1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR...

3Chapitre

Les objectifs du programme

Pour approfondir les méthodes de dénombrement vues en classe de première, l’étude visera les caractéristiques essentielles des différentes méthodes de dénombrement et les paramètres qui les différencient.A

CTI

VIT

ÉS

CO

UR

S 1. Dénombrement après filtration sur membrane 56

2. Dénombrement en milieu liquide 58

3. Dénombrement en milieu solide (masse, surface) 60

4. Dénombrement par observation directe 65

N°1 Diagnostic d’une infection urinaire 68

N°2 Dénombrement des E. coli dans une préparation à base de viande 71

N°3 Dénombrement des entérocoques dans une eau 73

N°1 La filtration d’un liquide 76

FIC

HE

TEC

HN

IQU

E

Dénombrement d’une flored’un produit microbien

56

Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceu-tiques buvables ou injectables...), les micro-organismes sont à une concentration très faible (voire nulle si le pro-duit est stérile). Leur dénombrement (rendu en UFC par unité de volume) impose donc de « concentrer les micro-organismes » pour pouvoir compter des colonies. Cette « concentration » se fait grâce à la filtration d’un grand volume de produit sur une membrane retenant les micro-organismes.

1.1. Matériel nécessaireLes différentes étapes d’un dénombrement par une tech-nique de filtration nécessitent l’utilisation d’un matériel spécifique.

1.1.1. Une membrane filtranteLa membrane filtrante (document 1 ) a des pores d’un diamètre de 0,45 �m dont la disposition selon un ré- �m dont la disposition selon un ré- dont la disposition selon un ré-seau en trois dimensions permet de retenir à sa surface les bactéries. En effet le diamètre des pores du filtre est inférieur à celui des bactéries classiquement rencontrées.Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 �m pour retenir les bactéries les plus petites, des bacilles très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage de la membrane de 0,45 �m (cas de Pseudomonas aeruginosa) ou encore des spores.

Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

Le terme « dénombrement d’une flore » signifie que l’analyse microbiologique doit permettre de quanti-fier dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat d’une telle analyse quantitative est rendu sous forme d’une concentration en micro-organismes (appartenant à une flore particulière) par unité de masse ou de volume d’échantillon.Les échantillons peuvent correspondre : - à des bioproduits, à de l’eau, pour un dénombrement de : · flore test d’hygiène générale (Flore Mésophile Aéro-

bie Totale), · flore témoin de contamination fécale (coliformes

totaux, coliformes thermotolérants, E. coli, Entéro-coques, spores de bactéries anaérobies sulfito-réduc-trices,…),

· flore pathogène (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Legionella pneumophilia, Listeria monocytogenes…) ;

- à des prélèvements issus de l’environnement (air, sol) pour un dénombrement des micro-organismes sapro-phytes (bactéries, levures, moisissures) ;

- à des ferments contenant des micro-organismes utiles, permettant la transformation d’une matière première en produit alimentaire fini : · Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) et fabrication

de la bière à partir d’un moût obtenu principalement à partir d’orge germé,

· Streptococcus salivarus subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et fabrication du yaourt à partir du lait.

Il existe de nombreuses méthodes de dénombrement.

Les méthodes directesCertaines nécessitent une culture réalisée dans des conditions d’incubation adaptées aux exigences de la flore dénombrée (temps, température, atmosphère) et à

l’aide d’un milieu adapté à ses exigences nutritives (mi-un milieu adapté à ses exigences nutritives (mi-à ses exigences nutritives (mi-exigences nutritives (mi-lieu pouvant en plus être sélectif et discriminatif ). La culture peut se faire sur différents types de milieux : - sur milieu solide (milieu gélosé) : · dénombrement dans la masse (avec ou sans double

couche), · dénombrement en surface (boîte de Petri classique ou

boîte contact). Cette technique a été automatisée par la société Intersciences qui a développé un ensemen-ceur en surface Spiral® (cf. p. 64),

· dénombrement après culture sur un filtre ayant permis une concentration des micro-organismes (échantillons peu concentrés en micro-organismes) puis déposé sur un milieu gélosé. Il existe des supports alternatifs aux supports tradi-tionnels comme le PetrifilmTM ou les lames gélosées ;

- en milieu liquide (notamment méthode du Nombre le Plus Probable-NPP). La méthode traditionnelle avec culture en tubes à essais peut être miniaturisée (culture en microplaques, cf. p. 63).

D’autres méthodes directes ne nécessitent pas de mise en culture : - estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par unité de volume par mesure du trouble d’une culture (ou d’une suspension) en milieu liquide (opacimétrie, turbidimétrie) (cf. p. 57) ;

- cytométrie : · manuelle : dénombrement en hématimètre, associé

ou non à une estimation de la viabilité des micro-organismes,

· automatisée : cytométrie de flux (cf. p. 67).

Les méthodes indirectesElles associent le résultat de la mesure d’une acti-vité biochimique à un nombre de micro-organismes : dénombrement par ATP-métrie (cf. p. 57).

Chapitre 3

1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR MEMBRANE

57

Mesure du trouble et estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par unité de volumeLe trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à l’aide d’un spectrophoto-mètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble.Ce principe est également celui de la méthode des étalons de MacFarland (solutions troubles obtenues traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum).On peut comparer visuellement le trouble d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel pour en estimer sa concentration. En effet, le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une concentration bactérienne selon le tableau de correspondance suivant :

Étalon McFarland Numéro 0,5 1 2 3 4

Chlorure de Baryum à 1 % (mL) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4

Acide sulfurique à 1 % (mL) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6

Concentration cellulaire approximative (x108 UFC.ml-1)

1,5 3,0 6,0 9,0 12,0

Absorbance à 600 nm 0,132 0,257 0,451 0,582 0,669

L’ATPmétrieL’ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l’ATP (Adénosine triphosphate), molécule de stockage d’énergie présente dans les organismes vivants.La technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant une quantité d’ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise et mesurée par un luminomètre (valeur obtenue en Unité Relative de Lumière (URL) :

ATP + luciférine + O2 luciférase Mg2+

AMP + PPi + oxyluciférine + lumière

On distingue trois sources d’ATP au niveau des prélèvements à analyser : - ATP d’origine microbienne, provenant des bactéries, des levures ou des moisissures ; - ATP dit « somatique », provenant de cellules d’êtres vivants (lait, sang, muscle, végétaux,…) ; - ATP extracellulaire, provenant de débris de micro-organismes ou de cellules somatiques. Cet ATP

est rapidement dégradé dans le milieu extérieur.

Le problème des opérations de nettoyage et de désinfection dans les bio-industries est celui de l’hy-giène. Le nettoyage et la désinfection sont donc des étapes primordiales de la fabrication. Appliqué ainsi au nettoyage-désinfection, le dosage de l’ATP sur les surfaces ou les eaux de rinçage permet la détection de résidus organiques vivants (résidus alimentaires) et de développement microbien :

- si de l’ATP est détecté sur une surface ou dans un liquide, c’est qu’il y a présence de cellules vivantes ;

- dans le cas d’ATP microbien, la présence de micro-organismes représente un risque direct puisqu’il peut y avoir contamination des produits ;

- en revanche, si l’ATP est d’origine somatique, c’est qu’il reste des débris organiques sur la surface ; ceux-ci peuvent servir de support de croissance pour des micro-organismes, ce qui constitue un risque indirect pour les produits.

