Les réactions antigènes-anticorps Cécile Balter Paul Rouzaire Année 2009-2010.

Les réactions antigènes-anticorps

Cécile Balter

Paul Rouzaire

Année 2009-2010

I. PRESENTATION1. A quoi cela va-t-il vous servir ?2. Quels sont les champs d’application ?3. Interactions Ag-Ac4. Quelles techniques utiliser ?

II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR1. Agglutination2. Précipitation3. Neutralisation4. Immunochromatographie

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radio immunologie

IV. CONCLUSION

Les réactions antigènes - anticorps :

I. PRESENTATION :

1. A quoi cela va-t-il vous servir ?

2. Quels sont les champs d’application ?

3. Interactions Ag-Ac

4. Quelles techniques utiliser ?

I. 1. A quoi cela va-t-il vous servir ?

Utilisations pratiques : à faire un diagnostic à interpréter le résultat de ce diagnostic à commenter un bilan biologique

Utilisations plus fondamentales : préparation de réactifs à usage in vitro ou in vivo compréhension de mécanismes fondamentaux compréhension de pathologies

I. 2. Quels sont les champs d’application ?

Identification et/ou dosage d’un Ag : Identification d’une cellule Identification d’un agent infectieux Identification et/ou dosage d’une protéine Dosage d’une hormone Dosage d’un médicament …

Mise en évidence et/ou titrage d’un Ac : Diagnostic et suivi sérologique d’une infection

Sérologies bactériennes : Fièvretyphoïde, syphilis … Sérologies virales : Hépatites, grippe, rubéole, HIV … Sérologies parasitaires : Toxoplasmose … Contrôle de vaccination

Diagnostic et suivi sérologique d’une maladie auto immune Diagnostic sérologique d’une allergie Suivi d’une grossesse Suivi d’une transplantation …

I. 3. Interactions Ag/Ac (1/8) :

Entre : L’épitope de l’Ag (ou déterminant antigénique) et le paratope de l’Ac (ou régions de complémentarité : CDR)

Interaction réversible : Pas de modifications irréversibles de l’Ag ou l’Ac Implique plusieurs interactions, non covalentes :

- Liaisons faibles par rapport à

une liaison covalente : un grand

nombre nécessaire

- Liaisons qui opèrent sur une

très courte distance : grande

complémentarité : excellente

spécificité

Affinité : Force des interactions entre un seul site de fixation de l’Ag sur un Ac et

un seul épitope.

Avidité : Résultante des interactions entre les déterminants multiples et répétés

d’un antigène et les sites de liaisons multiples d’un anticorps.- Meilleure mesure de la capacité de liaison au sein des systèmes

biologiques

- Une forte avidité peut compenser une faible affinité (ex : IgM

pentamériques vs IgG)

Ac polyclonaux vs Ac monoclonaux

Réaction réversible : loi d’action de masse à l’équilibre :

ka[Ag] + [Ac] [Ag - Ac]

A l’équilibre, selon la loi d’action de masse :

[Ag] . [Ac] x ka = [Ag - Ac] x kd

[Ag - Ac] ka = = Ka [Ag] [Ag] kd

Ka = constante d’affinité (ou d’association)

LA REPRESENTATION DE SCATCHARD : [ Ag - Ac]Ka = [Ag ].[Ac]

Si : F = [Ag] et B = [Ag - Ac]

BKa = F . [Ac]

Si : [Ac]T = concentration totale en anticorps

F . ([Ac]T - B)

= Ka ([Ac]T - B) F

= - Ka.B + Ka.[Ac]T

LA REPRESENTATION DE SCATCHARD :

B[Ac]T

Ka . [Ac]T

Pente = -Ka

Conditions physiochimiques :

pH : liaison quand pH

Force ionique : liaison quand force ionique

Température : en général de l’affinité avec température (37°C)

Réactivité croisée :

Si deux Ag différents partagent un épitope identique

Si des Ac spécifiques d’un épitope se fixent à un épitope non apparenté

possédant des propriétés physicochimiques semblables

Rq : souvent observée pour des Ag polysaccharidiques qui contiennent des

résidus oligosaccahridiques semblables (Ex :Ag des groupes sanguins ABO)

