1

1

VECTEURS ET BANQUES

Yann audic _2006

2

VECTEURS ET BANQUES● DEFINITIONS● VECTEURS et CLONAGE

– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage

● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation

3

Définitions

Un vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.

Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.

L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule

l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.

4

ADN génomique

ARNm

pre-ARNmAAAAAAA...AAA

AAAAAAA...AAA

Transcription

Epissage

ADNc

Transcriptase inverse

IN VITRO

ARNm

2

5

AAAAAAAAAAAAA

TTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAA

Reverse Transcriptase

Reverse Transcriptase

Oligonucleotide aleatoire : un mélange d'oligonucleotides de 6 nucleotides de toutes les séquences possibles : 46 = 4096

NNNNNN

OLIGOdT

6

VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE

– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage

● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation

7

UTILITE● Permet de conserver une séquence d'ADN

donnée.● Permet de la multiplier pour en accroître la

quantité.● Permet de la modifier pour y introduire des

mutations, déletions.● Permet de la réintroduire dans des cellules.

8

● Un Vecteur

● Une Cellule hôte

● Un fragment d'ADN d'intérêt.

Principes

Circulaire

Linéaire

Procaryote

Eucaryote

ADN génomique

ADNc

3

9

pg-ng d'ADN

µg-mg d'ADN 10

Différents vecteurs pour différentes utilisations

VECTEURS HOTE INSERT (Kb)Plasmide Bactérie 20Phage Lambda Bactérie 25BAC Bactérie 300YAC Levure 1000

BAC

11

plasmide

Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires naturellement présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de la cellule les possédant.

12

Plasmide Type● Origine de replication

(E.Coli)● Gene de résistance a

un Antibiotique● Site de clonage● Gène de sélection

négative● Origine de réplication

(Phage)

4

13

MCS

● Sites pour enzymes de restriction uniques. ● Site pour primer de séquencage.● Promoteurs pour RNA polymerase phagiques

(Phages T7,T3). 14

Bacteriophage Lambda (λ)

15

Bacteriophage M13

16

Bacterial Artificial ChromosomesBAC

7.4kb

● parA,parB and repE sont des genes requis pour la stabilité du BAC.

● OriS est une origine de réplication

● CM : gène de résistance au chloramphenicol

5

17

BACs● Avantages :

– Grande capacité d'insertion– Facilité de manipulation (comme plasmide)– Hôte bactérien– Copie unique– Pas (peu) de réarrangement

18

YAC

19

VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE

– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage

● BANQUES – Définition– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation

20

DéfinitionUne banque d'ADN est une POPULATION de vecteurs contenant des fragment d'ADN divers représentatif d'un type cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de développement.

Une Banque est caractérisée par :

- le type de vecteur- la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine- le pourcentage de vecteurs possédant un insert- la taille moyenne des inserts- la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque

6

21

Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC

ADN Génomique fragmenté

22

Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC

ADN Génomique fragmenté

23

Banque non ordonnée vs banque ordonnées

Chaque colonie est repiquée individuellement dans un puit de la plaque de 384 puits. 24

Exemple une banque d'ADN génomique humain

1,4 .105 X 156 103 = 2,18 1010 bpHG = 3,2 109 bp

Couverture = 6.7 X

Segment 1VectorRestriction Enzyme MboIDNA Source bloodPlate Numbers 1 to 384Plate Count 384Empty Wells 1917 (1.3%)

70 (0.05%)Non-Insert Clones Approx. 3097 (2.1%)Recombinant Clones 142372Average Insert Size 156 KbpGenomic Coverage 6.7X

pTARBAC1.3

Non-Recombinant Clones

7

25

Banque ADNc● Synthese ADNc

– Clonage bout franc– Clonage / linker– Clonage directionel

● Les ESTs● Criblage différentiel●

26

Banque ADNc

Polishing of cDNA ends

27

Clonage bout franc

28

Clonage avec linker

8

29

Clonage avec linker

46 = 4096

30

Que faire pour éviter de digérer les ADNc ?