1 Membrane filtrante et aspect microscopique du réseau tridimensionnel d’une membrane de cellulose

58

2.1. PrincipeSi les conditions optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans l’inoculum intro-duit dans un milieu liquide se développe en y créant un trouble (et une modification visible du milieu si celui-ci est discriminatif ). La lecture des tubes contenant le milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est donc de type binaire : - résultat négatif si absence de trouble et de modi-fication du milieu : il y avait moins de un micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide ;

- résultat positif si présence de trouble (et de modifica-tion du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait au moins un micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide.

Le résultat sera positif, que l’inoculum introduit dans le tube de milieu liquide contienne 1, 10, 100, 1 000… micro-organismes.La méthode repose sur la répartition aléatoire des micro-organismes dans le prélèvement (méthode statistique reposant sur l’utilisation de la loi de Poisson). On ense-mence donc une série de tubes avec un volume donné du produit à analyser ou ses dilutions, à raison de 1, 2, 3, 5 voire même 10 tubes par dilution testée. Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans la série de tubes, on peut déterminer la concentration en micro-organismes présents dans une unité de volume ou de masse du produit analysé.

2.2. Mode opératoireLa méthode décrite ci-dessous (NF ISO 7218, mai 1996) est techniquement lourde, mais utilisée lorsque les bactéries cultivent difficilement en milieu gélosé ou lorsque le nombre de bactéries présentes dans l’échan-tillon est relativement faible (document 4 ) :- volume de l’inoculum : le plus souvent Vinoculum = 1 mL

(parfois 10 mL) ;- choix du milieu à ensemencer :

. milieu de croissance sans indicateur : la présence de micro-organismes se traduit par un trouble,

. milieu sélectif et discriminatif du micro-organisme à quantifier : sa présence se manifeste par un trouble et le virage d’un indicateur de pH par exemple ;

- choix des dilutions à tester : dépend de la population estimée, le but étant d’obtenir, pour une analyse statis-tique optimale des résultats :. une dilution contenant moins d’un micro-organisme dans l’inoculum utilisé,

. une dilution contenant plus d’un micro-organisme dans l’inoculum utilisé ;

- choix du nombre d’essais par dilution (dépend de la précision souhaitée pour les résultats en fonction de leur analyse statistique) :. en général trois tubes sont ensemencés par dilution,. un ou deux tubes sont ensemencés si une précision moins importante est suffisante,

. cinq ou même dix tubes sont ensemencés si une pré- tubes sont ensemencés si une pré-tubes sont ensemencés si une pré-cision plus importante est demandée.

1.1.2. Un système de filtrationL’unité ou rampe de filtration (document 2 ) comporte un socle grillagé stérilisable sur lequel on dépose dans un premier temps la membrane filtrante, puis dans un second temps un godet (entonnoir) stérilisable dans le-quel on verse le volume de produit à analyser. Le tout est relié à une pompe à vide qui permet de faire passer rapidement le volume de produit à analyser à travers la membrane. Le liquide filtré, débarrassé des bactéries, est collecté dans un récipient « poubelle » pour être éliminé.

1.1.3. Des milieux de cultureLa membrane est ensuite déposée sur une gélose nutri-tive adaptée au type de flore recherchée et l’ensemble est mis à incuber (document 3 ). Les milieux utilisés sont le plus souvent sélectifs : ils permettent le développe-ment de la flore recherchée en inhibant (au mieux) les autres flores (dites flores contaminantes). Ils sont aussi souvent discriminatifs (différentiels) : ils permettent de mettre en évidence un (des) caractère(s) biochimique(s) caractéristique(s) de la flore recherchée.Les nutriments diffusent au travers de la membrane et les colonies se développent directement à sa surface. La

taille des colonies observées après 24 à 48 heures d’incu-bation reste inférieure à celle de colonies qui se dévelop-peraient directement sur le milieu gélosé.

1.2. Exploitation des résultatsLe nombre de colonies suspectes sur la membrane (colo-nies présentant les caractères biochimiques caractéris-tiques de la flore recherchée en fonction du milieu uti-lisé) permet de calculer la concentration bactérienne N en nombre d’Unité Formant Colonies (UFC) par mL selon la formule :

NUFC/mL = nv

n nombre d’UFC sur la membraneV volume de produit filtré (en mL)

Dans l’analyse microbiologique des eaux, les normes im-posent de filtrer 100 mL d’eau à analyser et le résultat est rendu en UFC pour 100 mL. Il n’y a donc pas de calcul à faire : le résultat correspond directement au nombre de colonies sur la membrane.

Dénombrement d'une flore d'un produit microbienChapitre 3

2. DÉNOMBREMENT EN MILIEU LIQUIDE

59

2 Unité et rampe de filtration pour analyse microbiologique

Couvercle de l’entonnoir

Entonnoir de 250 ml

Joint torique en sillicone(à l’intérieur)

Membrane filtrante

Grille support du filtre

Branchement du tuyau

Flacon récepteur «poubelle»

rampe de filtration

poubelle pompe à vide

godets

valve

3 Exemples de milieux utilisés dans les techniques de filtration sur membrane

Gélose lactosée au TTC et Tergitol 7Ce milieu est utilisé pour le dénombrement des coliformes qui sont des bacilles Gram négatif de la famille des Entérobactéries, capables de dégrader le lactose. Ils sont recherchés comme témoin de contamination fécale récente.Le Tergitol 7 inhibe la croissance des micro-organismes à Gram positif, limite l’envahissement par les Proteus et favorise la récupération des coliformes. Ceux-ci présentent des colonies de coloration jaune ou orangée, à l’intérieur d’un halo jaune visible sous la membrane. Ce halo est provoqué par l’acidification liée à la dégradation du lactose en présence de l’indicateur coloré de pH, le bleu de bromothymol (teinte jaune à pH acide).Les autres micro-organismes présentent des colonies dont la coloration rouge à marron est due à la réduction du TTC en formazan insoluble.Sont considérées comme caractéristiques toutes les colonies « lactose-positif », quelle que soit leur taille, si le milieu sous la membrane présente une coloration jaune.

Gélose de Slanetz et BartleyCe milieu est utilisé pour le dénombrement des entérocoques. Les entérocoques sont des coques Gram positif recherchés comme témoin de contamination fécale plutôt ancienne.L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes utilisant une chaine respiratoire aérobie.Le TTC est un indicateur de la croissance bactérienne. Il est réduit en formazan insoluble à l’inté-rieur de la cellule. Cette réaction se manifeste par l’apparition de colonies de couleur rouge à marron. Les entérocoques ont un fort potentiel réducteur et leurs colonies présentent donc cette coloration.

4 Organigramme d’un dénombrement en milieu liquide

60

Le principe de ces méthodes s’appuie sur le fait qu’un micro-organisme présent dans un produit ou dans une suspension de ce produit, mis en culture dans des condi-tions optimales, en milieu solide convenable, s’y déve-loppe en formant une colonie.Il s’agit de faire correspondre un micro-organisme à une UFC (Unité Formant Colonie) puisque, dans certains cas, le développement de plusieurs micro-organismes

groupés peut conduire à une unique colonie.Ces techniques ayant déjà été décrites dans l’ouvrage de Première1, voici les principales informations à retenir (document 7 ).• Dilution préalable : le plus souvent, le nombre d’UFC

par unité de masse ou de volume du bioproduit à ana-lyser est important ; une étape préalable de dilution (série de dilutions de raison 1/10e) est nécessaire.

