Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes

Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand

3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie

Université de Rouen- Maison de l’université3 et 4 Juin 2004

Le Cryo-SEM en qqes mots:• SEM classique (Philips SEM 505)• Étage cryogénique T < -80°C (Hexland CT 100)

– Observation – Métallisation

• En dessous du point de sublimation de la glace• Observation d’échantillons hydratés mais congelés

• Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation (méthode directe)

Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal

Photos: C BodetÉpiderme d’une feuille

Photos: C BodetCoupe d’une feuille (cryo-fracture)

Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal

Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal

Anatomie d’une aiguille de Pin

Circulation des sèves dans l’arbre

CO2

Sève élaboréeRiche en sucresDescendantePhloème

H2O

Sève bruteEauAscendanteXylème

Croissancede l’arbre

Deux phénomènes à mettre en évidence

Présence de bulles d’air dans les vaisseaux

conducteurs (embolie) NormalCollapsé

Déformation de la paroi des vaisseaux (collapse)

From: Piquemal et al 1998

Observation du xylème au SEMÉchantillons prélevés et déshydratés

Observation du xylème au cryo-SEMRisques de sublimation de la glace

(cryo-décapage ou métallisation)

Betula platyphylla, Utsumi et al 1998

Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons prélevés puis congelés

LN2

Cryo-fracture

Cryo-microtome

La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point d’observation

No

mb

re d

e v

ais

seau

x e

mb

olis

és

Distance à la coupemillimètres

Pétiole de Noyer

Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.

Circulation de la sève bruteÉvaporation

Sol : Eau diluée

Xylème: Tubes Parois rigides

Feuilles: Surface poreuse

Feuilles :Pompe

aspirante

Un système vasculaire sous tension (dépression)

Sol : Eau diluée

• La sève brute est aspirée par dépression

• La « pompe aspirante » se désamorce

• L’appareil vasculaire s’embolise

Photo: C Bodet, INRA-PIAF

L’appareil vasculaire est constitué de conduits de dimensions

variables mais finies

vaisseau

Terminaison de vaisseau

La sève se retire sur toute la longueur des vaisseaux

Perturbation du contenu des vaisseaux lors du prélèvement des échantillons

Cochard et al Plant Physiol 2000

Cryo-SEM

LN2

Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés

Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés

-0.7 MPa

10 µ

m

>-0.03 MPa!

-0.7 MPa

Le paradoxe du Cryo-SEM

Les mesures de tension de sève sont-elles erronées ?

Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?

Cryo-SEM

LN2

Importance du mode préparatoire des échantillons

Water

Échantillons recoupés sous eau puis congelés

Solar Time

0 6 12 18 24 30 36 42 48

0

5

10

15

20

25

30

Solar Time

0 6 12 18 24 30 36 42 48

0

5

10

15

20

25

30

0

5

10

15

20

25

30

Per

cent

em

bolis

ed v

esse

ls

Per

cent

loss

con

duct

ance

Water

LN2

+

Variations journalières d’embolie dans un pétiole de noyer

Vitesse de congélation des échantillons par LN2

LN2

T,°C

Artéfact de congélation

Collapsus des Collapsus des paroisparois

Étude des phénomènes de collapse

LN2Cochard et al, Plant Physiol 2004

Mise en évidence du phénomène de collapse par cryo-SEM dans des

aiguilles de Pinus cembra

Aiguille bien hydratée

Pinus cembra -4 MPa

Aiguille fortement déshydratée

Pinus cembra -4.6 MPa

Aiguille très fortement déshydratée

Eau 2 min

Importance du mode préparatoire des échantillons

LN2

LN2

Conclusions

• Pour le xylème: la fiabilité des observations est très dépendante de la préparation des échantillons.

• Possibilités d’artéfacts et d’interprétations erronées des observations.– Embolie : recouper sous eau– Collapse : ne pas recouper sous eau !

• Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation ?