Service central d'authentification - Vecteurs banques …...Un vecteur est une séquence d'ADN...
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1 1 VECTEURS ET BANQUES Yann audic _2006 2 VECTEURS ET BANQUES ● DEFINITIONS ● VECTEURS et CLONAGE – Utilité – Principe – Différents vecteurs / différents usage ● BANQUES – Principe – Banques génomiques – Banques d'ADNc – Normalisation 3 Définitions Un vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée. Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique. L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm. 4 ADN génomique ARNm pre-ARNm AAAAAAA...AAA AAAAAAA...AAA Transcription Epissage ADNc Transcriptase inverse IN VITRO ARNm
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1
VECTEURS ET BANQUES
Yann audic _2006
2
VECTEURS ET BANQUES● DEFINITIONS● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation
3
Définitions
Un vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.
Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.
L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule
l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.
4
ADN génomique
ARNm
pre-ARNmAAAAAAA...AAA
AAAAAAA...AAA
Transcription
Epissage
ADNc
Transcriptase inverse
IN VITRO
ARNm
2
5
AAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAA
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase
Oligonucleotide aleatoire : un mélange d'oligonucleotides de 6 nucleotides de toutes les séquences possibles : 46 = 4096
NNNNNN
OLIGOdT
6
VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation
7
UTILITE● Permet de conserver une séquence d'ADN
donnée.● Permet de la multiplier pour en accroître la
quantité.● Permet de la modifier pour y introduire des
mutations, déletions.● Permet de la réintroduire dans des cellules.
8
● Un Vecteur
● Une Cellule hôte
● Un fragment d'ADN d'intérêt.
Principes
Circulaire
Linéaire
Procaryote
Eucaryote
ADN génomique
ADNc
3
9
pg-ng d'ADN
µg-mg d'ADN 10
Différents vecteurs pour différentes utilisations
VECTEURS HOTE INSERT (Kb)Plasmide Bactérie 20Phage Lambda Bactérie 25BAC Bactérie 300YAC Levure 1000
BAC
11
plasmide
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires naturellement présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de la cellule les possédant.
12
Plasmide Type● Origine de replication
(E.Coli)● Gene de résistance a
un Antibiotique● Site de clonage● Gène de sélection
négative● Origine de réplication
(Phage)
4
13
MCS
● Sites pour enzymes de restriction uniques. ● Site pour primer de séquencage.● Promoteurs pour RNA polymerase phagiques
(Phages T7,T3). 14
Bacteriophage Lambda (λ)
15
Bacteriophage M13
16
Bacterial Artificial ChromosomesBAC
7.4kb
● parA,parB and repE sont des genes requis pour la stabilité du BAC.
● OriS est une origine de réplication
● CM : gène de résistance au chloramphenicol
5
17
BACs● Avantages :
– Grande capacité d'insertion– Facilité de manipulation (comme plasmide)– Hôte bactérien– Copie unique– Pas (peu) de réarrangement
18
YAC
19
VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES – Définition– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation
20
DéfinitionUne banque d'ADN est une POPULATION de vecteurs contenant des fragment d'ADN divers représentatif d'un type cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de développement.
Une Banque est caractérisée par :
- le type de vecteur- la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine- le pourcentage de vecteurs possédant un insert- la taille moyenne des inserts- la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque
6
21
Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC
ADN Génomique fragmenté
22
Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC
ADN Génomique fragmenté
23
Banque non ordonnée vs banque ordonnées
Chaque colonie est repiquée individuellement dans un puit de la plaque de 384 puits. 24
Exemple une banque d'ADN génomique humain
1,4 .105 X 156 103 = 2,18 1010 bpHG = 3,2 109 bp
Couverture = 6.7 X
Segment 1VectorRestriction Enzyme MboIDNA Source bloodPlate Numbers 1 to 384Plate Count 384Empty Wells 1917 (1.3%)
70 (0.05%)Non-Insert Clones Approx. 3097 (2.1%)Recombinant Clones 142372Average Insert Size 156 KbpGenomic Coverage 6.7X
pTARBAC1.3
Non-Recombinant Clones
7
25
Banque ADNc● Synthese ADNc
– Clonage bout franc– Clonage / linker– Clonage directionel
● Les ESTs● Criblage différentiel●
26
Banque ADNc
Polishing of cDNA ends
27
Clonage bout franc
28
Clonage avec linker
8
29
Clonage avec linker
46 = 4096
30
Que faire pour éviter de digérer les ADNc ?