2.3. Exploitation des résultats

2.3.1. Dénombrement à un seul essaiCe dénombrement s’effectue sans recourir aux tables de Mac Grady. On ensemence 1 tube par dilution avec 1 mL d’inoculum.Exemple de résultats :

Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Résultats + + + - - - il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum (1 mL) de la plus grande dilution (10-2) présentant en-core un trouble : la concentration est donc d’au moins 102 micro-organismes par mL de produit ou de « sus-pension mère » non dilués ;

- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum (1 mL) de la première dilution (10-3) ne présentant plus de trouble : la concentration est donc strictement inférieure à 103 micro-organismes par mL de produit ou de « suspension mère » non dilués.

On peut exprimer le résultat selon l’intervalle :102 ≤ Nmicro-organismes/mL < 103

La concentration du produit analysé est comprise entre 102 et 103 micro-organismes dans 1 mL.

2.3.2. Dénombrement à essais multiplesCe dénombrement s’effectue en utilisant les tables de Mac Grady (document 6 ).

Mise en place du nombre caractéristiqueLe nombre caractéristique de la série réalisée est une combinaison de trois chiffres : - chaque chiffre correspond au nombre de tubes « posi-tifs » pour une dilution donnée ;

- les trois chiffres correspondent à trois dilutions suc-cessives ;

- le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilu-tion (donc à la plus forte concentration en micro-orga-nismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus grande dilution.

Parmi les différentes combinaisons, on choisit celle cor-respondant au nombre le plus grand et, si possible, infé-rieur à 330 (correspond à une meilleure répartition des micro-organismes dans les dilutions).

Exemple : cinq dilutions ont été ensemencées à raison de trois essais par dilution ; trois combinaisons (de trois chiff res) sont possibles avec les résultats obte- chiff res) sont possibles avec les résultats obte-chiffres) sont possibles avec les résultats obte-nus (tableau 5 ). Parmi les trois combinaisons de trois chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le nombre le plus élevé et inférieur à 330 est sélectionné ; dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont insuffisantes, on peut être amené à utiliser des nombres caractéristiques comme 333, 332 ou 331.

Lecture du NPP (Nombre le Plus Probable) dans la table statistique de Mac GradyOn reporte le nombre caractéristique de la série dans une table statistique de Mac Grady.On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de micro-organismes présents dans l’inoculum de la dilution cor-respondant au chiffre des centaines du nombre caracté-ristique.Exemple : 321 correspond au NPP de 15. Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inocu- bactéries dans l’inocu-bactéries dans l’inocu-lum de la dilution 10-(n+1). D’après les limites de confiance données par certaines tables, cette valeur numérique de 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95 %, entre 2 et 52 avec une pro- %, entre 2 et 52 avec une pro-entre 2 et 52 avec une pro-babilité de 99 %.

Expression du résultat

N nombre de micro-organismes par mL de produit NPP x k analysé ou de « suspension mère »

NPP nombre lu dans la table

k facteur de la dilution correspondant au chiffre des cen-taines du nombre caractéristique (combinaison retenue)

V volume de l’inoculum (1 mL en général)

Si le produit analysé est solide, on prépare une « suspen-« suspen-suspen-sion mère » de produit en introduisant « x » g de pro-« x » g de pro-x » g de pro- » g de pro-g de pro-duit dans « 9 x » mL de diluant. Cela correspond à une dilution au 1/10e du produit. Le nombre de micro-orga-nismes par g de produit analysé est donc N x 10.


3. DÉNOMBREMENT EN MILIEU SOLIDE (MASSE, SURFACE)

1. Biotechnologies 1re STL, SCEREN, 2012

61

5 Mise en place du nombre caractéristique

Résultats (trois essais par dilution)

Dilutions et aspect des tubes après incubation (lecture d’un trouble associé à la production de gaz collecté dans une cloche).

10-n

10-(n+1)

10-(n+2)

10-(n+3)

10-(n+4)

Résultats + + + + + + + + - + - - - - -

Nombre de tubes + 3 3 2 1 0

Combinaison possible 3 3 2



6 Tables de Mac Grady

Deux tubes par dilution Trois tubes par dilution

Nombre caractéristique

NPP Nombre caractéristique



NPP

000001010011020100101110111120121200201210211212220221222

0,00,50,50,90,90,61,21,32,02,03,02,55,06,0

13,020,025,070,0

110,0

000001010011020100101102110111120121130200

0,00,30,30,60,60,40,71,10,71,11,11,51,60,9

201202210211212220221222223230231232300301

1,42,01,52,03,02,03,03,54,03,03,54,02,54,0

302310311312313320321322323330331332333

6,54,57,511,516,09,515,020,030,025,045,0110,0140,0

62

• Inoculation du milieu gélosé : - dans la masse : Vinoculum = 1 mL. Cet inoculum est introduit dans une boîte de Petri vide et stérile, re-couvert du milieu gélosé en surfusion que l’on laisse durcir après parfaite homogénéisation. On peut en-suite recouvrir le milieu d’une couche de milieu sté-rile (double couche) pour limiter l’envahissement des colonies en surface et avoir des colonies présentant toutes le même aspect ;

- en surface : Vinoculum = 0,1 mL, à étaler à la surface d’un milieu gélosé préalablement coulé en boite de Petri.

• Incubation à la température adaptée à la fl ore recher-ncubation à la température adaptée à la flore recher-chée pendant 18 à 72 heures.

• Dénombrement des colonies : - en surface : elles ont un aspect macroscopique clas-sique et caractéristique ;

- en profondeur : elles ont un aspect lenticulaire.• Exploitation des résultats

Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218 (manipulation réalisée en ensemençant deux boites par dilution) : voir Biotechnologies 1re STL, pp. 69-70.Elle peut être effectuée selon la norme ISO 7218 modifiée en octobre 2007, qui officialise l’utilisation d’une seule boite par dilution :- choix des essais : choisir deux dilutions successives

dont :. l’une au moins présente un minimum de dix colonies,. le « nombre maximal de colonies en totalité est de

trois cents par boite ». En présence d’un agent de différenciation, le « nombre maximal de colonies caractéristiques ou présumées est de cent cinquante par boite »,

. pour les levures et les moisissures, on retient pour le calcul les dilutions présentant entre dix et cent cin-quante colonies par boite ;

- calcul de la concentration bactérienne N en UFC par mL ou par g de produit :

Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs et l’exprimer en nombre compris entre 1,0 et 9,9.10n UFC par mL ou par g.


