - - - - VPX S I V R CM 1 - AERAPEV- T –AGEA- FGP. . . . - - RDML- KV- L- - RL- F HP- F- - RL- R VPX S I V MAC 51 RSWEYWHDEQ GMSQSYVKYR Y LCLI QKALF MHCKKGCRCL G EGHGAGGWR VPX S I V S M660 51 - - - - - - R- - M - - - E- - T-- - - - - - - - - - - - V- - - R- - - - - - - E- - - - - - - VPX S I V S MPBJ 51 - - - - - - - - - M - - - V- - T-- - - - - - - - - - M- - - - - - - - - - - - GE- - - - - - - VPX S I V H U 51 - - - - - - - G- M - - - E- - T-- - - - - - - - - - M- - - - - - - - - - - - - - - - V- - - - VPX HI V2 ROD 51 - - - R- - - - - - - - - E- - T-- - - - - - - - - - VY - - VR- - - T- - - R- - - P- - - - VPX S I V R CM 47 TCV- H- - - VH - R- LEYAA- - - - L- M- - - - - I - - QT- - SQ. . . . . . . . . . R VPX S I V MAC 101 PGPPPPPP. . . . . . . PGLA VPX S I V S M660 101 S- - - - - - - . . . . . . . - - -- VPX S I V S MPBJ 101 - - - - - - - - . . . . . . . - - -- VPX S I V H U 101 S- - - - - - - . . . . . . . - - -- VPX HI V2 ROD 101 - - - - - - - - . . . . . . . - - - V VPX S I V R CM 87 H- - N- RAVGE R I TI L- - M.
VPR: VPR H I V1 NL43 1 M. EQ. . . . . . . . . . . . . APE D QGPQ. . . . . . . . . . . REPY N EWTLELLEE VPR H I V1 BCF 1 - . - - . . . . . . . . . . . . . -- - - - - - A. . . . . . . . . . . - - - F - - - - - - - - - - VPR S I V MAC 1 - E- R. . . . . . . . . . . . . P- - NE- - Q. . . . . . . . . . . - - - W D- - VV- V- - - VPR S I V A GM 1 - ASGGWLPPY G GDPPKDP- K NPREEI PGWL ETWDLP- - - F D- - LRDM- QD VPR H I V1 NL43 26 LKSEAVRHFP R I WLHNLGRH I YET. . . . YG DT. WAGVEAI I RI LQQLPFI VPR H I V1 BCF 26 - - T- - - - - - - - P- - MS- - QY - - D- . . . . - - - - . - V- - M- - - - - - - L- L- A VPR S I V MAC 27 - - E- - LK- - D PRL- TA- - N- - - NR. . . . H- - - . LE- AGEL - - - - - RALFM VPR S I V A GM 51 - N- - - QC- - - - NL- FR- WWN –V- EPAI DH- Q- RLE- WYKY C - - - - KAL- V VPR H I V1 NL43 71 HFRI GCRHSR I GV. . . . .. . . . . . TRQRRA RNGASR. . . . . . . . . VPR H I V1 BCF 71 - - - - - - Q- - - - - I . . . . .. . N PSN- - - - GR - - - S- - P. . . . . . . . VPR SI V MAC 72 - - - G- - N- - - - - G. . . PGGG NPLS- I PPS. . . . . . . . . . . . . . . . VPR S I V A GM 101 - MKGR- CKPK T HPAYGPGAG GP. . . . PPGL G. - - - GGAAS A APGL
Figure 4 : Alignement des protéines Vpx et des protéines Vpr des souches utilisées ( Vpx du SIVmac251, SIVsm660, SIVsmPBj, SIVhu, HIV-2ROD, SIVrcm, Vpr du HIV-1 NL4-3, HIV-1BCF, SIVmac251, SIVagm).