Zone d’équivalence / Phénomène de zone

Sensibilité / Spécificité

- Pour une réaction

- Pour l’interprétation d’un résultat

Courbes ROC

Reproductibilité (CV) / Précision

Détection et/ou dosage d’Ag :

Ag étalons

Ac de référence

Résultats quantitatifs ou qualitatifs

Détection et/ou titrage d’Ac :

Pas de sérum étalon

Ag de référence

Dépistage : résultat qualitatif

Titre : résultat semi quantitatif

Sérums de calibration

Seuil de positivité

Différence IgM / IgG

Ac d’infection / Ac protecteur

I. 4. Quelles techniques utiliser ?

Techniques possibles :

Méthodes n’utilisant pas de marqueur : observation directe - Immunoprécipitation - Agglutination

- Neutralisation- Immunochromatographie

Méthodes utilisant un marqueur : observation indirecte- Radioimmunologie- Immunoenzymologie- Immunofluorescence

II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR :

1. Agglutination

2. Précipitation

3. Neutralisation

4. Immunochromatographie

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (1) :

a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Applications

Ag : présent à la surface d’une particule

Ac : agglutinines, IgM, liaison multivalente

Réseau tridimensionnel

Sensibilité : de 0,001 à 0,3 mg/L

Lecture : à l’œil

Détections / dosages d’Ag

Détections / titrages d’Ac

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (2) : a. Caractéristiques

b. Méthodologiesc. Applications

Agglutination directe : Ag directement particulaire (bactéries,

hématies …)

Agglutination passive, indirecte, conditionnée : Un Ag ou un Ac soluble qui est fixé artificiellement sur une particule inerte (latex …)

Test négatif

Test positif

II. 1. Réactions d’AGGLUTINATION (5) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies

c. Applications

Exemples :

Groupes sanguins

Test de Coombs direct et indirect

Sérotypage des bactéries

Sérodiagnostic des fièvres typhoïde et paratyphoïde, de la

brucellose

Sérodiagnostic de la Syphilis : THPA / VDRL

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (1) :

a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications

Ag : Soluble

Ac : Précipitines, Ig polyclonales

Réseau tridimensionnel

Lecture : - Néphélémètre

- Turbidimètre- Oeil

Sensibilité : de 3 à 0,01 mg/L

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (2) : a. Caractéristiques

b. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications

Précipitation en milieu liquide :

- Néphélémétrie

- Turbidimétrie

Précipitation en milieu gélifié :

- Immunodiffusion radiale : Mancini

- Immunodiffusion double : Ouchterlony

Techniques d’identification :

- Immunoélectrophorèse

- Immunofixation

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (3) : a. Caractéristiquesb. Méthodologies

c. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications

Immunodiffusion radiale : Technique de Mancini :

Plaque de gélose contenant un Ac dans le gel en concentration connue Dépôt de l’Ag à doser dans un puits Diffusion sur plusieurs jours (2-10) Surface du disque généré proportionnelle à la quantité d’Ag

Technique simple, mais technique manuelle Dosage assez précis (CV < 10%) Faibles volumes de spécimens ( qq.mL ) Interférences : hémolyse, lactescence Peu adaptée aux grosses molécules (IgM)

Immunodiffusion double : Technique d’Ouchterlony :

Disque de gélose Diffusion sur plusieurs jours (~2) Méthode qualitative et comparative Interprétation parfois difficileQuantification approximative

Technique de Mancini : Technique d’Ouchterlony :

Technique de Mancini :

Technique d’Ouchterlony :

Electrophorèse en fusée (EID, Technique de Laurell)

– Ac mélangé avec gélose à pH 8,6

– Migration de l’Ag (~3-4h)

– Hauteur de l’arc = [Ag]

– Réfrigérer plaques de migration

Electrosynérèse– Dépôt des Ac et Ag en

puits– Migration à pH 8,0– Migration Ag par

électrophorèse– Migration Ac par

électroendosmose– Sensibilité > IDR– Nombreux faux positifs

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (7) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifié

d. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications

Zone d’excès d’Ac Zone d’excès d’Ag

Zone d’équivalence

Anticorps ajouté

Piège majeur : EXCES d’ANTIGENE

Immunserums : Cheval : complexes

immuns maintenus + longtemps en solution

Lapin : limite de détection + basse

Excès d’antigène :

Solubilisation des complexes Ag-Ac par les Ag libres

Même valeur du signal 2 valeurs différentes de la concentration en

analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée).