63

Dénombrement en microméthode des entérocoquesPour l’analyse des eaux, il existe des microplaques de 96 puits permettant de dénombrer les Enterococcus selon le principe du NPP

(d’autres microplaques permettent de dénombrer E. coli). La microplaque MUD/SF permet de réaliser le dénombrement des entéro-coques dans les eaux, suivant la méthode NF EN ISO 7899-1-

Les entérocoques (E. faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae), représentant 70 à 100 % des « streptocoques fécaux », sont de bons indicateurs de contamination fécale ancienne.Le principe de ce dénombrement repose sur la mise en évidence des entérocoques par la détection d’une de leur enzyme spécifique, la β-glucosidase, dont le substrat (4-méthylumbelliféryl-β-D-glucopyranoside ou MUD) est déshydraté dans les cupules de la microplaque.En présence de l’enzyme le substrat libère un composé fluorescent révélé dans l’UV. Le milieu de culture est déshydraté et fixé au fond des puits de la microplaque.La réhydratation du milieu se réalise lorsque l’eau à analyser est introduite dans les puits. Les entérocoques (éventuellement présents dans l’inoculum) hydrolysent le MUD en 4-méthylumbelliférone et en glucose. La production de 4-méthylumbelliférone, composé à fluores-cence bleue, est observée à l’aide d’une lampe UV proche du visible, à 366 nm.De plus, la composition du milieu, à teneur élevée en peptone et en galactose, permet une excellente récupération des entérocoques. Le milieu contient aussi de l’acide nalidixique et de l’acétate de thallium qui assurent l’inhibition de la presque totalité de la microflore contaminante. L’incubation à 44 °C permet aussi d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes de la microflore secon-daire. Ainsi, toutes ces conditions sélectives de culture ne permettent que la croissance des entérocoques.Une analyse statistique fondée sur la loi de Poisson permet, une fois la lecture faite, de dénombrer les entérocoques présents dans l’échantillon en fonction du nombre de puits fluorescents obtenus par dilution testée.

Exemple de résultats pour une eau de surface.

On ensemence 24 puits (3 colonnes de 8 puits) avec 200 µL de chaque dilution :

- dilution au 1/2 de l’eau à analyser ; on obtient 10 puits positifs sur les 24 ense-mencés ;

- dilution au 1/20e, on obtient 3 puits positifs sur 2 ;

- dilution au 1/200e, on obtient 1 puits positif sur 24 ;

- dilution au 1/2 000e, on obtient 0 puits positif sur 24.

Le nombre caractéristique de la série est de 3/24, 1/24 et 0/24 soit 3/1/0 (si possible ce nombre doit se terminer par 0). On reporte ce nombre caractéristique dans une table statistique et on obtient le NPP puis on calcule la concentration en entérocoques de l’eau analysée.

Dilution1/2

Dilution1/20e

Dilution1/200e

Dilution1/2000e

7 Dénombrement en milieu solide (masse, surface) (ISO 7218 modifiée)

1 mL

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Échantillon àanalyser

Culture

Dilutions non exploitables : nombre de colonies supérieur à 300 Dilutions exploitables :deux dilutions successives dont une contient entre 10et 300 UFC.

Dilutions deraison 1/10réalisées dansdes tubescontenant 9 mLde diluant stérile

1/10 1/100 1/1000 1/10 000 1/100 000

64


Dénombrement grâce à un ensemenceur Spiral ® La méthode d’ensemencement Spiral ® permet l’ensemencement automatique et standardisé à partir d’un échantillon contenant de 30 à 10.106 UFC/mL, sur une seule boîte de Petri et sans dilution préalable, selon la norme AFNOR V08-100.Un volume fixe de l’échantillon (50, 100 ou 200 µL) est ensemencé en suivant la forme d’une spirale d’Archimède décroissante (du centre vers la périphérie). Le volume est donc calibré et connu en tout point de la boîte.

Après incubation, la lecture s’effectue en rapportant le nombre de colonies au volume déposé sur un secteur donné. Seuls servent au dénombrement les secteurs où les colonies sont correctement espacées.Le comptage est réalisé manuellement à l’aide de la grille qui divise la boîte en secteurs cor-respondant à un volume précis d’échantillon déposé.Aspect de la spirale mise en évidence

par un colorant bleuLa densité des colonies est décrois-sante du centre vers la périphérie

Exemple : ensemence-ment en mode spiral de 50 µL d’échantillon sur une boite de Petri de 90 mm de diamètre

Paires de secteurs opposés

µL déposés(volume cumulé)

1 1,00

2 2,58

3 5,07

4 9,00

5 15,21

6 25,00

Boîte entière 50,00

Dans un quadrant choisi (A ou B) on dénombre les colonies de la périphérie vers le centre et sur un nombre de secteurs suffisants pour compter au moins 20 colonies. On répète ce comptage sur le même nombre de secteurs dans le quadrant opposé.On calcule ensuite la concentration en micro-organismes de l’échantillon :

- en additionnant les deux comptages ; - en ramenant ce nombre d’UFC au volume déposé dans les secteurs dénombrés ; - en prenant en considération une dilution préalable du produit analysé. -

1

234

5

6

123456

1

234

5

6

1 2 3 4 5 6 A

A

B

B

1

234

5

6

123456

1

234

5

6

1 2 3 4 5 6 A

A

B

B

21 colonies comptées sur les secteurs 1 à 4 du quadrant B en haut à gauche.

15 colonies sur le nombre de secteurs équiva-lent dans le quadrant B en bas à droite.

Dans notre exemple, le volume correspondant aux secteurs 1 à 4 des deux quadrants B opposés est de 9 µL (mode spiral exponentiel de 50 µL) et le produit à analyser a été préalablement dilué au 1/10e avant ensemencement.

C = nombre total de colonies x k = (21+15) x 10 = 4,00.104 UFC.mL-1

Vsecteur 900.10-3

65

2. Biotechnologies 1re STL, SCEREN, 2012

4. DÉNOMBREMENT PAR OBSERVATION DIRECTE

La numération cellulaire peut être réalisée par comptage au microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale ou cellule de numération ou hématimètre. Cette tech-nique ayant déjà été décrite dans l’ouvrage de Première2, voici les principales informations à retenir.• Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée,

il est nécessaire de réaliser une dilution préalable de façon à permettre le comptage des cellules au micros-cope.

• Le comptage se fait grâce à un hématimètre, épaisse lame en verre dont le plateau central comporte un qua-drillage spécifique gravé (document 8 ).

• Le volume de comptage est déterminé par : - la surface du quadrillage gravé sur la lame ; - la profondeur de la chambre : hauteur entre le plan-cher de la plate-forme centrale et la face inférieure de la lamelle optiquement plane.

• Remplissage de l’hématimètre : - faire adhérer parfaitement la lamelle optiquement plane aux plateaux latéraux ;

- remplir complètement la chambre de comptage avec la suspension cellulaire préalablement homogénéisée. Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans bulles d’air et sans faire déborder le liquide dans les rigoles. L’hématimètre doit toujours rester « à plat » pour éviter une mauvaise répartition des cellules sur le quadrillage ;

- laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage quelques minutes.

• Numération au microscope (objectif X 40 en général) : - vérifier l’homogénéité de la répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer) ;

- compter les cellules contenues sur une surface donnée donc un volume donné ; le nombre de cellules comp-tées doit être compris entre 200 et 500 cellules pour être statistiquement correct.

• Prévoir une décontamination et un rinçage de l’héma-timètre après comptage.

• Calcul de la concentration cellulaire :

n nombre de cellules comptéesV volume de comptage (L ou mL)k facteur de dilutionN nombre de cellules par litre (ou

mL)

L’hématimètre de Malassez possède un quadrillage spécifique de 2,5 mm de longueur, 2 mm de largeur et une hauteur sous lamelle de 0,2 mm (document 9 ). Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3. Ce quadrillage comporte 100 rectangles ; chaque rectangle correspond à un volume de 0,01 mm3.