31

Clonage directionnel

Reverse transcriptase,methyl-dCTPdATP,dGTP,dTTP

Rnase H, DNA pol I, dNTPs

EcoRI adaptateurs

Digestion XhoI

ADNc permettant clonage directionnel 32

MCS

EcoRI Xho I

9

33

Les EST● Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu

étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des étiquettes des séquences exprimées.

34

Les EST● Celle-ci permettent

1) l'identification des ARNm exprimés.

2) l'attribution d'une identiité à chaque clone.

2) Une estimation du niveau d'expression par comptage des EST correspondant à un ARNm donné.

35 36

● Une banque d'ADNc va donc normalement représenter sous forme de clones l'ensemble des ARNm présent dans le tissus initial.

● La représentation de chaque clone représentant en proportion la quantité d'ARNm dans la cellule.

● Ceci pose le problème des ARNm rares qui peuvent n'être représentés que par 1 clone ou même aucun tandis que des ARNm très abondant peuvent représenter une proportion importante des clones de la banque.

10

37

Criblage differentiel● Pour déterminer quels sont les gènes

différentiellement exprimés entre 2 tissus. Par exemple, tissus sains versus tissu cancéreux

38

Criblage differentiel

Maspin, a Serpin with Tumor-Suppressing Activity in Human Mammary Epithelial Cells (Science, 1994)

39

LA NORMALISATION DES BANQUES

● BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule quelque soit son nombre de copie dans le tissus étudiés soient représentés en nombre de clones identique dans la banque.

40

Banque ADN simple brin

Banque partiellement double brin

Sélection vecteur avec double brin

Les clones dont la concentration est importante reforment du double brin ceux dont la concentration est faible, non.

Sélection vecteur simple brin = Banque Normalisé.

11

41

Pour Quoi Faire ?● Pour les organiser et automatiser la gestion

● Pour les analyses fonctionnelles (post-génomique)

42

Pour Quoi Faire ?● Analyses fonctionnelles :

- Vecteurs d'expression : étude du rôle de la protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire.

Neomycin

pCMV

43

● Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI ?

44

12

45

Lecture ?● Visiter le site du NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/● Molecular Cloning: A Laboratory Manual

(Third Edition)

VECTEURS ET BANQUES

Yann audic _2006

VECTEURS ET BANQUES● DEFINITIONS● VECTEURS et CLONAGE

– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage

● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation

Définitions

Un vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.

Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.

L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule

l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.

ADN génomique

ARNm

pre-ARNmAAAAAAA...AAA

AAAAAAA...AAA

Transcription

Epissage

ADNc

Transcriptase inverse

IN VITRO

ARNm

AAAAAAAAAAAAA

TTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAA

Reverse Transcriptase

Reverse Transcriptase

Oligonucleotide aleatoire : un mélange d'oligonucleotides de 6 nucleotides de toutes les séquences possibles : 46 = 4096

NNNNNN

OLIGOdT

VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE

– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage

● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation

UTILITE● Permet de conserver une séquence d'ADN

donnée.● Permet de la multiplier pour en accroître la

quantité.● Permet de la modifier pour y introduire des

mutations, déletions.● Permet de la réintroduire dans des cellules.

● Un Vecteur

● Une Cellule hôte

● Un fragment d'ADN d'intérêt.

Principes

Circulaire

Linéaire

Procaryote

Eucaryote

ADN génomique

ADNc

pg-ng d'ADN

µg-mg d'ADN

Différents vecteurs pour différentes utilisations

VECTEURS HOTE INSERT (Kb)Plasmide Bactérie 20Phage Lambda Bactérie 25BAC Bactérie 300YAC Levure 1000

BAC

plasmide

Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires naturellement présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de la cellule les possédant.

Plasmide Type● Origine de replication

(E.Coli)● Gene de résistance a

un Antibiotique● Site de clonage● Gène de sélection

négative● Origine de réplication

(Phage)

MCS

● Sites pour enzymes de restriction uniques. ● Site pour primer de séquencage.● Promoteurs pour RNA polymerase phagiques

(Phages T7,T3).