31
Clonage directionnel
Reverse transcriptase,methyl-dCTPdATP,dGTP,dTTP
Rnase H, DNA pol I, dNTPs
EcoRI adaptateurs
Digestion XhoI
ADNc permettant clonage directionnel 32
MCS
EcoRI Xho I
9
33
Les EST● Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu
étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des étiquettes des séquences exprimées.
34
Les EST● Celle-ci permettent
1) l'identification des ARNm exprimés.
2) l'attribution d'une identiité à chaque clone.
2) Une estimation du niveau d'expression par comptage des EST correspondant à un ARNm donné.
35 36
● Une banque d'ADNc va donc normalement représenter sous forme de clones l'ensemble des ARNm présent dans le tissus initial.
● La représentation de chaque clone représentant en proportion la quantité d'ARNm dans la cellule.
● Ceci pose le problème des ARNm rares qui peuvent n'être représentés que par 1 clone ou même aucun tandis que des ARNm très abondant peuvent représenter une proportion importante des clones de la banque.
10
37
Criblage differentiel● Pour déterminer quels sont les gènes
différentiellement exprimés entre 2 tissus. Par exemple, tissus sains versus tissu cancéreux
38
Criblage differentiel
Maspin, a Serpin with Tumor-Suppressing Activity in Human Mammary Epithelial Cells (Science, 1994)
39
LA NORMALISATION DES BANQUES
● BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule quelque soit son nombre de copie dans le tissus étudiés soient représentés en nombre de clones identique dans la banque.
40
Banque ADN simple brin
Banque partiellement double brin
Sélection vecteur avec double brin
Les clones dont la concentration est importante reforment du double brin ceux dont la concentration est faible, non.
Sélection vecteur simple brin = Banque Normalisé.
11
41
Pour Quoi Faire ?● Pour les organiser et automatiser la gestion
● Pour les analyses fonctionnelles (post-génomique)
42
Pour Quoi Faire ?● Analyses fonctionnelles :
- Vecteurs d'expression : étude du rôle de la protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire.
Neomycin
pCMV
43
● Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI ?
44
12
45
Lecture ?● Visiter le site du NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/● Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Third Edition)
VECTEURS ET BANQUES
Yann audic _2006
VECTEURS ET BANQUES● DEFINITIONS● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation
Définitions
Un vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation, la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.
Le clonage est l'action d'isoler et d'insérer dans un vecteur un fragment d'ADN d'intérêt pour le multiplier à l'identique.
L'ADN génomique est le support physique de l'ensemble des gènes de la cellule
l'ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.
ADN génomique
ARNm
pre-ARNmAAAAAAA...AAA
AAAAAAA...AAA
Transcription
Epissage
ADNc
Transcriptase inverse
IN VITRO
ARNm
AAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAA
Reverse Transcriptase
Reverse Transcriptase
Oligonucleotide aleatoire : un mélange d'oligonucleotides de 6 nucleotides de toutes les séquences possibles : 46 = 4096
NNNNNN
OLIGOdT
VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES – Principe– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation
UTILITE● Permet de conserver une séquence d'ADN
donnée.● Permet de la multiplier pour en accroître la
quantité.● Permet de la modifier pour y introduire des
mutations, déletions.● Permet de la réintroduire dans des cellules.
● Un Vecteur
● Une Cellule hôte
● Un fragment d'ADN d'intérêt.
Principes
Circulaire
Linéaire
Procaryote
Eucaryote
ADN génomique
ADNc
pg-ng d'ADN
µg-mg d'ADN
Différents vecteurs pour différentes utilisations
VECTEURS HOTE INSERT (Kb)Plasmide Bactérie 20Phage Lambda Bactérie 25BAC Bactérie 300YAC Levure 1000
BAC
plasmide
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires naturellement présentes dans les bactéries en plus des chromosomes bactérien. Ils ne contiennent généralement pas de gènes indispensables à la survie de la cellule. Ils apportent des gènes pouvant présenter un avantages dans des conditions de cultures particulières (antibiotique, métaux lourd, hyper salinité,...) où ils vont apporter un avantage pour la croissance de la cellule les possédant.
Plasmide Type● Origine de replication
(E.Coli)● Gene de résistance a
un Antibiotique● Site de clonage● Gène de sélection
négative● Origine de réplication
(Phage)
MCS
● Sites pour enzymes de restriction uniques. ● Site pour primer de séquencage.● Promoteurs pour RNA polymerase phagiques
(Phages T7,T3).
Bacteriophage Lambda (λ)
Bacteriophage M13
Bacterial Artificial ChromosomesBAC
7.4kb
● parA,parB and repE sont des genes requis pour la stabilité du BAC.