N = n × k V

8 Un hématimètre de Malassez

9 Quadrillage d'un hématimètre de Malassez

66

Chapitre 3 Dénombrement d'une flore d'un produit microbien

Comptage cellulaire et viabilité cellulaire des micro-organismes eucayotes (levures)L’industrie agro-alimentaire utilise de nombreuses levures sélectionnées, conditionnées sous forme de levain (ou de ferment). Ces levures, ajoutées à une matière première, assurent des étapes de la transformation de cette matière première en produit fini.L’inoculation de la matière première doit se faire avec un nombre connu de micro-organismes (on veut y obtenir une concentration initiale optimale) et ceux-ci doivent être vivants, pour être capables d’exprimer leurs activités enzymatiques et de se multiplier pendant le processus de transformation.La viabilité cellulaire des levures peut être analysée lors du comptage en hématimètre grâce à l’utilisation de colorants qui, en fonction de leurs caractéristiques, pénètrent soit dans les cellules vivantes soit dans les cellules mortes. La proportion relative des cellules colorées ou non est un reflet exact du nombre de cellules vivantes ou mortes et donc de la viabilité de l’ensemble de la population cellulaire.On peut alors calculer le % de viabilité d’une suspension cellulaire :

Il existe deux types de colorants utilisables lors d’une recherche de viabilité réalisée en hématimètre. • Les colorants vitaux ou d’inclusion, qui colorent les cellules vivantes. Un colorant vital est une substance qui met en évidence une

structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de la cellule. Pour cela, il faut que le colorant soit utilisé à concentration relativement faible et qu’un élément cellulaire soit capable de l’accumuler. Le rouge neutre, par exemple, est un colorant cationique qui diffuse rapidement à travers la membrane plasmique et se concentre dans les vacuoles (cellules végétales) et les lysosomes. Sa concentration intracellulaire peut être 100 à 1 000 fois plus importante que la concentration extracellulaire. Les cellules vivantes sont donc rouges et les cellules mortes sont incolores.

• Les colorants supravitaux ou d’exclusion, qui colorent les cellules mortes. Il existe deux explications concernant la coloration diffé-rentielle des cellules mortes et vivantes à l’aide de ce type de colorant :

– ces colorants ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable. Toute perturbation de l’intégrité membranaire provoquera une modification de la pénétration de ces colorants. Les cellules vivantes n’incorporent pas ces colorants au contraire des cellules mortes (non viables) qui les incorporent et qui apparaissent alors colorées ;

– ces colorants ont tendance à entrer dans les cellules qu’ils rencontrent. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un méca-nisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cel-lules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et deviendra colorée.

Exemples de colorants d’exclusion : le bleu trypan (cancérigène), l’érythrosine B, le bleu de Funk, des colorants fluorescents comme l’iodure de propidium ou le bromure d’éthidium. Avec le bleu trypan ou le bleu de Funk, les cellules vivantes sont incolores et les cellules mortes sont donc bleues.

Observation de Saccharomyces cerevisiae coloré au bleu de Funk (cellules vivantes blanches, cellules mortes bleues)

67

Le cytomètre de flux Bactiflow ALS ®

But recherché : passage d’une méthode traditionnelle lente à une méthode alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage du produit fini en industrie agro-alimentaire (mise plus rapide sur le marché de produit à DLC courte, augmentation de la production en flux tendu).

La technique est basée sur : – le marquage fluorescent des organismes viables présents

dans le produit ; – la cytométrie en flux, adaptée à la microbiologie indus-

trielle. L’échantillon à analyser est envoyé dans une veine liquide. Un rayon laser permet d’activer la fluorescence des bactéries vivantes. Un système optique permet de détecter et de mesurer l’émission de fluorescence.

Un signal fluorescent détecté est dû à la présence d’une bactérie vivante. La comptabilisation des signaux détectés pour un volume d’échantillon donné permet de connaître le nombre de bactéries vivantes par unité de masse ou de volume de l’échantillon à analyser.La méthode alternative doit donner des résultats équivalents à la méthode de référence.

Dans le cadre d’un test qualitatif, la validation de la méthode alternative consiste à réaliser le test de présence/absence com-parativement avec la méthode traditionnelle, avec des charges en micro-organismes de plus en plus faibles et en dessous de 1 UFC.g-1 et une pré-incubation en bouillon de 24 heures.L’ensemble des résultats obtenus permet de valider (pour chaque souche testée) que la limite de détection de la méthode alternative est inférieure à1 UFC/g, ce qui permet de la valider pour un test qualitatif en présence /absence dans 1 g et garan-tir l’absence des germes spécifiés.

Flux liquidien contenant les bactéries vivantes(fluorescentes) ou mortes (non fluorescentes)

Rayon laser activant lafluorescence Système optique

détectantl’émission defluorescence

68

ACTIVITÉ 1 DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION URINAIRE


PRÉSENTATIONLe diagnostic et le traitement des infections des voies urinaires reposent sur le dénombrement des bactéries (bactériurie), leur identification et la détermination de leur sensibilité à différents antibiotiques (antibio-gramme).Au cours des dernières années de nombreuses techniques simplifiées ont été développées pour le comptage des bactéries urinaires, comme les cultures sur lames gélosées de type « Uricult ». L’ensemencement se fait immédiatement après la miction (au maximum après 20 min pour éviter tout développement des bactéries) en plongeant directement la lame gélosée dans l’urine. La lame gélosée introduite dans un flacon est mise à incuber 18 à 24 h à 37 °C.En général les lames ont deux faces gélosées différentes (document 1 ) : - une face avec le milieu CLED (Cystine, Lactose, Elec-trolyte Déficient, cette dernière caractéristique évite l’envahissement par certaines bactéries très mobiles comme Proteus), milieu non sélectif permettant de mettre en évidence le caractère lactose + grâce à la pré-sence de lactose et de BBT (jaune à pH < 6 ; vert entre pH 6 et 7,6 ; bleu au-delà) ;

- une face avec un milieu sélectif pour les bactéries Gram -, le milieu de Mac Conkey qui permet lui aussi de mettre en évidence le caractère lactose + grâce à la présence de lactose et de rouge neutre (rouge à pH < 6,8 ; orange entre pH 6,8 et 8 ; jaune-orangé au-delà).

Après incubation, on estime le nombre des bactéries (en UFC.mL-1) en comparant la croissance sur la lame gélosée à la tabelle du fournisseur (document 2 ).Critères diagnostiques dans l’urine : - UFC ≥ 105/mL : bactériurie signifi cative. Une ana- bactériurie significative. Une ana-lyse bactériologique (culture, identification et antibio-gramme) est indiquée ;

- UFC compris entre 104 et 105/mL : valeur limite. S’il s’agit d’une culture pure (un seul type de colonie), une analyse bactériologique (culture, identification et anti-biogramme) est également indiquée. S’il s’agit d’une culture mixte (plusieurs colonies d’aspect différent), répéter l’analyse ;

- UFC < 104/mL : bactériurie non significative.

QUESTIONS1. Le document 3 présente le résultat obtenu avec la

lame immergée d’un patient :1.1. Conclure sur la bactériurie d’après la densité des

colonies obtenues sur la face CLED.

1.2. Les colonies observées sont-elles lactose + ou - ?1.3. La bactérie responsable de l’infection urinaire

est-elle probablement Gram + ou Gram - ?1.4. À l’aide de l’annexe 1 , proposer, en les justifiant,

les tests nécessaires pour réaliser une orientation de famille ou de genre ?