Virus original
gagpro-pol
env
LTR 5'
Gfp
Transfection des 3 ADNs
Transduction
LTR 3'
PsipCMV
gène rapporteur LTR 5' LTR 3'pCMV VSV-G gag pro-pol
pCMV
Vecteur Enveloppe
eGFP
Vecteur auxiliaire
Lentivecteur
Cellule productrice du vecteur
A
B
Figure 5: Principe des lentivecteurs. A: La séquence du génome viral est répartie sur 3 plamides différents: l'un joue le rôle de génome et comporte les séquences cis permettant sa mobilisation, ainsi qu'une casette contenant un gène rapporteur (ici l'eGFP: enhanced Green Fluorescent Protein) sous le contrôle du promoteur CMV. Un deuxième plasmide contient un gène d'enveloppe (ici la protéine G du VSV permettant un large tropisme cellulaire). Enfin un troisième plasmide code les gènes gag et pro-pol des protéines de structure et des enzymes virales respectivement.B: La transfection de ces 3 plasmides dans une lignée cellulaire productrice de vecteurs permet la formation de particules contenant toutes les protéines virales présentes chez le virus sauvage alors que le génome encapsidé ne code que le gène rappoteur. Les cellules cibles transduites par les vecteurs produits expriment donc uniquement le gène rapporteur.
Cellule cible
Plasmides
Expression du transgène
Lentivecteur
Vecteur
Enveloppe
Vecteur auxiliaire
Mesure de la GFP.Calcul du nombre de particules infectieuses par ml de préparation.
vpx
cellule 293T
1. Transfection 3. Normalisation des vecteurs par titre infectieux
cellule HeLaP4
2. Purification des vecteurs produits sur double coussin de sucrose
génome
enveloppe pantropique VSV-G
gag pol
DCMonocyte
IL-4GM-CSF
4 jours
4. Transduction des DCs à MOI 5
Mesure de la GFP
Figure 6: Représentation schématique des étapes de la production des lentivecteurs et de la transduction des DCs. Les plasmides sont cotransfectés dans des cellules 293T. Deux jours plus tard le surnageant des cellules est centrifugé sur double coussin de sucrose afin de purifier les lentivecteurs produits. Les lentivecteurs sont ensuite titrés sur cellules HeLaP4 puis normalisés par titre infectieux pour transduire des DCs différenciées à partir de monocytes du sang cultivés 4 jours en présence d'IL4 et de GM-CSF à une MOI (multiplicity of infection ou nombre de particules infectieuses par cellule cible) déterminée.
Plasmides
Tableau 1: ADNs utilisés pour le clonage des gènes vpx des souches SIVsmBPj, SIVsm660, SIVhu, SIVrcm, HIV-2
ROD et des gènes vpr des souches SIVagm et HIV-1bcf. Une PCR a été réalisée avec chaque couple d'amorce sur une
matrice d'ADN proviral plasmidique lorsqu'il était disponible ou d'ADN obtenu après transcription inverse de l'ARN viral. Les produits de PCR ont ensuite été digérés par les couples d'enzymes correspondants et introduits dans le plasmide pcDNA3+ (Invitrogen). La séquence de chacun des gènes amplifiés a été vérifiée.
