> Fixation de l’azote atmosphérique (1h30)

I – ACTIVITE NITROGENASE et COMPLEXE NITROGENASE/REDUCTASE

1°) L’azote moléculaire (N2) est indisponible pour la plupart des êtres vivants, malgré son abondance dans

l’atmosphère (78%). Vous expliquerez pourquoi.

2°) Quelle enzyme clé permet la fixation du N2 par les êtres vivants ? Schématisez sa structure et écrivez

l’équation catalysée par cette enzyme en y faisant apparaître l’ATP et le pouvoir réducteur (d’où provient ce

pouvoir réducteur ?). Comment mesurer l’activité nitrogénase ?

Doc A : Voies biotiques et abiotiques de fixation (réduction) du N2.

Doc B : La nitrogénase.

La nitrogénase est une enzyme complexe, formée de 2 métalloprotéines, nommées protéines I et II, qui

comportent 3 groupements prosthétiques différents. La protéine I est un tétramère (2 et 2β) d’environ

220 kDa qui contient le cofacteur à fer et à molybdène (abrégé Fe-Mo co) au niveau duquel est réduit

l’azote moléculaire en ammoniaque (G0’=- 33,5 kJ/mol). La protéine II est un dimère de 68 kDa, formé

de 2 sous-unités identiques reliées par un groupement prosthétique unique 4Fe-4S qui reçoit

directement les électrons de la ferrédoxine ou d’une flavodoxine et assure leur transfert à la protéine I.

Ce transfert électronique est associé à l’hydrolyse d’ATP. Cette enzyme est codée par de nombreux

gènes, appelés nif, dont la régulation est très complexe. Si certains gènes impliqués dans la fixation de

l’azote, les gènes nif et fix, sont communs à tous les fixateurs symbiotiques, d’autres sont spécifiques de

chaque espèce de Rhizobium, tant au niveau de leur organisation que de leur régulation.

Nature

PHYSIOLOGIE VEGETALE

THEME 1 : Autotrophie - Nutrition carbonée THEME 3 : Relations hydriques THEME 2 : Nutrition minérale

3°) Qui sont les organismes diazotrophes ? Dans quelles structures ou conditions les retrouve-t-on ?

4°) Légendez :

Doc E : Quelques organismes fixateurs de l’azote moléculaire.

Doc C : Fixation biologique de l’azote par le complexe Nitrogénase/Hydrogénase. Pour chaque électron

fourni par l’intermédiaire de la réductase à la nitrogénase pour la réduction de l’azote il y a consommation

de 2 liaisons phosphates riches en énergie (2 ATP). Une molécule de H2 est formée en même temps que

celle de l’ammoniac.

Doc D : Réactions catalysée par la nitrogénase. En présence de N2 comme substrat, la réaction conduit

toujours, en plus de l’ammoniaque, à la production de dihydrogène par la réduction de protons. Le

complexe catalyse également la réduction d’analogues stériques du diazote, comme l’acétylène qui est

réduit en éthylène. L’éthylène produit est facilement dosable par chromatographie en phase gazeuse.

II – MORPHOLOGIE ET FORMATION DES NODOSITES

1°) Comment nomme-t-on le résultat de la symbiose nodulaire à l’échelle cellulaire ? Décrivez cette

structure.

2°) A l’aide de vos connaissances, définissez la rhizosphère. Vous expliciterez ensuite avec la méthode

appropriée la notion de « dialogue moléculaire » entre Rhizobium et les Fabales.

Doc F : Schéma de la libération des bactéries dans les cellules de la zone d’infection (zone II) et formation d’un symbiosome (d’après Kannenberg et Brewin, 1994).

Dans la cellule infectée, les bactéroïdes ne sont pas au contact direct du cytosol, mais isolés de celui-ci par une

membrane, de type plasmique, d’origine végétale, appelée membrane péribactéroïdienne. Elle est issue d’un

phénomène d’endocytose impliquant le système endomembranaire (Roth et Stacey, 1989). Cette vésicule peut

contenir un seul bactéroïde (Medicago, Trifolium, …) ou plusieurs (Glycine, Phaseolus, …) et constitue une entité

dénommée symbiosome (Roth et al, 1988). Chez le soja, les symbiosomes, évalués à environ 8 000 par cellule,

occupent plus de 80% du volume cellulaire. Les bactéroïdes contiennent la nitrogénase, enzyme qui assure la

réduction du N2.

Doc H : Rôle des produits des gènes nod dans la synthèse du principal facteur Nod de R. meliloti.

Doc G : Echange de signal d’infection.