2. Le technicien a ensemencé une galerie API 20E à l’aide des colonies obtenues après repiquage. Le docu-ment 4 montre le résultat obtenu après culture et révélation des tests dans les différentes cupules. On a identifié ainsi E. coli comme bactérie responsable de cette infection urinaire.À l’aide de l’annexe 2 , répondre aux questions suivantes :2.1. Pourquoi certaines cupules ont-elles leur titre

souligné ? Encadré ?2.2. Quel réactif a été ajouté à la cupule IND ? Ce

réactif révèle la présence d’indole, produit par l’action d’une tryptophanase sur le tryptophane. En déduire : - la composition minimale du milieu présent dans la cupule ;

- le nom de l’enzyme présente chez la bactérie en cas de réaction positive.

2.3. Le perchlorure de fer ajouté à la cupule TDA met en évidence la présence d’acide indolpyruvique produit par l’action d’une tryptophane désaminase sur le tryptophane. Écrire la réaction catalysée par la TDA.

2.4. Donner le résultat + ou - pour les cupules suivantes MAN et SAC. Le mannitol et le saccharose sont des glucides dont l’utilisation est visualisée grâce à la présence de BBT dans le milieu déshydraté.

2.5. Faire un logigramme permettant d’expliquer les différents résultats possibles du test de la réduction des nitrates en nitrites, puis éventuellement des nitrites en azote.

2.6. L’identification proposée est-elle en adéquation avec l’aspect des colonies obtenues sur les deux faces de la lame immergée ?

3. Le traitement de cette infection urinaire nécessite une antibiothérapie. Le technicien entreprend donc la réalisation d’un antibiogramme dont le résultat est fourni par le document 5 . Répondre aux questions suivantes à l’aide des fiches techniques de la partie 2 de cet ouvrage (Réalisation d’un antibiogramme et Lecture d’un antibiogramme :3.1. Faire un organigramme des différentes étapes de

la réalisation d’un antibiogramme.3.2. Donner le nom du milieu utilisé.

69

3.3. Indiquer, en le justifiant, le nom donné à la concentration en antibiotique obtenue dans la gélose à la limite entre croissance et absence de croissance.

3.4. Pourquoi le technicien mesure-t-il les diamètres d’inhibition de la croissance autour des disques d’antibiotique ?

3.5. Construire l’abaque de lecture pour la ticarcilline (TIC), puis : - estimer la CMI de la ticarcilline pour la souche E. coli ;

- dire si le médecin peut prescrire la ticarcilline pour soigner cette infection urinaire.

DonnéesDiamètre d’inhibition mesuré pour la ticarcilline : 26 mm.Diamètre correspondant à la concentration critique infé-rieure : 22 mm.Diamètre correspondant à la concentration critique supé-rieure : 18 mm.Concentration critique supérieure (concentration plasma-tique maximale) : 64 mg.L-1.Concentration critique inférieure (concentration plasma-tique minimale) : 16 mg.L-1.

1 Lame gélosée

2 Comptage des bactéries sur lame gélosée : tabelle du fournisseur

3 Bactériurie sur lame gélosée

Face CLED

Face Mac Conkey

4 Résultat galerie API 20E

5 Résultat de l'antibiogramme

ANNEXE 1 Principales espèces bactériennes retrouvées dans les infections urinaires • Bacilles Gram - de la famille des entérobactéries (oxydase -) : Escherichia coli (lactose +), Proteus mirabilis (lactose -),

Klebsiella spp. (lactose +).• Bacilles Gram -, oxydase + : Pseudomonas spp.(lactose -).• Coques Gram + : entérocoques (catalase -) et Staphylococcus saprophyticus (catalase +).

70


ANNEXE 2Extrait de la notice de la galerie API 20E1. PrincipeLa galerie API 20E comporte vingt microtubes contenant des substrats déshydratés. Les microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les tests. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à l’aide du tableau de lecture et l’identification est obtenue à l’aide du Catalogue Analytique (vendu par le fournisseur) ou d’un logiciel d’identification.

2. Échantillons (prélèvement et préparation)La galerie API 20E ne doit pas être utilisée directement à partir des prélèvements d’origine clinique ou autres. Les micro-organismes à identifier doivent, dans un premier temps, être isolés sur un milieu de culture adapté à la culture des Enterobacteriaceae et/ou des bacilles à Gram négatif non exigeants selon les techniques usuelles de bactériologie.3. Mode opératoire• Test oxydase

Le test oxydase doit être réalisé selon les instructions du fabricant, il constitue le 21e test d’identification à noter sur la fiche de résultats.

• Préparation de l’inoculum - Ouvrir une ampoule d’API NaCl 0,85 % Medium (5 mL) ou utiliser un tube contenant 5 mL d’eau phy-siologique stérile ou d’eau distillée stérile, sans additif.

- À l’aide d’une pipette, prélever une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé. Réaliser une suspension bactérienne en homogénéisant soigneusement cette colonie dans le milieu. Cette suspension doit être utilisée extemporanément.

• Inoculation de la galerie - Introduire la suspension bactérienne dans les tubes de la galerie à l’aide de la même pipette : · pour les tests CIT, VP et GEL, remplir microtube et microcupule ; · pour les autres tests, remplir uniquement les microtubes (et non les cupules) ; · pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S et URE, créer une anaérobiose en remplissant leur microcupule

d’huile de paraffine. - Refermer la boîte d’incubation. Incuber à 36 °C ± 2 °C pendant 18-24 h.

4. Lecture et interprétation Lecture de la galerie Noter sur la fiche de résultats toutes les réactions spontanées puis révéler les tests nécessitant l’addition de réactifs, soient les tests :

Réduction des nitrates en nitrites (NO2) et en azote (N2) et cupule GLU : après avoir lu le caractère glucose, ajouter 1 goutte des réactifs NR1 (acide sulfanilique) et NR2 (α-naphtylamine). Attendre 2 à 5 minutes. Une coloration rouge indique une réaction positive (présence de NO2 issu de la réduction des nitrates par une nitrate réductase bactérienne). Une réaction négative (coloration jaune) peut être due à la production d’azote (N2) à partir des nitrites :ajouter 2 à 3 mg de réactif Zn (poudre de zinc) dans la cupule GLU. Après 5 minutes, un tube resté jaune indique une réaction positive (présence de N2) à noter sur la fiche de résultats. Si la cupule est orange-rouge, la réaction est négative, les nitrates encore présents dans le tube ont été réduits en nitrites par le Zinc.

TDA :Ajouter une goutte de réactif TDA (perchlorure de fer). Une couleur marron rougeâtre indique une réaction positive (présence d’acide indol pyruvique) à noter sur la fiche de résultats.

IND :Ajouter une goutte de réactif JAMES (ou de KOVACS). Une couleur rose diffusant dans toute la microcupule indique une réaction positive (présence d’indole) à noter sur la fiche de résultats.

VP :Ajouter une goutte des réactifs VP1 (KOH) et VP2 (α-naphtol). Attendre au minimum 10 min. Une couleur rose ou rouge indique une réaction positive (présence d’acétoïne) à noter sur la fiche de résultats. Une faible coloration rose apparaissant après 10 min doit être considérée négative.

microtube contenant le milieu déshydraté

microcupule

71


PRÉSENTATIONLe tableau 1 présente un extrait du règlement (CE) n° 2073/2005 de la commission européenne du 15 novembre 2005 concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires.

La norme NF ISO 16649-2 d’août 2001 (annexe 1 ) est une méthode pour le dénombrement des E. coli β-glucuronidase positive par la technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen d’un milieu contenant du 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-Dglucuronate, substrat chromogénique permettant la détection de l’enzyme β-glucuronidase.

