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Diagnostic et suivi des infections virales

DUACAI – 16/03/2017


Diagnostic & suivi des infections virales - Définitions

Identifier la nature et la cause d’une infection – Est-ce une infection virale?

– Quel est le virus en cause?

Une fois le virus identifié, suivre le déroulement de l’infection


• Prélèvements biologiques

• Principes du diagnostic Direct - Indirect

• Diagnostic direct • Isolement viral • Recherche d’antigènes viraux • Recherche de génomes viraux

• Diagnostic indirect • Recherches d’anticorps

• Combiner Direct et Indirect

• Vie quotidienne au laboratoire de virologie

Diagnostic & suivi des infections virales - Plan


3 éléments fondamentaux 1. Un seul type d’acide nucléique : ADN ou ARN

2. Reproduction à partir de son propre matériel génétique

3. Parasitisme intracellulaire obligatoire

André Lwoff, 1953

Diagnostic & suivi des infections virales Echantillons


Qualité de l’échantillon biologique 1. Prélevé au bon moment

2. Conservé et acheminé dans les bonnes conditions

3. Correctement renseigné

Diagnostic & suivi des infections virales Echantillons

Diagnostic direct : mettre en évidence le virus ou un de ses constituants

Etudes du génome viral

Microscopie électronique

Isolement sur culture cellulaire

Détection immunologique d’antigènes viraux

Principes des diagnostics direct et indirect

7


Principes des diagnostics direct et indirect

Diagnostic indirect : détecter des anticorps synthétisés en réaction à une infection virale

infection en cours = IgM

IgG = infection ancienne


Principes des diagnostics direct et indirect Stratégies

Preuve d’une origine virale • Décision thérapeutique • Situations difficiles

Suivi des infections • Infections chroniques

Dépistage obligatoire • Dons (sang, tissus…) • Prétherapeutique Contrôle des épidémies

• Services hospitaliers • EHPAD • Autres

Epidémiologie

Diagnostic DIRECT Diagnostic INDIRECT

Diagnostic direct : mettre en évidence le virus ou un de ses constituants

Etudes du génome viral

Microscopie électronique

Isolement sur culture cellulaire

Détection immunologique d’antigènes viraux

Diagnostic direct


Diagnostic direct – Isolement viral


• Isolement viral en culture cellulaire : technique qui amplifie (multiplie) le virus

• L’amplification nécessite plusieurs cycles de réplication dans des cellules en culture

• Dans certains cas, la réplication virale se traduit par l’apparition d’un effet cytopathogène (ECP) :

• ensemble des modifications cellulaires associées à la réplication virale.


Cellules HeLa


Cellules permissives en culture • Cellules primaires – peu utilisées • Lignées continues +++ • Fibroblastes embryonnaires humains +

ECP de CMV sur cellules MRC5



Avantages • Production de virus infectieux • Technique de référence

Inconvénients

• Fastidieux : manuel, entretien des cellules • Personnel qualifié compétent +++



Limites • Certains virus ne se répliquent pas sur cultures cellulaires

= HCV, HBV, HAV, HEV, HPV, Rubéole… • Certains virus ne donnent pas d’ECP = grippe

Applications • Suspicion d’infection congénitale à Cytomégalovirus

=> CMV dans urines du nouveau-né ?

• Infection respiratoire sans orientation


Diagnostic direct – Recherche d’antigènes viraux

Immunofluorescence (IF) • A partir d’un échantillon biologique contenant des cellules

infectées • Utilise des anticorps monoclonaux couplés à des

fluorochromes : distinguer IF directe et IF indirecte • S’observe en microscopie à fluorescence



Avantages • Rapide, sensible, spécifique • Peu coûteux

Inconvénients • Pas toujours facile à lire

Recherche de virus Parainfluenzae par IF



Limites • Faux positifs/Faux négatifs

Applications

• Détection de virus respiratoires à partir de prélèvements respiratoires +++

• Typages de virus après isolement en culture cellulaire



ELISA

• Antigènes produits au cours d’une infection

• HIV = p24

• HBV = HBe, HBs

• Suivi des infections, quantification



Avantages • Rapide, sensible, spécifique • Peu coûteux • Automatisé

Inconvénients • Faux positifs/Faux négatifs



Applications

• Diagnostic et suivi des hépatites B • Diagnostic de la primo-infection à HIV = Ag p24