Le processus de nodulation commence par un échange de signaux entre la plante hôte et la bactérie. Les

racines rejettent par leur métabolisme normal, des substances qui ont des effets attracteurs sur certains

microorganismes du sol (chimiotactisme). Certaines d'entre elles appartiennent au groupe des flavonoïdes

tels que les flavones, isoflavones, flavonone (Rasanen, 2002). Ce signal, une fois perçu par le rhizobium,

induit la production de facteurs Nod (Oldroyd, 2001). Ceux-ci sont des signaux de nodulation ciblant le

programme organogénétique de la plante (Patriarca et al.,2004).

3°) Relevez les principales étapes de la formation précoce de la nodosité. Vous construirez un schéma

approprié (vous pourrez compléter celui de la question précédente).

Doc I : Infection.

Les bactéries s'attachent aux racines par l'intermédiaire de la rhicadhésine ainsi que d'autres protéines

spécifiques localisées à la surface des cellules (Dardanelli et al., 2003; Perry et al.,2004). Les facteurs Nod

émis par les rhizobiums, induisent une dépolarisation de la membrane plasmique accompagnée d'une

oscillation du flux de Ca2+. Cette étape se poursuit par une induction de l'expression de gènes spécifiques

(Pelmont, 1995; Gage, 2004) et une modification de la croissance polaire des poils absorbants formant

une structure dite en « crosse de berger» qui enferme les rhizobiums (Esseling et al., 2003).

L'infection qui s'accompagne d'une digestion de la paroi cellulaire du poil racinaire peut avoir lieu à travers

les poils absorbants, les blessures, ou l'espace intercellulaire (Rasanen, 2002).

Doc J : Développement du nodule

Une fois que les parois des cellules de poils sont digérées, une structure tubulaire appelée filament

d'infection est formée. Elle se compose de cellules de la paroi nouvellement synthétisée qui formeront le

matériel entourant le Rhizobium. Le centre du tube est une glycoprotéine contenant quelques produits

bactériens et quelques glycoprotéines de la plante hôte (Gage, 2004).

Ces changements majeurs dans la forme des cellules et la croissance dirigée sont causées par des

altérations significatives dans le cytosquelette de la plante. La dépolymérisation de l'actine est l'un des

effets observés dans les poils absorbants suite à l'exposition au facteur Nod (Gage et Margolin, 2000).

Les bactéries prolifèrent à l'intérieur du cordon et vont se libérer dans le cytoplasme des cellules corticales,

via ce cordon, provoquant ainsi l'apparition du méristème dont l'activité est à l'origine de la formation du

nodule, dans laquelle les bacilles se différencient irréversiblement en bactéroïdes (Lindström et al., 2002).

Doc J : Développement de la nodosité (suite)

Ces dernières, de forme irrégulière, ont un volume supérieur à celui des formes libres. Ils ne se divisent

plus et ne synthétisent plus de protéines Nod mais se concentrent dans la production des nitrogénases

indispensables à la fixation de l'azote atmosphérique.

Les bactéroïdes sont séparés du cytoplasme végétal par une membrane de séquestration, la membrane

péribactéroïde, servant de plaque d'échange entre les bactéries et les cellules de la plante hôte. Dans

cette membrane les bactéries différenciées forment les bactéroïdes de fixation de l'azote (Pelmont, 1995;

Corbière, 2002).

Doc K : Maturation de la nodosité

Le nodule prend forme avec la multiplication des cellules du cortex. Il se charge de pigments appelés

leghémoglobine (LegHB, analogues de l’hémoglobine), synthétisés à l'intérieur du cytoplasme des cellules

de la plante. Le complexe enzymatique Nitrogénase/Hydrogénase est très sensible à l’oxygène. L'action

de la leghémoglobine est de maintenir l'oxygène à faible concentration dans l'environnement de l'enzyme,

compatible avec le fonctionnement de la fixation de l'azote. Les gènes de leghémoglobine sont activés 7 à

8 jours après l'infection chez le soja (Glycine). La première augmentation réelle de la transcription

commence dans les 4 jours apparents plus tard.

Le passage à l'état symbiotique s'accompagne d'une forte répression des gènes du métabolisme basal et

d'une surexpression de ceux impliqués dans la fixation et l'assimilation de l'azote (Becker et al., 2004).

Quelques rares cellules bactériennes quiescentes, de forme bacillaire, sont présentes dans le nodule; ce

sont les cellules qui survivront et se multiplieront dans le sol après la mort de la plante. Elles pourront alors

infecter les racines des plantes introduites dans le même site (Perry et al., 2004).