● OriS est une origine de réplication
● CM : gène de résistance au chloramphenicol
BACs● Avantages :
– Grande capacité d'insertion– Facilité de manipulation (comme plasmide)– Hôte bactérien– Copie unique– Pas (peu) de réarrangement
YAC
VECTEURS ET BANQUES● VECTEURS et CLONAGE
– Utilité– Principe – Différents vecteurs / différents usage
● BANQUES – Définition– Banques génomiques– Banques d'ADNc– Normalisation
DéfinitionUne banque d'ADN est une POPULATION de vecteurs contenant des fragment d'ADN divers représentatif d'un type cellulaire, d'un génome, d'un stade particulier de développement.
Une Banque est caractérisée par :
- le type de vecteur- la nature des inserts (ADN genomique, ADNc), leur origine- le pourcentage de vecteurs possédant un insert- la taille moyenne des inserts- la taille de la banque c.a.d la quantité de clones / ml de banque
Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC
ADN Génomique fragmenté
Construction d'une banque d'ADN genomique dans un BAC
ADN Génomique fragmenté
Banque non ordonnée vs banque ordonnées
Chaque colonie est repiquée individuellement dans un puit de la plaque de 384 puits.
Exemple une banque d'ADN génomique humain
1,4 .105 X 156 103 = 2,18 1010 bpHG = 3,2 109 bp
Couverture = 6.7 X
Segment 1VectorRestriction Enzyme MboIDNA Source bloodPlate Numbers 1 to 384Plate Count 384Empty Wells 1917 (1.3%)
70 (0.05%)Non-Insert Clones Approx. 3097 (2.1%)Recombinant Clones 142372Average Insert Size 156 KbpGenomic Coverage 6.7X
pTARBAC1.3
Non-Recombinant Clones
Banque ADNc● Synthese ADNc
– Clonage bout franc– Clonage / linker– Clonage directionel
● Les ESTs● Criblage différentiel●
Banque ADNc
Polishing of cDNA ends
Clonage bout franc
Clonage avec linker
Clonage avec linker
46 = 4096
Que faire pour éviter de digérer les ADNc ?
Clonage directionnel
Reverse transcriptase,methyl-dCTPdATP,dGTP,dTTP
Rnase H, DNA pol I, dNTPs
EcoRI adaptateurs
Digestion XhoI
ADNc permettant clonage directionnel
MCS
EcoRI Xho I
Les EST● Une banque permet d'avoir une image des ADNc présents dans le tissu
étudié. Pour cela, le séquencage partiel de l'ensemble des clones de la banques permet d'obtenir des EST ou Expressed Sequence Tag. c.a.d des étiquettes des séquences exprimées.
Les EST● Celle-ci permettent
1) l'identification des ARNm exprimés.
2) l'attribution d'une identiité à chaque clone.
2) Une estimation du niveau d'expression par comptage des EST correspondant à un ARNm donné.
● Une banque d'ADNc va donc normalement représenter sous forme de clones l'ensemble des ARNm présent dans le tissus initial.
● La représentation de chaque clone représentant en proportion la quantité d'ARNm dans la cellule.
● Ceci pose le problème des ARNm rares qui peuvent n'être représentés que par 1 clone ou même aucun tandis que des ARNm très abondant peuvent représenter une proportion importante des clones de la banque.
Criblage differentiel● Pour déterminer quels sont les gènes
différentiellement exprimés entre 2 tissus. Par exemple, tissus sains versus tissu cancéreux
Criblage differentiel
Maspin, a Serpin with Tumor-Suppressing Activity in Human Mammary Epithelial Cells (Science, 1994)
LA NORMALISATION DES BANQUES
● BUT : Faire que chaque ARNm de la cellule quelque soit son nombre de copie dans le tissus étudiés soient représentés en nombre de clones identique dans la banque.
Banque ADN simple brin
Banque partiellement double brin
Sélection vecteur avec double brin
Les clones dont la concentration est importante reforment du double brin ceux dont la concentration est faible, non.
Sélection vecteur simple brin = Banque Normalisé.
Pour Quoi Faire ?● Pour les organiser et automatiser la gestion
● Pour les analyses fonctionnelles (post-génomique)
Pour Quoi Faire ?● Analyses fonctionnelles :
- Vecteurs d'expression : étude du rôle de la protéine X sur tel ou tel mécanisme cellulaire.
Neomycin
pCMV
● Criblage fonctionnel : ou QUI FAIT QUOI ?
Lecture ?● Visiter le site du NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/● Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Third Edition)
