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ENZYMOLOGIE
INHIBITIONS ENZYMATIQUES
Notes de cours
Casimir BLONSKI
Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay - UMR 8182
Groupe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique
LabEx LERMIT
Université Paris-Sud 11
Orsay
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Inhibition enzymatique
• inactivation d’une enzyme (ralentissement de la
réaction enzymatique) par la liaison d’une petite
molécule
– différente que la dénaturation
Types d’inhibition
• réversible
– compétitive
– incompétitive
– noncompétitive
• irréversible
– par marqueur d’affinité
– par inhibition suicide
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Leonor Michaelis (1875-1940) and Maud Leonora Menten (1879-1960)
The kinetics of invertase activity
Biochemische Zeitschrift 49, 333 (1913)
Saturation curve for an enzyme showing the relation between the
concentration of substrate and rate.
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Inhibition compétitive
• la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la
liaison du substrat
Exemple de l’inhibition competitive
l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la
déhydrogénase de succinate lors de sa liaison :
S
Enz
SEnz
IEnz
I
E E•S E + P k1, S k2
E•I
ki, I
k-1
k-i
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Équations pour l’inhibition comp.
Graphique d’inhibition compétitive
[S]
Vit
esse
, v
Vm
ax /
2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
KMapp
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
KMapp'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive
+⋅+
=
i
M
max
]I[1]S[
]S[
KK
Vv
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Graphique d’inhibition compétitive
1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1 / Vmax
-1 / KM
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition compétitive
-1 / KMapp'
-1 / KMapp
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
Détermination de Ki (compétitive)
maxmax
M1
S][
1
]I[1
1
VV
KK
v
i+⋅
+
=
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Équation pour IC50 (compétitive)
• équations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 :
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Inhibition incompétitive
• l’inhibiteur est lié par le complexe E•S
Exemple de l’inhibition incompétitive
• inhibition de la phosphatase alkaline par la L-
phénylalanine:
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Équations pour l’inhibition incomp.
Graphique d’inhibition incompétitive
[S]
Vit
esse
, v
Vm
ax /
2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
KMapp
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
KMapp'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incompétitive
Vm
axa
pp /
2V
ma
xa
pp' /
2
+
+
+
=
i
M
i
max
]I[1
]S[
]I[1
]S[
K
K
K
V
v
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Graphique d’inhibition incompétitive
Détermination de Ki (incompétitive)
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Équation pour IC50 (incompétitive)
• équations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 :
Inhibition non-compétitive
• l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe
E•S
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Exemple de l’inhibition non-comp.
• inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :
Équations pour l’inhibition noncomp.
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Inhibition non-compétitive simple
• l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la
présence de substrat (i.e. Ki = Ki')
– KM n’est pas affecté
– Vmax est diminué par le facteur de
+
'
i
]I[1
K
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Graphique d’inhibition non-compétitive simple
[S]
Vit
esse
, v
Vm
ax
/ 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple
Vm
axa
pp
' / 2
Vm
axa
pp / 2
M
i
max
]S[
]I[1
]S[
K
K
V
v+
+
=
Graphique d’inhibition non-compétitive simple
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Détermination de Ki (non-compétitive simple)
• équation pour la diminution de Vmax :
Inhibition non-compétitive mixte
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• l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat
(i.e. Ki ≠ Ki')
– Vmax est toujours diminué par le facteur de
– KM est affecté selon Ki et Ki'
Inhibition non-compétitive mixte
• lorsque Ki < Ki', KM augmente et l’inhibition ressemble
à l’inhibition compétitive :
+
'
i
]I[1
K
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Inhibition non-compétitive mixte
• lorsque Ki > Ki', KM diminue et l’inhibition ressemble à
l’inhibition incompétitive :
Détermination de Ki' (non-compétitive mixte)
• équation pour la diminution de Vmax :
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Détermination de Ki (non-compétitive mixte)
• équation pour la variation de KM :
Équation pour IC50 (non-comp. simple)
• équations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 :
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Inhibition irreversible
• pour des inhibiteurs réversibles, on utilise le Ki comme
un indice de l’efficacité de l’inhibition
• pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le kinact et le
KI
• il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles :
– réactifs du site actif (marquage par affinité)
– inhibiteurs basés sur le mécanisme (substrats «
suicide »)
Marqueurs par affinité
• démontrent la spécificité envers un groupement
fonctionnel des acides aminés du site actif
– analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans
les site actif
– comprennent aussi un groupement réactif
(pharmacophore) – typiquement un électrophile qui
réagit avec un nucléophile dans le site actif
• possèdent un seul site saturable et réagissent de manière
stœchiométrique (1 mol de I/mol de E)
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Marquage par affinité
• l’enzyme est protégée contre cette inhibition par le
substrat (ou co-facteur)
• la perte d’activité suit une cinétique de premier ordre,
parce que l’enzyme est consommée comme un réactif
pendant la réaction
• l’inhibition est accompagnée de la modification covalente
de l’enzyme :
– l’enzyme demeure inactive après la séparation de
l’excès de l’inhibiteur
– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou
filtration sur gel (ou sur membrane) même après la
dénaturation de l’enzyme
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Exemples de marquage par affinité
TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)
• ressemble un amide de la phénylalanine, mais le
groupement chlorométhyle cétone effectue l’alkylation de
la His57 de la chymotrypsine :
DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)
• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de
sérine :
O
CH2
Cl
NH
S OO
CH3
N NH
Enz
N N
O
CH2
NH
S OO
CH3
Enz
Cl
H
Enz
HO
P
O
F
OO
Enz
O
P
O
OO
F
H
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PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)
• utilisé pour inhiber des protéases et réagit aussi avec des
résidus de sérine :
Exemples de marquage par affinité
Enz
HO
F
H
CH2 S
O
F
O
Enz
O
CH2 S
O
O
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Analyse cinétique
• liaison rapide à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la
formation lente et irréversible d’un complexe inactif :
• la proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la
concentration de I
• E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre
k1
k-1KI =
E I E•I E I+k1
k-1
kinact
complexe covalentinactif
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Mesure de kinact
• kinact peut être déterminée en mesurant la perte d’activité
en fonction du temps (kobs) à différentes concentrations
d’inhibiteur :
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% a
cti
vit
é
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)
[I] = 0
[I] = 0.2 × KI
[I] = 0.5 × KI
[I] = 2 × KI
[I] = KI
constante de vitesse = kobs
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