Diagnostic direct – Recherche de génomes viraux

Basées sur les techniques de biologie moléculaire • PCR, RT-PCR • Séquençage

Utilisées pour des virus non cultivables • HPV • HCV, HBV, HEV

Apportent des réponses quantitatives • Suivi des personnes infectées

PCR temps réel quantitative



Avantages • Sensible, spécifique +++ • Peut être multiplex, quantitatif • Peut être rapide (3h)

Inconvénients • Coûteux +++ • Personnel qualifié +++



Limites • Infection?

Applications • Diagnostic et suivi des hépatites B, C, E • Diagnostic et suivi des infections à HIV • Diagnostic des infections respiratoires, de

l’immunodéprimé, des infections à HPV…


Diagnostic indirect – Recherche d’anticorps

1. Dépister une infection en cours ⇒Face à une hépatite aiguë clinique : HAV, HEV, HBV ⇒Face à infection d’une femme enceinte : Rubéole, CMV



2. Déterminer le statut sérologique d’une personne vis-à-vis d’une infection virale

⇒Avant une vaccination : HAV ⇒Avant un traitement immunosuppresseur (chimiothérapie,

transplantation … ⇒Lors de la prise en charge d’un patient infecté par le HIV

A partir d’un échantillon de sérum • 1 seule recherche d’IgG suffit • ELISA pour rechercher des Acs • Western blot comme technique de confirmation pour HIV



3. Dépister et suivre une infection chronique

⇒HBV = mettre en évidence des séroconversions

A partir d’un échantillon de sérum

Cinétique des anticorps au cours d’une infection par HBV



Avantages • Rapide, sensible, spécifique • Peu coûteux • Automatisé

Inconvénients • Faux positifs/Faux négatifs


Infection par le Zikavirus • Fièvre, éruption, douleurs articulaires +

musculaires

Diagnostic virologique : • J0 – J7 après début des signes cliniques

RT-PCR sur le sang + IgG et IgM anti-Zika

• J7 – M1 après début des signes cliniques RT-PCR sur les urines + IgG et IgM anti-Zika

Combiner Direct et Indirect


Infection par le HIV • Suivi de l’infection, éventuellement sous traitement, par

quantification des ARN viraux dans le sang (RT-PCR)

• En cas d’échec du traitement, recherche de mutations de résistances par séquençage

Vie quotidienne au laboratoire de virologie



Réception et Tri des échantillons (RTE)

Echantillons biologiques

Sérologies

Conservation

Culture – IF … Biologie Moléculaire

Service de Virologie



Sérologies Culture – IF … Biologie Moléculaire



Sérologies Culture – IF … Biologie Moléculaire

Service de Virologie

• J+1 • Séries

Exceptions • AES • Dons organes • Hépatites

fulminantes

• J0 – J+1 • Séries • Coup par coup

PCR

• J0, J+1, 2, 3… • Séries • Coup par coup

Typage Mutations


Avez-vous des Questions ?

Diagnostic & suivi des infections virales

Diapositive numéro 1Diapositive numéro 2Diapositive numéro 3Diapositive numéro 4Diapositive numéro 5Diapositive numéro 6Diagnostic direct : mettre en évidence le virus ou un de ses constituantsDiapositive numéro 8Diapositive numéro 9Diapositive numéro 10Diagnostic direct : mettre en évidence le virus ou un de ses constituantsDiapositive numéro 12Diapositive numéro 13Diapositive numéro 14Diapositive numéro 15Diapositive numéro 16Diapositive numéro 17Diapositive numéro 18Diapositive numéro 19Diapositive numéro 20Diapositive numéro 21Diapositive numéro 22Diapositive numéro 23Diapositive numéro 24Diapositive numéro 25Diapositive numéro 26Diapositive numéro 27Diapositive numéro 28Diapositive numéro 29Diapositive numéro 30Diapositive numéro 31Diapositive numéro 32Diapositive numéro 33Diapositive numéro 34Diapositive numéro 35Diapositive numéro 36Diapositive numéro 37

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