« Les chevelus racinaires, une alternative à la

production en champs pour les principes actifs

d’origine végétale »

Professeur Michèle Boitel-Conti

Académie Nationale de Pharmacie

30 septembre 2015

« Les chevelus racinaires, une alternative à la

production en champs pour les principes actifs

d’origine végétale »

Professeur Michèle Boitel-Conti

Académie Nationale de Pharmacie

30 septembre 2015

Membre fondateur

Conseiller scientifique

Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine

végétale

Métabolites

spécialisés

(alkaloïdes, terpenes,

…)

Attraction des insectes pollinisateurs

Répulsion pour des pathogènes

Insecticides, fongicides

Allélopathie

Arômes

Parfums

Insecticides

Principes actifs

Métabolites primaires

(sucres, acides organiques, hormones

…)

Protéines recombinantes

(insuline, lipase gastrique humaine,…)

Système de production hétérologue

Croissance

Energie

Respiration

Morphogenese

Principes actifsINDUSTRIES PHARMACEUTIQUES, DES COSMETIQUES

ArômesINDUSTRIES AGRO-ALIMENTAIRES

- Molécules restreintes à quelques familles

- Généralement à faibles concentrations

- Plantes cultivées au champs

- Importées ou cultures encadrées

- > 500 000 molécules d’intérêt

Aujourd’hui

Papaver somniferum

Datura inoxia

hyoscyamine, scopolamine, …

Catharanthus roseus

vinblastine, vincristine,…

codéine, morphine,…

Marché non couvert Biotechnologies ?

Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine

végétale

Extraction

Culture en fiole d’1 clone

Problématiques

Grande taille

Organes pluricellulaires hétérogènes

Activités métaboliques qui évoluent :

- âge

- sollicitations environnement

Lieux de biosynthèse et de stockage :

- cellules

- organes

- molécules circulantes

- faibles teneurs

Plantes supérieures

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végétale

Biotechnologies ?

Demain

PGM

- Plantes à potentialités bio synthétiques amplifiées,

- Culture en milieu confiné et contrôlé

- Simplification de la « plante »

Datura inoxia

hyoscyamine, scopolamine, …

vinblastine, vincristine,…

Papaver somniferum

codéine, morphine,…

Catharanthus roseus

- Dédifférenciation culture de cellules perte du métabolisme spécialisé

- Transformation génétique culture d’organe

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végétale

Biotechnologies ?

Datura inoxia

hyoscyamine, scopolamine, …

vinblastine, vincristine,…

Papaver somniferum

codéine, morphine,…

Catharanthus roseus

- Transformation génétique culture d’organe

Les chevelus racinaires ou « hairy roots »

Métabolisme spécialisé?

Les chevelus racinaires, une alternative à la production en champs pour les principes actifs d’origine

végétale

Qu’est-ce qu’un chevelu racinaire?

Il est issu d’un évènement naturel

Bactéries en symbiose avec les plantes

au sein de la rhizosphère

transfère certains de ses gènes(blessures mécaniques)

Rhizobium rhizogenes Certaines cellules de racines naturelles

sans avec

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végétale

Au laboratoire

Rhizobium rhizogenes

transfère certains de ses gènes(blessures mécaniques)

Certaines cellules de racines naturelles

Culture in vitro de plantes Culture de R. rhizogenes

Piqure avec

aiguille infectée

Les bactéries sont tuées par

un antibiotique : le céfotaxime

après 10 à 15 jours de co-culture

Racine

transgénique

Les gènes bactériens se sont

insérés dans le génome des

cellules de la plante

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végétale

- On coupe la racine transformée

- On la place sur un milieu de culture solide stérile : sucres et sels minéraux

- Chaque racine donnera un clone racinaire issu d’une seule piqure

6 clones Culture en fiole d’1 clone1 clone

Culture en bioréacteurs de 3, 15 et 20 litres:

milieu confiné et contrôlé

- sans lumière

- entre 20° et 25°

- eau + sucre + sels minéraux

et les molécules d’intérêt ?

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végétale

P. Somniferum produit les alcaloides

benzylisoquinoline

à partir de la L-tyrosine.

codéine thébaine

Morphine (2 cycles arômatiques suppl.)

Anthony G. Millgate et al, 2004, Nature

Voie de biosynthèse

Les alcaloïdes morphiniques ?

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Alcaloides

(contenus en % Poids sec)

Hairy roots

(HR)

Racines

naturelles

Milieu de culture

(HR)

Total 0.46 +/- 0.06 0.32 +/- 0.05

morphine 0.26 +/- 0.04 0.27 +/- 0.05 0.255 +/- 0.03

sanguinarine 0.02 +/- 0 0.05 +/-0 0.014 +/- 0

codeine 0.18 +/- 0.02 0.05 +/- 0

Le Flem-Bonhomme V. et al, 2004, Planta

Les alcaloïdes morphiniques ?