Solutions :

- 2nde addition d’Ag : pas de rebond du signal

- Mesure Vmax et tmax

- Aspect des pics d’immunoprécipitation en flux

continu

Immunonéphélémétrie :

Déviation de la lumière par des complexes immuns en milieu

liquide (Cf chimie analytique)

Si échantillons dilués : minimisation de la réflexion et l’auto-

absorption, mais sources de forte intensité et photodétecteurs

sensibles

Problèmes :

- Excès d’Ag

- Diffusion « non immunologique » de la

lumière par particules en suspension ou des substances

lipidiques

- Nécessité d’analyseurs spécialisés

Immunonéphélémétrie :

ÉchantillonSource lumineuse

Lumière non déviée

Lumière déviée

Cellule photoélectrique

Immunoturbidimétrie : Absorption de la lumière par des complexes immuns en milieu liquide (Cf

chimie analytique)

Nécessité d’une grande sensibilité des spectrophotomètres

Sur des analyseurs de biochimie

Problèmes :

- Excès d’Ag

- Interférences ictère, hémolyse et hyperlipémie

IDR EID Néphélométrie Turbidimétrie

Rapidité 48h 3-4h Quelques minutes

Exécution Manuel Automatisé

Interprétation

Délicate Plus FacileValeur chiffrée directe

mais interférences possibles

Sensibilité~ 1 mg/L

EID < IDR Fonction du bruit de fond

→ 1 µg/L (latex)

Précision 8-10% 5% < 5%

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide

e. Précipitation : méthodes d’identificationf. Applications

Immunoélectrophorèse (IEP, Grabar et Williams) Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose

Puis double diffusion contre des Ac spécifiques (~48h)

Méthode qualitative +++ et comparative

Faible coût

Quantification approximative

Personnel formé et expérimenté

Phénomène de zone si excès d’Ag

Cercle de précipitation avec cryoglobulines ou IgM polymérisées

Technique de référence pour m.e.e Ig monoclonale

Immunofixation : Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose (sur

plusieurs pistes)

Dépôt d’antisérums monospécifiques, individuellement sur chaque piste de

migration

Coloration des complexes immuns précipités

Dilution du sérum en fonction de la concentration en Ig totalespour limiter effet de

Interférences analytiques : fibrinogène, lipides / hémolyse

Problèmes si cryoglobuline ou IgM polymérisée

Rapidité (<2h) et Facilité de lecture (plusieurs Ig MC)

Sensibilité > à l’IEP (mais attention aux erreurs par excès)

a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide

Immunofixation :

IgM Kappa

Immunofixation :

IgG et IgA Lambda

Immunosoustraction : Mise en contact protéines et Ac spécifiques fixés sur billes de sépharose

Électrophorèse capillaire de zone (gel de PAA) sur les surnageant

Moins sensible que l’IF (pic étroit individualisable) => risque de faux négatifs

Automatisée

SPE Anti-IgG Anti-Kappa

a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquide

IEP IF IS

Rapidité ~ 48h < 4h ~ 30min

ExécutionPersonnel

expérimentéSimple

AutomatisableAutomatisé

Interprétation Subjective Assez facile Facile

Sensibilité ++ +++ +

Qualitatif Oui Oui Oui

Semi -quantitatif

Oui Non ±

Coût + +++ +++

II. 2. Réactions de PRECIPITATION (14) : a. Caractéristiquesb. Méthodologiesc. Précipitation en milieu gélifiéd. Précipitation en milieu liquidee. Précipitation : méthodes d’identification

f. Applications

Dosage des protéines sériques :