Doc L : Développement de nodosités fixatrices d’azote.

A : Système racinaire de Vigna radiata couvert de nodules. B : Nodosités de V. unguiculata 36 jours après l’inoculation de

Sinorhizobium fredii NGR234. C : Section d’une nodosité avec en son centre et colorée en rose par la leghémoglobine, la zone

des cellules végétales qui sont infectées par les rhizobia. Principales étapes du processus de formation et d’infection des

nodosités: D : Les rhizobia (rz) symbiotiques induisent la courbure de poils absorbants (rh), et forment un centre d’infection (ic)

puis un cordon d’infection (it); E : En progressant en direction du primordium nodulaire (np) constitué de cellules corticales en

division (c), le cordon d’infection se ramifie (rit); F : A l’extrémité du cordon d’infection (it), les rhizobia (rz) sont libérés dans le

cytoplasme d’une cellule de la nodosité où ils se différencient en bactéroïdes (bc). Un ou plusieurs bactéroïdes entourés par une

membrane végétale péribactéroidienne forment un « symbiosome » (s).

5°) A l’aide des documents suivants et de votre cours, vous comparerez d’une manière adaptée les deux

types de nodosités.

Doc N : Nodosités à forme indéterminée et nodosités à forme déterminée.

Dans la famille des Légumineuses, la morphologie des nodules et le type de nodosité développée est

déterminé par la plante hôte (Dart, 1975; Newcomb et al., 1979; Newcomb et Tandom, 1981).

(A) Nodosités à forme indéterminée où l'activité méristématique se maintient. De nouvelles cellules

apicales sont continuellement infectées. Cela résulte en une forme cylindrique de la nodosité. Ces

nodosités sont connues chez les légumineuses des zones tempérées (sulla, pois, Vicia sp., Medicago

sativa L., etc...).

Plusieurs zones histologiques différentes peuvent être observées sur une coupe longitudinale de nodosité

de Medicago (Vasse et al, 1990). On distinguera, depuis la partie apicale :

- La zone I ou zone méristématique, essentiellement

constituée de petites cellules qui ne sont jamais

envahies par les bactéries à ce niveau ;

- La zone II, riche en cordons d’infection renfermant de

nombreux Rhizobium participant à l’invasion des

cellules sous-jacentes ;

- L’inter-zone II-III, constituée de quelques assises de

cellules en partie envahies par les bactéries et riches en

amyloplastes ;

- La zone III ou zone de fixation, comprend majoritairement des cellules à contenu dense en raison

de la présence de très nombreux bactéroïdes, forme endosymbiotique de Rhizobium et exprimant

Doc M : Coupe longitudinale schématique d’une nodosité à forme indéterminée (A) et à forme déterminée

(B).

I = zone méristématique, Il = zone d’infection, II-III = interzone, III = zone fixatrice d’azote. IV = zone de sénescence. Ce = cortex externe, E = endoderme, Ci = cortex interne, FV = faisceau vasculaire, CF = couche frontière (parenchyme), TC = tissu central, CC = cylindre central de la racine, CI = cellule racinaire infectée par les bactéroïdes, CN = cellule non-infectée.

la nitrogénase qui catalyse la réduction de l’azote moléculaire. C’est également dans cette zone

que se trouve la léghémoglobine, hémoprotéine appartenant à la famille des nodulines, dont les

gènes de synthèse ne s’expriment qu’au sein de la nodosité ;

- La zone IV ou zone de sénescence est situé à la partie la plus basale de la nodosité, où le

brunissement observé sur des préparations extratemporanées, traduit une désorganisation de ce

tissu.

(B) Nodosités à croissance déterminée où l'activité méristématique cesse tôt. Les cellules infectées

engendrent d'autres cellules infectées et la nodosité en grandissant par expansion acquiert une forme

sphérique. Ce type de nodosité existe seulement chez les légumineuses des zones tropicales telles que le

soja et le haricot (Hirsch et al., 2001). Le tissu central est homogène et peut être assimilé à la zone III des

nodosités de type indéterminé.

III – EFFICIENCE DES SOUCHES BACTERIENNES

1°) Quel est le principal facteur limitant l’activité nitrogénase (voir doc K) ? En éliminant ce facteur, on

constate néanmoins une diminution brutale de la teneur en azote au sein de la bactérie, que conclure ?

2°) Quelle solution les Fabales ont-elles adoptée pour s’approvisionner en ce facteur tout en limitant sa

propagation au sein des tissus nodulaires (voir doc K) ?