QUESTIONS1. Que traduit la présence de E. coli en quantité importante

dans une préparation à base de viande ?2. La présence du sérotype E. coli O157:H7 ne peut pas

être détectée avec la gélose TBX (annexe 2 ). À l’aide du Zoom p. 23 (Les cas groupés de syndrome hémolytique et urémique), indiquer si cela peut engendrer un problème de santé publique.

3. Combien attend-on au maximum de colonies sur les boîtes de la dilution 10-2 si l’unité d’échantillon de l’aliment analysé est « acceptable » (classe 2) ?

4. Les résultats du dénombrement réalisé sont présentés dans le tableau 2 .4.1. À l’aide de la formule de calcul normalisée, calculer

le nombre d’UFC :- par mL de suspension mère ; - par gramme de préparation à base de viande.Donnée : formule de calcul normalisée :

4.2. Analyser les résultats obtenus pour cette unité d’échantillon. Conclure.

4.3. Les analyses des autres unités d’échantillon ont donné les résultats suivants :n2 = 9.102 UFC.g-1 ; n3 = 1.103 UFC.g-1 ; n4 = 4.103 UFC.g-1 ; n5 = 6.102 UFC.g-1.

Conclure.

1 Recherche et dénombrement d’E. coli dans une préparation à base de viande

Plan d’échantillonnage Limites en UFC/g Méthode d’analyse de

référence

Stade d’application du critère

Action en cas de résultat insatisfaisantn C m M

5 2 500 5000 ISO16649-1ou 2 Fin du procédé de fabrication

Amélioration de l’hygiène de production et amélioration de la sélection et/ou de l’origine des

matières premières

2 Résultats du dénombrement

Suspension mère 10-1 10-2

Nombre de colonies totales

Boîte 1 450 45 8

Boîte 2 380 56 9

Nombre de colonies caractéristiques

Boîte 1 142 15 2

Boîte 2 138 17 3

ACTIVITÉ 2 DÉNOMBREMENT DES E. COLI DANS UNE PRÉPARATION À BASE DE VIANDE

L’eau, un composant essentiel des organismes vivants

72


ANNEXE 1Recherche et dénombrement des E. coli selon la norme NF EN ISO 16649-2

Introduire 10 g de préparation à base de viande dans 90 mL de tryptone-sel. Homogénéiser après broyage. On obtient la « suspension mère ».

Réaliser les dilutions 10-1 et 10-2 de la « suspension mère » en tryptone-sel.

Introduire 1 mL de la « suspension mère » et de chacune des dilutions dans deux boîtes de Petri stériles. Ajouter 15 mL de milieu TBX en surfusion à 45-50 °C. Bien homogénéiser. Laisser durcir. Recouvrir de milieu stérile. Laisser durcir. Incuber 18 à 24 h à 44 °C.

Après la période d’incubation spécifiée, compter les UFC caractéristiques de E. coli β-glucuronidase positive dans chaque boîte contenant moins de 150 UFC caractéristiques et moins de 300 UFC au total (UFC caractéristiques et non caractéristiques). Pour que le résultat soit valide, il est en général estimé nécessaire de compter les UFC caractéristiques sur au moins une boîte contenant un minimum de 15 UFC caractéristiques. Dans la formule de calcul normalisée, est alors la somme des UFC comptées sur toutes lesboîtes de deux dilutions successives dont au moins une contient un minimum de 15 UFC caractéristiques.

J 0

J 1

ANNEXE 2Le milieu TBX

Les sels biliaires inhibent la croissance de la majorité des micro-organismes à Gram positif et favorisent la récupération des Escherichia coli.Le BCIG (acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronique) est un substrat chromogène. La plupart des souches d’Escherichia coli possédant une β-glucuronidase agissent par clivage du BCIG, entraînant la coloration des colonies en bleu.Il est important de noter que toutes les bactéries de l’espèce Escherichia coli ne possèdent pas de β-glucuronidase. C’est le cas notamment du sérotype O157:H7 qui présente donc des colonies blanches.L’incubation réalisée à 44 °C et impérativement limitée à 24 h permet d’inhiber la croissance de la majorité des micro-organismes contaminants.

∑C

73

L’eau, un composant essentiel des organismes vivants

PRÉSENTATIONLes entérocoques possèdent les propriétés suivantes : - ce sont des coques Gram +, catalase -, ne formant pas d’endospore ;

- ils appartiennent aux streptocoques du groupe D (selon Lancefield), groupe divisé en deux sous-groupes : les entérocoques et les non-entérocoques ;

- ils sont, entre autre, capables de cultiver à 45 °C et en bouillon 6,5 % de NaCl à 35 °C ;

- ils résistent à de nombreux inhibiteurs et notamment à la bile et à l’azide de sodium ;

- ils sont, entre autres caractères biochimiques, TTC+ et esculine +.

Leur présence dans une eau traduit une contamination fécale relativement ancienne si elle est associée à celle des coliformes fécaux. Il existe également des entérocoques d’origine non fécale provenant de matières végétales, du sol et des insectes. Ces espèces ne sont pas associées à la présence de coliformes fécaux.Étant donné qu’il est difficile de discriminer les entérocoques d’origine fécale et les entérocoques d’origine non fécale, les entérocoques doivent être plutôt perçus comme un indicateur général de pollution d’origine organique.

Le dénombrement des entérocoques dans une eau peut se faire par filtration ou par une méthode de dénombrement en milieu liquide (selon le NPP).

QUESTIONS1. Dénombrement des entérocoques par la technique de

filtration (norme NF EN ISO 7899-2)Selon cette norme (annexe 1 ) :

- les entérocoques présumés sont les bactéries se dé-veloppant en 44 ± 4 h à 36 °C, sur milieu sélectif à l’azoture de sodium (gélose de Slanetz et Bartley, document 1 ) en donnant des colonies typiques réduisant le chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium (colonies TTC+) ;

- les entérocoques sont les bactéries se développant en 44 ± 4 h à 36 °C, sur milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant des colonies typiques réduisant le chlorure de triphényl-2,3,5 tétrazolium qui, de plus donnent une réaction positive sur une gélose biliée à l’esculine (colonies esculine +) (document 2 ) et une réponse négative au test catalase.

Le document 5 montre le résultat de la membrane déposée sur gélose de Slanetz et Bartley après incubation, pour une eau analysée selon cette norme.

1.1. Commenter le choix de la porosité de la membrane filtrante ; en déduire le diamètre minimal des entérocoques.

1.2. Commenter l’aspect macroscopique des colonies observées sur la gélose de Slanetz et Bartley. Conclure.

1.3. Après transfert de la membrane sur gélose BEA, on observe sous 2/3 des colonies l’apparition d’un halo noirâtre. Conclure.

1.4. Rendre le nombre d’entérocoques pour 100 mL d’eau analysée.

2. Dénombrement des entérocoques par la méthode du NPP (norme NF EN ISO 9308-3)Dans cette norme (annexe 2 ) sont considérés comme entérocoques les micro-organismes donnant une réac-tion positive en 48 h à 37 °C dans un milieu de Rothe (document 3 ) et une réaction positive en 24 h à 37 °C sur un milieu de Litsky (document 4 ). Le tableau 6 donne les résultats obtenus pour une eau analysée selon cette norme.