– IgG, IgM, IgA

– Albumine

– CRP

– Haptoglobine …

Identification de :

– Ig monoclonale

– …

Recherche d’Ac :

– FR

– ASL

II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (1) :

- enzyme (SLO)

- hémagglutinine virale / rubéole, grippe …

- neutralisant

- IgA ou autres

- protecteur

Sensibilité :

- environ 1mg/L

Application :

Détection et titrage d’Ac anti Streptolysine O (ASLO) (Cf bactériologie)

(http://stl_bjb.ac-dijon.fr/biohum/bhaslo.htm)

Lyse des hématies

L’hémoglobine intra-

érythrocytaire est rejetée dans

le milieu

Action de la SLO sur les hématies :

Détection des ASLO par neutralisation :

Sérum qui contient des ASLO

Sérum qui ne contient pas d’ASLO

NEUTRALISATION

Pas de neutralisation

Pas de lyse des hématies, les SLO sont neutralisées

Lyse des hématies

SLOHématies

Puis dilutions successives du serum pour titrage des ASLO :

II. 4. Réactions d’IMMUNOCHROMATOGRAPHIE (1) :

Test de Détection Rapide

Technique sandwich

Recherche d’Ag :

- Streptocoque du groupe A

- Détection de toxines bactériennes

- Recherche de Plasmodium

- Recherche de médicaments

- Détection d’hormone

Recherche d’Ac :

- Syphilis

- Maladie de Lyme

- Maladie coeliaque

- Ac anti tétanique

migration

dépôt Contrôle migration

Si Ac+Si Ac+

conjugué à particules d’or ou coloréAc Ac (sérum) ?(sérum) ?

Ag fixé Ac fixé

migration

Si Ac-Si Ac-

C CAg conjugué à particules d’or ou coloréAc Ac (sérum) ?(sérum) ?

Ag fixéAc fixé

migration

Si Ag+Si Ag+

Ac conjugué à particules d’or

Ag Ag (sérum) ?(sérum) ?

Ac fixé Ad fixé

migration

Si Ag -Si Ag -

Ac conjugué à particules d’or

Ag Ag (sérum) ?(sérum) ?

Ac fixé Ag fixé

Nég Pos

Ininter-prétable

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :

1. Principes et méthodologies de

2. ELISA

3. Immunofluorescence

4. Radioimmunologie

1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie

Réaction Ag-Ac avec Ag ou Ac marqué par un traceur

Différenciation traceur libre / traceur lié ([Ag-Ac])

- Signal mesuré après séparation (phase

hétérogène)

- Modification du signal (phase homogène)

Nombreuses techniques en fonction

- de la nature du traceur (isotopique, enzymatique,

luminescent, fluorescent)

- du procédé : indirect, compétitif ou sandwich

Procédé sandwich : (IRMA, IEMA, IFMA, ICMA)- En excès d’Ac- Réaction totale- Signal croissant avec la concentration d’Ag à doser

Avantages :- Sensibilité, précision , spécificité et domaine de mesure +

++- Praticabilité accrue

Mais :- Seulement pour les Ag de MM élevée (2 sites

antigéniques)- Effet crochet pour les concentrations élevées- Superspécificité, Ac hétérophiles (anti-Ig animales du

réactif)

Lavage Lavage Lavage

Puits avec l’Ac adsorbé

Ajout de l’Ag à doser

Ajout de l’Ac secondaire

conjugué à un enzyme

Ajout du substrat de l’enzyme et mesure

de l’intensité de coloration

Signal fraction

Effet crochet : Chute paradoxale du signal mesuré en présence d'une forte concentration

de l'Ag à doser et obtention d'une courbe en cloche.

Même valeur du signal 2 valeurs différentes de la concentration en

analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée).