Bacteriophage Lambda (λ)

Bacteriophage M13

Bacterial Artificial ChromosomesBAC

7.4kb

● parA,parB and repE sont des genes requis pour la stabilité du BAC.

● OriS est une origine de réplication

● CM : gène de résistance au chloramphenicol

BACs● Avantages :

– Grande capacité d'insertion– Facilité de manipulation (comme plasmide)– Hôte bactérien– Copie unique– Pas (peu) de réarrangement

YAC

VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE

– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage

● BANQUES – Définition– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation

DéfinitionUne banque d'ADN est une POPULATION de vecteurs contenant des fragment d'ADN divers représentatif d'un type cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de développement.

Une Banque est caractérisée par :

- le type de vecteur- la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine- le pourcentage de vecteurs possédant un insert- la taille moyenne des inserts- la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque

Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC

ADN Génomique fragmenté

Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC

ADN Génomique fragmenté

Banque non ordonnée vs banque ordonnées

Chaque colonie est repiquée individuellement dans un puit de la plaque de 384 puits.

Exemple une banque d'ADN génomique humain

1,4 .105 X 156 103 = 2,18 1010 bpHG = 3,2 109 bp

Couverture = 6.7 X

Segment 1VectorRestriction Enzyme MboIDNA Source bloodPlate Numbers 1 to 384Plate Count 384Empty Wells 1917 (1.3%)

70 (0.05%)Non-Insert Clones Approx. 3097 (2.1%)Recombinant Clones 142372Average Insert Size 156 KbpGenomic Coverage 6.7X

pTARBAC1.3

Non-Recombinant Clones

Banque ADNc● Synthese ADNc

– Clonage bout franc– Clonage / linker– Clonage directionel

● Les ESTs● Criblage différentiel●

Banque ADNc

Polishing of cDNA ends

Clonage bout franc

Clonage avec linker

Clonage avec linker

46 = 4096

Que faire pour éviter de digérer les ADNc ?

Clonage directionnel

Reverse transcriptase,methyl-dCTPdATP,dGTP,dTTP

Rnase H, DNA pol I, dNTPs

EcoRI adaptateurs

Digestion XhoI

ADNc permettant clonage directionnel

MCS

EcoRI Xho I

Les EST● Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu

étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des étiquettes des séquences exprimées.

Les EST● Celle-ci permettent

1) l'identification des ARNm exprimés.

2) l'attribution d'une identiité à chaque clone.

2) Une estimation du niveau d'expression par comptage des EST correspondant à un ARNm donné.

● Une banque d'ADNc va donc normalement représenter sous forme de clones l'ensemble des ARNm présent dans le tissus initial.

● La représentation de chaque clone représentant en proportion la quantité d'ARNm dans la cellule.

● Ceci pose le problème des ARNm rares qui peuvent n'être représentés que par 1 clone ou même aucun tandis que des ARNm très abondant peuvent représenter une proportion importante des clones de la banque.

Criblage differentiel● Pour déterminer quels sont les gènes

différentiellement exprimés entre 2 tissus. Par exemple, tissus sains versus tissu cancéreux

Criblage differentiel

Maspin, a Serpin with Tumor-Suppressing Activity in Human Mammary Epithelial Cells (Science, 1994)

LA NORMALISATION DES BANQUES

● BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule quelque soit son nombre de copie dans le tissus étudiés soient représentés en nombre de clones identique dans la banque.

Banque ADN simple brin

Banque partiellement double brin

Sélection vecteur avec double brin

Les clones dont la concentration est importante reforment du double brin ceux dont la concentration est faible, non.

Sélection vecteur simple brin = Banque Normalisé.

Pour Quoi Faire ?● Pour les organiser et automatiser la gestion

● Pour les analyses fonctionnelles (post-génomique)

Pour Quoi Faire ?● Analyses fonctionnelles :

- Vecteurs d'expression : étude du rôle de la protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire.

Neomycin

pCMV

● Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI ?

Lecture ?● Visiter le site du NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/● Molecular Cloning: A Laboratory Manual

(Third Edition)