Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris

DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE

ADNpatient *Cy3

ADNtémoin*Cy5

Cohybridation

Lavage

Lecture parscanner

Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5

par un logicieladapté

Marquagedes ADN

Principe de la CGH Principe de la CGH arrayarray

Puce 2500clones (BAC)

Wolf-Hirschhorn Cri du Chat

Williams-Beuren

Langer-Giedion

Prader-Willi / Angelman

Miller-Dieker

Smith-Magenis

DiGeorge

13

21

18

YX

Quelle technologie utilise Prenatal BoBs?

BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence.5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

Prenatal BoBs

ACs n ead

Random Primer SolutionBiotin-dNTP MixPolymeraseSample Diluent

Marquage de l’ADN à la Biotine

Biotine

J1

Purification de l’ADN

Kit de purification Purelink INVITROGEN Biotine

Colonne avec filtre

Hybridation de l’ADN sur les billes

Biotine

Sonde fixée sur les micro billes

Hybridation à 52°C à 1200 rpm16 à 20H

Dénaturation 5 mn à 85°C

Wash Buffer 1

Lavages

Elimination de l’ADN non hybridé

ADN marqué non-hybridé

Filtre 0,45 µm en µplaque

J2

Reporter ConcentrateReporter Diluent

Révélation du signal

Biotine

Streptavidine

Phycoérythrine

37°C 1200 rpm

Wash Buffer 2

Lavages

Filtre 0,45 µm en µplaque

Streptavidine non couplée

Lectures des billes

Lecture d’une plaque complète = 2h

Lectures des billes

Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN

Le laser rouge identifie le signal de la bille

Profil féminin normal

Profil masculin anormal

Notre expérienceà Robert Debré

BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région.

Nos résultatsDe avril 2011 à juillet 2012

Intérêts

– Rendu de résultats rapide– Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL

de LA ou 1 petite villosité– Comparaison avec des références mâles et

femelles– Jusqu’à 44 patients par plaque– Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8

sondes par région étudiée– Screening plus large (dont contrôles sur

quelques autosomes)

Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus

Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un

RCIU à 34SA

Inconvénients

– Non détection des translocations équilibrées ?– Difficulté d’interprétation des triploïdies– Technique très manuelle– Technique coûteuse ?– Certaines microdel étudiées inutiles ?

Exemple d’une triploïdie chez un fœtus