3°) Cette molécule est une protéine héminique à fer dont l’hème est synthétisé par l’hôte et dont la partie

protéique est synthétisée par la bactérie. Sachant cela, définir l’efficience d’un organisme diazotrophe en y

faisant apparaître le mot « dioxygène ». Qui des symbiontes ou des bactéries diazotrophes libres sont les

fixateurs les plus efficients ?

Doc O

Les rhizobia sont des bactéries du sol, appartenant à la famille des Rhizobiaceae, Gram négatif, strictement

aérobies, possédant une forme de bâtonnets de 0,6 à 0,9 nm de largeur et de 1,2 à 3 jnm de longueur et

non sporulant (Jordan, 1984). Ce sont des bactéries mobiles grâce à un flagelle polaire ou subpolaire ou 2

à 6 flagelles péritriches (Werner, 1992). Leur croissance est optimale à une température de 28 °C et un pH

entre 6 et 7 (Burton, 1985).

Doc P : Efficience des souches.

Les échecs des cultures de légumineuses dans certaines régions sont souvent le résultat d'une insuffisance

ou d'un manque d'efficience des souches de rhizobium. En effet, les souches natives sont généralement

plus efficientes que les exogènes (Mezni et al., 2002).

L'inoculation est très efficace chez le sulla si l'espèce n'a pas été cultivée depuis longtemps sur la même

parcelle (Robson 1991). Dans ce sens, Il a été rapporté qu'une faible fixation biologique de l'azote a été

observée quand le sulla est installé dans des sites non conventionnels à l'espèce (Ewing et al., 2001).

Selon Casella et al.(1984), l'introduction du sulla dans des pays tels que l'Australie, en dehors de la

distribution naturelle du genre Hedysarum, doit être obligatoirement accompagnée d'une inoculation par des

souches spécifiques pour favoriser la nodulation.

4°) En quoi l’effet de sécheresse est-il un paradoxe pour l’efficience des diazotrophes ?

IV – TRANSPORT DE L’AMMONIUM

1°) Après lecture du document ci-dessous, vous compléterez le tableau de la question II-5°).

Doc R : Coupe transversale de nodosités de féveroles. Après sécheresse (B), on constate une diminution

immédiate de l’activité nitrogénase. Toutefois, la plasmolyse des cellules corticales entraîne leur tassement,

réduisant les espaces intercellulaires et ainsi la diffusion des gaz par l’apoplaste. CE : cortex externe, E :

endoderme, CI : cortex interne, TC : tissu central, FV : faisceau vasculaire.

Doc Q : Activité nitrogénase chez les fixateurs libres ou symbiotiques

Activité nitrogénase des f. libres (kg de N fixé/hectare/an)

25

Activité nitrogénase chez les Fabales et Rhizobium (kg de N fixé/hectare/an)

80 à 250

Doc R : Amides et uréides sont les formes de transport de l’azote.

Les procaryotes diazotrophes symbiotiques rejettent de l’ammonium, qui, pour éviter la toxicité, doit rapidement être

converti en formes organiques dans les nodosités racinaires avant d’être transporté jusqu’aux racines par le xylème.

Les Fabacées diazotrophes peuvent être divisées en exportateurs d’amide et en exportateurs d’uréides sur la base de

la composition de leur xylème.

- Les amides (principalement des acides aminés tels que l’asparagine et la glutamine) sont exportés par les

Fabacées des régions tempérées, à nodosités indéterminées (cylindriques), comme le pois (Pisum), le trèfle

(Trifolium), la fève (Vicia) ou la lentille (Lens).

- Les uréides sont exportés par les Fabacées des régions tropicales à nodosités déterminées (sphériques),

comme le soja (Glycine), le haricot rouge (Phaseolus), la cacahuète (Arachis) ou le dolique (Vigna). Les trois

principaux uréides sont l’allantoïne, l’acide allantoïque et la citrulline. L’allantoïne est synthétisée dans les

peroxysomes à partir de l’acide urique issus de la dégradation des purines de la cellule infectée, et l’acide

allantoïque est synthétisé à partir de l’allantoïne dans le réticulum endoplasmique. Le site de synthèse de la

citrulline à partir de l’acide aminé ornithine n’a pas encore été déterminé. Les trois composés sont finalement

libérés dans le xylème et transporté aux parties aériennes, où ils sont rapidement catabolisés en ammonium.

Cet ammonium entre dans la voie d’assimilation décrite précédemment.

Les formules des uréides cités ci-dessus sont fournies en ANNEXE.

ANNEXE – DOCUMENTS SUPPLEMENTAIRES