Amorce SéquenceSite de
restrictionsens GCGCGAATTCACCATGTCAGATCCCAGAGAGAG EcoRI
antisens CGCGCTCGAGTTATGCTAGTCCTGGAGGGG XhoIvpx SIVrcm sens GCGCGAATTCACCATGGCAGAAAGAGCCCCCG EcoRI
antisens CGCGCTCGAGTTACATCCCCGGTAGGATGG XhoIvpx HIV-2 sens GCGCGAATTCACCATGACAGACCCCAGAGAGAC EcoRI
antisens TTGGCTCGAG TTAGACCAGA CCTGGAGG XhoIvpr SIVagm sens GCGCGGTACCATGGCCTCAGGAGGGTGGC KpnI
antisens CGCGCTCGAGTCACAGGCCTGGAGCGGCCG XhoIvpr HIV-1bcf sens GCGCGAATTCACCATGGAACAAGCACCTGAGG EcoRI
antisens CGCGCTCGAGTCAGGGTCTACTGGATCCATTTC XhoI
vpx SIVsmPBj, vpx SIVsm660, vpx SIVhu
64,248,837,1
19,4
25,9
14,8
aucu
n V
px
Vpx
SIV
mac
Vpx
SIV
sm66
0
Vpx
SIV
sm P
Bj
Vpx
SIV
hu
Vpx
HIV
-2
Vpx
SIV
rcm
Figure 7: Restauration dela transduction des DCs par un vecteur SIVmac en présence de Vpx ou Vpr de différentes souches de lentivirus. Des DCs humaines ont été transduites à une MOI de 5 par des vecteurs SIVmac minimaux auquels ont été apportés en trans l'un des Vpx (A) ou des Vpr (B) des souches de lentivirus indiquées. Dans les deux cas un contrôle a été réalisé avec un vecteur SIVmac minimal. Le pourcentage de restauration de la transduction des DCs est indiqué pour chaque Vpx, par rapport à Vpx de SIVmac servant de référence.B et D: Analyse de l'incorporation des Vpx (B) ou Vpr (D) dans les particules virales SIVmac par empreinte western réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par rest d'activité transcriptase inverse exogène. Les anticoprs utilisés sont dirigés contre la protéine p27 de la capside (CA) du SIVmac, contre Vpx du HIV-2 (B) ou contre Vpr du HIV-1 (D).
BA
Vpx
CD
CA
kDa
37,1
19,4
25,9
14,8
kDaau
cun
Vpr
Vpr
SIV
mac
Vpr
SIV
agm
CA
aucu
n V
px
Vpx
SIV
mac
Vpx
SIV
sm66
0
Vpx
SIV
sm P
Bj
Vpx
SIV
hu
Vpx
HIV
-2
Vpx
SIV
rcm
aucu
n V
pr
Vpr
SIV
mac
Vpr
SIV
agm
Vpx
SIV
mac
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de restauration de la transduction des DCs
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de restauration de la transduction des DCs
HIV
-2 s
auva
ge
HIV-2 délété
aucu
n V
px
Vpx
HIV
-2
Vpx
SIV
mac
Figure 8: Défaut de transduction des DCs humaines par un vecteur HIV-2 délété et restauration de la transduction par l'apport de Vpx du SIVmac. Des DCs humaines ont été transduites à des MOI de 5 ou 25 par un lentivecteur HIV-2 contenant tous les gènes accessoires (A, HIV-2 sauvage), ou possédant une délétion touchant vpx et vif (A, HIV-2 délété, aucun Vpx), auquel ont été apportées en trans les protéines Vpx du HIV-2 ou du SIVmac. (B) Une empreinte western a été réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par titre infectieux sur cellules HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un anticorps dirigé contre Vpx du HIV-2.
37,1
25,919,4
14,8
HIV
-2 s
auva
ge
aucun Vpx
VpxHIV-2
VpxSIVmac
HIV-2 délété
CA
Vpx
BA
0,1
1
10
100
% de transduction des DCs
MOI 5MOI 25
Figure 9: Le vecteur HIV-1MVP
peut trasduire les DCs sans gène accessoire. A: Des DCs humaines ont été
transduites à des MOI de 5 ou 25 par les lentivecteurs minimaux HIV-1 8.91 ou HIV-1MVP
auquel a pu être
apporté en trans la protéine Vpr du HIV-1BCF
, appartenant comme HIV-1MVP
au groupe O du HIV-1. B: Une
empreinte western a été réalisée sur des quantitées de lentivecteurs normalisées par titre infectieux sur cellules HeLaP4, avec un anticorps dirigé contre la protéine p27 de la capside (CA) de SIV et un anticorps dirigé contre Vpr du HIV-1.
aucu
n V
pr
Vpr
HIV
-1B
CF
HIV-1MVP
HIV-1 8.91
aucu
n V
pr
Vpr
HIV
-1
bcf
HIV-1MVP
64,248,837,1
19,4
25,9
14,8
kDa
82,2
CA
A B
0,1
1
10
100
% de transduction des DCs
MOI 5MOI 25
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