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stilbènes/ Vitis vinifera:

exploration analytique et développement de procédé

stratégies

Photos BIOPI 2015: Léo-Paul TisserantHairy roots de Vitis vinifera

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resvératrol

stilbènes/ Vitis vinifera:

exploration analytique et développement de procédé

stratégies

Exploration analytique

Elicitation de la

voie de biosynthèseSécrétion de stilbènes totaux :

150 mg. l-1 de milieu de culture

Vin (France) : 5,4 ± 1,2 mg·l1

Grain de raisin sec (Thomson seedless) : 486 mg·kg-1

Renouée du Japon : 10 mg.kg-1

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1

Pics connus ??

?????? ??????

??

??

X 1500

stratégiesIvan Boublik, CRBM UMR 5237 CNRS

Systèmes défaillants:

- diabète/insuline

- croissance/ h-GH

- Immunité/ IFNγ

- Coagulation/ facteur VIII

Extraction tissus humains

Systèmes recombinants

Production de protéines recombinantes :

50 Milliards $ en 1997 300 Milliards $ en 2015

CHO

Insatisfaisant pour les protéines complexes

Organismes transgéniques

Systèmes cellulaires

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Chevelus racinaires :

Alternative aux systèmes microbiens et CHO

pour les protéines complexes ?

Médicaments

(traitements

hormonaux,

antiviraux,

vaccins,…)

Identification

séquençage

gène

Végétaux comestibles

Protéine d’intérêt

thérapeutique

(insuline, anticorps,

vaccins,…)

Génération de racines

porteuses du gène codant la

protéine d’intérêt

Culture de racines

en milieu confiné (bioréacteur)

R. rhizogenes

Sélection /

mise en culture

Transformation

génétique

Extraction /

purification

Pathologie caractérisée

(déficience en une protéine)

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Chevelus racinaires :

Alternative aux systèmes microbiens et CHO

pour les protéines complexes ?

stratégies

Etude de cas: GFP (I)

Co-transfert des deux T-DNAs dans le génome de la cellule infectée (feuille, tige…)

Génération de racines adventives type « hairy root » porteuses du gène d’intérêt

Brassica rapa rapa

(navet)lumière blanche lumière bleue

Type sauvage GFP Type sauvage GFP

GFP

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LBRB

Prom Term Prom TermSP

Vecteur binaire

RB LB

Prom TermProm TermProm Term

Plasmide pRi

Gène d’intérêt nptII Rol A Rol B Rol C

Directement à partir du milieu de culture et

sans aucune étape de purification

La GFP représente plus de 70% des protéines totales

sécrétées (120 mg/L) 18

Plate forme RhizoProt

Marqueur

Gel acrylamide coloré au

coomassie

Protéines

totales

sécrétées

GFP25 kDa

37 kDa

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Brassica rapa rapa

19

Système historique tabacPlateforme RhizoProt

(Brassicaceae)

Sécrétion GFP 0.8 mg/L* 100 mg/L

Durée de vie de la culture

< 40 jours> 3 mois =>production en

continu

Stabilité des protéines sécrétées

Présence de protéases** stable

Toxicité Alcaloïdes (nicotine…) Végétaux alimentaires

*Medina-Bolivar et al.;

2004

** Pham et al.; 2011 RhizoProt :

Plateforme de production de biomolécules

- innovante

- performante

- sans pathogène,

- à faible coût,

- confiné et contrôlé

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Brevet UPJV 2010

20

Valorisation industrielle:

Développement d’un procédé de production/sécrétion de protéines

recombinantes à partir de chevelu racinaire (brevet WO2011138233A1)

Industrialisation

du procédé

Développement

de candidats

médicaments

Start-up de biotechnologie créée en 2011Exploitant exclusif du brevet et de la

plateforme RhizoProt

3 protéines propriétaires (enzymes humaines) en développement pour le traitement de patients atteints de

maladies rares

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stratégies

L’équipe et moi-même vous remercions de votre attention

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végétale

stratégies

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végétale

La démarche, les outils, les compétences

Chimie analytique

Génie métabolique

Génie génétique

Génie des bio-procédés

Développement industriel

10 molécules d’intérêt à l’étude

Recherche

fondamentale

Application en

industrie

10 ans

ESSAIS CLINIQUES

1 seule produite

NCH3

HO

O

C

3

2H OH

C1 C2

Systèmes modèles

500 000 molécules découvertes

transfert

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