2.1. Le choix des dilutions testées est-il satisfaisant ?2.2. Pourquoi certains résultats dans la série de Litsky

sont « non effectués » ?2.3. Déterminer NPP, le nombre le plus probable

d’entérocoques par mL d’eau analysée (cf. table de Mc Grady p. 61).

2.4. Une eau analysée précédemment a donné comme résultat : 2 000 entérocoques par mL. Quelles dilutions doivent être réalisées pour avoir une série de résultats exploitables de façon optimale par cette méthode ?

3. Comparaison des deux méthodes3.1. Dresser un tableau de comparaison entre la

technique par filtration et la technique par dénombrement en milieu liquide (NPP) en comparant les points suivants : - temps de manipulation (court, long) ; - temps nécessaire à l’obtention du résultat de

l’analyse (en heures) ; - matériel nécessaire.

3.2. À partir des critères microbiologiques suivants établis pour différentes catégories d’eau, quelle méthode peut-on choisir pour leur analyse ?

- eau de consommation : 0 entérocoques pour 100 mL ;

- eau de baignade (eau de qualité correcte) : 100 entérocoques pour 100 mL ;

- eau destinée à la production d’eau potable né-cessitant un traitement classique : 1 000 entéro- 000 entéro-entéro-coques pour 100 mL.

ACTIVITÉ 3 DÉNOMBREMENT DES ENTÉROCOQUES DANS UNE EAU

74


1 Milieu présomptif de Slanetz et Bartley 2 Milieu confirmatif : gélose biliée à l’esculine et à l’azoture (BEA)

La présence d’azide de sodium limite la croissance de toutes les bactéries pourvues d’une chaîne respiratoire (flore secondaire inhibée). Les entérocoques, bactéries anaérobies aérotolérantes donc dépourvues de chaîne respiratoire, ne sont pas inhibés. De plus ils réduisent le TTC en formazan qui colore leurs colonies en rouge.

Alors que la prolifération des entérocoques tolérant la bile n’est pas ralentie, la croissance des bactéries secondaires d’origine non intestinale est largement inhibée par les sels biliaires. Les entérocoques hydrolysent l’esculine (glucoside) en glucose et en esculine. L’esculine forme avec les ions Fer(III), un complexe noir qui diffuse dans le milieu.

3 Milieu présomptif : bouillon glucosé à l’azoture (milieu de Rothe)

4 Milieu confirmatif : milieu de Litsky

Le milieu de Rothe contient du glucose, indispensable à la croissance des entérocoques (micro-organismes pour lesquels la présence de peptones ne suffit pas à la production d’énergie), et un inhibiteur, l’azide de sodium ou azoture de sodium, qui rend le milieu sélectif pour les bactéries dépourvues de chaîne respiratoire dont les entérocoques.

Le milieu de Litsky est plus sélectif que le milieu de Rothe car il contient, en plus de l’azide de sodium, un second inhibiteur, l’éthyl violet ou cristal violet. Les quelques souches de bacilles sporulés et coques à Gram positif autres que les entérocoques donnant des résultats positifs en milieu de Rothe, sont inhibés en présence d’éthyl-violet.Le développement des entérocoques se traduit par un trouble associé à la formation (ou non) d’une pastille violette au fond du tube.

5 Résultat de la culture sur gélose Slanetz et Bartley (44 h à 36 °C)

6 Dénombrement des entérocoques en milieu liquide par la méthode du NPP

100 10-1 10-2 10-3 10-4

Bouillon de Rothe- trouble + + + + + + + + - + - - - - -

Bouillon de Litsky- trouble- pastille violette

+ + ++ + +

+ + ++ - +

- - -- - -

- ne ne1

- ne ne ne ne nene ne ne

1ne : test non effectué

75

ANNEXE 1Recherche et dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 7899-2

Filtrer 100 mL d’eau à analyser sur une membrane filtrante de 0,45 µm de porosité.

Placer la membrane sur une gélose de Slanetz et Bartley avec TTC. Incuber 44 h à 36 °C.

Dénombrer les colonies caractéristiques d’entérocoques présumées présentant une coloration rouge, marron ou rose, pouvant être limitée au centre ou à la périphérie. En cas de présence de colonies d’entérocoques présumées transférer la membrane sans la retourner sur une boîte de milieu confirmatif gélose Bile Esculine Azide (BEA). Placer 2 h à 44 °C. Compter les colonies d’entérocoques confirmées entraînant l’apparition d’un halo noir dans le milieu. En cas de doute, une réaction négative au test de la catalase confirmera la présence d’entérocoques.

J 0

J 1

ANNEXE 2Dénombrement des entérocoques selon la norme NF EN ISO 9308-3Méthode par ensemencement en milieu liquide et détermination du NPP

Réaliser une série de dilutions de l’eau à analyser en eau physiologique stérile de raison 1/10. Ensemencer trois bouillons présomptifs glucosés à l’azoture (bouillon de Rothe) avec 1 mL d’eau analysée et de chaque dilution réalisée. Incuber 24 h à 37 °C.

Lecture des bouillons de Rothe : considérer comme positifs les tubes pour lesquels on observe un trouble. À partir de chaque bouillon de Rothe positif, ensemencer à l’aide d’une anse calibrée, un bouillon confirmatif de Litsky. Incuber 24 h à 37 °C.

Lecture des bouillons de Litsky : la présence d’entérocoques se caractérise par l’apparition d’un trouble dû au développement bactérien, avec ou sans dépôt violet au fond du tube.

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FICHE TECHNIQUE 1LA FILTRATION D’UN LIQUIDE

Chapitre 3

1 Stériliser, avant usage, l’unité de filtration par autoclavage.

2 Installer la trompe à vide et placer l’ensemble de l’appareil entre deux becs Bunsen de manière à ménager une zone de travail stérile.

3 Séparer le godet de la base de l’unité de filtration, en déposant le godet, couvercle à l’envers, derrière la zone de travail. Ne jamais passer les mains au-dessus des structures ouvertes.

4 Déposer stérilement sur le support, une membrane filtrante neuve et stérile (quadrillage vers le haut).

5 Replacer le godet et l’ouvrir. Déposer son couvercle à l’envers sur la paillasse, toujours derrière la zone de travail pour éviter de passer les mains par-dessus.

6 Après avoir bien agité le liquide à analyser, le verser doucement jusqu’à la graduation adéquate. Refermer le couvercle du godet.

7 Faire le vide sans brutalité pour ne pas briser la membrane filtrante et filtrer la totalité du liquide.

8 Arrêter la filtration.

9 Ouvrir l’unité et rincer (trois fois) avec de l’eau stérile les parois internes du godet pour récupérer les micro-organismes qui s’y seraient déposés. Filtrer après chaque rinçage.

9 Sécher la membrane filtrante en effectuant plusieurs petits vides..

10 Arrêter la filtration.

11 Ouvrir l’unité en déposant toujours le godet, couvercle à l’envers, derrière la zone de travail.

12 Prélever stérilement la membrane filtrante et la déposer sans la retourner sur une gélose nutritive. Il ne doit pas y avoir de bulles d’air sous la membrane sous peine d’avoir des zones ne permettant pas la diffusion des nutriments.

Membrane filtrante sur un support

Échantillon d’H2O filtré au travers de la membrane (0,45 µm)

Dépôt de la membrane sur une boite contenant le milieu.

Incubation pendant 24 h

1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR...

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