Solution : diluer

Procédé compétitif : (RIA, EIA, FIA, CLIA)- En défaut d’Ac- Réaction à l’équilibre- Signal décroissant avec la concentration d’Ag à doser

Avantages :- Pour tous les Ag (même les haptènes)- Phase homogène possible (FPIA, EMIT)

Mais :- Domaine de mesure restreint- Mauvaise précision, spécificité moindre, moins praticable

Lavage Lavage

Incubation de l ’Ac avec l’Ag

à doser Placer le mélange Ag-Ac dans un puits avec l’Ag adsorbé

Signal fraction

Procédé indirect : (IF, ELISA)- Signal croissant avec la concentration d’Ac à doser

Avantages :- Etude des classes et sous classes des Ac

Mais :- Problème d’expression des résultats

Lavage Lavage Lavage

Puits avec l’Ag adsorbé

Ajout de l’As spécifique à

Signal fraction

Traceur Avantages Inconvénients

Radioactif

3H, 125I, 57Co - Faible encombrement stérique- Signal d’émission direct, spontané et spécifique- Précision, LD basses

- Législation- Gestion des risques, déchets, commandes- Peut être automatisée

Enzymatique

HRP, PAL, G6PD

- Pas d’appareillage spécialisé- Simplicité du marquage

- LD moins bonnes- Très dépendant des conditions opératoires - Faible dynamique du signal - Automatisable

Traceur Avantages Inconvénients

Fluorescent

Fluorescéine4MUP£

Chélates de lanthanides (Eu)

- Facilité de marquage- Stabilité du traceur- Précision, LD basses

- Quenching- Conventionnels : *LD peu favorables *Interférences *Faible dynamique du signal

Luminescent

LuminolEsters acridiumDioxétanesSels de Ru

- Stabilité du traceur- Signal très spécifique- Acquisition rapide et grande dynamique du signal

- Quenching- Signal fugace- Appareillage spécialisé

Rq : 4MUP : 4 methyl umbelliferyl phosphate

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base

2. ELISA3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel une enzyme a été fixée

Marqueurs :

- Phosphatase alcaline, peroxydase

- Ag ou Ac marqué par une enzyme

Révélation par un :

- Substrat chromogène : spectrophotomètre

- Substrat luminogène : chimiluminescence

Phase hétérogène

Sensibilité : environ 0,00001 mg/L

Résultats qualitatifs, semi quantitatifs ou quantitatifs

Méthodologies :

ELISA indirect

ELISA compétitif

ELISA sandwich

Chimioluminescence

Techniques dérivées :

- Western Blot

- ELISPOT

- Immuno peroxydase

1. Principes et méthodologies de base

ELISA par compétitionRecherche d’un Ac

P signal

[Ac] à doser

Ac marqués à la phosphatase alcaline

Ac à doser

Lecture spectrophotométrique

ELISA indirectRecherche d’un Ac

Ag fixé sur le support (cupule)

Ac recherché

Ac anti Ig totales ou de classe marqué par une enzyme

Révélation substrat chromogène

ELISA sandwichRecherche d’un Ag

Ac spécifiques de l’Ag recherché

Ag recherché

Ac spécifiques de l’Ag recherché

Ac anti Ig marqués par une enzyme

Révélation Révélation substrat substrat chromogènechromogène

Technique dérivée : Immunotransfert = immuno-empreinte = Western Blot :

Séparation par électrophorèse sur gel de PAA (+ résolutif)

Transfert sur une membrane (de nitrocellulose, par exemple)

Dépôt d'un Ac spécifique, suivi d'un second Ac marqué par une enzyme

Pour l’analyse et l’identification des Ac

Technique longue

Sensibilité +++ (20 µg/mL)

Faible coût, interprétation facile

Western BlotWestern Blot

Ag fixés sur le support

Ac recherchés

Ac de chèvre anti IgG marqués à la phosphatase alcaline

P P P P P

P P P P P P

Western Blot HIV1

Ac anti histones

Ac Anti ribosomes

Technique dérivée : ELISPOT Dénombrement au sein d’une suspension hétérogène des cellules sécrétant

des Ac spécifiques ou des cytokines.

