éLéctrophorèse d'adn
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La république Algérienne Démocratique et Politique
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université Mohamed khider-Biskra
Faculté des Sciences exacte et des Sciences de la nature et de la vie
Département de science de la nature et de la vie
Groupe: 01
2011/2012
Chargé de module:
Mr Athamena .A
Thème L’électrophorèse des
acides nucléiques
introduction
Définition
But et principe
Matériels et gels utilisé
Type d’électrophorèse
Conclusion
Plan de travail
applications
Introduction
L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées en
biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules.
Elle a quelques applications en chimie, mais principalement
utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation
des protéines ou celle des acides nucléiques.
Alors comment réaliser l’électrophorèse des acides
nucléiques ?
Technique de séparation et d’analyse des
particules chargé grâce à la migration différentielle sous l’action d’un champ
électrique .
Définition
BUT
Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques
Déterminer la taille des fragments d’ADN inconnu
Principe
l'électrophorèse est basée sur le principe du mouvement d’ions sous l’effet d’un champ électrique.
La vitesse de migration des acides nucléiques sera en fonction de :
Taille (PM ) [ ]du gel
vitesse de migration
[ ]du gel support
les petits fragments
Migrent rapidement
Forme III linéaire (deux brins cassés)
Forme II circulaire relachée (un brin
coupé)
Forme I circulaire super enroulée fermée
Les fragments des acides nucléiques peuvent être séparer selon leur conformation tridimensionnelle
Les acides nucléiques sont des macromolécules poly
anioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ
électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).
Mobilité élèctrophorétique différente
Les matériels
Tampon d'électrophorèse
(tampon TBE). est une solution contenant du Tris [tris (hydroxyméthyl) aminométhane]Du borate ,de EDTA (Ethyléne diamine tétra acétate )ajustée à PH 8.3
Tampon de charge : bleu de bromophénol - xylène cyanol - glycérol - tampon TBE.
LES GELS UTILISÉS
Gel d’agarose
Gel de polyacrylamide
• Pour les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb)
• Pour les fragments de moins de 1000 paires de base
•Séparer des fragments d’ADN double brin•Ne peuvent pas déterminer précisément la taille d’un fragment
•Séparer des fragments d’ADN simple brin
Les gels non dénaturants
Les gels dénaturants (DGGE)
gel de polyacrylamides
Il existe deux types de gel de polyacrylamide :
L’électrophorèse d’ADN est constituée de cinq étapes importantes :
1) Préparation des gels
d’agarose
2) Dépôt de l’ADN dans les puits du
gel
3) Migration
4) Coloration
5) observation
Réalisation du gel d’agarose par dissolution à chaud de poudre d’agarose dans un tampon TBE à pH 8.2
et refroidissement jusqu’à une température voisine de 50°C.
Préparation du
gel
Électrophorèse sur gel d’agarose
Préparation du moule pour couler le gel :
après avoir obturé les
deux extrémités du moule
avec un scotch fort, placer le
moule sur une surface bien
horizontale et disposer dans
les encoches prévues à cet
effet le peigne nécessaire à la
réalisation des puits dans le
gel.
Coulage du gel :
verser lentement le gel dans la cuve sans dépasser le niveau
supérieur des dents du peigne.
Laisser refroidir 30 mn environ avant d’enlever délicatement le peigne. Les puits sont alors prêts pour recevoir les dépôts d’ADN et le scotch fermant la cuve peut-être enlevé.
les puits sont placés du
côté de la cathode et la cuve
est remplie de tampon TBE
jusqu’au niveau supérieur
du gel.
Mise en place du gel dans la cuve :
Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre
certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient
pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc
thermique à 65°c avant de le refroidir brutalement.
Préparation de
l’ADN
Dilution et densification de l’ADN par une solution de charge permettant que le dépôt s’enfonce bien au fond de chaque puits. Cette solution est colorée par du bleu de bromophénol et elle permettra de suivre l’avancement de l’électrophorèse.
On dépose directement
le dépôt de l’ADN dans les
puits et la migration se fait
dans le gel.
On branche la cuve a la prise de courant pendant une heure environ.
Quand le front de migration atteint l’extrémité du gel, on coupe le courant.
pendant la migration, il faut préparer la solution pour révéler les fragments d’ADN : il s’agit d’un colorant bleu dans une solution tampon dont on ajuste le pH à pH= 5.2
Révélation des fragments :
Elimination de la coloration de fond du gel par de l'eau distillée
Après migration
coloration par du bleu de méthylène
Placer le gel sur un rétroprojecteur pour une observation par la classe entière.
Gel d'électrophorèse sur
agarose sur lequel on voit :
les marqueurs (ou
échelle, "ladder") de
longueur (en paires de base)
de fragments d'ADN
un fragment d'ADN
inconnu
Détermination de la taille d'un fragment d'ADN:
Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose
préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose
pas de dénaturation des échantillons
l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide
les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses
supplémentaires
Électrophorèse en champ pulsé
On change périodiquement l’orientation du champ par rapport au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .
Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé
L’OFGE (Orthogonal Field
Alternating Gel Electrophoresis)
Le FIGE(Field Inversion Gel
Electrophoresis)
Le CHEF(Contour clamped
Homogeous Eletric Field )
Deux champs non homogènes orthogonaux sont appliqués alternativement Les migrations sont plus linéaires que dans la technique originale Séparer des fragments dont la taille peut atteindre 9Mb
champ homogène.Le sens du champ électrique étant simplement inversé périodiquement.
champ homogène et l’angles de réorientation était fixé à 120°Les Migrations sont linéaires Séparer des fragements dont la taille peut atteindre 12 Méga bases. .
A -
A +
B -
B +
A -
A + B -
B +
A -
A +
B -
B +
α = 90°
OFAGE
α = 180° α = 120°
FIGE CHEF
Orthogonal Field Alternation Gel Electrophoresis
Field Invertion Gel Electrophoresis
Contour-Clamped Homogeneous Electric Field
Figure 1: Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé
Tube capillaire de faible diamètre (50microns)remplie d’un gel remplie d’un gel séparateur.
Électrophorèse capillaire
Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon.
Sous l’influence d’une haute tension.
pénétration et migration d’acides nucléiques dans le capillaire .
Figure2:instrumentation d’électrophorèse capillaire
Avantages
Le système ne consomme qu’une quantité infime d’échantillon
Il n’est pas nécessaire de faire de dépôt
Les applications de l’électrophorèse
Estimation du poids moléculaire de fragments d'ADN après une digestion par des enzymes de restriction
Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par PCR
Séparation de fragments d’ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.
L’électrophorèse humain a joué un rôle important dans la
cartographie du génome .l’ électrophorèse est la séparation de
particules causées par un courant électrique.
Le processus sépare les composants de l'ADN pour
déterminer la présence de certains responsables génétiques et
même la présence de troubles et de maladies
Conclusion
MERCI À VOTRE ATTENTION