Sensibilité +++ (10-5)

Elimination des cellules et Lavage

Puits avec l’Ac anti-cytokine

adsorbé

Ajout de l’Ac anti-cytokine

Ajout de la population de

cellules à tester

Ajout du substrat de l’enzyme et

dénombrement des spots

Puits vu de dessus

Spot = emplacement de la cellule sécrétrice

Technique dérivée : ELISPOT

1 : Ag ?2 : Ac spécifique3 : Anti Ig4 : Avidine-biotine-peroxydase

Technique dérivée : Immunopéroxydase

Ag :– Recherche d’Ag

bactériens, viraux fongiques, parasitaires

– Dosages hormonaux– Dosages de

médicaments– …

Ac :– Auto immunité– Sérologies

bactériennes– Sérologies virales– Sérologies parasitaires– IgE spécifiques– …

Applications de l’ELISA :

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA

3. Immunofluorescence4. Radioimmunologie

IF : IMMUNOFLUORESCENCE : Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel un produit fluorescent a

été fixé

Marqueurs :

- fluorescéine, rhodamine, phycoérythrine

- Ag ou Ac marqué par un produit fluorescent

Phase hétérogène

Révélation au microscope à fluorescence

Utilisation de banques d’images

Sensibilité : environ 0,1 mg/L

Résultats qualitatifs ou semi quantitatifs

IF : IMMUNOFLUORESCENCE : IF directe : détection d’Ag surtout

IF indirecte : détection d’Ac surtout

- Ac anti isotype

- Protéine A

IF sandwich

Techniques dérivées :

Cytométrie en flux = FACS

Technique Multiplex

Microscopie confocale

1. Principes et méthodologies de base2. ELISA

Cytométrie en Flux = CMF

– Numération des cellules exprimant un Ag au sein d’une suspension hétérogène

– Ac monoclonaux conjugués à des fluorochromes

– Analyse multiparamétrique :

• taille (petits angles)

• granulosité (à 90°)

• intensité de fluorescence de plusieurs fluorochromes différents / seuil de positivité

– Plusieurs milliers de cellules en quelques secondes

Cytométrie en Flux / Principes

LentilleLentille

Poubelle

Tube collecteur 1 Tube collecteur 2

Plaque + Plaque -

Laser Photodiode

Suspension cellulaire

Liquide de gaine

Filtres dichroïques

Taille (FSC)

Granulosité (SSC)Filtres

Cytométrie en Flux

Cytométrie en Flux / Expression des résultats

Cytogramme en 2 dimensions

Sélection d’une population à analyser

Ly T CD8+Ly T CD8-

Ly CD8+ CD3-

Cytométrie en Flux

Histogramme Histogramme avec superposition d’un

marquage spécifique et anticorps de contrôle

(irrelevant)

Principe : Combinaison d’une détection de fluorescence en cytométrie sur des billes

spécifiques d’un analyte. Utilisation de différentes billes, repérables chacune par leur intensité de

fluorescence rouge et orange. Pour chaque type de bille on réalise un immunodosage en fluorescence d’un

analyte.

Technique Multiplex

Incubation du milieu avec le mélange de billesLavage, incubation avec le système de révélationPassage des billes sur un « cytomètre »

spécifique

RIA = RADIO IMMUNOASSAY

Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur le quel un radio-isotope a été fixé

Marqueurs :

-125 I,3H

- Ag ou Ac marqué par un radio-isotope

Révélation par comptage

Sensibilité: environ 0,00001 mg/L

Phase hétérogène

Résultats quantitatifs

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence

4. Radioimmunologie

Méthodologies : RIA indirect : Ac

Ac anti isotype

Protéine A

RIA compétitif : Ag et Ac

RIA sandwich : Ag et Ac

III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base2. ELISA3. Immunofluorescence

4. Radioimmunologie

IV. CONCLUSIONS :

Nombreuses techniques possibles : Pièges Limites Avantages

Choix de la technique en fonction de : Sensibilité Spécificité Matériel dont on dispose Prix de revient Nombre de tests

Automatisation ou coup par coup Temps Nature du prélèvement Ag ou Ac Classe des Ig Rendu du résultat : qualitatif, quantitatif ou semi quantitatif …

Les réactions antigènes-anticorps Cécile Balter Paul Rouzaire Année 2009-2010.

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